DE2315508A1 - Mit polymeren traegerverbindungen zu unloeslichen materialien vereinigte biologisch aktive stoffe und verfahren zur herstellung derselben - Google Patents
Mit polymeren traegerverbindungen zu unloeslichen materialien vereinigte biologisch aktive stoffe und verfahren zur herstellung derselbenInfo
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Description
TL <·*■<»·
28. März I973
Ceskoslovenskä akademie ved, Prag (CSSR)
Mit polymeren Trägerverbindungen zu unlöslichen Materialien vereinigte biologisch aktive Stoffe und Verfahren
zur Herstellung derselben
Gegenstand der Erfindung sind mit polymeren Trägerverbindungen zu unlöslichen Materialien vereinigte biologisch
aktive Stoffe, wie Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Hormone, Antigene, Antikörper, immunaktive Stoffe u.dgl. sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben, was grundsätzlich durch
Bindung der löslichen biologisch aktiven Verbindungen, die eine oder mehrere primäre Aminogruppen enthalten, an einen
durch Copolymerisation von Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Oligo- oder Polyglykolacrylaten, Oligo- oder
Polyglykolmethacrylaten mit AIkyIdiacrylaten, Alkyldimethacrylaten, Oligo- oder Polyglykoldiacrylaten und Oligo- oder PoIyglykoldimethacrylaten erzeugten definierten polymeren Träger
erreicht wird.
233-(S 7884) NoHe
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aktiven Produkte besitzen die ^igansohaften von selektiv
wirkenden heterogenen Katalysatoren chemischer Reaktionen (Enzyme) oder von enzymatisch en Inhibitoren bzw» -von Verbindungen
mit apezifi acher 7!ivku ng Gleise,
Die Vorteile dieser Produkte werden nachfolgend am Beispiel der Gruppe der am häufigsten angewandten biologischen
Stoffe, der Enzyme, diskutiert.
Die Welt produktion der für uia Katalyse chemischer Reaktionen
in der pharmazeut-" acnen Industrie und Lebensmittelindustrie benutzten Enzyme bewegt sich in der i'-rö'Senordnung
von mehreren Tausend Tonnen pro craiu% wobei ihrer noch breiteren
Anwendung die relativ komplizierte Herstellungsweise im Wege steht. Mit Ausnahme von Hibonuoleasa, die synthetisch
dargestellt wurde, geht dia Herstellung der Enzyme ausachließlich
von natürlichen Rohstoffen bzw, biologischen Materialien aus, was sion selbstverständlich sehr erheblich
auf ihren Preis auswirkt.
Der möglichen breiteren Anwendung der Enzyme für die
Katalyse chemischer Reaktionen im Industriemaßatab steht neben
dem Preis auch die geringe Stabilität und besonders ihre sehr unwirtschaftliche Anwendungs^eise im Wege: Bei der üblichen
Durchführung enzymatisch katalysierter !Reaktionen wird das Enzym wie eine der reagierenden Komponenten der Lösung
bzw. Reaktionsmischung zugesetzt« Bach Beendigung der Reaktion
wird das Enzym aus dem Endproduktgemisch durch Verfahren entfernt, die in der Regel seine Aktivität zerstören,
oder es verbleibt im Gemisch als verunreinigende Beimischung (üblicherweise gemeinsam mit den zugesetzten Deaaktivatoren,
die den enzymatisch katalysierten Prozeß abbrechen. Verfahren, die man für die Rückgewinnung der aktiven Enzyme anwenden
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könnte, sind in der Regel technologisch nicht durchführbar.
Das Enzym wird also für die Reaktionskatalyse nur einmal angewendet und ist dann entwertet.
Die Erzeugung unlöslicher Enzym-Präparate durch Bindung des löslichen Enzyms an einen polymeren Träger ermöglicht
die wiederholte Anwendung des unlöslichen Enzyme bei chargenweiser oder kontinuierlicher Reaktion, wobei dem unlöslichen
Enzym die Funktion eines heterogenen Katalysators zukommt. Bei der so durchgeführten Katalyse werden das Problem der Enzymabtrennung
vom erhaltenen Reaktionsgemisch gelöst, die Kosten sowohl bei der chargenweisen als auch bei der kontinuierlichen
Durchführung der Reaktion wesentlich gesenkt und die Automatisierung des Prozesses bei kontinuierlicher Durchführung
erleichtert.
