DE2605797C3

DE2605797C3 - Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen

Info

Publication number: DE2605797C3
Application number: DE2605797A
Authority: DE
Inventors: Murray Campbell Hoffman Estates Ill. Fusee; Joseph Northbrook Ill. Levy
Original assignee: UOP LLC
Current assignee: Honeywell UOP LLC
Priority date: 1975-02-18
Filing date: 1976-02-13
Publication date: 1986-02-13
Also published as: CS209424B2; DD123346A5; IT1055978B; DE2605797B2; YU37476A; DE2605797A1; PL102119B1; FR2301533B1; ZA76871B; PT64790A; AU497243B2; EG11923A; DK145104B; ATA116176A; DK145104C; BR7600989A; NO760511L; JPS571988B2; BE838684A; NL7601580A

Description

Es ist bekannt, daß Enzyme, die Proteinnatur haben und gewöhnlich wasserlöslich sind, biologische Katalysatoren umfassen, die dazu dienen, viele und unterschiedliche chemische Reaktionen zu regulieren, die in lebenden Organismen auftreten. Die Enzyme können auch isoliert und auf analytischen, medizinischen und industriellen Anwendungsgebieten verwendet werden. Beispielsweise finden sie Verwendung in industrieller Anwendung bei der Herstellung von Lebensmittelprodukten, wie Käse oder Brot, und außerdem werden sie bei der Herstellung alkoholischer Getränke verwendet.

Einige spezielle Anwendungen in der Industrie sind beispielsweise die Verwendung von Enzymen zur Auftrennung von Aminosäuren, bei der Modifizierung von Penicillin unter Bildung verschiedener Substrate derselben, die Verwendung verschiedener Proteasen bei der Käseherstellung, beim Zarünachen von Fleisch, für Detergenspräparate, bei der Lederherstellung und als Verdauungshilfen, die Verwendung von Carbohydrasen bei der Stärkehydrolyse, bei der Rohrzuckerinversion, bei

ίο der Glukoseisomerisierung usw, die Verwendung von Nucleasen bei der Geruchseinstellung oder die Verwendung von Oxidasen für die Oxidationsverhinderung und Farbeinstellung von Nahrungsmitteln. Diese Verwendungen sowie viele andere sind in der Literatur ausführlieh beschrieben.

Wie oben ausgeführt wurde, sind Enzyme, da sie gewöhnlich wasserlöslich und allgemein instabil und leicht deaktivierbar sind, auch schwierig aus den Lösungen, in welchen sie benützt werden, für eine nachfolgende Wiederverwendung zu isolieren, bzw. es ist schwierig, ihre katalytische Aktivität über relativ lange Zeiträume zu erhalten. Diese Schwierigkeiten führen natürlich zu erhöhten Kosten bei der Verwendung von Enzymen für gewerbliche Zwecke infolge des Erfordernisses, dieses Enzym häufig zu ersetzen, wobei ein solcher Ersatz gewöhnlich mit jeder Anwendung erforderlich ist Um den hohen Kosten eines Ersatzes oder Austausches entgegenzuwirken, wurde vorgeschlagen, die Enzyme vor ihrer Verwendung zu immobilisieren bzw. unlöslich zu machen. Durch eine Immobilisierung bzw. Trägerfixierung der Enzyme durch verschiedene Systeme, die nachfolgend im einzelnen noch erläutert werden, ist es möglich, die Enzyme relativ zu stabilisieren und daher die Wiederverwendung des Enzyms zu ermöglichen, das sonst einer Deaktivierung unterliegen oder in dem Reaktionsmedium verlorengehen würde. Solche immobilisierten bzw. trägerfixierten oder unlöslich gemachten Enzyme können in verschiedenen Reaktorsystemen verwendet werden, wie in gepackten Säulen, gerührten Behälterreaktoren usw., je nach der Natur des Substrates, das darin benutzt wird. Im allgemeinen liefert die Immobilisierung der Enzyme eine günstigere oder breite Umgebungsstabilität, ein Minimum an Auslaufproblemen und Materialbehandlung sowie die Möglichkeit, die Aktivität des Enzyms selbst aufzubessern.

