JP2003528181A - 磁性シラン化ポリビニルアルコール系キャリア材料 - Google Patents

磁性シラン化ポリビニルアルコール系キャリア材料

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    • G01N33/54326—Magnetic particles

Abstract

(57)【要約】 本発明は、磁性高分子ポリビニルアルコール系キャリア材料に関する。前記材料の表面は少なくとも一部分がシラン化されている。本発明はまた、このような材料の表面をシラン化する方法および生体材料、好ましくは核酸を単離するための磁性シラン化キャリア材料の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明の主題は、その表面が少なくとも部分的にシラン化されている磁性高分
子ポリビニルアルコール系キャリア材料、このような材料の表面をシラン化する
方法、および生体材料を単離するため、好ましくは核酸を単離するための磁性シ
ラン化キャリア材料の使用である。
【０００２】 磁性高分子キャリア材料、特にポリマー粒子は、細胞、タンパク質および核酸
を分離するために生物化学および医学的診断にますます使用されつつある。磁性
キャリア材料の使用は、磁力を用いて荷電キャリア材料を試料中の他の成分から
簡単かつ迅速に分離することができるという、従来の分離方法をしのぐ利点を有
している。１０μｍ未満の範囲の狭い粒径分布を持つ磁性のビーズ状または球状
のポリビニルアルコール系ポリマー粒子は、この種の分離方法に特に適している
ことが判明している（ＷＯ９７／０４８６２）。
【０００３】 ある種の生体材料、特に核酸は、多大な努力なしには自然環境から単離されな
いことも知られている。このことは、このような生体試料が一般に他の固体およ
び／または溶存化合物を、例えばタンパク質、を含有し、これらが単離を妨げる
という事実に、または核酸が、研究するべき生体試料中に極めて低濃度でしか存
在しないことが極めて多いという事実にしばしば起因している。
【０００４】 しかしながら、磁性粒子を用いて生体試料から核酸を単離する利点を活用する
ため、とりわけ、本質的に無孔であるガラス表面を持つ磁性粒子を用いて核酸を
分離できると提案されている（ＷＯ９６／４１８１１）。これらの粒子は特定の
組成を有していなければならず、すなわちそれらのガラス表面は所望の効果を得
るために特定の組成を有していなければならず、さらに、これらの粒子を製造し
、ガラス表面に必要な焼結を行うためには比較的複雑な工程が必要である。
【０００５】 そこで、本発明の目的は、生体試料から、生物学的物質、好ましくは核酸を単
離し、および／または精製するための他の磁性キャリア材料であって、核酸に極
めて特異的であることが好ましく、したがってまた自動診断方法を可能にする材
料を提供することとした。さらに、キャリア材料の製造は簡単で安価でなければ
ならない。
【０００６】 本発明によれば、その表面が少なくとも部分的にシラン化され、生体分子と結
合する親和性リガンドを場合によっては備えているポリビニルアルコール系磁性
キャリア材料を提供することによってこのことが達成される。
【０００７】 これらの磁性キャリア材料は、フィルタまたは膜として設計することができる
。磁性キャリア材料をビーズ状または球状粒子として作成することが好ましく、
これらの粒子は０．２〜５０μｍの粒径を有することが好ましく、０．５〜５μ
ｍであることが特に好ましい。ビーズ状および球状が好ましいことに加えて、そ
れらの粒径分布はできる限り狭い範囲でなければならない。
【０００８】 磁性ポリビニルアルコールキャリア材料、好ましくはビーズ状の粒子形状を持
つ材料を製造する方法は、ＤＥ−４１ ２７ ６５７およびＷＯ９７／０４８６
２で知られており、キャリア材料の製造方法に関するその開示を本明細書に引用
する。これらの公知の方法を用いて、特に懸濁液中の生体物質の単離および診断
薬として用いられる、極めて狭い粒径分布で粒径が１〜４μｍである磁性粒子を
製造することができる。
【０００９】 この場合、特定の乳化剤混合物を油中水エマルジョンの油相に加えることによ
ってポリビニルアルコール粒子を製造する。油相への添加に適した乳化剤は、プ
ロピレンオキシド−エチレンオキシドブロック共重合体、ソルビタン脂肪酸エス
テル、ペンタエリスリトール脂肪酸エステルのクエン酸との複雑な混合エステル
、ポリエチレングリコールヒマシ油誘導体、ヒマシ油誘導体からのブロック共重
合体、ポリエチレングリコール、修飾ポリエステル、ポリオキシエチレン−ソル
ビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−エチレン
ジアミンブロック共重合体、ポリグリセリル誘導体、ポリオキシエチレンアルコ
ール誘導体、アルキルフェニルポリエチレングリコール誘導体、ポリヒドロキシ
脂肪酸ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリエチレングリコールエー
テル誘導体である。このタイプの物質は、なかでもＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標
）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）、Ｔｒ
ｉｔｏｎ（登録商標）、Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ＢｒｉｊＯＲ（登録商標）、ＲｅｎｅＸＯＲ、Ｈｙｐ
ｅｒｍｅｒ（登録商標）、Ｌａｍｅｆｏｒｍ（登録商標）、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ（
登録商標）またはＥｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）の商品名で市場で知られている
。
【００１０】 好ましくは粒径が０．５〜１０μｍである均一なビーズ状ポリマー粒子を得る
ために、前記の界面活性物質のうち少なくとも２種類、好ましくは３〜４種類の
混合物を油相に添加する。親油性の乳化剤成分は、半親水性、すなわち水と油の
双方に可溶である少なくとも１種類の乳化剤と混合する。後者の性質を持つ乳化
剤の例には、エチレンオキシド含有量が優勢なエチレンオキシド−プロピレンオ
