DE4127657B4

DE4127657B4 - Perlförmige Polyvinylalkoholgele für die Aufreinigung und Auftrennung biologischer Flüssigkeiten, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE4127657B4
Application number: DE19914127657
Authority: DE
Inventors: Detlef Dr. Müller-Schulte
Original assignee: Chemagen Biopolymer Technologie AG
Current assignee: Chemagen Biopolymer Technologie AG
Priority date: 1991-08-21
Filing date: 1991-08-21
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2011-08-22
Also published as: DE4127657A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung perlförmiger Polyvinylalkoholgele mit Partikelgrößen zwischen 1 und 3000 um, dadurch gekennzeichnet, daß
1.1 Polyvinylalkohol (PVAL) mit einem Polymerisationsgrad von 300 bis 6000 in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und einem Polyvinylalkohol (PVAL) lösenden organischen Lösungsmittel gelöst wird;
1.2 gegebenenfalls die Viskosität der Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung durch die Bemessung der Menge an Wasser oder der Mischung aus Wasser und organischem Lösungsmittel auf einen Wert von 5 bis 2000 centipoise bei 20°C eingestellt wird;
2.1 die Polyvinylalkohol enthaltende Lösung 1.2 in einer mit dem Polyvinylalkohol enthaltenden Lösungsmittel nicht mischbaren, bei 20°C eine Viskosität von 10–200 centipoise aufweisenden organischen Phase, bestehend aus Pflanzenöl, Paraffinöl, Mineralöl, gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren sowie Mischungen derselben, und ggf. mit 1–20 Vol.-% eines organischen Lösungsmittels, das mit der Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung nicht mischbar ist, ohne Zugabe eines Emulgators und ohne Zugabe eines Salzes durch Rühren bei einer vorgegebenen Rührgeschwindigkeit von etwa...

Description

Perlförmige Trägermedien auf der Basis von PVAL sind aus den Patentschriften DE-OS 29 43 193 , DE-OS 3344 912 , Japanisches Patent 5865,735 , US. Patent 41 04 208 sowie DE-OS 2040 106 (entsprechend JP 54-1 40421 ) bekannt. Allen Verfahren ist gemeinsam, daß sie vom Vinylacetat ausgehen, das zunächst in wäßriger Phase unter Zugabe eines bifunktionellen Vernetzers suspendiert und anschließend radikalisch polymerisiert wird. Die beschriebenen Verfahren sind technisch aufwendig, da mehrere Stunden Reaktionszeit (bis zu 100 Stunden DE-OS 3040 106 ) benötigt werden und der gebildete Polyvinylacetat erst anschließend zum PVAL verseift werden muß. Das synthetische Material besitzt je nach Vernetzungsgrad eine bestimmte Porosität. Nachteile der nach diesen Verfahren hergestellten Produkte sind einmal die mangelnde mechanische Stabilität – die Träger können nicht mit einem Magnetrührer gerührt werden –, zum anderen können Spuren von Emulgatoren oder von Polymerisationskatalysatoren in Polymeren verbleiben, die, im Kontakt mit biologischen Flüssigkeiten (z.B. Blut), ausgelaugt werden können und so zu unphysiologischen Reaktionen führen.
Ein anderes Verfahren, direkt ausgehend vom PVAL, zur Herstellung von Chromatographie-Medien ist in der DE-OS 39 00 272 beschrieben. Das dort beschriebene Verfahren geht von pulverförmigen PVAL-Festprodukten aus, die im ersten Schritt mit Epihalogenhydrinen in heterogener Phase vernetzt werden. Dieses Verfahren ermöglicht nicht die Herstellung perlförmiger Produkte und gestattet auch nicht, die Größe der Polymerträger entsprechend den chromatographischen Anforderungen zu variieren, was z.B. für den Einsatz in der Hemoperfusion Voraussetzung ist. Die Einsatzmöglichkeiten der nach o.a. Verfahren hergestellten Trägergele sind zum einen auf die reine Gelfiltration ( DE-OS 29 43 193 , DE-OS 20 40 106 , U.S. Patent 41 04 208 ) sowie auf die Affinitätschromatographie beschränkt.
Verfahren zur Herstellung von Ionenaustauschern sind in den Patentschriften US 32 77 025 ; DE-OS 20 05 407 D2 , DE Patent 20 05 408 beschrieben. Hierbei werden als Basis vorwiegend Zellulose und Dextrane verwendet, die, nachdem sie in Suspension zu perlförmigen Trägern vernetzt wurden, mit Diäthylaminoäthylhalogeniden umgesetzt werden. Die dort beschriebenen Polysaccharidderivate weisen über die mangelnden mechanischen Eigenschaften hinaus erhebliche Mängel hinsichtlich der chemischen und biologischen Stabilität auf.
Aus EP 256 293 sind Verfahren zur Herstellung vernetzter Polyvinylalkoholpartikel für chromatographische Zwecke bekannt, wobei vor der Vernetzung eine Gelbildung durch Quellung des Materials erfolgt. GB 13 77 342 beschreibt Hybrid-Ionentauscher, die durch Vernetzung vorgefertigter Inonentauscherpartikel in eine PVA-Matrix hergestellt werden. Aus EP 24 055 ist ein Verfahren zur Herstellung von Ionentauscherpartikeln auf PVAL-Basis bekannt, bei dem die wäßrige PVAL-Lösung zusammen mit einem vernetzendem Agens in einem hydrophoben Medium dispergiert wird und die Vernetzung in Suspension abläuft.
Weitere Verfahren zur Herstellung von polymeren Trägermedien entweder für die Ionenaustausch-Chromatographie oder die Gelchromatographie sind in den Patentschriften JP 5865,735 , JP 5811,046 und JP 8190,804 beschrieben. Allen Verfahren ist gemeinsam, daß sie a) für die Herstellung nur eines Trägertyps geeignet sind, b) auf die Verwendung von Emulgatoren angewiesen sind und c) als organische Phase hochgiftige Lösungsmittel wie z.B. Benzol, Toluol oder chiorierte Kohlenwasserstoffe verwenden. Diese Verfahrensweisen schränken die Verwendung obiger Medien drastisch ein und erfordern aufwendige Sicherheits- und Abfallbeseitigungsmaßnahmen.
Mangelnde mechanische Stabilität und zeitaufwendige Präparation (über 24 Stunden) sind auch die Nachteile eines im Japanischen Patent 6245,637 beschriebenen Verfahrens, bei dem PVAL Beads durch mehrstündiges (20 Stunden) Ausfrieren bei minus 20°C aus einer Ölsuspension gewonnen werden. Die so gewonnenen Medien sind jedoch wegen ihrer partiellen Löslichkeit nur für Mikroeinkapselungen geeignet. Anwendungen für die Chromatographie sind hierbei ausgeschlossen. Träger für die Affinitätschromatographie auf der Basis von Silikaten sind beschrieben in: DE-OS 27 08 974 und DE-OS 26 27 063 . Silikate adsorbieren jedoch aufgrund ihrer chemischen Struktur Proteine unspezifisch und sind daher hydrophilen organischen Produkten unterlegen (Y. Yanagihara et al. DE-OS 3040 106 A1 ). Des weiteren ist auch hier die Synthese und die Derivatisierung sehr aufwendig (mehr als 12 Stunden Umsetzung unter teilweiser Druckanwendung).
