JP2010530462A - ポリマー2相システムおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
Saravaanen(Settu Saravaanan, Johny A. Reena, Jonnalagadda R. Rao, Thanapalan Murugesan, and Balanchandran U. Nair in J. Chem. Eng. Data 2006, 51, 1246-1249: Phase Equilibrum Compositions, Densities, and Viscosities of Aqueous Two-Phase Poly(ethylene glycol) + Poly(acrylic acid) Systems at Various Temperatures)は、様々な質量分率(0.05〜0.50)および液体-液体平衡、密度、そして平衡化の時点での水性2相PEG-6000 + PAA + 水システムの粘性といった、ポリ(アクリル酸)(PAA)水溶液の密度や粘性に対する、温度の作用についての研究に関する。
1またはそれ以上の本発明の側面は、添付する特許請求の範囲に規定する様に達成することができる。本発明のさらなる目的および利点は、以下の詳細な開示から明らかである。
本件出願において使用される場合、用語“ポリ(酸)”は、側鎖基および/または末端基として多数の酸性基を含有する、直鎖または分岐鎖ポリ(酸)バックボーンを意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、合成のポリ(酸)である第1のポリマー、親水性のポリ(エーテル)である第二の合成ポリマー、そして少なくとも1つの塩を含む、水性ポリマー多相システムを形成することができる液体混合物に関し、ここでポリ(酸)の分子量は、1000〜100,000 Daの範囲である。
(a)ポリ(酸)である合成ポリマーを、親水性のポリ(エーテル)である第2の合成ポリマーおよび少なくとも1つの塩と組み合わせる工程;
(b)少なくとも1つの標的化合物を含む液体を、(a)から得られたシステムに対して添加する工程;
(c)(b)から得られたシステムを、少なくとも2相が形成されるまで穏やかに混合する工程;そして、場合により
(d)所望の標的化合物を、相の一つから回収する工程;
を含む。
粒子および/または凝集物は、ポリマーにより共有結合的に修飾されるかまたはその他で修飾されていてもよい;これには、イムノ-親和性クロマトグラフィー、レクチン-親和性クロマトグラフィー、または金属イオン-親和性クロマトグラフィーまたはその他の-親和性クロマトグラフィー、並びにイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、およびイオン-pi、p-p、およびvan der Waals相互作用または分散相互作用に基づくものを含めたその他の相互作用が関連する、クロマトグラフィーのその他の様式、において一般的に使用されるリガンドなど、様々なポリマー修飾された“リガンド”を使用することが含まれる。
特に示さない限り、以下の割合は、重量/重量(w/w)で示される。
図1は、PEG 4000およびNaポリアクリレート8000を使用して形成される、本発明の水性ポリマー2相システムについての相図を示す。より具体的には、このシステム は、200 mM NaClを用いて22℃で形成された。バイノーダル曲線を、○:2相システム;□:1-相システム;そして△:一見して二峰性領域であり指定することが困難なシステム;に関連する濃度点に対してシステムを滴定することにより、視覚的に推定した。ここでの相は、相対的に低い(全)ポリマー濃度で形成し、そしてそれらは透明で、相対的に低い粘性を有するものであり、そして単位重力で迅速に分離する。さらに、相バイノーダル曲線は、臨界点近くではより直線的であり、このことは、この領域近くで形成される2相システムが、有意な連絡線(tie-line)の長さを有し、そして従って、物理的性質に関して、そして分配の結果に関しても、より再現性が高いことを示唆する。二峰性曲線上の二峰性ポリマー濃度に対する最低の全ポリマー濃度は、約12%であるようであり、これは各ポリマーが6%であることに対応することに注目すべきである。
実施例1-本発明の2相システムおよび相図の調製
材料