キシドブロック共重合体誘導体、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル
、短鎖ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸、ポリエチレングリコールまたは短
鎖ソルビタン脂肪酸エステルが含まれる。油相における乳化剤の濃度は、通常２
〜６体積％、好ましくは３．５〜５．０体積％である。ポリマー小滴の細かさお
よび狭い粒径分布に関して、有利な乳化剤は、少なくとも２種類の親油性成分と
１種類の半親水性乳化剤とを含有する乳化剤である。半親水性乳化剤の濃度は通
常、乳化剤の全量に対して１５〜３０体積％である。粒子の細かさに加えて、粒
子はビーズ状の形状を有する。
【００１１】 油相用の乳化剤に加えて、水性ポリマー相に可溶である特殊な界面活性物質は
、低分子量の特にポリビニルアルコール溶液のエマルジョンの性質を改善するの
に役立つ（Ｍｏｗｉｏｌ、Ｃｌａｒｉａｎｔ ＧｍｂＨ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ
ａｍ Ｍａｉｎ、ＦＲＧ）。さらに、イオン性乳化剤を添加すると、固形で添加
される磁性コロイドの微細分散が得られる。二元混合物としても用いることがで
きるこのような乳化剤の例には、血清アルブミン、ゼラチン、脂肪族および芳香
族スルホン酸誘導体、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドンま
たは酢酸酪酸セルロースが含まれる。用いる乳化剤の量は通常、ポリマー相に対
して０．０１〜２重量％であり、イオン性乳化剤の濃度は必ず０．０１〜０．０
５重量％である。当業者は、撹拌速度ならびに２相の濃度および粘度の粒径に対
する影響について知っているはずである。好ましい粒径０．５〜１０μｍを得る
ためには、従来型の二枚刃プロペラミキサーを使用して１５００〜２０００回転
／分の撹拌速度が必要である。
【００１２】 原則として、この工程中にポリビニルアルコールマトリックスに封入される磁
性粒子は、適切な粒径および通常は５０〜４００ガウスの磁気飽和を有する強磁
性または超常磁性コロイドでよい。磁性粒子が満たさねばならない他の要件は、
ポリビニルアルコールが存在する水性ポリマー相における分散性である。次いで
、有機相中の次のエマルジョンと同時に、磁性コロイドをポリマー小滴中に封入
する。
【００１３】 磁性コロイドは、粒径が１０〜２００ｎｍのマグネタイトであることが好まし
い。このような物質は、市場で、例えばＢａｙｆｅｒｒｏｘまたはＦｅｒｒｏｆ
ｌｕｉｄｉｃｓの商品名で入手することができる。このようなコロイドの製造は
当技術分野で知られているため、知られている手順、例えばＳｈｉｎｋａｉ他、
Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ、５巻、６１ページ、１９９１年、Ｒｅｉｍｅｒｓお
よびＫｈａｌａｆａｌｌａ、Ｂｒ．Ｐａｔｅｎｔ １，４３９，０３１またはＫ
ｏｎｄｏ他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４１巻
、９９ページ、１９９４年に記載の手順に従って磁性粒子を製造することができ
る。この相に関しては、ポリマー相中のコロイドの濃度は通常、製造方法により
水性コロイドとしてすでに存在するコロイドの場合には４〜１４体積％であり、
固体物質の場合には０．３〜２重量％である。製造に際しては、ポリマー中の磁
性コロイドを直接混合する。粒子の細かい分散と均一な分布を確保するため、高
速分散ツール（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）を用い、続く超音波処理（音波処理
（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ））により水性分散液を短時間に混合しなければならな
い。磁性粒子を製造するのに必要なポリマー相は通常、２．５〜１０重量％ポリ
ビニルアルコール溶液からなる。
【００１４】 本発明に従って用いるポリビニルアルコール粒子は、多孔質であってはならな
い。したがって、２．５〜５重量％のポリマー濃度および５００００ｇ／ｍｏｌ
を超えるのモル質量(molar mass)を用いることが好ましい。磁性粒子の多孔性に
関係する他の要素は、架橋剤またはその濃度の選択である。１０％までの粒子の
架橋では、事実上無孔粒子が得られる。原則として、可能な架橋剤には、ポリビ
ニルアルコールの水酸基と反応する、例えばアルデヒド、酸塩化物またはジビニ
ルスルホンなどのすべての水溶性二官能性物質が含まれる。酸触媒の下でグルタ
ルアルデヒドを架橋剤として用いることが好ましく、それはこの物質が数分以内
にポリマーと反応し、永久に架橋した粒子を生成するからである。従来の物質で
は１〜２時間の反応時間が必要である。水性ポリマー相に対する架橋剤の濃度は
通常、０．２〜１体積％であり、グルタルアルデヒドの場合には２〜７体積％で
ある。グルタルアルデヒドは常に６〜２５％水溶液の形態で使用する。
【００１５】 磁性粒子を製造するためには、まず、一般的に体積で２０〜２５倍量の有機相
、好ましくは市販の植物油を指定し、その中でポリマー−磁性コロイド混合物を
撹拌下で懸濁する。
【００１６】 その後、それ自体が当業者に知られている方法に従い、例えば濾過および洗浄
により懸濁液から磁性ポリビニルアルコールキャリア材料を回収することができ
る。
【００１７】 本発明によるポリビニルアルコール系キャリア材料は、この磁性ポリビニルア
ルコールキャリア材料を好ましくは粒子形態で有機シラン化合物で変換すること
によって製造する。この変換に特に適しているのは、一般式Ｉ、 Ｘｑ−Ｓｉ−（ＯＲ）４−ｑ （Ｉ） ［式中、 ｑは、整数０〜３を表し、 Ｒは、同一または異なり、水素、アルキル残基であって、好ましくはＣ１〜Ｃ６ 、特に好ましくはＣ１〜Ｃ２のアルキル残基、アリール残基、好ましくはフェニ
ル残基を表し、 Ｘは、同一または異なり、水素、アルキル残基であって、好ましくはＣ１〜Ｃ２ のアルキル残基、アリール残基、好ましくはフェニル残基、またはハロゲン、好
ましくは塩素を表す］ または一般式（ＩＩ）のシラン化合物、 （Ｙ−Ｒ１）ｑ−Ｓｉ（ＯＲ）４−ｑ （ＩＩ） ［上式で、 Ｒ、ｑは、一般式（Ｉ）について示したものと同一の意味を有し、 Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル残基、好ましくはエチレンまたはプロピレン残基