Man verwendet zur Kopplung von Liganden oder Antikörpern Alkyl- bzw. Arylsulfonester, deren Handhabung aufwendig und teuer ist. Man benötigt für die Aktivierung absolut wasserfreie Medien und Lösungsmittel, so daß diese Verfahren für eine technische Anwendung kaum in Frage kommen. Darüber hinaus sind Träger auf Silikatbasis Alkalihydrolyseanfällig, insofern ist ihr Einsatz in der Chromatographie eingeschränkt.
Diese Nachteile der oben beschriebenen Verfahren und Produkte können durch das erfindungsgemäße Verfahren nach Anspruch 1, bei dem direkt vom PVAL ausgangen wird und dieser in gelöster wäßriger Phase in einer organischen Phase suspendiert und gleichzeitig chemisch vernetzt wird, sowie die nach diesem Verfahren hergestellten perlförmigen Polyvinylalkoholgele und die Verwendung der erfindungsgemäßen Gele überwunden werden.
In der U.S. Patentschrift 43 06 031 wird die Herstellung eines schwach saurer Kationenaustauschers auf der Basis von PVAL beschrieben. Dabei wird der in Wasser gelöste PVAL in einer organischen Phase, bestehend aus chlorierten Kohlenwasserstoffen und Toluol suspendiert und mit Glutaraldehyd oder Epichlorhydrin zu perlförmigen Trägern vernetzt. Anschließend wird das Produkt mit Glyoxylsäure zu einem schwach sauren Ionenaustauscher umgesetzt. Auch dieses Verfahren erfordert sehr lange Reaktionszeiten (bis zu 24 Stunden), ferner chlorierte Lösungsmittel als organische Phase sowie Emulgatoren, ohne die eine Kugel- bzw. Periform nicht realisiert werden kann. Allen zitierten Verfahren ist gemeinsam, daß sie nicht geeignet sind zur Herstellung makropartikulärer Hemoperfusions-Träger (> 500 μm) oder stark saurer bzw. basischer Ionenaustauscher. Um eine bestimmte Porosität zu erreichen, werden bei den genannten Verfahren Salze zugefügt, die nach der Peribildung erst ausgelaugt werden müssen.
Es konnte nun überraschenderweise gezeigt werden, daß bei Verwendung von organischen Medien, die eine bestimmte Viskosität aufweisen – vorzugsweise 30 bis 80 centipoise –, sich die Verwendung von Emulgatoren, salzartiger Zusätze oder die Verwendung von organischen leicht siedenden Lösungsmitteln gänzlich erübrigt Hierfür werden Pflanzenöle wie z.B. Rapsöl, Olivenöl, Sojabohnenöl oder Paraffinöl sowie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren wie z.B. Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure sowie Mischungen derselben verwendet.
Auch Fettsäuren oder Fettsäuregemische, die bei Zimmertemperatur fest sind, sich jedoch bei 30 bis 60°C verflüssigen lassen und die die entsprechende Viskosität aufweisen, können für diesen Zweck verwendet werden. Vorzugsweise wird die organische Phase in einem zwei- bis vierfachen Volumenüberschuß, bezogen auf die wäßrige Phase, eingesetzt. Die Vernetzung der suspendierten Polymerlösung kann mit solchen Dialdehyden bewerkstelligt werden, die wasserlöslich sind. Dazu gehören z.B. Glutardialdehyd, Glyoxal, Therephthaldialdehyd und Pentadial. Wie aus der Literatur bekannt, wird die Acetalvernetzungsreaktion durch Mineralsäuren katalysiert, wobei die Acetalbildungsgeschwindigkeit proportional zur Säurekonzentration ansteigt. Bei dem vorliegenden Verfahren haben sich Konzentrationen von 0.1 bis 1 normal als vorteilhaft erwiesen. Sie ermöglichen unter den gewählten Versuchbedingungen bei Raumtemperatur eine befriedigende Abreaktion nach bereits 60 Minuten. Die Vernetzung mit Therephthalaldehyd führt in der Regel zu etwas festeren Gelen, da dieser Aldehyd dem Gel eine höhere Steifigkeit verleiht als der flexiblere Glutaraldehyd.
Die Porosität von polymeren Trägern wurde bei den bisheri gen Verfahren im allgemeinen durch die Konzentration des Vernetzers eingestellt. In der vorliegenden Erfindung wird nun überraschenderweise gezeigt, daß die Porosität nicht allein von der Vernetzerkonzentration, sondern im besonderen Maße von dem Polymerisationsgrad des Polymeren sowie der Polymerkonzentration abhängt. Die Porosität nimmt bei vorgegebener Polymerkonzentration mit steigendem Polymerisationsgrad entsprechend der Abnahme der Knäueldichte zu. So können bei der Verwendung von Polymeren mit einem Polymerisationsgrad von unter 1000 sehr kompakte, unporöse Gele hergestellt werden, die vorwiegend für die "fast-flow" Ionenaustauschchromatographie eingesetzt werden können. Proteine mit einer Molmasse von 30.000 können dabei nicht in das Innere des Geles eindiffundieren. Dadurch findet der Stoffaustausch vorwiegend an der Trägeroberfläche statt, der einen raschen Massetransport und damit eine schnelle Proteinauftrennung gewährleistet. Träger dagegen mit einem Polymerisationsgrad über 1000 lassen sich vorteilhaft als Affinitätsmatrizes einsetzen.
Neben den erwähnten Parametern zur Regulierung der Porenstruktur kann durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln zu der wäßrigen Phase die Knäueldichte und damit die Porenstruktur beeinflußt werden. Hierfür sind vor allem solche Lösungsmittel geeignet, die das Polymerknäuel entweder quellen oder schrumpfen lassen. Zur ersteren Kategorie gehören Lösungsmittel wie z.B., Dimethylsulfoxid, Formamid, Dimethylformamid, Pyridin, Piperazin, zur letzteren Kategorie Lösungsmittel wie, Alkohole, Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan. Durch Zumischen zu der wäßrigen Phase kann die Knäueldichte des Polymeren entsprechend den Quell- oder Schrumpfeigenschaften des zugesetzten Lösungsmittels nach oben oder unten variiert werden. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, je nach Anforderung, zwischen 25 und 50 Vol% – bezogen auf die Polymerphase – organisches Lösungsmittel zuzusetzen. Besonders weitporige Gele werden durch Lösen in reinem Dimethylsulfoxid erhalten.
Durch die zusätzliche Einführung obiger Stoff- und Versuchsparameter ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Bandbreite der Polymerträgereigenschaften gegenüber früheren Verfahren deutlich zu erweitern und so den verschiedenen Anforderungen besser anzupassen.