ポリマー:ポリ(エチレングリコール)4000(Merck)、PEG 8000(Sigma-Aldrich)、Na-ポリ(アクリレート)(Aldrich)、CAS-番号:9003-04-7、分子量30000(40 wt%水溶液中)、分子量8000(45 wt%水溶液中)。NaClおよびNa2SO4メタノール、Ba(NO3)2(Merck由来、そしてP.A.品質)。ミリポア水を、全ての溶液において使用した。
ステムの相境界面(二峰性)を、周知の滴定方法により決定した[Methods in Enzymology, Vol. 228, Aqueous Two-Phase Systems, Harry Walter and G. Johansson eds. Academic Press, New York, 1994を参照]。この場合、2相領域中に存在することが疑われる組成物を有するシステムが作製される。このシステムが混合に際して不透明(混濁)に変化する場合、2相システムの存在が示唆される。研究されたシステムと同一の塩濃度を有する塩溶液を添加する際、このシステムは、ポリマーに関して希釈されることになる。ポリマー濃度が臨界値以下に含まれる場合、このシステムは1相システムに変化し、混合される場合に混濁しない。ポリマーを添加し、そしてこのシステムを連続的に希釈することにより、相図を、相境界面の両側にマッピングする。これはすなわち、バイノーダル曲線である。このシステムを、22℃(室温)および25℃(水槽)中で決定する。
溶液の屈折率は、既知濃度のPEG-水、Na-ポリ(アクリレート)-水、および塩-水溶液の別個の標準曲線を作成することによる、水富化溶液(>90%)中で、直線的な追加的な特性である。屈折率装置は、Carl Zeiss(Oberkochen, Wurttemberg, Germany)から入手した。
塩およびNa-ポリ(アクリレート)の溶解度は、メタノール中では非常に低く(<0.1 wt%)、一方でPEGは非常に高い溶解度を有するため、メタノール中にPEGを選択的に抽出することができ、そしてメタノールを蒸発させることにより、PEG重量測定法で測定ことができる。1.00 gの上部相または底部相を、少なくとも6 gのメタノールと混合する。Na-ポリアクリレートおよび塩の沈殿物が形成され、そして3000×gで10分間遠心される。PEGを含有する上清を回収し、そして高さが既知の15 mlのガラスチューブ中に入れる。沈殿物を2 gのメタノールを用いてさらに洗浄し、その後遠心を行った。この後の上清画分を最初のものと一緒に保存する。このチューブを、3日間、通気フード中で開放したままにする。メタノールのほとんどが蒸発し、そして残りはオーブン中で70℃で蒸発させる。このチューブを秤量し、そして乾燥させたPEGを重量測定法で測定する。
硫酸ナトリウム塩を、Ba-サルフェートを用いた滴定により、測定することができる。しかしながら、Na-ポリアクリレートは、二価カチオンにより沈殿するため、このポリマーは、解析の前に除去しなければならない。これを、以下の様にして行う:
1 gのサンプル(上部相または底部相)を、15 mlのガラスチューブ(A)に加えた。0.1 gのNa-ポリアクリレート8000(濃度:水中45 wt%)および0.3 gのPEG 8000(濃度:水中30 wt%)および0.2 gのHCL(37 wt%)を、サンプルに対して添加し、そしてボルテックスにかけ、そして最終的に3000×gで遠心した。PEGおよび高濃度のポリアクリル酸から構成される底部粘稠相を含有する2相システムを、形成した。上部相は、水富化相である。容量比は高い(>10)。この水富化相を注意深く回収し、そして既知重量の別の15 mlのガラスチューブ(B)中に入れる。1.5 gをガラスチューブ(A)中の粘稠相に添加し、ボルテックスにかけ、そして3000×gで遠心する。水富化相を再び注意深く回収し、そしてチューブ(B)中に入れる。この手順において、Na2SO4の全てを含有する水溶液とは別個に、PEGおよびポリアクリル酸を除去する。
Na-ポリアクリレートの濃度を、以下の方法により、屈折率(RI)を通じて測定する。3回希釈される相のRIを測定する。この値には、PEGおよび塩からの寄与が含まれる。記載されたように測定された既知濃度のPEGおよび塩から、屈折率に対するそれらの寄与を測定する。この結果として得られる値は、以前に測定された標準曲線により決定されるNa-ポリアクリレートによるものである。