を表し、 Ｙは、アミノ基、ジアルキルアミノ基、好ましくはジメチル−ジエチルアミノ基
、ＳＨ、エポキシド基、ビニル基、好ましくは−ＣＲ２＝ＣＲ３ ２基を表し、Ｒ ２ またはＲ３は、同一または異なって、水素、アルキル残基であって、好ましく
はＣ１〜Ｃ２のアルキル残基、アリール残基、好ましくはフェニル残基、または
アクリル酸残基を表す］ または一般式（ＩＩＩ）の反復単位を有するポリマーシラン化合物である。
【００１８】
【化２】 ［上式で、 Ｒは、一般式（Ｉ）について示したものと同一の意味を有し、好ましくはメチル
残基を表す］ 本発明の別の主題は、磁性ポリビニルアルコール系キャリア材料のすでにシラ
ン化された表面を一般式ＩＩの有機シラン化合物で変換してさらに官能基を導入
し、次いで公知の親和性リガンドに変換することができる反復シラン化の方法で
ある。これらの親和性リガンドは、生体分子と結合させ、それらの単離および同
定に用いることができる。
【００１９】 原則として、アフィニティークロマトグラフィで用いられるリガンドはすべて
、親和性リガンドとして結合させることができる。実際的見地からかなり有望な
リガンドの例には、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ｌ、ストレプトア
ビジン、ビオチン、ヘパリン、抗体、血清アルブミン、ゼラチン、リジン、コン
カナバリンＡ、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質
結合金属イオン、レクチンおよび酵素が含まれる。このような親和性マトリック
スで行うことができる特別な分離は一般的な従来技術である。それ自体が知られ
ているこの方法の詳細に関しては、Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、
５１０巻、１９９０年における説明を参照されたい。通常、本発明による表面修
飾された磁性シラン化キャリア材料を用いて行うことができるすべての分離に共
通するのは、２〜５分以内であまり努力せずに分離を行えることである。
【００２０】 磁性キャリア材料、好ましくは磁性粒子の使用に関連するもう１つの興味深い
分野は、診断学の分野、特にイムノアッセイの分野である。
【００２１】 ２１ 基本的原則は、特異的物質の定量的測定にある。実際には、この特異的結合は
固定化抗体を介して行われる。この場合、本発明による多重にシラン化されてい
る可能性のある磁性キャリア材料がイムノアッセイに使用する優れた土台を提供
する。これを行うために、診断に関連する特異的抗原に対する抗体を知られてい
る方法で磁性粒子に化学的に結合させることができる。このような抗体の例には
、抗インスリン、抗甲状腺、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する抗体、甲状
腺結合グロブリンに対する抗体、抗コルチゾン、抗フェリチン、抗絨毛性ゴナド
トロピン、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、抗プロゲステロン、抗テストステロン、
抗エストラジオール、抗プロラクチン、抗ヒト成長ホルモン、抗ジゴキシン、抗
β２ミクログロブリン、抗α２マクログロブリン、抗ビタミンＢ１２、抗ＶＩＩ
Ｉ因子、細胞表面抗原に対する抗体（いわゆる抗ＣＤｘ抗体）または抗ＡＦＰが
含まれる。抗体結合磁性キャリア材料と試料とのインキュベーション時間は通常
２〜５分である。極めて特異的なキャリア結合抗原抗体複合体の形成によって標
的抗原を磁気によって分離した後、別の有標抗体を用いるか、あるいは溶離条件
の下で抗原を脱離させた後の直接的な光度測定により検出を行う。抗体に加えて
、他の物質を、好ましくは粒子の形態で本発明による磁性シラン化キャリア材料
に結合させ、特異的物質の検出に使用することができる。このような物質の例は
血中糖含有量の検出に使用することができる３−アミノフェニルホウ酸である。
リガンドを固定化するには、ポリビニルアルコールキャリアでリガンドを変換し
、そのポリビニルアルコールキャリアのＯＨ機能をジイソシアネートとのリガン
ド結合のために活性化した。通常、変換には磁性キャリア１００ｍｇ当たり３−
アミノフェニルホウ酸１５〜３０ｍｇを用いる。血中糖含有量の分析は、血中に
存在しホウ酸リガンドと特異的に結合するグリコシル化ヘモグロビンを用いて行
う。次に、結合したグリコシル化分画をマトリックスから溶離し、光度測定法に
より分画を定量的に分析することができる。このことは、この方法がルーチン分
析にとって特に有利に使用できることを意味している。
【００２２】 したがって、本発明の他の目的は、 −生体材料を含有する液体の試料を、本発明による場合によっては表面が修飾さ
れた磁性ポリビニルアルコール系シラン化粒子と、生体材料が粒子表面と結合す
る条件の下で接触させること、および −液体から生体材料を分離することにより、生体材料を単離しおよび／または精
製する方法である。
【００２３】 すでに説明したように、生体材料は、粒子または分子ベースの材料として理解
すべきである。これらには、特に細胞、例えばウイルスおよび細菌、白血球など
の単離されたヒトおよび動物細胞、ならびに抗原、抗体および核酸などの免疫学
的に活性な低分子および高分子化合物が含まれる。本発明によるポリビニルアル
コール系シラン化キャリア材料で極めて希薄な溶液からさえ選択的に単離するこ
とができる核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡが特に好ましく、ＤＮＡが最も好ま
しい。
【００２４】 本発明の意味に含まれる試料は、例えば血液、血清、唾液、尿、脳脊髄液、喀
痰、大便、穿刺液などの臨床試料ならびに骨髄試料である。試料はまた、環境分
析、食品分析または分子生物学的研究の分野、例えば細菌培養液、食細胞溶解物
（ｐｈａｇｏｌｙｓａｔｅｓ）および例えばＰＣＲで用いられる増幅工程に由来
する生成物からも得られる。
【００２５】 本発明による方法を用い、天然または修飾生体材料を単離することができる。
天然生体材料とは、天然に存在する生体材料と比べて構造が不可逆的に変化して
いない材料と理解すべきである。しかしながら、このことは、試料の他の成分を
改変することを排除するものではない。例えば、細胞を単離しなければならない