Beim Durchgang einer Lösung des Substrate (für eine enzymatisch
e Reaktion) durch eine Gelsäule mit chemisch gebundenem
Enzym wird die Geschwindigkeit der enzymatisch katalysierten Reaktion nicht nur durch die Art und Aktivität des Enzyme,
sondern auch durch den Charakter der Bindung des Enzyme an den Träger, durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften
des Trägers (Porosität, Oberfläche), durch die hydrodynamischen
Parameter der Apparatur und durch die Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung beeinflußt. Die gleichzeitige oder
aufeinanderfolgende Wirkung mehrerer Enzyme kann durch Vermischen
oder Schichtung der Säulenfüllung oder durch Serienschaltung von Säulen mit verschiedenen unlöslichen Enzymen
erreicht werden.
Eine ähnliche Situation ergibt sich bei anderen biologisch aktiven Stoffen (Inhibitoren, Antigenen, Antikörpern
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und immunoaktiven Verbindungen) mit spezifischer Anwendung.
Nach einer Reaktion des Substrats (für die biologische Reaktion) mit dem an den Träger gebundenen biologisch aktiven
Stoff können die Reaktionsprodukte durch allgemeine Verfahren der chemischen Technologie (Sedimentation, Filtration, Zentrifugation)
wirtschaftlich und schnell getrennt werden.
Als polymere Träger für biologisch aktive Stoffe wurden bisher poröses Glas, Cellulose und ihre Derivate, Stärke,
Derivate von vernetztem Polystyrol, Ithylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymere,
Polyacrylamid und Polysaccharide herangezogen. Die letztgenannten Verbindungen sind dank ihrer relativ
hohen Porosität im gequollenen Zustand häufig angewandte Träger,
kit Ausnahme von porösem Glas und lolystyrol besitzen die genannten Gele eine sehr geringe mechanische Festigkeit,
die ein Arbeiten unter Druckanwendung und damit höhere Durchflußgeschwindigkeiten
durch die Gelsäule ausschließt. Häufig ist auch die geringe Hydrolyse-Beständigkeit der bisher angewandten
Träger hinderlich, und es sina Fälle bekannt, bei denen die Reaktion des Substrats mit dem biologisch aktiven
Stoff am Träger durch mangelhafte hydrophile Eigenschaften der Trägeroberfläche oder eine unspezifiache Sorption an die
Gelmatrix kompliziert bzw. erschwert wird. Locker vernetzte Polysaccharide oder Acrylamide können in trockenem Zustand
nicht in Form diskreter Teilchen bereitet werden.
Zum "Immobilmachen" des biologisch aktiven Stoffes wird oft ein Verfahren angewandt, bei dem das polymere biologisch
aktive Molekül mechanisch in die dreidimensionale Struktur des locker vernetzten Gels eingeschlossen wird. Die
Diffusion des Substrats wird dann durch die ftetzdichte des umhüllenden Gels bestimmt. Die mechanischen Eigenschaften
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dieser Materialien sind in der Regel nicht sehr zufriedenstellend,
und auch die biologische Aktivität wird durch den Typus des umhüllenden Gels und seine Vernetzung stark beeinflußt.
Erfindungsgemäß werden nun mit polymeren Trägerverbindungen zu unlöslichen Materialien vereinigte biologisch aktiven
Verbindungen,wie beispielsweise Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren,
Antikörper, Antigene, Hormone, immunoaktive Verbindungen und Antibiotica, die eine oder mehrere NHp-Gruppen
im Molekül enthalten, vorgesehen, die dadurch erhalten werden, daß man die Oberfläche von durch Copolymerisation von
hydrophilen Monomeren wie Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten,
Oligo- oder Polyglykolacrylaten, Oligo- oder Polyglykolmethacrylaten, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrylamiden,
MethacryJLamiden, Aminoalkylacrylaten, Aminoalkylmethacrylaten,
Acrylsäure oder Methacrylsäure
mit monomeren Divinyl- oder Polyvinylverbindungen wie Alkyldiacrylaten,
Alkyldimethacrylaten, Oligo- oder Polyglykoldiacrylaten, Oligo- oder Polyglykoldimethacrylaten, Alkylenbis-acrylamiden
oder Divinylbenzol
erzeugten polymeren homogenen oder heterogenen makroporösen Gelen mit Verbindungen wie Bromcyan, Säureanhydriden oder
Säurechloriden, Diisocyanaten oder Isothiocyanaten aktiviert,
die mit der funktioneilen Hydroxyl- oder Aminogruppe reagieren;
die so aktivierten Gele werden dann der Reaktion mit den Aminogruppen enthaltenden löslichen biologisch aktiven
Verbindungen unterworfen oder mit intermediären Molekülen, die mit der Hydroxyl- oder Aminogruppe der Gele reagieren
und eine weitere reaktive funktioneile Gruppe enthalten, die (dann) mit den biologisch aktiven Stoffen eine chemische
Bindung eingeht, wobei sich diese löslichen Verbindungen an
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das polymere Material unter Erhaltung ihrer chemischen und
biologischen Reaktivität chemisch binden. Die resultierenden Stoffe übertreffen in ihren Eigenschaften die bisher bekannten
Präparate.