水性ポリマー相システムは、そのようなシステムのための標準に従って調製される。乾燥ポリマーを完全に水和するために必要とされる時間(不攪拌溶液中では24時間かかる場合もある)を回避するため、典型的には30〜40重量%のポリマーのストック溶液を、作製する。NaPAAの場合、そのようなストック溶液を、商業的に購入することができる。PEGの場合、ストック溶液をオペレータにより作製した。NaCl(1 M)またはその他の塩のストック溶液、例えば、0.5Mのリン酸Na pH 6.8、もまた同様に作製する。6%のPEG、6%のNaPAA、300 mMのNaCl、50 mMのリン酸Naからなる1000グラム(約1リットル)の相システム を作製するため、150 gのPEGストック、150 gのNaPAAストック、300 gのNaClストックおよび100 gのリン酸Naストックを単純に混合し、次いで水を添加して、所望の全量にする。一旦作製したら、そのようなシステムを数分間攪拌して、完全な混合を確実にし、そして次いで、自然に2相に分離させることができる。10 mlの同一のシステムを作製することは、100分の1の少ない量の各ストックのみが必要とされる。
2相システムを、上述したようにして調製した。EOPO 3900システムおよびNaPAA 15000システムに対するpHの作用を調べた。結果を、以下の表2に示し、これにより相容量比に対するpHの作用、および200 mM NaPバッファー中でのEOPOおよびNaPAA含有2相システムにおける相システム形成についての洞察が得られる。これらのポリマー分子量、濃度条件および塩条件にて、pH 6〜8では2相が形成されたが、pH 5では2相が形成されなかった。
プラスミドDNAおよびRNAを、本発明による2相システム中で以下のようにして分配した:pDNAおよびRNAについての分配の結果は、Phast(登録商標)システムおよびDRIgest III(登録商標)分子量標準(GE Healthcare)、そしてそのようなサンプルのための刊行物に記載されたGE Healthcareのプロトコルを使用するゲル電気泳動により、さらに確認された。ランタイムは、pDNAについて47分(図1、レーン1〜3)、そしてRNAについて30分(図1、レーン4 〜6)であった。
%分配の結果は、典型的にはn = 3の実験に基づく平均値(X)であり、典型的なSDは<0.1Xである。
b. システムは、NaPAA 8000 45%(w/w)Sigma-Aldrich No. 416029(Batch 12630LC)またはNaPAA 15000 35%(w/w)Sigma-Aldrich No. 416037(Batch 05206CA)を使用して構成される。
c. システムは、プラスミドDNA(pDNA)、RNAおよび被検タンパク質サンプルを使用して評価される。被検タンパク質は、ポリクローナルヒトIgGサンプル(Gammanorm(登録商標), Octapharma)であった。
%分配の結果は、n = 3の実験に基づく平均値(X)および典型的な<0.1XのSDである。
d. pDNAの総量(6 kbpのpJV4)は、各チューブ中に約0.25 mg(360μlの0.683 mg/mlのストック溶液U1504:100)を最初は導入した。得られる総[pDNA]は、約0.05 mg/mlである。RNA(U1489088)を、初めに2.1 Mの(NH4)2SO4水溶液中に溶解し、そして使用前に、PD-10カラム(GE Healthcare Code No. 17-0851-01)を用いて脱塩することが必要とされた。[RNA]約0.16 mg/mlの脱塩されたRNAストックを、各チューブに添加し(386μlのRNAストック溶液、約62.5μgのRNA)、約0.025 mg/mlのチューブあたりの総[RNA]を得た。
Claims (25)
- 多相システムを形成することができる液体混合物であって、この液体がポリ(酸)である第1のポリマー、ポリ(エーテル)である第2のポリマー、そして少なくとも1つの塩を含み、第1のポリマーの分子量が1000〜100,000 Daの範囲である、前記液体混合物。
- 第1のポリマーが、ポリ(アクリル酸)およびポリ(メタクリル酸)からなる群から選択される、請求項1に記載の液体混合物。
- 第1のポリマーおよび第2のポリマーの少なくとも一方が、合成ポリマーである、請求項1または2に記載の液体混合物。
- 第2のポリマーの分子量が、900〜100,000 Daの範囲である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の液体混合物。
- 第2のポリマーがエチレンオキシドを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の液体混合物。