場合に、細胞を取り囲む培地は改変してよいが、細胞それ自体は改変されてはな
らない。核酸を単離しなければならない場合にも、核酸は天然の形態で単離しな
ければならず、すなわち切断し、あるいは反応性基のカップリングによって修飾
してはならない。したがって、用語「天然生体材料」には特にビオチン化核酸は
含まれない。天然生体材料の例には、ファージＤＮＡまたは血液由来の細胞性核
酸が含まれる。
【００２６】 修飾生体材料には、自然状態では天然に存在しない材料、例えば、反応性のも
しくは検出可能な基または固定化を可能にする基を結合させることによって修飾
された核酸、例えばビオチン化核酸が含まれる。
【００２７】 ある場合には、いかなる前処理もなく本発明による単離方法において該試料を
用いることができる。しかしながら、多くの場合には、適切な方法によって試料
を分解して試料中に含まれる生体材料を放出させる。試料を分解する方法は当業
者には知られており、化学的、酵素的または物理的性質でよい。これらの材料の
組合せも可能である。
【００２８】 この場合、異なる微生物には異なる方法がより適していることがあるが、以下
に列挙する各々の方法が原則として適している。
【００２９】 界面活性剤、例えばＳＤＳ、ＬｉＤＳまたは適当な緩衝液中のサルコシルを用
いる溶解、例えばグアニジン塩酸塩（ＧＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（Ｇ
ＴＣ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、過塩素酸ナトリウムなどのカオトロープ
（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の使用、機械的破壊、例えば、フレンチプレス、超音波
による破壊、ガラスビーズ、アルミニウムによる、または液体窒素中の粉砕、酵
素的溶解、例えばリゾチーム、プロテイナーゼ、プロナーゼもしくはセルラーゼ
または溶解用として市販されている酵素の他のうちの１種による溶解、バクテリ
オファージまたはウイルス感染による細胞の溶解、凍結乾燥、浸透圧衝撃、マイ
クロ波処理、温度処理、例えば加熱もしくは煮沸、または冷凍、例えばドライア
イスもしくは液体窒素中、および解凍、アルカリ性溶解。
【００３０】 上述のように、上述の方法はすべて、従来の技術から十分によく知られている
標準の溶解技法であり、いずれの手順も、またはそれらの組合せも使用すること
ができる。
【００３１】 例えば、カオトロープと界面活性剤の組合せは、細菌細胞に特に有効である。
したがって、溶解に適当な試剤の例には、ＧＴＣまたはＧＨＣｌなどのカオトロ
ープ、およびＳＤＳまたはサルコシルなどの界面活性剤が含まれる。溶解用のこ
れらの薬剤は、水溶液または緩衝溶液、すなわちいわゆる溶解緩衝液中に存在す
ることができる。トリス、トリシンまたはリン酸緩衝液などの適当ないずれの緩
衝液も緩衝液として使用することができる。あるいは、溶解試剤を別々に加えて
もよい。溶解試剤の適当な濃度および量は、当該の系、細胞のタイプ等によって
異なり、当業者が決定することができるが、例えば、ＧＴＣ、ＧＨＣｌまたはＮ
ａＩまたは過塩素酸ナトリウムなどのカオトロープを２Ｍ〜７Ｍ、ＮａＯＨなど
のアルカリ試剤を０．１Ｍ〜１Ｍまたは界面活性剤０．１〜５０重量％（重量／
体積）の範囲の濃度で使用することができる。したがって、この種類の溶解緩衝
液の例には、４Ｍ ＧＴＣおよび１％（重量／体積）サルコシルの水溶液が含ま
れる。
【００３２】 異なる溶解系には従来の技術で知られている異なるインキュベーション条件が
適していることがある。例えば、界面活性剤および／またはカオトロープを含有
する溶解緩衝液の場合には、インキュベーションを室温またはより高温、例えば
３７〜６５℃で行うことができる。同様に、インキュベーション時間も数分、例
えば５分〜数時間、例えば１〜２時間となることがある。ＧＴＣ／サルコシル溶
解緩衝液と細菌細胞の場合には、例えば６５℃で１０〜２０分間のインキュベー
ションで十分であることが分かっているが、必要に応じて変更することもできる
。酵素的溶解、例えばプロテインキナーゼＫなどを用いる場合には、より長い処
理時間、例えば一夜必要なこともある。
【００３３】 生体材料から核酸を単離するには、修飾核酸の場合には、該修飾を示す核酸の
基を介する結合、例えばストレプトアビジンで修飾された表面との結合を介する
ビオチンが可能である。しかしながら、特に核酸に関しては、キャリアと核酸の
直接結合が好ましい。というのは、とりわけ核酸の修飾が必要でなく、天然の核
酸でも結合できるからである。本発明によれば、シラン化ポリビニルアルコール
系磁性キャリア材料を使用することにより、たとえ試料が極めて希釈な溶液中お
よび／または他の生体材料との混合物中に核酸を含んでいても選択的かつ効率的
に行われる。本発明によるキャリア材料と天然核酸との結合は、従来技術におけ
る方法と同様にして行うことができる。
【００３４】 結合は、カオトロピック塩の存在下で、これらの塩が２〜８ｍｏｌ／ｌ、好ま
しくは４〜６ｍｏｌ／ｌの濃度で行うことが好ましい。カオトロピック塩は、例
えばヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、イ
ソチオシアン酸グアニジニウムまたは塩酸グアニジニニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎ
ｉｎｉｕｍ）である。しかし、結合はこれらの化合物に限定されるものではない
。
【００３５】 単離に関しては、試料をキャリア材料、好ましくは粒子に接触させ、結合に十
分な時間インキュベートする。核酸に関しては、１０秒〜３０分のインキュベー
ション時間が好都合である。
【００３６】 核酸の単離に関しては、ビーズ状または球状の形状を有し粒径が０．２〜５０
μｍ、好ましくは０．５〜５μｍの範囲にあり、サイズ分布が極めて狭い、好ま
しくはシラン化された、磁性粒子を使用することが好ましい。
【００３７】 インキュベーションに続いて、生体材料、好ましくは核酸を試料液から分離す
る。これは一般に、本発明による磁性粒子に結合した核酸を磁場を用いて分離す
ることによって行われる。例えば、インキュベーションを行った容器の壁に磁性
粒子を引きつけることができる。これに続き、磁性粒子と結合しなかった試料の
内容物と共に液体を除去することができる。この除去は、インキュベーションを