Ein wichtiger Parameter chromatographischer Medien stellt die Teilchengröße (Beadgröße) dar. Der Trend innerhalb der Chromatographie geht heute dahin, immer kleinere Partikel zu verwenden, um mit Hilfe der vergrößerten Oberflächen zu einem rascheren Stofftransport zwischen stationärer und mobiler Phase zu gelangen. Dieses Ziel der "fast-flow"-Chromatographie wird heute durch den Einsatz von Harzen mit Teilchengrößen unter 10 μm Rechnung getragen. Andere Einsatzgebiete wie z.B. das Zellcounting, Radioimmunoassay, Zellseparation erfordern sogar Teilchengrößen um 1 μm. Für den Einsatz im Bereich der Hemoperfusion werden dagegen Beadgrößen von über 500 μm benötigt. Diese Grobkörnigkeit ist deswegen erforderlich, um die beim Durchfluß des Blutes auftretenden Druckkräfte weitestgehend zu minimieren, da andernfalls Hemolyse und Plättchenverluste auftreten können.
Für alle oben erwähnten Einsatzgebiete werden heute kommerzielle Medien angeboten, wobei für die genannten Einsatzgebiete jeweils verschiedene Matrizes zur Anwendung gelangen.
Die hier beschriebenen Verfahren ermöglichen es nun, mit denselben Ausgangsmaterialien Partikelgrößen zwischen 1 und 3000 μm herzustellen. Während bisher beschriebene Herstellunsgverfahren die Beadgrößen vorwiegend durch die Rührgeschwindigkeit beeinflussen konnten, ergibt sich bei dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren überraschend die Möglichkeit, diesen Parameter zusätzlich durch die Viskosität der Polymerlösung zu regulieren.
Bei vorgegebener Rührgeschwindigkeit nimmt die Teilchengröße mit steigender Viskosität der Polymerlösung zu. Die Viskosität ist eine direkte Funktion des Polymerisationsgrades sowie der Konzentration des Polymeren. Für Beadgrößen im Bereich von unter 100 μm werden vorzugsweise Polymerlösungen mit einer Viskosität unter 20 centipoise verwendet. Teilchengrößen über 500 μm dagegen erfordern Viskositäten von 200 bis 3000 centipoise.
Was die Polymerisationsgrade zur Regulierung der Beadgrößen anbetreffen, so werden für den Bereich unter 100 μm vorzugsweise Polymere mit einem Polymerisationsgrad unter 1000 eingesetzt. Die Konzentrationen der Polymerlösungen betragen in diesem Falle 5 bis 10 Gew%. Zur Herstellung makropartikulärer Medien (> 500 μm) sind bevorzugt Polymere mit einem Polymerisationsgrad über 1000 einzusetzen. Die Konzentrationen der Polymerlösungen liegen hierbei in der Regel zwischen 2 und 5 Gew.%. Die Rührgeschwindigkeiten betragen bei den genannten Fällen allgemein 100 bis 2000 Umdrehungen/Min. Als Rührwerke können handelsübliche KPG Rührwerke verwendet werden.
Die beschriebenen Basispolymeren können nun so modifiziert und derivatisiert werden, daß sämtliche heutzutage in der Chromatographie gebräuchlichen Matrixtypen synthetisiert werden können.
Wissenschaftlich und technologisch die wichtigsten Einsatzgebiete sind die Affinitäts- und Ionenaustausch-Chromatographie.
Für die Derivatisierung zu Ionenaustauschern bietet sich der Weg über die epoxy-aktivierten Gele an. Im ersten Derivatisierungsschritt werden die Polymerträger entweder mit Epihalogenhydrinen oder Alkylenbisepoxiden umgesetzt. Den Epoxiden bei den hier beschriebenen Verfahren und Produkte kommen somit zwei Funktionen zu: zum einen können die Epoxide als zusätzliche Vernetzer der Gele fungieren, wodurch eine hohe mechanische Stabilität bedingt wird, zum anderen kann durch nukleophile Substitution der eingeführten Epoxygruppen diese direkt zu Ionenaustauscher-, Chelating- oder Reversed-Phase-Funktionen derivatisiert werden. Diese doppelte Funktion der Epoxide zunutzen, stellt eine erhebliche Vereinfachung der Trägerherstellung gegenüber früheren Verfahren dar. Als Epoxide kommen vorzugsweise Epichlorhydrin, Epibromhydrin, Ethylenglykoldiglycidyläther, Diglycidyläther, 1.6-Hexandioldiglycidyläther zur Anwendung. Die Derivatisierung wird vornehmlich in saurem Medium unter Verwendung von z.B. Bortrifluordiäthylätherat oder Schwefelsäure oder mittels alkalischer Katalyse unter Verwendung von beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Kalziumhydroxid, üblicherweise bei einer Temperatur von 30 bis 60°C und einer Reaktionsdauer von zwei bis drei Stunden, durchgeführt. Der Substitutionsgrad der Hydroxylgruppen kann in weitem Rahmen durch die Konzentration der Epoxy-Verbindung, der Reaktionszeit und -temperatur beeinflußt werden.
Nach Einführung der Epoxygruppen in das Basispolymer kann die Umsetzung zu den verschiedenen Ionenaustauschern durch nukleophile Substitution mittels sekundärer und tertiärer Amine bewerkstelligt werden. Hierfür bieten sich z.B., Diäthylamin, Dimethylamin, Triäthylamin, Trimethyl amin oder Diäthyl-(2-hydroxypropyl)amin an. Diese Substanzen werden durch einfache Inkubation zu der Matrix zur Reaktion gebracht. Die Reaktionszeiten betragen in der Regel 6 bis 12 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 20 bis 40°C. Es entstehen so je nach Verwendung der sekundären oder tertiären Amine abgestuft schwach und stark basische Anionenaustauscher. In analoger Weise lassen sich stark und schwach saure Ionenaustauscher synthetisieren. Dazu werden die Epoxy-Träger mit entweder Alkali- oder Erdalkalisulfiten (stark saurer Austauscher) oder mit Aminocarbonsäuren (schwach saurer Austauscher) umgesetzt. Ähnlich verläuft die Derivatisierung zu Chelating-Trägern und Reversed-Phase-Trägern. Im ersteren Falle findet die Umsetzung mit Nitridotriessigsäure oder Iminodiessigsäure statt, im letzteren Falle mit längerkettigen Alkoholen oder primären Aminen, vorzugsweise mit einer Kettenlänge von 12 bis 18 Kohlenstoffatomen. Die Reaktionen finden allgemein bei einer Temperatur von 30 bis 50°C während einer Zeitdauer von 8 bis 24 Stunden statt. Die Substituenten werden in der Regel in 5 bis 10fachem Überschuß, bezogen auf den Epoxygehalt, eingesetzt. Der Epoxygehalt wird titrimetrisch mit Hilfe einer eingestellten Natriumthiosulfatlösung nach der Methode von Sundberg und Porath (J. Chromatogr., 90, 87, 1974) bestimmt. Er liegt bei den hier entwickelten Trägern zwischen 500 und 1000 μMol/g Träger.
Hinsichtlich der verwendeten Lösungsmittel bestehen keine speziellen Beschränkungen. Die Amine, meistenteils bei Raumtemperatur als Flüssigkeit vorliegend, können als solche direkt eingesetzt werden. Bei den Aminocarbonsäuren und Sulfiten bieten sich in der Regel wäßrige Lösungen an.