Die erhaltenen unlöslichen Enzyme zeichnen sich durch hervorragende mechanische Festigkeit der kugelförmigen teilchen,
durch hohe Kapazität, hohe biologische Aktivität und Aktivitätsbeatändigkeit sowie durch die Herstellungsmöglichkeit
in trockenem Zustand in Form von kugelförmigen Teilchen der gewünschten Dimension und Größenverteilung aus. Die
- auch im gequollenen Zuatar.i - erhebliche Steifigkeit der
Gelteilchen mit dem gebundenen biologisch aktiven Stoff erlaubt es, bei der Durchführung der Reaktion in Säulen die
Durchflußgeachwindigkeit der Substratlösung größenordnungsmäßig
zu erhöhen, denn die Anwendung von Druck an der Eintrittsstelle bewirkt weder eine Kontraktion d.er Gelsäule
noch eine Herabsetzung ihrer Durchlässigkeit.
Bei Einhaltung identischer Heaktionsbedingungen ist die
Menge und Aktivität der an das Gel gebundenen biologisch aktiven Stoffe höher als bei Anwendung der bisher bekannten Träger,
Im trockenen Zustand weisen die unlöslichen biologisch aktiven Stoffe gegenüber ihren löslichen iormen eine größere Aktivitätabeständigkeit
auf. Die hervorragende Hydrolyse-Stabilität dea Trägers gestattet die häufig wiederholte oder langzeitige
Anwendung der biologisch aktiven Katalysatoren, ohne daß es zu ihrer Vernichtung oder Schädigung durch Nebenreaktionen
mit dem polymeren Material kommt. Die hydrophile Natur der Oberfläche erleichtert die Diffusion des Substrats zum gebundenen
aktiven Molekül und verbürgt die hohe biologische Aktivität des Materials.
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Die Anwendung mikroporöser Träger auf der Basis von Acrylsäure- oder Methacrylsäureester kann bei geeigneter innerer
Struktur des Trägers die Diffusion der Substratmoleküle von bestimmter Größe fördern oder unterdrücken, wodurch eine
empfindlichere Steuerung der sich an der Geloberfläche abspielenden
biochemischen Reaktion erreicht werden kann.
Bei der Herstellung der unlöslichen biologisch aktiven Stoffe wird in der ersten Stufe das hydrophile Gel auf der
Basis von Acrylsäure- oder Methacrylsäureestern, das eine geeignete Porenverteilung und OberflächengröQe besitzt, mit
wässriger Bromcyanlösung oder mit einer Dicarbonsäureanhydrid-
bzw. -Chloridlösung oder mit der Lösung eines Diisocyanate bzw. Isothiocyanate u.a. aktiviert.
Die Suspension wird in wässriger Pufferlösung verrührt, und nach Einstellung des pH-Wertes mit Natriumhydroxid und/oder
Natriumcarbonat bzw. -bicarbonat wird in der zweiten Stufe
der aktivierte Träger bei niedriger Temperatur mit der betreffenden löslichen biologisch aktiven Verbindung reagieren
gelassen. Nach beendeter Reaktion wird das polymere Gelprodukt mit Pufferlösungen von optimalem pH-Wert für den gebundenen
biologisch aktiven Stoff gewaschen.
Bei den so hergestellten Präparaten wurde dann der Gehalt der gebundenen biologisch aktiven Verbindung bestimmt.
So wurde beispielsweise bei gebundenen proteolytischen Enzymen die Esterase-Aktivität mittels einer Acetyltyrosinäthyleeter-Lösung
bzw. Benzoylargininäthylester-Lösung beim pH-Optimum (9,1) und die proteolytische Aktivität an Hämoglobin bestimmt.
Die in gleicher Weise mit Chymotrypsin präparierte Agarοse
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weist einen erheblich niedrigeren Gehalt an gebundenem Enzym im Gel und eine ca. viermal niedrigere Esterase- und
proteolytische Aktivität (bezogen auf 1 ml Gelfüllung der Säule) auf.
'Analog wurden die unlöslichen Proteasen Trypsin, Papain,
Bromelain, Ficin, die Protease aus Streptomyces grizeus, Subtilopeptidase,
Leucinaminopeptidase u.a. sowie weitere Enzyme wie GlucoBOOxydase, Phenoloxydase, Ribonuclease, Alkoholdehydrogenase,
Peroxydase, Lipase, Urease, Cytochrom G und cX-Amylase bereitet.