行った容器のタイプによって異なる。液体の除去に適したステップは、例えば液
体のピペットによる採取またはサイフォンによる吸い上げである。
【００３８】 磁性シラン化キャリア材料は生体試料由来の核酸と極めて選択的に結合し、生
じる他の生体材料によるキャリア材料の汚染もないことから、洗浄段階を著しく
減らすことができる。
【００３９】 所望の場合には、荷電磁性粒子を洗浄液で１回または数回洗浄することができ
る。洗浄液は、できることなら粒子表面から生体材料、例えば核酸の脱離が起き
ず、どの汚染物質もできるだけよく洗い落とされるように選択する。この洗浄段
階は、洗浄液を荷電粒子と共にインキュベートすることによって行うことが好ま
しく、処理された粒子を、例えば振とうするか最初の磁場と同一でない磁場をか
けることによって再懸濁することが好ましい。汚染した洗浄液は、核酸の単離後
に残る試料液と全く同一の方法で除去することが好ましい。
【００４０】 洗浄液としては、従来のいかなる洗浄緩衝液または他のいかなる適当な媒質も
使用することができる。一般的に、例えばｐＨ８．０の１０ｍＭトリスＨＣｌ／
１０ｍＭ ＮａＣｌなどの低イオン強度から中イオン強度の緩衝液が好ましい。
他の洗浄用標準媒質、例えば７０％エタノールなどのアルコールを含有する媒質
も使用することができる。
【００４１】 磁性粒子を使用すると、単に粒子の磁気的凝集、媒質と結合する核酸の除去、
洗浄溶剤の添加、および必要なたびごとの粒子の再凝集だけで簡便な洗浄段階が
可能になる。
【００４２】 核酸単離法および所望の各洗浄段階後、該当する場合には、核酸を運ぶキャリ
アをいずれか適当な媒質、例えば水または低イオン強度の緩衝液に移し、例えば
再懸濁または浸漬することができる。
【００４３】 最後の洗浄段階後、磁性粒子の短い乾燥段階を真空中または液体の蒸発（を可
能にすること）によって行うことができ、アセトンで前処理することも可能であ
る。当業者が理解しているように、上述の洗浄および乾燥段階は、核酸の精製お
よび／または単離中だけでなく、前述の他の生体材料の精製および／または単離
についても行うことができる。
【００４４】 キャリアおよび後続のプロセシングの性質によっては、キャリアから核酸を脱
離させることが望ましい場合と、キャリアから核酸を脱離させないことが望まし
い場合がある。特に本発明による磁性粒子などの固体キャリアの場合には、多く
の場合、例えばＰＣＲまたは他の増幅方法において核酸をキャリアから溶離せず
に直接使用することがある。さらに、多くのＤＮＡ検出法または同定法にも溶離
は必要でない。というのは、ＤＮＡが偶発的に球の表面と接触して水素結合また
はイオン結合または他の力によって多くの点で結合することがあっても、オリゴ
ヌクレオチドとのハイブリッド形成および増幅にとって十分なＤＮＡの長さがあ
るからである。
【００４５】 天然核酸からなる生体材料の場合には、本発明に従って低塩含量の溶離緩衝液
により粒子から核酸を取り外すことができる。この種の緩衝液はＡｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７５巻、１９６〜２０１ページ（１９８
８年）で知られている。低塩含量の溶離緩衝液としては特に、塩含有量が０．１
ｍｏｌ／ｌ未満の緩衝液が使用される。溶離緩衝液がトリスＨＣｌを含有するこ
とが特に好ましい。脱塩水も特に適している。
【００４６】 所望の場合には、ＤＮＡからＲＮＡを除去することも可能であり、ＤＮＡ分離
段階の前にＲＮＡの破壊を、例えばＲＮＡｓｅまたは例えばＮａＯＨなどのアル
カリを添加することにより行うこともできる。
【００４７】 本発明の他の主題は、核酸、好ましくはＤＮＡの、本発明による表面修飾され
たシラン化磁性キャリア材料の使用による精製および／または単離である。
【００４８】 本発明の他の主題は、本発明によるキャリア材料、好ましくはビーズ状または
球状の細かく分散した粒子の形態の材料、および核酸を、好ましくは生体試料か
ら単離するのに適した溶液を含むキットである。
【００４９】 本発明による核酸を単離する方法はまた、体液または組織から細胞を免疫磁気
的に分離した後で行ってもよい。このような場合、試料を、抗原に対する抗体が
細胞上に固定化されている本発明による上述の磁性粒子と共に、例えば振とうし
ながらインキュベートすることができる。磁場をかけた後、１回または複数の洗
浄段階を食塩水洗浄液で行う。この方法で、所望の細胞が結合した粒子が得られ
る。最後に結合した細胞を食塩水緩衝液に再懸濁する。好ましい実施形態では、
この食塩水緩衝液はカオトロピック塩溶液であるため、核酸は細胞から放出され
る。
【００５０】 本発明による上述の細胞単離と本発明による既述の核酸単離を、好ましくは本
発明による磁性キャリア材料上の核酸の天然形態、好ましくは粒子形態で組み合
わせると、細胞を含む試料から核酸を単離する特に有利な方法となる。この実施
形態の利点は、その簡単さ、高い感度および選択性、ならびに自動化の容易さで
ある。
【００５１】 次に、本発明による方法の結果として単離される生体材料を希望に応じてさら
に使用することができる。例えば、様々な酵素反応の基質として使用することが
できる。核酸の場合には、引用例はシークエンシング、放射性または非放射性マ
ーキング、その中に含まれる１個または複数の配列の増幅、転写、有標の特別な
核酸とのハイブリッド形成、翻訳または連結反応である。本発明による方法の利
点の一つは、生体材料、特に核酸の液体からの分離が極めて簡単なことである。
【００５２】 さらに実施例を参照しながら本発明を以下に説明するが、実施例は発明の一般
的概念を限定するものではない。
【００５３】 実施例１ １ａ）シラン化 粒径０．５〜１μｍの超常磁性ポリビニルアルコール粒子５５ｍｇを反応容器
中の酢酸ナトリウムの水溶液（濃度１００ｍＭ、ｐＨ＝５．５）２．５ｍｌに懸
濁し、油浴中で９０℃の温度まで加熱した。次いで、テトラメトキシシラン（Ｆ
ｌｕｋａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）２５μｌを反応容器に加え、反応混合物を
振とうしながら２時間インキュベートした。２時間が経過した後、磁性キャリア
材料をいずれの場合も蒸留水３０ｍｌで３回洗浄して水に再懸濁した。
【００５４】 １ｂ）ＤＮＡの単離 天然ラムダＤＮＡ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｉｄｄｅｒａｕ）１
μｇの単離を実施例１ａ）に従ってシラン化した粒子５０μｇを用いて行った。
【００５５】 粒子５０μｇを７Ｍ ＮａＣｌＯ４２５０μｌに懸濁した。次いで、このよう
にして得られた懸濁液を水１００μｌ中にラムダＤＮＡ１μｇと一緒にマイクロ
リットル容器に加えた。次いで、この容器の内容物を混ぜ、室温で５分間インキ
ュベートした。インキュベーション後、磁気選別機（ｃｈｅｍａｇｅｎ ＡＧ、
Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、ＦＲＧ）を用いて粒子を分離した。上清を捨て、いずれ
の場合も粒子を７０％エタノール洗浄液５００μｌ中で３回洗浄し、毎回の洗浄
工程後に粒子を磁気的に分離して上清を捨てた。最後の洗浄工程後、粒子を空気
中で５分間乾燥した。
【００５６】 次いで、反応容器中で粒子を１０ｍＭトリアミノメタン塩酸塩（トリスＨＣｌ
）溶液（ｐＨ８．０）３５μｌに再懸濁し、時々振とうさせながら水浴上１０分
間５５℃の温度でインキュベートした。次いで、上清から粒子を分離し、上清を
清浄なマイクロリットル容器に移した。
【００５７】 次いで、溶出液１５μｌを着色した１．５％アガロースゲル（Ｇｅｌｓｔａｒ
（登録商標）、ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に添加した。次いで、ＴＢＥ
緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋａｒ
ｌｓｒｕｈｅ）を用いて電気泳動を行った。
【００５８】 ゲル電気泳動の評価は、本発明によるシラン化磁性キャリア材料を用いて単離
されたＤＮＡの強く明確に検出できるシグナルを示した。
【００５９】 実施例２ 比較実施例 ＤＮＡの単離 天然ラムダＤＮＡ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｉｄｄｅｒａｕ）１
μｇの単離を、シラン化しなかった実施例１ａ）による磁性ポリビニルアルコー
ル粒子５０μｇを用いて行った。
【００６０】 粒子５０μｇを７Ｍ ＮａＣｌＯ４２５０μｌに懸濁した。次いで、このよう
にして得られた懸濁液を水１００μｌ中のラムダＤＮＡ１μｇと一緒にマイクロ
リットル容器に加えた。次いで、この容器の内容物を混ぜ、室温で５分間インキ
ュベートした。インキュベーション後、磁気選別機（ｃｈｅｍａｇｅｎ ＡＧ、
Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、ＦＲＧ）を用いて粒子を分離した。上清を捨て、いずれ
の場合も粒子を７０％エタノール洗浄液５００μｌ中で３回洗浄し、毎回の洗浄
工程後に粒子を磁気的に分離して上清を捨てた。最後の洗浄工程後、粒子を空気
中で５分間乾燥した。
【００６１】 次いで、反応容器中で粒子を１０ｍＭトリスＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）３５μ
ｌに再懸濁し、時々振とうさせながら水浴上１０分間５５℃の温度でインキュベ
ートした。最後に、磁気選別機中で上清から粒子を分離し、上清を清浄なマイク
ロリットル容器に移した。
【００６２】 次いで、溶出液１５μｌを着色した１．５％アガロースゲル（Ｇｅｌｓｔａｒ
（登録商標）、ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に添加した。次いで、ＴＢＥ
緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋａｒ
ｌｓｒｕｈｅ）を用いて電気泳動を行った。
【００６３】 ゲル電気泳動の評価は、非シラン化キャリア材料を用いて単離されたＤＮＡの
弱くほとんど検出できないシグナルを示した。
【００６４】 実施例３ プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ水溶液、Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ、Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇ）２μｌ、次いで溶解緩衝液（１Ｍグアニジニウム塩酸塩、１０ｍＭ
トリスＨＣＬ、６％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７）１００μｌを、エチレ
ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理したヒト全血１０μｌに加えた。混合物を
４５℃で１５分間インキュベートし、次いで実施例１ａ）によるシラン化磁性粒
子６００μｇおよび結合緩衝液（９０％エタノール、１００ｍＭトリスＨＣｌ、
ｐＨ７）３００μｌに加えた。予めよく混ぜた懸濁液を室温で１０分間インキュ
ベートした後、磁気選別機（ｃｈｅｍａｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、
ＦＲＧ）中で磁性粒子を磁気的に分離し、上清を捨てた。粒子に結合したＤＮＡ
をいずれの場合も８０％イソプロパノール１ｍｌで３回洗浄し、次いで残留する
イソプロパノールを除去するために空気中で１０分間乾燥した。これをＴＢＥ緩
衝液３０μｌ中に再懸濁し、６５℃で１０分間インキュベートした。磁気的分離
後、溶出したＤＮＡ溶液を分離し、ＰＣＲ技術を用いて増幅を行った。
【００６５】 実施例４：全血５ｍｌからのゲノムＤＮＡの単離 全血（ＥＤＴＡ安定化）５ｍｌを５０ｍｌの反応容器中で溶解緩衝液（１．２
Ｍグアニジン塩酸塩、３０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７、３０ｍＭ ＥＤＴＡ、１
０％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）およびＦｌｕｃａ製の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００（登録商標））６．２５ｍｌと混ぜ、室温で５分間インキュベートした。
次いで、実施例１からの修飾粒子６００μｌおよび結合緩衝液（６０％エタノー
ル、１．２Ｍ ＮａＣｌＯ４、０．２Ｍ酢酸ナトリウム）１８ｍｌを加えた。室
温で５分間インキュベートした後、磁気的分離後に上清を捨てた。次いで、粒子