Die hier entwickelten Verfahrensweisen der nukleophilen Substitution der Epoxygruppen hat gegenüber den bisherigen Methoden (z.B. DE-OS 2806674 ), die Di- oder Trialkylaminohalogenide verwenden, den Vorteil der einfacheren Prozessführung und des wesentlich höheren Substitutionsgrades.
Dies bedeutet für die chromatographische Praxis eine deutlich verbesserte Kapazitätsausnutzung der Trägermedien.
Neben den oben beschriebenen Substitutionsreaktionen zur Herstellung von Ionenaustauschern z.B., können über die Epoxy-Funktion auch Biomoleküle wie Proteine, Antikörper, Enzyme, Oligosaccharide chemisch gekoppelt werden. Zur Kopplung dieser Liganden ist es vorteilhaft zunächst ein Spacermolekül in das Gel einzuführen. Dies erfüllt zwei Funktionen: Die Konformation des gebundenen Biomoleküls wird präserviert und damit dessen biologische Aktivität im gebundenen Zustand erheblich verbessert, zum anderen kann die Kopplungsausbeute deutlich gesteigert werden. Es bieten sich hierfür sowohl Polyäthylenglykole mit einer Molmasse von 200 bis 1000 – vorzugsweise 200 bis 400 – sowie Diamine in Form des Äthylendiamins oder Hexamethylendiamins an. Auch Polyäthylenimine kommen hierfür in Frage. Diese Spacer werden im ersten Reaktionsschritt an die epoxy-aktivierten Träger analog den oben beschriebenen Verfahren zur Kopplung von Aminen gebunden und im zweiten Schritt entweder mit Epighalogenhydrinen (im Falle der Polyäthylenglykol-Spacer) oder Glutaraldehyd (im Falle der Diamine) aktiviert. Die Spacer werden vorzugsweise in 5 bis 10fachem molaren Überschuß, bezogen auf den Epoxy-Gehalt, eingesetzt. Für die Aktivierung der Aminofunktion mit Glutaraldehyd bestehen keinerlei besonderen Beschränkungen, es können die bekannten Methoden wie sie in der Literatur beschrieben sind, unter Benutzung eines Phosphat-Puffers, pH 6.5 bis 8.5, angewendet werden. Die Kopplung der Biomoleküle an die aktivierten Spacer wird in der Regel in einem 0.1 bis 0.5 M Phosphat-Puffer, pH 6.5 bis 8.5, durchgeführt. Die Reaktionszeiten betragen unter Raumtemperaturbedingungen 2 bis 10 Stunden. Die Kopplungen an die epoxy-aktivierten Spacer erfolgen vorzugsweise in einem 0.1 bis 1 M Kalium-Phosphatpuffer, pH 7 bis 8.5.
Eine direkte Kopplung ohne die zusätzliche Einführung von Spacermolekülen ergibt sich überraschenderweise durch die Verwendung von polyfunktionellen Isocyanaten.
In der U.S. Patentschrift 4,177,038 ist die Aktivierung und Kopplung mittels Isocyanaten an Agarose, Dextran, Zellulose und Polyacrylamid-Träger beschrieben. Es werden durchweg aromatische Diisocyanate unter Basenkatalyse verwendet.
Aromatische Isocyanate haben jedoch den Nachteil, daß sie viel zu reaktiv sind, um z.B. mit einem Protein aus wäßriger Lösung umgesetzt werden zu können. In solchen Fällen reagiert die Isocyanatgruppe bereits mit dem Wasser zu Carbaminsäuren ab. Ein weiterer Nachteil des dort beschriebenen Verfahrens besteht in sehr aufwendigen Aktivierungsschritten. So wird in einem Fall der Isocyanat-Aktivierung eine Umsetzung mit Bromcyan vorangestellt oder es werden Polyethylenglykole und Polyethylenimine als Zwischenspacer verwendet. Diese Nachteile können in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren überraschenderweise dadurch umgangen werden, daß man die Aktivierung mittels aliphatischer Di- und Triisocyanate, die ihrerseits automatisch eine Spacerfunktion besitzen, durchführt.
Für die Aktivierung wird der getrocknete Träger mit einem 1.5 bis 5fachen Überschuß des Isocyanates, bezogen auf die Hydroxylgruppen, umgesetzt. Dabei beteiligt sich vorwiegend nur eine Isocyanat-Funktion an der Addition, so dass die Biomoleküle über die verbleibende Isocyanatgruppe kovalent gebunden werden können. Prinzipiell können alle multifunktionellen aliphatischen Isocyanate für die Aktivierung verwendet werden. Als vorteilhaft haben sich Substanzen wie: 3,5,5-Trimethyl-1-isocyanato-3-isocyanatomethylcyclohexan, 4,4'-Diisocyanatodicyclohexylmethan, 1.6-Hexamethylendiisocyanat, Diisocyanatohexansäuremethylester, Hexamethylendiisocyanat-Biuret erwiesen. Hierdurch ist die Möglichkeit gegeben, Biomoleküle auch im wäßrigen Milieu ohne zusätzlichen Spacer in hohen Ausbeuten an den Träger zu binden.
Im ersten Schritt wird das Basispolymer mit dem jeweiligen Isocyanat in einem organischen Lösungsmittel unter Zugabe eines Katalysators in Kontakt gebracht. Die Umsetzungen verlaufen sehr rasch innerhalb von 30 bis 40 Minuten bei 35 bis 45°C. Als Lösungsmittel werden inerte aprotische Medien wie, Dimethylformamid, Formamid, Dioxan, Aceton, Terahydrofuran verwendet. Einen besonders hohen Aktivierungsgrad erhält man überraschenderweise dadurch, daß die Aktivierung in Dimethylsulfoxid durchgeführt wird. Dimethylsulfoxid ist zum einen ein im Vergleich zu den Formamiden sehr stabiles Molekül, zum anderen besitzt es hohe Quelleigenschaften gegenüber dem Basispolymer. Dadurch werden Strukturbereiche für die Aktivierung und auch für die spätere Kopplung zugänglich gemacht, die bei den sonst üblichen Lösungsmitteln von vorneherein unzugänglich sind. Es wird so eine pro Trägereinheit hohe Biomolekül-Beladungsdichte und demzufolge eine optimale Ausnutzung der Trägers ermöglicht.
Die Aktivierungsreaktion verläuft unter Zugabe eines Katalysators, der, bezogen auf die eingesetzte Isocyanatverbindung, in der Regel in 0.01 bis 0.5 molarer Konzentration vorliegt. Als Katalysatoren werden solche Substanzen verwendet, die allgemein bei der technischen Polyurethansynthese Verwendung finden. Dies sind z.B. Stickstoffbasen wie Triethylendiamin, Ethylendiamin, Triethylentetramin, Dimethylbenzylamin oder Metallkatalysatoren wie Butyl-Zinn-chlorid, Zinn-II-chlorid, Zinn-octoat, Antimon-III-chlorid. Die Kopplung der Bioliganden erfolgt durch einfaches Inkubieren. Während Proteine in den entsprechenden Pufferlösungen zur Reaktion gebracht werden, hat es sich für niedermolekulare Liganden (z.B. Oligosaccharide) als vorteilhaft erwiesen, diese in einem aprotischen Lösungsmittel, wie sie oben für die Aktivierung angegeben wurden, durchzuführen. Die Reaktion läuft ohne Zugabe eines Katalysators innerhalb von 5 bis 12 Stunden bei Raumtemperatur ab.