Als weitere Beispiele für durch Bindung an Hydroxyalkylmethacrylat-
und Hydroxyalkylacrylat-Gel erzeugte unlösliche
Präparate von biologisch aktiven Stoffen sind u.a. die Präparate von Insulin, Vasopressin, Fötus-Protein, Immunoglobulin
des Fötus-Proteins, Streptomycin und Folsäure zu nennen.
Wenn der aktive Stoff keine Aminogruppe enthält oder
seine Aktivität durch Bindung über die Aminogruppe beeinträchtigt wird, kann man als intermediäre Substanz eine Verbindung
anwenden, deren Molekül eine Aminogruppe, die die chemische Bindung mit dem Gel ermöglicht und weitere funktionelle
Gruppen enthält, die fähig sind, chemische Bindungen mit dem biologisch aktiven Stoff einzugehen. Dieses Prinzip
wird auch angewendet, wenn der biologisch aktive Stoff - aus sterischen Gründen - über eine bewegliche Kette, den
sog. "Spacer", gebunden, also nicht dicht an der Oberfläche des Trägers vorliegen soll.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
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25 Gewichtstelle eines durch Polymerisation in Gegenwart eines aus Cyclohexanol und Laurylalkohol (9:1) bestehenden inerten Lösungsmittelsystems erhaltenen mit 39 Gew.-^
Äthylendimethacrylat vernetzten Hydroxyäthylmethacrylat-Gels
mit einer Ausschlußgrenze bei einem Molekulargewicht von 300.000 wurde über Nacht in destilliertem Wasser quellen gelassen. Nach Absaugen der Flüssigkeit fielen 100 ml gequollenes Gel an, das in 100 Gewichtsteilen destilliertem
Wasser verrührt wurde. Die mit einem Magnetrührer gerührte Suspension wurde mit 100 Teilen einer unmittelbar vor der
Anwendung frisch bereiteten Bromcyanlösung versetzt, dann
mit An NaOH auf pH 11 eingestellt und die Suspension unter stetigem Rühren bei Zimmertemperatur 12 Minuten lang unter
weiterer Zugabe von 4n NaOH bei diesem pH-Wert gehalten. Danach wurde die Suspension auf einem Glasfilter mit 2000 Teilen
einer gekühlten 0,1n Natriumbicarbonatlösung (pH 9) gewaschen,
welche Operation möglichst schnell durchgeführt werden soll.
Das abgesaugte Gel wurde mit 100 Teilen 0,1n NaHCO,
(pH 9) verrührt, dann sofort mit 10 g festem Chymotrypsin versetzt und die Suspension 24 Stunden mit einem Magnetrührer
bei 40C gerührt. Dann wurde das Gel abgesaugt, mit 4000 Teilen
einer Lösung von 0,1m Natriumborat und 1n Natriumchlorid (pH 8,5), anschließend mit 3000 Teilen einer Lösung von
0,1m Natriumacetat und In-Natriumchlorid (pH 4,1) und schließlich mit 3000 Teilen 0,01m Natriumacetat (pH 4,1) gewaschen.
Die so bereiteten Gele besitzen einen Chymotrypeingehalt
von 17,9 mg/ml, eine £sterase-Aktivität von 1320 yamol/min.ml
(das Aktivitätsverhältnis des gebundenen zum entsprechenden
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freien Chymotrypsin beträgt 55 $) und eine proteolytische
Aktivität von 28 Einheiten/ml (das Aktivitätaverhältnis des gebundenen zum entsprechenden freien Chymotrypsin beträgt
44 #). Die Esterase-Aktivität wurde beim Acetyltyrosin-äthylester
und die proteolytische Aktivität bei Hämoglobin bestimmt.
Die Herstellung des Präparats erfolgte nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit dem Unterschied, daß
10 Teile gequollenes, mit Bromcyan aktiviertes Gel angewandt
und in 10 Teilen 0,1n NaHCO-, (pH 9) verrührt wurden, worauf
zu der 30 bereiteten Suspension 2 Teile festes Pankreas-Trypsin
hinzugefügt wurden. Die proteolytische Aktivität wurde mit Hämoglobin und die Esterase-Aktivität mit Benzoylargininäthylester-Lösung
bestimmt.
Pur die Reaktion wurde ein durch Polymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat in Gegenwart von 24 Gew.-$>
Äthylendimethacrylat erzeugtes Hydroxyäthylmethacrylat-Gel verwendet.