を洗浄緩衝液Ａ（３０％エタノール、１．１Ｍ ＮａＣｌＯ４、０．１５Ｍ酢酸
ナトリウム）３０ｍｌで洗浄し、いずれの場合も６０％エタノール３０ｍｌで２
回洗浄し、次いで水４０ｍｌで短時間洗浄した。最後の洗浄液を分離した後、５
５℃における５分間のインキュベーションにより１０ｍＭトリスＨＣｌ１ｍｌ中
で溶離を行った。単離したゲノムＤＮＡは、例えばＰＣＲで直接用いることがで
きる。
【００６６】 実施例５：ＰＣＲ増幅産物の精製 細菌および細菌ＤＮＡと結合する磁性ポリビニルアルコール系粒子を含むキッ
ト、いわゆるＢｕｇｓ’ｎ Ｂｅａｄｓ Ｋｉｔ（ｃｈｅｍａｇｅｎ ＡＧ製の
Ｍ−ＰＶＡ ＤＮＡ ２００ Ｋｉｔ）を用いて大腸菌（Ｋ１２）から単離した
ゲノムＤＮＡのｍａｌＢ領域の５９５ｂｐＤＮＡ断片を、ＰＣＲ（Ｃａｎｄｒｉ
ａｎ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１２巻、３３９ページ
、１９９１年に対応するプライマーおよび条件）で増幅した。ＰＣＲ産物５０μ
ｌを実施例１からの粒子懸濁液１６μｌおよび結合緩衝液（９０％エタノール、
１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７）１００μｌと混ぜた。５分間インキュベート
した後、磁気的に分離し、上清を捨てた。いずれの場合も６０％エタノール４０
０μｌで２回洗浄し、洗浄液を完全に分離した後、開放容器中で８分間乾燥した
。次いで、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）３０μｌに再懸濁し、５５℃で
５分間インキュベートした後、上清および精製されたＤＮＡ増幅物を磁性粒子か
ら分離し、新しい容器に移した。
【００６７】 実施例６：大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単離 細菌培養液（プラスミドｐＵＣ１８の大腸菌、一夜培養）１．５ｍｌをまず１
．５ｍｌの反応容器中６０００ｇで２分間遠心分離し、上清を捨てた。細菌ペレ
ットを再懸濁緩衝液（ＴＥ緩衝液、ｐＨ８）１００μｌに再懸濁し、溶解緩衝液
（０．１Ｍ ＮａＯＨ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．２％）１００μ
ｌを加え、室温で５分間インキュベーションを行った。次いで、中和緩衝液（４
Ｍグアニジン塩酸塩、０．５Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ４．２）１４０μｌおよび実
施例１からの修飾粒子２０μｌを加えた。室温で５分間インキュベートした後、
磁気的分離後に上清を捨てた。次いで、粒子を洗浄緩衝液Ａ（３０％エタノール
、１．１Ｍ ＮａＣｌＯ４、０．１５Ｍ酢酸ナトリウム）５００μｌで洗浄し、
次いで７０％エタノール５００μｌで洗浄した。最後の洗浄液を分離した後、粒
子を空気中で６分間乾燥し、５５℃における５分間のインキュベーションにより
１０ｍＭトリスＨＣｌ５０μｌ中で溶離した。
【００６８】 実施例７：血清からのウイルスＤＮＡ（Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＢＶから）の単
離 Ｂ型肝炎陽性患者からの血清２００μｌを１．５ｍｌの反応容器中で溶解緩衝
液（１．２Ｍグアニジン塩酸塩、３０ｍＭトリスＨＣｌ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ、
１０％Ｔｗｅｅｎ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）と混ぜ、室温で５
分間インキュベートした。次いで、実施例１からの修飾粒子３０μｌおよび結合
緩衝液（６０％エタノール、１．２Ｍ ＮａＣｌＯ４、０．２Ｍ酢酸ナトリウム
）６００μｌを加えた。室温で５分間インキュベートした後、磁気的分離後に上
清を捨てた。次いで、粒子を洗浄緩衝液Ａ（３０％エタノール、１．１Ｍ Ｎａ
ＣｌＯ４、０．１５Ｍ酢酸ナトリウム）５００μｌで洗浄し、次いで７０％エタ
ノール５００μｌで洗浄し、次いで水６００μｌで短時間洗浄した。最後の洗浄
液を分離した後、５５℃で５分間インキュベートすることにより１０ｍＭトリス
ＨＣｌ１ｍｌ中で溶離を行った。単離されたウイルスＤＮＡは、特異的なプライ
マーと共にＢ型肝炎ウイルスの診断に、例えばＰＣＲで直接使用することができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｅ Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｃ０８Ｌ 29:04 Ｚ 30/88 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ０８Ｌ 29:04 Ｂ０１Ｄ 35/06 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＯ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アー・ブラサード， ロータル ドイツ連邦共和国， アーヘン 52066， バッハシュトラーセ 58 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 HA03 4D017 AA11 BA03 CA14 CB01 DA03 4F073 AA32 BA17 BA52 BB01 BB02 EA01 EA52 EA60 EA64

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 その表面が少なくとも部分的にシラン化され、場合によって
    は生体分子と結合する親和性リガンドを備えている、磁性ポリビニルアルコール
    キャリア材料。
  2. 【請求項２】 キャリア材料が強磁性または超常磁性であることを特徴とす
    る、請求項１に記載のポリビニルアルコールキャリア材料。
  3. 【請求項３】 キャリア材料がヒドロゲルの形態で存在することを特徴とす
    る、請求項１または２に記載のポリビニルアルコールキャリア材料。
  4. 【請求項４】 キャリア材料がビーズ状または球状粒子の形態で存在するこ
    とを特徴とする、請求項１〜３の一項に記載のポリビニルアルコールキャリア材
    料。