Es sind verschiedene allgemeine Methoden und Modifikationen derselben zur Immobilisierung und Trägerfixierung von Enzymen bekannt Eine erste Methode besteht in einer bloßen Adsorption des Enzyms auf der Oberfläche eines Trägers. Ein ähnliches Verfahren ist in der US-PS 38 02 909 beschrieben, bei dem anorganische Teilchen mit Albumin fein vermählen und durch Adsorptionskräfte aneinander gebunden werden, worauf das Albumin mit dem Enzym umgesetzt wird. Man bekommt bei dieser Methode nur schwache Bindungskräfte zwischen dem Träger und dem Enzym, so daß letzteres relativ leicht desorbiert und ausgewaschen wird. Gemäß der US-PS 35 56 945 wird das Enzym in ähnlicher Weise über Silanol-Gruppen eines anorganischen Trägers direkt an diesen gebunden. Die US-PS 35 56 945 und die DE-OS 19 44 418 befassen sich mit trägerfixierten Enzymen, bei denen die Enzyme chem'sch über ein intermediäres Silankupplurigsmittel an einen anorganischen Träger gebunden sind. In ähnlicher Weise benutzt auch die US-PS 37 83 101 eine Organosilanzusammensetzung als Bindemittel, wobei das Enzym kovalent an einen Glasträger mit Hilfe eines Silanzwischenbindemittels gebunden ist, der Siliciumanteil des Kupplungs-

mittels an den Träger gebunden ist, während der organische Anteil des Kupplungsmittels an das Enzym gebunden ist und die Zusammensetzung ein Metalloxid auf der Oberfläche des Trägers zwischen dem Träger und dem Siliciumanteil des Kupplungsmittels enthält. Auch bei 5 diesen Systemen ist die Bindung des Enzyms an den Träger relativ schwach, und das Enzym verliert erheblich an Aktivität durch die Immobilisierung.

Eine andere allgemeine Methode besteht darin, ein Enzym in einem Gelgitter oder Polymergerüst einzuschließen, wie gemäß der DE-OS 19 55 638. Solchermaßen trägerfixierte Enzyme haben stark verminderte Aktivität und schlechte mechanische Festigkeit in kontinuierlichen Fließsystemen, was zu einer Veränderung der Teilchengrößen und Porengrößen und als Folge hiervon zu Verstopfungen der Apparatur und zur Freisetzung von Enzym führt Außerdem können einige Porengrößen auch so klein werden, daß große Diffusionshindernisse für den Transport des Substrates und Produktes zu einer Reaktionsverzögerung führen, und dies trifft besonders dann zu, wenn man ein Substrat mit hohem Molekulargewicht verwendet Methoden unter Polymerisieren mit Röntgen- oder ^-Strahlen sind aufwendig und nicht für großtechnischen Maßstab geeignet und bergen die Gefahr einer Deaktivierung der Enzyme in sich.

Aus »Biochemical and Biophysical Research Communications«, Vol. 45 (1971), S. 1574 bis 1580, ist es bekannt, Enzyme über Glutaraldehyd an Polyacrylamidperlen zu binden. Ein solches trägerfixiertes Enzym mit organischem Träger hat aber nur geringe mechanische Festigkeit und wird leicht deformiert und schnell verschlissen.

Eine weitere allgemeine Methode ist die Vernetzung des Enzyms selbst oder auch mit dem Träger mit Hilfe bifunktioneller Substanzen. Diese Methode führt zu einem Mobilitätsmangel des Enzyms und einer sterischen Hinderung seiner aktiven Gruppen, da es nicht die für maximale Aktivität erforderliche Konfiguration einnehmen kann. Dies führt zu einer erheblichen Deaktivierung des Enzyms. Solche Verfahren sind in den DE-OS 23 45 185, 23 45 186 und 19 15 970 beschrieben. Ähnliche Verfahren beschreiben die US-PS 37 96 634 und 37 05 084, bei denen das Enzym zunächst als Schicht auf Kieselsäureteilchen bzw. einem macroporösen Reaktorkern adsorbiert und anschließend mit sich selbst vernetzt wird.