Das Verhältnis der die Porosität des Gels bestimmenden inerten
Komponenten Cyclohexylalkohol und Dodeeylalkohol betrug 7:3. Die Aueschlußgrenze des hydrophilen Gels lag bei einem Molekulargewicht
von 10 . Die Herstellung des Präparats erfolgte nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren mit dem Unterschied,
daß das Gel - nach der Aktivierung - in 10 Teilen 0,1m Phosphatpuffer (pH 6) suspendiert und die Suspension mit 2
Teilen Glucosooxydase versetzt wurde. Nach Bindung des Enzyms wurde die Suspension mit einer Lösung von 0,1m Natriumphosphat
und 1m NaCl (pH 6,0) und den weiteren Puffern wie in Beispiel 1 und 2 gewaschen. Die Aktivitätsbestimmung des unlöslichen Enzyms
erfolgte anhand der freigesetzten' Sauerstoffmenge/min.ml.
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Die Herstellung erfolgte nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren mit dem Unterschied, daß das angewandte Gel
30 $> vernetzendes Athylendimethacrylat enthielt und die inerte
Phase bei der Copolymerisation durch 82 Gew.-yo Cyclohexanol
und 18 Gew.-$> Dodecylalkohol gebildet wurde. Als Ausschlußgrenze
dieses Gels wurde ein Wert von 700.000 gefunden.
Das gemäß Beispiel 2 aktivierte Gel wurde in 10 Teilen 0,1m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und die Suspension
mit 2 Teilen fester oC-Amylase versetzt. Als erster Waschpuffer
wurde 0,1m Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 1m NaCl (pH 7) angewandt. Die weiteren Waschpuffer waren die
gleichen wie in Beispiel 2. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte auf Grund der aus einer Stärkelösung/min.mg freigesetzten
reduzierenden Zuckermenge.
30 Gewichtsteile eines durch Polymerisation von Diäthylenglykolmonomethacrylat
in Gegenwart von 40 56 Athylendimethacrylat
hergestellten Gels (die inerte Phase bestand aus 90 i» Cyclohexanol
und 10 i» Dodecylalkohol) wurde mit überschüssigem
destillierten Wasser (100 Teile) 20 Stunden lang quellen gelassen. Das anfallende gequollene Gel (120 ml) wurde mit
100 Gewichtsteilen destilliertem Wasser verdünnt und dann die Aktivierung des Gels nach dem in Beispiel 1 beschriebenen
Verfahren durchgeführt. Zu 15 Teilen aktiviertem Gel wurden
3 Gewichtsteile Protease aus Streptomyces grizeus hinzugefügt
und das Gemisch analog zu Beispiel 1 reagieren gelassen. Die Protease-Aktivität wurde an Hämoglobin bestimmt.
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Die Herstellung des Präparats erfolgte nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, mit dem Unterschied, daß
als Träger ein aus Hydroxyäthylacrylat und Äthylendiacrylat bereitetes Copolymeres mit einer Ausschlußgrenze bei einem
Molekulargewicht von 500.000 verwendet und 50 Gewichtsteile Suspension - nach erfolgter Aktivierung - mit 5 Gewichtsteilen
Bromelain versetzt wurden. Die proteolytische Aktivität wurde an Hämoglobin und die Esterase-Aktivität an Benzoyl-L-argininäthylester
bestimmt.
20 Teile eines durch Copolymerisation von Diäthylenglykolmonomethacrylat
mit Tetraäthylenglyicoldimethacrylat erzeugten
hydrophilen Gels, dessen Ausschlußgrenze bei einem Molekulargewicht von 300.000 lag, wurden nach 24 Stunden langem
Quellen in überschüssigem destillierten Wasser abgesaugt und 80 Teile der gebildeten Suspension in 100 Teilen destilliertem
Wasser verrührt. Das Gel wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren aktiviert. 12 Teile des aktivierten
Gels wurden mit 2 Gewichtsteilen Subtilopeptidase versetzt. Nach 24-stündiger Reaktion bei 40C und Waschen mit Pufferlösungen
gemäß Beispiel 1 wurde die Esterase-Aktivität an Acetyltyrosin-äthylester bestimmt.
30 Teile eines durch Copolymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat
mit Äthylendimethacrylat bereiteten Gels, dessen
Molekulargewichts-Ausschlußgrenze bei 10 lag, wurden in
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überschüssigem destillierten Wasser 12 Stunden quellen gelassen. Die gebildete Suspension wurde auf einer !'ritte
abgesaugt, in 100 Teilen destilliertem Wasser verrührt und nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren aktiviert,
mit dem Unterschied, daß für 30 Gewichtsteile Gel 5 Gewichtsteile Leucinaminopeptidase verwendet wurden. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte anhand der Hydrolyse von L-Leucinamid,
die durch alkalische Titration ermittelt wurde.