  5. 【請求項５】 粒子が０．２〜５０μｍ、好ましくは０．５〜５μｍの粒径
    を有することを特徴とする、請求項４に記載のポリビニルアルコールキャリア材
    料。
  6. 【請求項６】 キャリア材料がフィルタまたは膜の形態で存在することを特
    徴とする、ポリビニルアルコールキャリア材料。
  7. 【請求項７】 ポリビニルアルコールキャリア材料が有機シラン化合物で変
    換されることを特徴とする、請求項１〜６の一項に記載の表面修飾磁性ポリビニ
    ルアルコールキャリア材料の製造方法。
  8. 【請求項８】 使用するシラン化合物が、一般式（Ｉ） Ｘｑ−Ｓｉ−（ＯＲ）４−ｑ （Ｉ） ［上式で、 ｑは、整数０〜３を表し、 Ｒは、同一または異なり、水、アルキル残基、好ましくはＣ１〜Ｃ６の、特に好
    ましくはＣ１〜Ｃ２のアルキル残基、アリール残基、好ましくはフェニル残基を
    表し、 Ｘは、同一または異なり、水素、アルキル残基、好ましくはＣ１〜Ｃ２のアルキ
    ル残基、アリール残基、好ましくはフェニル残基、またはハロゲン、好ましくは
    塩素を表す］ または一般式（ＩＩ）の少なくとも１個のシラン化合物、 （Ｙ−Ｒ１）ｑ−Ｓｉ（ＯＲ）４−ｑ （ＩＩ） ［上式で、 Ｒ、ｑは、一般式（Ｉ）について示したものと同一の意味を有し、 Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル残基、好ましくはエチレンまたはプロピレン残基
    を表し、 Ｙは、アミノ基、ジアルキルアミノ基、好ましくはジメチルジエチルアミノ基、
    ＳＨ、エポキシ基、ビニル基、好ましくは−ＣＲ２＝ＣＲ３ ２基を表す（ここで
    、Ｒ２またはＲ３は、同一または異なり、水素、アルキル残基、好ましくはＣ１ 〜Ｃ２のアルキル残基、アリール残基、好ましくはフェニル残基、またはアクリ
    ル酸残基を表す。）。］ または一般式（ＩＩＩ）の反復単位を有するポリマーシラン化合物であることを
    特徴とする、請求項７に記載の方法。 【化１】 ［上式で、 Ｒは、一般式（Ｉ）について示したものと同一の意味を有し、好ましくはメチル
    残基を表す］
  9. 【請求項９】 変換が７０〜１５０℃、好ましくは８０〜１００℃の温度で
    行われることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ポリビニルアルコールキャリア材料、好ましくはポリビニ
    ルアルコール粒子が、変換のために好ましくはｐＨが２〜７の水性媒質中に懸濁
    されることを特徴とする、請求項７〜９の一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ポリビニルアルコールキャリア材料、好ましくはポリビニ
    ルアルコール粒子が、変換のために疎水性有機溶媒中に懸濁されることを特徴と
    する、請求項７〜９の一項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 好ましくはポリビニルアルコールキャリア材料とシラン化
    合物の混合による変換が、１分〜４８時間の間行われることを特徴とする、請求
    項７〜１１の一項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ポリビニルアルコールキャリア材料の表面上のＯＨ基が１
    ．２〜１．８当量のシラン化合物で変換されることを特徴とする、請求項７〜１
    ２の一項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 一般式Ｉ〜ＩＩＩのシラン化合物による変換後、ポリビニ
    ルアルコールキャリア材料が、場合によっては反応媒質からの分離および精製の
    後に、一般式ＩＩのシラン化合物で再び変換されることを特徴とする、請求項７
    〜１３の一項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 シラン化ポリビニルアルコールキャリア材料が、生体分子
    と結合する親和性リガンドで変換されることを特徴とする、請求項７〜１４の一
    項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 請求項３〜５に記載のポリビニルアルコール粒子、または
    請求項７〜１５に記載の方法に従って得られるポリビニルアルコール粒子からク
    ロマトグラフ分離するためのカラム充填物。
  17. 【請求項１７】 請求項１５に従って得られるポリビニルアルコールキャリ
    ア材料、好ましくは磁性粒子が、生体材料の固定化および分離に使用されること
    を特徴とする、生体材料の単離方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜６に記載の、または請求項７〜１４に従って得
    られるポリビニルアルコールキャリア材料、好ましくは磁性粒子が、核酸の固定
    化および分離に使用されることを特徴とする、生体試料からの核酸の単離および
    ／または精製の方法。
  19. 【請求項１９】 生体試料が核酸の抽出に適した緩衝溶液と混合されること
    を特徴とする、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 抽出の前に生体試料がリボ核酸（ＲＮＡ）を破壊する試剤
    、好ましくはＲＮＡｓｅまたはアルカリと混合されることを特徴とする、請求項
    １９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜６の一項に記載のポリビニルアルコールキャリ
    ア材料、または請求項７〜１５の一項に従って得られるポリビニルアルコールキ
    ャリア材料、リボ核酸の破壊用溶液、およびデオキシリボ核酸の抽出用溶液を含
    むデオキシリボ核酸の単離用キット。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜６の一項に記載のポリビニルアルコールキャリ
    ア材料、または請求項７〜１５の一項に従って得られるポリビニルアルコールキ
    ャリア材料、および核酸の抽出用溶液を含む核酸の単離用キット。
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