Zusätzlich zu den klassischen Anwendungen im Rahmen der Chromatographie erschließt sich den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte durch die Möglichkeit der Verwendung makropartikulärer Trägermedien mit einer Größe über 500 μm überraschenderweise auch Einsatzgebiete wie die Hemoperfusion, die den bisher beschriebenen Verfahren verschlossen blieben.
Hauptanliegen bei der Hemoperfusion ist u.a. die selektive Abtrennung von Blutgruppen-Antikörpern oder Toxinen aus Seren oder Blut. Mit Hilfe von Oligosaccharidliganden wie sie z.B. von Lemieux beschrieben wurden (R.U. Lemieux, Chem. Soc. Rev., 1978, 7,423), die als spezifische Blutgruppendeterminanten fungieren, können Blutgruppen-Antikörper praktisch quantitativ aus dem Blut oder dem Serum entfernt werden. Für dieses Verfahren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, entweder von einem epoxy- oder isocyanat-aktivierten Gel auszugehen. Die Antikorper-Bindungskapazitäten der so gewonnenen Träger sind sehr gut, sie liegen um über 70% höher als kommerzielle Affinitätsharze wie z.B., Protein A und G Sepharose^R. Dies ist umso überraschender, als die hier beschriebenen erfindungsgemäßen Adsorbentien eine wesentlich größere Teilchendimension aufweisen als die genannten kommerziellen Affinitätsharze.
Ein weitere Anwendung für die Hemoperfusionsmedien ergibt sich auf dem Gebiet der Nierenerkrankungen. Im Verlaufe dieser Erkrankungen kommt es sehr häufig zu einer vermehrten Ausschüttung von lysosomalen Enzymen (Proteinasen). Aufgrund des vermehrten Auftretens dieser Substanzen werden Proteine u.a. des Gerinnungs-, Komplement- und Kallikrein-Systems enzymatisch abgebaut. Die dabei anfallenden Abbauprodukte sind hoch toxisch und können zum totalen Nierenversagen führen.
Die vorliegende Erfindung hat sich zur Aufgabe gemacht, Verfahren zur Abtrennung dieser Enzyme aus Blut, Serum oder Plasma zu entwickeln. Es bieten sich auch hier die Hemoperfusionsmedien mit einer Teilchengröße von über 500 μm an. Da diese Medien während des Separationsprozesses direkt mit dem Blut in Kontakt kommen, muß eine optimale Blutkompatibilität gewährleistet sein. Diese Vorraussetzung wird überraschenderweise durch den Einsatz der Gele dadurch erfüllt, daß bei der Herstellung der Polymeren gänzlich auf irgendwelche Zusätze wie Emulgatoren, Stabilisatoren oder Polymerinitiatoren verzichtet werden kann, von denen bereits Spuren in der Regel toxische bzw. unphysiologische Reaktionen hervorrufen können.
In Analogie zur Methodik der Immunaffinitäts-Chromatographie werden für die Abtrennung und Entfernung der Enzyme anti-Enzyme-Antikörper als Affinitätsliganden verwendet.
Zur Kopplung der Antikörper-Liganden wird vorzugsweise der oben beschriebene Weg über die epoxy- oder isocyanat-aktivierten Gele beschritten. In praxi kann die Hemoperfusion entweder im Batch-Verfahren durchgeführt werden, wobei das Blut für eine bestimmte Zeit mit dem Träger inkubiert und anschließend abfiltriert wird, oder das Blut wird in Art eines chromatographischen Prozesses mit definierter Flußgeschwindigkeit über eine mit dem Adsorber gefüllte Säule geleitet. Dabei werden die Enzymbestandteile automatisch an das Säulenträgermaterial gebunden. Das Eluat ist dann weitesgehend frei von lysosomaler Enzymaktivität.
Aufgrund der hervorragenden Eigenschaften des erfindungsgemäßen PVAL Geles erschließen sich seiner Verwendung weitere Anwendungen vor allem im medizinischen Bereich. Im Zuge der Behandlung von Arteriosklerose oder Hypercholesterolämie sind in den letzten Jahren alternative Verfahren zum Einsatz gelangt, deren Therapieprinzip in der extrakorporalen Abtrennung des Low Density Lipoproteins (LDL), das über 70% des vorhandenen Cholesterins enthält, besteht. Wegen der mangelnden Bindungskapazitäten der herkömmlichen Adsorber konnte diese Therapie bis dato nur mit mikropartikulären Trägern durchgeführt werden. Als Adsorber für das LDL sind vornehmlich Träger beschrieben, die entweder LDL-Antikörper, Acrylate (K. Thies et al., Artif. Organs, Vol 12, 1988, 320), Heparin ( PCT 0110409 A2 ), Aminoverbindungen ( PCT 0232875 ) oder oxäthylierte Alkohole ( US 4.098.771 ) als Liganden enthalten.
Außer den Antikörper tragenden Medien weisen alle übrigen Träger unspezifische Wechselwirkungen mit den Serum- oder Plasmabestandteilen auf, d.h. diese Adsorber arbeiten nicht sehr selektiv. Diesem Umstand wird nun in der vorliegenden Erfindung dadurch Rechnung getragen, daß an den erfindungsgemäßen PVAL Träger solche Liganden gekoppelt werden, die LDL spezifisch binden. Dazu gehören überraschenderweise Azofarbstoffe wie z.B., Sudan III, Sudan Rot B, Lipid Crimson, Sudan Schwarz B sowie Verbindungen wie:
Cholesterin, Cholsäure, Natriumcholat, Deoxycholsäure, Natriumdeoxycholat oder Prostaglandine. Diese Liganden werden vorzugsweise über die Isocyanatfunktion an den Träger gebunden. Abweichend von den oben beschrieben Verfahren zur Kopplung wasserlöslicher Peptide oder Proteine werden diese Liganden vorzugsweise in einem organischen aprotischen Lösungsmittel wie z.B., Dimethylformamid, Formamid, Pyridin, Dioxan oder Dimethylsulfoxid gebunden. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Adsorbern können die erfindungsgemäßen Träger wegen ihrer hohen Blutverträglichkeit sowie dem Umstand, daß sie auch als makropartikuläre Beads (> 500 μm) eingesetzt werden können, direkt mit dem Blut in Kontakt gebracht werden. Es entfällt somit die aufwendige Plasmaabtrennung.
Neben den klassischen chromatographischen Separationstechniken haben sich in letzter Zeit auf dem medizinischen Sektor alternative Trennverfahren etablieren können, deren Prinzip in der Abtrennung von Polymeradsorbern aufgrund magnetischer Eigenschaften besteht. Hierfür werden die gleichen Polymerharze wie z.B. für die Affinitätschromatographie oder die Immunadsorption benutzt. Durch Inkorporieren mikropartikulärer ferromagnetischer Stoffe in das Polymergel werden diesem magnetische Eigenschaften verliehen, die es nun gestatten durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes, den Träger aus der übrigen Flüssigkeit abzutrennen.