Me Herstellung des Präparats erfolgte wie in Beispiel 1, nur daß 10 Teile gequollenes Gel mit 2 Teilen Ficin versetzt
wurden. Die Esterase-Aktivität wurde durch Hydrolyse von Benzoyl-L-arginin-äthylester bestimmt.
20 Gewichtsteile eines durch Copolymerisation von Diäthylenglykolmonomethacrylat
mit Äthylendimethacrylat bereiteten Gels mit einer Ausschlußgrenze bei einem Molekulargewicht
von 300.000 wurden nach Quellung mit Wasser ebenso wie in Beispiel 1 aktiviert. 10 Teile des aktivierten Gels wurden
dann mit 2 Teilen Pankreas-Lipase versetzt; im übrigen wurde wie in Beispiel 1 verfahren. Die Aktivität wurde durch Hydrolyse
von Olivenöl bestimmt.
25 Gewichtsteile eines durch Copolymerisation von 2-Hydroxyathylmethacrylat
mit Äthylendimethacrylat hergestellten Gels
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mit einer Ausschlußgrenze bei einem Molekulargewicht von 1Cr
wurden nach Quellung in Wasser ebenso wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. 20 Gewichtsteile aktiviertes Gel wurden
in gequollenem Zustand mit 5 Gewichtsteilen Alkoholdehydrogenase
20 Stunden lang reagieren gelassen. Die biologische Aktivität des erhaltenen Präparats wurde mittels NAD
(Nicotinamid-adenin-dinucleotid) bestimmt.
Die Herateilung des Präparats erfolgte analog zu Beispiel
2, nur daß in die Suspension des aktivierten Gels anstatt Trypsin 2 Teile kristallisiertes Insulin gegeben wurden.
Die Aktivität wurde aus dem Desoxyribose-Gehalt nach Reaktion des gebundenen Insulins mit C*~Aminobuttersäure in Gegenwart
von Epithelzellen nach T. OKA, Y.J. TOPPER, Proc. Nat. Acad.
Sei. USA, £ö (1971) 2066 bestimmt.
Die Herstellung des Präparats erfolgte in einer zu Beispiel 1 analogen Weise, nur daß als Träger mit Diäthylenglykoldimethacrylat
vernetztes Diäthylenglykolmonomethacrylat-Gel
mit einer Ausechlußgrenze bei einem Molekulargewicht von 100.000 und als biologisch aktiver Stoff Vasopressin angewandt
wurden. Die Menge des gebundenen Vasopressins wurde anhand des Aminosäuregehaltes bestimmt.
20 Gewichtsteile des nach Beispiel 1 mit Bromcyan aktivierten durch Copolymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat
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mit Athylendimethacrylat bereiteten Gels wurden unter den
in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen mit 4 Teilen aus Labor-Ratten gewonnenem Fötus-Protein reagieren gelassen.
Die biologische Aktivität des gebundenen Proteins wurde anhand des immunochemisehen Tests unter Anwendung des entsprechenden
Immunoglobulins bestimmt.
Die Herstellung des Präparats erfolgte ähnlich wie in Beispiel 14, nur daß ein durch Copolymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat
mit Athylendimethacrylat bereitetes Gel mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 10 angewandt
wurde. 15 Teile dieses Gels wurden in destilliertem Wasser
gequollen und ebenso wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. Das aktivierte Gel wurde dann 24 Stunden lang mit dem Immunoglobulin
des Fötus-Proteins reagieren gelassen. Nach Waschen mit Puffern wurde die Aktivität des gebundenen Immunoglobulin
durch immunochemisehen Test bestimmt.
25 Teile eines durch Copolymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat
mit Athylendimethacrylat bereiteten Gels mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 100.000
wurden in gequollenem Zustand mit Bromcyan aktiviert. Ähnlich wie in Beispiel 1 wurde das aktivierte Gel mit 8 Gewichtsteilen Streptomycin reagieren gelassen. Die Menge des gebundenen
Antibioticums wurde anhand des Stickstoffgehaltes bestimmt.
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Beispiel 17
20 Gewichtsteile Gel von gleicher Aussehlußgrenze und
Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurden nach gleicher Aktivierung wie in Beispiel 1 mit -10 Gewichtsteilen Hexamethylendiamin
reagieren gelaasen und das gebildete Material dann bei 400C mit 8 Gewicht steil en !Folsäure zur Reaktion gebracht.