Schließlich besteht eine letzte allgemeine Methode in einer kovalenten Bindung des Enzyms an ein Polymer, das seinerseits auf einem inerten Träger niedergeschlagen ist. Diese Methode erfordert im allgemeinen aufwendige Vorbehandlungen, besonders durch Diazotierung. Außerdem ist diese Methode auf bestimmte Stoffkombinationen beschränkt, da das Polymer adsorptiv fest auf dem Träger haften und sich andererseits mit dem Enzym unter Ausbildung kovalenter Bindungen umsetzen muß. Solche Verfahren sind beispielsweise in der US-PS 37 15 278 und in »Abstract 166th Meeting, American Chemical Society, 1973«, sowie in der DE-OS 22 29 298 und der entsprechenden GB-PS 13 42 186 beschrieben. Bei diesen Verfahren wird auf einem anorganischen Träger ein Polymer als Schicht aufgebracht und dann mit dem Enzym umgesetzt. Dabei wird das Enzym weder an funktioneile Reste in Seitengruppen des Polymers gebunden, noch besteht die Möglichkeit einer gleichzeitigen Adsorption des Enzyms an den Träger. Auch die so gebundenen Enzyme haben daher ungenügende Mobilität, um die für maximale Aktivität erforderliche Konfiguration einnehmen zu können.

Aus »Bonded Stationary Phases in Chromatography, Arm Arbor Publishers Ina, 1974, Seiten 93 bis 112, ist es bekannt, für die Affinitätschromatographie große Moleküle über Verankerungsarme an eine Polymermatrix zu binden, um sie kleinen Molekülen leichter zugänglich zu machen. Die Druckschrift betont aber, daß solche Verankerungsarme bei immobilisierten Enzymsystemen keine Bedeutung haben.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand nun darin, die geschilderten Nachteile der bekannten Methoden zu beseitigen und auf einem Träger fest fixierte, dennoch aber durch ausreichende Mobilität hochaktive Enzyme zu bekommen, wobei ihre Träger hohe mechanische Festigkeiten haben sollen, um in kontinuierlichen Fließsystemen nicht deformiert oder abgerieben zu werden.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das in den Ansprüchen angegebene Verfahren gelöst

Eine spezielle Ausführungsform dieser Erfindung betrifft die Hersteilung eines immobilisierten Enzymverbundes, der ein organisch-anorganisches Grundmaterial aus einem porösen Kieselsäure-Tonerdeträger mit niedrigem Schüttgewicht und mit relativ großer Oberfläche, das auch anorganische Zusatzstoffe enthalten kann, sowie ein in situ hergestelltes Tetraäthylenpentamin-Glutaraldehyd-Polyniermaterial, das in den Poren des Kieselsäure-Tonerdeträgers adsorbiert und eingeschlossen ist, und schließlich das Enzym Glucoamylase umfaßt, welches kovalent an die an dem Polymermaterial hängenden Glutaraldehydgruppen im Endbereich dieser Gruppen oder nahe derselben gebunden und außerdem teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert ist

Im Gegensatz zu den Zusammensetzungen, die immobilisierte Enzyme nach dem Stand der Technik enthalten, können die Zusammensetzungen nach der Erfindung unter Verwendung relativ billiger Reaktanten sowie unter Benutzung einfacherer Stufen in dem Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung gewonnen werden. Außerdem ist die mechanische Festigkeit und die Stabilität der Enzymverbundpräparate nach der Erfindung größer als diejenige, die immobilisierte Enzyme nach dem Stand der Technik besaßen. Daher ist leicht ersichtlich, daß die Zusammensetzungen nach der Erfindung wirtschaftliche Vorteile besitzen, die sie für industrielle Anwendung brauchbar machen.

Infolge des speziellen Herstellungsverfahrens hängen an dem Polymermaterial Gruppen mit funktionellen Resten an den Enden oder nahe den Enden dieser Gruppen. Diese Gruppen wirken somit als Abstandshalter für das Enzym und gewährleisten dessen Mobilität und minimale sterische Hinderung, um die für maximale Aktivität erforderliche Konfiguration einnehmen zu können.

Das Polymermaterial ist in den Poren des anorganischen Trägers nicht nur adsorbiert, sondern auch formschlüssig fixiert und das Enzym nicht nur kovalent an das Polymermaterial, sondern zusätzlich noch durch Adsorptionskräfte an den anorganischen Träger gebunden, was eine optimale Trägerfixierung ergibt. Der Träger selbst ist widerstandsfähig gegen kontinuierliche Fließsysteme.