Es konnte nun überraschenderweise gezeigt werden, daß durch einfaches Zumischen von ferromagnetischen Substanzen wie z.B., Magnetit oder anderen Eisen-, Nickel- oder Cobalt-verbindungen zu der gelösten Polymerphase, diese beim anschließenden Suspendiervorgang in das gebildete Gel inkorporiert werden. Die sonstigen grundsätzlichen Eigenschaften des Polymeren unterliegen hierbei keinen Veränderungen, d.h. man kann prinzipiell die gleichen Liganden-Kopplungen durchführen wie mit den herkömmlichen unmagnetischen PVAL Gelen. In der Regel wird das Ferromagnetikum, das vorzugsweise eine Partikelgröße von 1–10 μm aufweist, in einer Menge von 1 bis 30 Gew%, bezogen auf die Polymerphase, zugegeben. Die so synthetisierten magneti schen Träger lassen sich im Bereich des Immunoassays sowie der Zellseparation einsetzen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand einiger Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 1
20 ml einer 15%igen PVAL Lösung mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 800 werden mit 2 ml einer 25%igen Glutaraldehyd Lösung versetzt und 2 Minuten in einem Becherglas bei Raumtemperatur gerührt. Dieser Lösung werden dann 4 ml 1 N Salzsäure zugegeben und diese Mischung wird 8 Sekunden intensiv gerührt. Danach wird die Mischung in einer organiche Phase, bestehend aus 100 ml 84 centipoise viskosem Olivenöl suspendiert. Die Suspension wird für 30 Minuuten mit 900 U/Min. gerührt und anschließend abgesaugt. Es wird mit n-Hexan, Aceton und schließlich Methanol mehrfach nachgewaschen. Die gewonnen PVAL Partikel haben einen mittleren Durchmesser von ca. 70 μm.
Beispiel 2
Zu 20 ml einer 20%igen wäßrigen PVAL Lösung, Polymerisationsgrad 340, werden 2 ml 25%ige Glutaraldehyd Lösung zugegeben. Nach zweiminütigem Rühren wird die Lösung mit 5 ml 0.5 N Salzsäure versetzt. Die Mischung wird, nachdem sie 10 Sekunden intensiv gerührt wurde, in 90 ml Ölsäure mit einer Viskosität von 30 centipoise eingerührt. Die Suspension wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt (1000 U/Min.) und anschließend gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Es fallen perlförmige Gele mit einem mittleren Durchmesser von ca. 50 μm an.
Beispiel 3
Zu 160 ml einer 50 centipoise viskosen Pflanzenölphase wird eine wäßrige Phase, bestehend aus 60 ml 5%ige PVAL Lösung (mittlerer Polymerisationsgrad 3000), 3 ml 25%igem Therephtaldialdehyd und 10 ml 1 N Salzsäure, unter Rühren zugegeben. Die wäßrige Phase wurde zuvor für 50 Sekunden gerührt und besitzt eine Viskosität von 800 centipoise. Die Suspension wird für 30 Minuten weitergerührt (500 U/Min.) und gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Es fallen kugelförmige Teilchen mit einer mittleren Größe > 400 μm an.
Beispiel 4
160 ml Olivenöl (Viskosität 84 centipoise) werden in einem Becherglas vorgelegt und mit 200 U/min gerührt. In diese Phase wird eine Mischung bestehend aus 60 ml 5%ige PVAL Lösung (mittlerer Polymerisationsgrad 5300), 20 ml 10%ige Glutaraldehyd und 20 ml 1 N Salzsäure suspendiert. Die wäßrige Phase wird vor dem Suspendiervorgang 60 Sekunden intensiv gerührt und besitzt eine Viskosität von > 1000 centipoise. Die Suspension wird für 45 Minuten gerührt (600 U/Min.) und anschließend, wie oben beschrieben, abgesaugt und gewaschen. Man gewinnt so Gelpartikel mit einer mittleren Größe von ca. 600 μm.
Beispiel 5
1 g getrockneter PVAL Träger gemäß Beispiel 1, wird mit 4 ml 4,4^,-Diisocyanato-dicyclohexylmethan und 5 ml Dimethylformamid sowie 20 μl Triethylentetramin versetzt. Die Mischung wird für 40 Minuten bei 40°C gerührt. Danach wird mit Aceton und Dimethylformamid abwechselnd auf einer Fritte nachgewaschen bis das Waschwasser frei von Reaktionsstoffen ist. Das aktivierte Gel wird anschließend mit 300 mg Maltose, das in 5 ml Dimethylformamid gelöst ist, versetzt und 12 Stunden bei 30°C zur Reaktion gebracht. Es wird mit Dimethylformamid und Wasser mehrmals nachgewaschen bis das Filtrat frei von Maltose ist. Der so gewonnene Affinitäts-Träger kann nun zur Aufreinigung von Amylasen direkt verwendet werden.
Der Träger wird dazu in eine Chromatographiesäule (10 × 1 cm) versehen mit Einlaß- und Auslaßadapter gepackt und mit 1 mM Citratpuffer, pH 6.0, äquilibriert. Die Amylase Probe (10 mg gelöst in 10 ml 1 mM Citratpuffer) wird auf die Säule aufgetragen und mit einer Flußgeschwindigkeit von 70 ml/h adsorbiert. Nach dem Säulendurchlauf wurde keine Amylase Aktivität mehr im Filtrat festgestellt. Danach wird mit 0.5 M Citratpuffer, pH 6.0, mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 50 ml/h eluiert. Das Eluat weist nunmehr 97% Enzymaktivität auf.
Beispiel 6
10 g Träger gemäß Beispiel 1 wird mit 50 ml 0.5 N Natronlauge und 30 ml Epichlorhydrin versetzt und bei 55°C zwei Stunden umgesetzt. Sodann wird abgesaugt und bis zur Neutralreaktion mit Wasser nachgewaschen. Das aktivierte Gel wird nun mit einer Mischung, bestehend aus 30 ml Wasser, 20 ml Äthanol und 30 ml Triäthylamin versetzt und bei Raumtemperatur 24 Stunden stehen gelassen. Nach Beendigung der Substitution wird abgesaugt und mit Wasser bis zur Neutralreaktion nachgewaschen. Es entsteht so ein stark basischer Anionenaustauscher, der für die Auftrennung von diversen Protein- oder Nukleinsäuregemischen nach den bekannten Verfahren geeignet ist.
Beispiel 7
2 g mit Epichlorhydrin aktiviertes Gel gemäß Beispiel 6 wird mit 6 ml 30%iger wäßriger Natriumsulfitlösung versetzt und 12 Stunden bei 35°C umgesetzt. Das Produkt wird abgesaugt und mit Wasser solange nachgewaschen, bis das Filtrat frei von Sulfit ist. Es wird so ein stark saurer Kationenaustauscher gewonnen, der nach den bekannten Verfahren zur Auftrennung von Proteingemischen verwendet werden kann.