Die Aktivitätsbestimmung des resultierenden Präparats erfolgte unter Anwendung der entsprechenden Reduktaae.
50 Gewichtsteile eines durch Copolymerisation von Hydroxydecylmethacrylat
in Gegenwart von 50 c/o Butylendiacrylat und
einer inerten Phase erzeugten Gels wurden in überschüssigem destillierten V/asser gequollen und in gleicher Weise wie in
Beispiel 1 aktiviert. 10 Teile des aktivierten Gels wurden mit 1 Gewichtsteil Coenzym Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD)
versetzt und das Gemisch ebenso wie in Beispiel 1 reagieren gelassen.
Ein durch Copolymerisation von 40 Gew.-?& Äthylendimethacrylat,
50 Gew.-^ 2-Hydroxyäthylmethacrylat und 10 Gew.-#
Acrylnitril bereitetes makroporöses Gel wurde gemäß Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. 10 Gewichtsteile des aktivierten Gels
wurden mit 1 Gewichtsteil aus Kartoffeln isoliertem Chymotrypsin-Inhibitor
versetzt und das Gemisch unter Rühren 12 Stunden lang bei 4 C zur Reaktion gebracht.
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7315508
Ein durch Suspensionspolymerisation von Polyglykolacrylat mit einem mittleren Molekulargewicht von 400
(90 Gew.-0Ji) mit Butylendiacrylat (10 Gew.-^) in Gegenwart
von Dibutyläther hergestelltes makroporöse Gel wurde mit
Methylen-bis-(phenylisocyanat) aktiviert. 10 Gewichtsteile
des gebildeten aktivierten Gels wurden in Dioxan mit einem Gewichtsteil Folsäure reagieren gelassen.
10 Gewichtsteile des makroporösen Gels von Beispiel 1
wurden mit einer Lösung von 25 Gewichtsteilen Phosgen in Gewichtsteilen Benzol aktiviert, 5 Gewichtsteile des aktivierten Gels wurden unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen mit 1 Gewichtsteil Chymotrypsin zur Reaktion gebracht.
Ein durch Reaktion von 40 Gewichtsteilen Hydroxyäthyldimethacrylat, 40 Gewichtsteilen Äthylendimethacrylat und
Gewichtsteilen Methacrylnitril in Gegenwart einer aus Cyclohexanol und Laurylalkohol (9s1) bestehenden inerten Phase
hergestelltes makroporöses Copolymeres wurde durch Reaktion mit Thionylchlorid aktiviert. Das gebildete Halogenderivat
wurde mit der gleichen Menge Phenylendiamin umgesetzt. Das
aromatische Amin ergibt durch Reaktion mit Thiophosgen das Isothiocyanat. 3 Gewichtsteile des so aktivierten Gels wurden
unter den in Beispiel 3 angeführten Bedingungen mit Pankreas-Tryptase zur Reaktion gebracht.
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Ein durch Copolymerisation von Polyglykolmethaerylat mit einem mittleren Molekulargewicht von 360 (90 Gew.->)
mit Äthylendiacrylat (10 Gew.-^) in Gegenwart von Toluol
hergestelltes makroporöses Gel wurde ähnlich wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. 5 Gewicht3teile des so aktivierten
Gels wurden mit 1 Gewichtsteil des durch Affinitätschromatographie
gewonnenen Antikörpers des Insulins 24 stunden lang bei 4 G reagieren gelassen.
20 Gewichtsteile eines durch Copolymerisation von Ιί,Ν-Dimethylacrylamid (50 Gew.-^), Methylenbisacrylamid
(10 Gew.-%) und 2-Hydroxyäthyimethacrylat; (40 Gew.-^) erzeugten
Gels wurden ähnlich wie in Beispiel 1 mit Bromcyan aktiviert. 10 Teile des aktivierten Gels wurden unter den
in Beispiel 1 angeführten Bedingungen mit Chymotrypsin zur Reaktion gebracht.
10 Gewichtsteile einea durch Copolymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat
(60 Sew,-',*), Acrylsäure (20 Gew.-^c)
und Äthylendiacrylat (20 Gew.-$) gebildeten makroporösen Gels
wurden durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid (30 Gew.-^i)
in Gegenwart von 30 Gewichtsteilen Pyridin in 60 Gewichtsteilen Diäthyläther aktiviert. Dae so aktivierte Gel wurde
mit 3 Gewichtateilen Trypsin in einem Puffer (pH 7) umgesetzt.