- エチレンオキシドポリマーが、ポリ(エチレン)グリコール;エチレンオキシドプロピレンオキシド(EOPO);BreoxTM;PluronicTM;およびエトキシ-含有多糖類からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の液体混合物。
- 塩濃度が、1〜500 mMの範囲であり、好ましくは100〜300 mMの範囲である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の液体混合物。
- 塩が、NaCl、Na2PO4、KPO4、NaSO4、クエン酸カリウム、(NH4)2SO4および酢酸ナトリウム;またはこれらのいずれかの組合せ;からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の液体混合物。
- 全ポリマー含量が、約8〜20%(w/w)を構成する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の液体混合物。
- 3種またはそれ以上のポリマーを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の液体混合物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に規定される液体混合物により形成される多相システム。
- 少なくとも1つの生体分子、細胞、または粒子の単離における、請求項1〜10のいずれか1項に記載の液体混合物により形成される多相システム の使用。
- 液体から、少なくとも1つの生体分子または粒子を単離する方法であって、この方法は:
(a)ポリ(酸)である第1のポリマーを、親水性のポリ(エーテル)である第2のポリマーおよび少なくとも1つの塩と組み合わせる工程;
(b)少なくとも1つの生体分子または少なくとも1つの粒子を含む液体を、(a)から得られたシステムと組み合わせる工程;
(c)(b)から得られた液体混合物を、少なくとも2相が形成されるまで穏やかに混合する工程;そして、場合により
(d)所望の生体分子または粒子を相の一つから回収する工程;
を含む、前記方法。 - ポリ(酸)の分子量が、1000〜100,000 Daの範囲である、請求項13に記載の方法。
- ポリ(エーテル)がエチレンオキシドを含む、請求項13または14に記載の方法。
- 工程(a)において、請求項1〜9のいずれか1項に記載の液体混合物が提供される、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)において、選択的湿潤化(preferential wetting)を介してマトリクス上に局在化される(1または複数の)ポリマーが提供される、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 単一の粒子または粒子の凝集物を使用し、そしてその粒子は典型的には直径が200ミクロン未満かつ直径が5 nmより大きいものである、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 粒子および/または凝集物が、共有結合的であるか、またはポリマーにより修飾されたものである、請求項18に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の液体混合物中に含まれるか、または請求項1〜10のいずれか1項に記載の液体混合物により形成される多相システム中に含まれる、少なくとも標的化合物、細胞、または粒子の単離のためのキット。
- 別個の区画中に、ポリ(酸)である第1のポリマー、ポリ(エーテル)である第2のポリマー、そして少なくとも1つの塩、およびその使用説明書を含み、ここでポリ(酸)の分子量が1000〜100,000 Daの範囲である、少なくとも1つの標的化合物の単離のためのキット。
- 構成成分が、プラスチックバッグ中で提供される、請求項20または21に記載のキット。
- 水溶液中にまたは乾燥形状で、少なくとも1つのポリ(酸)を含有する、請求項13〜18のいずれか1項に記載の方法を実行するためのキット。
- エチレンオキシドを含む第2のポリマー、および少なくとも1つの塩も含み、ここでポリ(酸)の分子量が1000〜100,000 Daの範囲である、請求項23に記載のキット。
- 1またはそれ以上のポリマー濃縮相が、容器、粒子またはフィルターの表面に配置される、キット。
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