Beispiel 8
10 g PVAL Träger gemäß Beispiel 4 werden mit 20 ml Epichlorhydrin unter Zugabe von 40 ml 1 N Natronlauge bei 55°C für 2 Stunden umgesetzt. Danach wird abfiltriert und mehrfach mit Wasser bis zur Neutralreaktion nachgewaschen. Das aktivierte Gel wird nun mit 30 ml Polyethylenglykol (mittleres Molgewicht 200) unter Schütteln bei 40°C für 10 Stunden umgesetzt. Es wird abfiltriert und mehrfach mit Wasser nachgewaschen. Das gewonnene Spacerarm enthaltende Gel wird anschließend wie beim ersten Aktivierungsschritt mit Epichlorhydrin in Natronlauge umgesetzt.
Nach den üblichen Filtrations- und Waschschritten wird das Gel mit 30 mg des Blutgruppen-Oligosaccharids GalNAc(1-3)βGal-αFuc(1-2), gelöst in 30 ml 0.1 M Natrium-Borat-Puffer, pH 9,5, versetzt. Nach 24stündiger Reaktion bei 40°C wird das Polymere abgesaugt und mehrfach mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat frei von Zuckeroligomeren ist. Das gewonnene Affinitätsgel kann nun zur Entfernung von Blutgruppe-A-Antikörpern herangezogen werden. Dazu werden 10 g dieses Trägers zunächst mehrfach mit physiologischer Kochsalzlösung im batch-Verfahren äquilibriert. Sodann werden 60 ml gepooltes Humanserum, Blutgruppe 0, für 10 Minuten mit dem Träger unter leichtem Schütteln inkubiert. Es werden über 90% des ursprünglich vorhandenen Antikörpers an den Träger gebunden, wie sich anhand eines üblichen Agglutinationstestes nachweisen läßt.
Beispiel 9
1 g PVAL Träger gemäß Beispiel 1 wird mit 10 ml Dimethylsulfoxid, 50 μl Zinn-octoat und 7 ml Hexamethylen-Biuret versetzt. Nach 30 minütiger Reaktion bei 40°C wird das Gel abgesaugt und mehrfach mit Dimethylsulfoxid und Aceton nachgewaschen bis das Filtrat frei von irgendwelchen Reaktionsprodukten ist. Sodann werden 0.2 g Histidine, gelöst in 6 ml Dimethylsulfoxid, zugegeben und die Mischung für 12 Stunden bei 40°C gerührt. Das entstandene Affinitätsharz wird abgesaugt und mehrfach mit Wasser und Methanol nachgewaschen. Man erhält so einen Träger für die Aufreinigung von Antikörpern der Klasse IgG1.
Beispiel 10
1 g PVAL Träger gemäß Beispiel 1, wird mit 10 ml Dimethylformamid, 100 μl DABCO und 5 ml Hexamethylendiisocyanat versetzt und bei 40°C für 30 Minuten aktiviert. Das Produkt wird anschließend abgesaugt und mit Dimethylformamid und Aceton mehrmals nachgewaschen bis das Filtrat fei von Reaktionsprodukten ist. 50 mg anti-Faktor-VIII-Antikörper, gelöst in 5 ml 0.1 M K-Phosphatpuffer, pH 7,5, werden zugesetzt. Die Mischung wird für 5 Stunden bei 4°C geschüttelt, danach abgesaugt und 5mal mit dem Kupplungspuffer nachgewaschen. Man erhält so einen Träger für die Immunoaffinitätschromatographie zur Aufreinigung von Faktor VIII.
Dazu wird der Affinitätsträger in eine Chromatographiesäule analog Beispiel 5 gepackt und 15 Minuten mit 0.1 M K-Phosphatpuffer, pH 7,5, äquilibriert. Die Probe, bestehend aus 3 ml Rohproteinlösung mit einem Gehalt von ca. 0.1 mg Faktor VIII, wird mit einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min auf der Säule adsorbiert. Verunreinigungen und unspezifisch gebundene Bestandteile werden mit 2 Säulenvolumina 0.1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7,5, ausgewaschen und das spezifisch gebundene Protein mit 1 M Na-Rhodanidlösung und einer Elutionsgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Ausbeute beträgt 44%.
Beispiel 11
5 g PVAL (mittlerer Polymerisationsgrad 5500) wird durch mehrfaches Umfällen aus Wasser in Methanol gereinigt. Mit diesem Produkt werden perlförmige Gele gemäß Beispiel 4 synthetisiert. Es erfolgt Aktivierung mit Epichlorhydrin und Umsetzung mit Polyethylenglykol analog Beispiel 8. Man erhält so ein Spacerarm enthaltendes Trägergel. Nach nochmaliger Aktivierung und Aufreinigung gemäß obigem Beispiel werden 10 ml 0.1 N K-Phosphatpuffer, pH 8,0, in dem 10 mg anti-Proteinase-IgG gelöst sind, zugegeben. Die Suspension wird 20 Stunden bei 4°C geschüttelt und anschließend abgesaugt. Es folgt mehrfaches Waschen mit dem Kupplungspuffer. Die nicht abreagierten Epoxy-Gruppen werden durch Zugabe von 0,2 M Mercaptoäthanollösung, pH 8.0, desaktiviert (4 Stunden, Raumtemperatur). Danach wird das Produkt 5 mal mit Kupplungspuffer und 5mal mit physiologischer Kochsalzlösung nachgewaschen.
20 ml unverdünntes Human Serum eines Urämikers werden für 10 Minuten mit dem Träger inkubiert. Nach der Inkubation hat sich die Proteinaseaktivität auf unter 10% des ursprünglichen Wertes reduziert.
Beispiel 12
5 g Trägermaterial, gemäß Beispiel 4, wird mehrfach mit absolutem Aceton gewaschen und anschließend mehrere Stunden im Hochvakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wird sodann mit 20 ml absolutem Dimethylformamid, das 0.1 Gew% Zinn-Octoat enthält, versetzt und mit 10 ml Hexamethylendiisocyanat bei 45°C 30 Minuten umgesetzt. Der aktivierte Adsorber wird anschließend mehrfach mit Aceton und Dimethylformamid gewaschen, bis das Eluat frei von Isocyanat ist. 200 mg Lipid Crimson, gelöst in 15 ml Dimethylformamid, werden für 8 Stunden bei 35°C mit dem Träger umgesetzt. Das erhaltene Produkt wird mehrfach mit Aceton und Dimethylformamid gewaschen bis das Eluat frei von ungebundenem Farbstoff ist. Um die LDL Bindungskapazität des Adsorbers zu prüfen, werden 300 ml gepooltes Humanplasma für 15 Minuten unter leichtem Schütteln mit dem Träger inkubiert. Der Cholesteringehalt läßt sich so von 370 mg/dl auf 90 mg/dl reduzieren.
Beispiel 13
0,5 g Magnetit (Teilchengröße 10 μm) wird unter Rühren in einer wäßrige Lösung, bestehend aus 120 ml 5%igem PVAL, (mittlerer Polymerisationsgrad 2500) und 32 ml 1 N HCl, suspendiert. Die Mischung wird anschließend mit einer Rührgeschwindigkeit von 800 U/Min in 400 ml Pflanzenöl (Viskosität 70 centipoise) suspendiert. Nach einer Minute werden 0.5 ml 25%er Glutardialdehyd zugegeben und die Suspension für weitere 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension abfiltriert und analog Beispiel 1 gewaschen. Es fallen 22 ml magnetisches PVAL Gel mit einwer mittleren Teilchengröße von ca. 50 μm an.