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" 19 " 7315508
Die Herstellung des Präparats erfolgte analog zu Beispiel 25, mit dem Unterschied, daß statt der Acrylsäure die
gleiche Gewichtsmenge Methacrylsäure verwendet wurde.
Die Herstellung des Präparats erfolgte analog zu Beispiel 24, mit dem Unterschied, daß für die Copolymerisation
statt des W,N-Dimethylacrylamids N-Äthylmsthacrylamid verwendet
wurde.
Ein durch Copolymerisation von 39 Gew.-$ Äthylendimethacrylat,
20 Gew.-i» Diäthylaminoäthylmethacrylat und 41 Gew.-#
2-Hydroxyäthylmethacrylat hergestelltes makroporöses Gel wurde
mit Bromcyan aktiviert und ähnlich wie in Beispiel 1 mit Chymotrypsin reagieren gelassen.
Die Herstellung des Präparats erfolgte analog zu Beispiel 28, mit dem Unterschied, daß statt des Diäthylaminoäthylmethacrylat
β Dxäthylaminoäthylacrylat verwendet wurde.
Die Herstellung des Präparats erfolgte analog zu Beispiel 4, mit dem Unterschied, daß als Vernetzungsmittel statt
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7 3 tiS 5 0 8
Ä'thylendimethacrylat Divinylbenzol verwendet wurde.
Die Herstellung des Gels erfolgte analog zu Beispiel 20,
mit dem Unterschied, daß statt des Butylendiacrylats ein durch Reaktion von Acrylsäurechlorid mit einem Glykolgemisch
mit einem mittleren Liolekulargewicht von 360 gebildetes Diacrylat verwendet wurde.
Die Herstellung des Präparats erfolgte wie in Beispiel 25, mit dem Unterschied, daß die Aktivierung des Gels mit 30
Gewichtsteilen Glutarsäureanhydrid vorgenommen wurde.
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Claims (4)
- 7315508Patentansprüche[Yl Mit polymeren Trägerverbindungen zu unlöslichen Materialien vereinigte bioaktive Stoffe wie Enzyme, Hormone, Antibiotica u.dgl., dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerverbindung durch ein aus hydrophilen Monomeren und Divinyl- oder Polyvinylverbindungen erzeugtes makroporöses Hydroxyl- oder Aminogruppen enthaltendes Gopolymeres gebildet wird, an das die bioaktiven Stoffe insbesondere aber ihre Aminogruppe(n) unter Vermittlung von mit den Hydroxyl- oder Aminogruppen des Copolymeren umgesetzten Bindungsgliedern unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität chemisch gebunden sind.
- 2. Verfahren zur Herstellung unlöslicher Präparate von biologisch aktiven Verbindungen wie Enzymen, Coenzymen, üinzyminhibitoren, Antikörpern, Antigenen, Hormonen, imiuunoaktiven Verbindungen und Antibiotica, die insbesondere eine oder mehrere NH2-Gruppe(n) im Molekül enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oberfläche eines durch Copolymerisation von hydrophilen Monomeren mit monomeren Divinyl- oder Polyvinylverbindungen erzeugten polymeren homogenen oder heterogenen makroporösen Gels mit Verbindungen aktiviert, die mit der funktioneilen Hydroxyl- oder Aminogruppe der Gele reagieren und die so aktivierten Gele dann der Reaktion mit den Aminogruppen enthaltenden löslichen biologisch aktiven Verbindungen unterwirft oder der Iieaktion mit intermediären Molekülen, die mit der Hydroxyl- oder Aminogruppe der Gele reagieren und eine weitere reaktive funktionelle Gruppe enthalten, die fähig ist mit den biologisch aktiven Stoffen eine chemische Bindung einzugehen, wobei sich diese löslichen Ver-309842/10 897315508bindungen an das polymere Material chemisch binden unter Erhaltung ihrer chemischen und biologischen Reaktivität.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Gele Copolymere von hydrophilen Lonomeren wie Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Cligo- oder Polyglycol acryl at en, Oligo- oder Polyglyicolmethaerylaten, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrylamiden, liethaerylamiden, Aminoalkylacrylaten, Aminoalkylmethacrylaten, Acrylsäure oder Methacrylsäure mit monomeren Divinyl- oder Polyvinylverbindungen wie Alkyldiacrylaten, Alkyldimethacrylaten, Oligo- oder Polyglykoldiacrylaten, Oligo- oder Polyglykoldimethacrylaten, Alkylen-bia-acrylamiden oder üivinylbenzol verwendet werden.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung des Gels mit Bromcyan, Säureanhydriden oder Säurechloriden, Diisocyanaten oder Isothiocyanaten durchgeführt wird.309842/ 1089
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