Claims

Verfahren zur Herstellung perlförmiger Polyvinylalkoholgele mit Partikelgrößen zwischen 1 und 3000 um, dadurch gekennzeichnet, daß 1.1 Polyvinylalkohol (PVAL) mit einem Polymerisationsgrad von 300 bis 6000 in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und einem Polyvinylalkohol (PVAL) lösenden organischen Lösungsmittel gelöst wird; 1.2 gegebenenfalls die Viskosität der Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung durch die Bemessung der Menge an Wasser oder der Mischung aus Wasser und organischem Lösungsmittel auf einen Wert von 5 bis 2000 centipoise bei 20°C eingestellt wird; 2.1 die Polyvinylalkohol enthaltende Lösung 1.2 in einer mit dem Polyvinylalkohol enthaltenden Lösungsmittel nicht mischbaren, bei 20°C eine Viskosität von 10–200 centipoise aufweisenden organischen Phase, bestehend aus Pflanzenöl, Paraffinöl, Mineralöl, gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren sowie Mischungen derselben, und ggf. mit 1–20 Vol.-% eines organischen Lösungsmittels, das mit der Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung nicht mischbar ist, ohne Zugabe eines Emulgators und ohne Zugabe eines Salzes durch Rühren bei einer vorgegebenen Rührgeschwindigkeit von etwa 100 bis 2000 U/min suspendiert wird; 2.2 während des Suspensionsvorganges der in der wäßrigen Phase gelöste Polyvinylalkohol mittels eines zugesetzten Dialdehydes unter Säurekatalyse vernetzt wird, und anschließend 3.1 die perlförmigen Polyvinylalkoholgele durch Abtrennen und gegebenenfalls durch mehrmaliges Waschen gewonnen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als organische Phase Pflanzenöl aus der Gruppe, die Rapsöl, Olivenöl und Sojaöl umfaßt, ungesättigte Fettsäuren aus der Gruppe, die Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure umfaßt, sowie Mischungen der genannten Stoffe verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Einstellung der Viskosität der Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung 1.2 vor dem Suspendieren in der organischen Phase 2.1 durch Zugabe eines in der den Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung 1.2 löslichen Dialdehyds und Mischen für eine definierte Zeit erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß der Dialdehyd nach dem Suspendieren der Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung 1.2 in der organischen Phase 2.1 zugegeben wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß der Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung 1.2 vor dem Suspendieren in der organischen Phase 2.1 10 bis 80 Vol.-%, bezogen auf die Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Piperazin zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß der Polyvinylalkohol enthaltenden Lösung 1.1 vor dem Suspendieren 2.1 1 bis 30% (w/v) eines ferromagnetischen mikropartikulären Stoffes zugemischt wird.
Verfahren zur Derivatisierung der nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellten Polyvinylalkoholgele, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Vernetzung 2.2 nicht umgesetzte Hydroxylgruppen des Polyvinylalkoholgels mit Epihalogenhydrinen unter Säure- oder Basenkatalyse umgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der epoxy-aktivierte Polyvinyl alkohol mit Polyethylenglykol einer mittleren Molmasse zwischen 200 und 1000 umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der epoxy-aktivierte Polyvinylalkohol mit längerkettigen Diaminen umgesetzt wird.
Perlförmige Polyvinylalkoholgele, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–9 hergestellt wurden.
Verwendung von perlförmigen Polyvinylalkoholgelen, hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 7, zur Herstellung von stark basischen oder stark sauren Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß das epoxy-aktivierte Polyvinylalkoholgel mit tertiären Aminen oder Sulfiten der Alkali- und Erdalkalireihe umgesetzt wird.
Verwendung von perlförmigen Polyvinylalkoholgelen, hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 7, zur Herstellung von stark basischen oder stark sauren Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß das epoxy-aktivierte Polyvinylalkoholgel mit tertiären mit sekundären Aminen oder Aminosäuren umgesetzt wird.
Verwendung von perlförmigen Polyvinylalkoholgelen, hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 7, zur Herstellung eines Polymerträger für die Chelating- Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß das epoxy-aktivierte Polyvinylalkoholgel mit Iminodiessigsäure oder Nitridotriessigsäure umgesetzt wird.
Verwendung von perlförmigen Polyvinylalkoholgelen, hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 7, zur Herstellung eines Polymerträgers für die Hydrophobic-Interaction-Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß das epoxy-aktivierte Polyvinylalkoholgel mit einem primären Alkohol oder einem primären Amin, welche eine Kohlenstoffkette von C5 bis C18 aufweisen, umgesetzt wird.
Verwendung von perlförmigen Polyvinylalkoholgelen nach einem der Ansprüche 1–6, 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxy- oder Aminogruppen mit einem aliphatischen polyfunktionellen Isocyanat in wasserfreiem organischen Lösungsmittel umgesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit Isocyanat in Gegenwart eines Metallkatalysators oder einer Stickstoffbase, die üblicherweise für die Polyurethansynthese verwendet werden, stattfindet.
Verwendung nach einem der Ansprüchen 15–17, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide, Proteine, Antikörper oder Zuckeroligomere als Affinitätsliganden an das Polyvinylalkoholgel gekoppelt werden.
Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Affinitätsliganden Antikörper gegen lysosomale Enzyme (Proteinasen) verwendet werden.
Verwendung eines perlförmigen Polyvinylalkoholgels, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Polyvinylalkoholgels gemäß Anspruch 10 oder gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 verwendetem Derivats zur Abtrennung von Blutgruppen-Antikörpern aus Human Blut, Plama oder Serum, dadurch gekennzeichnet, daß blutgruppen-spezifische Oligosaccharide kovalent an den Träger gekoppelt sind.
Verwendung eines perlförmigen Polyvinylalkoholgels, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Polyvinylalkoholgels gemäß Anspruch 10 oder gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19 verwendetem Derivats zur Abtrennung von lysosomalen Enzymen aus Human Blut, Plama oder Serum, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper gegen diese Enzyme kovalent an den Träger gekoppelt sind.
Verwendung eines perlförmigen Polyvinylalkoholgels, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Polyvinylalkoholgels gemäß Anspruch 10 oder gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 verwendetem Derivats zur Abtrennung von von Lipoproteinen (Low Density Lipoprotein, LDL) aus Human Blut, Plasma oder Serum, dadurch gekennzeichnet, daß anti-LDL Antikörper kovalent an den Träger gekoppelt sind.
Verwendung eines perlförmigen Polyvinylalkoholgels, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Polyvinylalkoholgels gemäß Anspruch 10 oder gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17 verwendetem Derivats zur Abtrennung von von Lipoproteinen (Low Density Lipoprotein, LDL) aus Human Blut, Plasma oder Serum, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Azofarbstoffe: Lipid Crimson, Sudan III, Sudan Rot B oder Sudan Schwarz B, oder Deoxycholsäure, Deoxycholsäure Natriumsalz, Cholsäure, Cholsäure Natriumsalz, Prostaglandine oder Cholesterin an den Träger gekoppelt sind.