Das Verfahren kann nach der vorliegenden Erfindung in relativ einfacher Weise durchgeführt werden. Bei der bevorzugten Herstellungsmethode wird das anorganische poröse Trägermaterial mit einer Lösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung, des ersten bi- oder polyfunktionellen Monomers oder Polymerhydrolysats be-

handelt, wonach die nichtadsorbierte Lösung in an sich bekannter Weise entfernt wird, wie durch Ablaufenlassen. Es können auch andere billige organische Lösungsmittel, wie Aceton, Tetrahydrofuran oder dergleichen, als Träger für die oben erwähnter Monomere verwendet werden. Nach der Entfernung der nichtadsorbierten Lösung wird dann der feuchte poröse Träger mit dem anspruchsgemäßen Überschuß des zweiten bifunktionellen Monomers behandelt, wobei dieses zweite bifunktioneile Monomer ebenfalls in einer wäßrigen Lösung zugegeben wird. Dabei bildet sich ein polymeres Grundmaterial, das in den Poren des Trägers adsorbiert und eingeschlossen wird und von dem aus sich am Polymergrundgerüst hängende Gruppen des zweiten Monomers erstrecken. Diese Gruppen enthalten funktioneile Reste infolge der Tatsache, daß eine überschüssige Menge des zweiten bifunktionellen Monomers bei der Behandlung des Trägers verwendet wurde. Die unumgesetzten funktioneilen Reste sind dann für kovalente Bindungen an das Enzym verfügbar, das zu dem resultierenden organisch-anorganischen Grundmaterial zugesetzt wird, und zwar wiederum gewöhnlich in einer wäßrigen Lösung. Nach Entfernung der unumgesetzten Materialien, wie durch Behandlung, durch Waschen usw., ist das Enzym nicht nur kovalent an die am Polymer hängenden Gruppen mit funktioneilen Resten in deren Endbereichen oder nahe derselben gebunden, sondern ist teilweise auch an das Grundmaterial adsorbiert. Es ist daher leicht ersichtlich, daß das gesamte Immobilisierungsverfahren in einfacher und billiger Weise unter Benützung wäßriger bzw. billiger Lösungsmittelmedien durchgeführt werden kann, wobei das Verfahren über einen Temperaturunterschied durchgeführt wird, der im Bereich von unterhalb Umgebungstemperatur (etwa 5°C) bis zu erhöhten Temperaturen von etwa 60°C liegen kann und vorzugsweise bei Umgebungstemperatur (etwa 20 bis 25° C) liegt Dieses Verfahren wird unter Benutzung einer minimalen Zahl von Verfahrensstufen durchgeführt und gestattet außerdem eine leichte Entfernung der überschüssigen Reaktionspartner und der fertigen Zusammensetzung.

Viele der anorganischen Träger, die im Stand der Technik beschrieben sind, sind Materialien mit »kontrollierter Porengröße«, wie Glas, Tonerde usw., mit einem Porendurchmesser von 500 bis 700 A für etwa 96% des Materials und mit einem maximalen Porendurchmesser von 1000 A, einer Oberfläche von 40 bis 70 m²/g und Teilchengrößen von 40 bis 80 Maschen (US-Siebreihe). Außerdem können diese Träger mit Metalloxiden, wie Zirkonoxid und Titanoxid, überzogen sein, um größere Stabilität zu erreichen. Im Gegensatz zu diesen Trägern liegt es im Erfindungsgedanken, daß die anorganischen porösen Träger, die hier benützt werden, Materialien sind, die Porendurchmesser im Bereich von 100 A bis zu 55 000 A besitzen, wobei so viel wie 25 bis 60% des porösen Trägermaterials Poren mit Durchmessern oberhalb 20 000 A besitzen und die Oberfläche im Bereich von 150 bis 200 m²/g liegt. Die Teilchengröße kann auch über einen weiten Bereich von 10 bis 20 Maschen bis zu einem feinen Pulver variieren, wobei diese Teilchengröße von dem speziellen System abhängt, in welchem sie verwendet werden. Die porösen Trägermaterialien können auch mit verschiedenen Oxiden des oben beschriebenen Typs überzogen werden, oder sie können darin eingelagert verschiedene andere anorganische Materialien enthalten, wie Borphosphat usw., wobei diese anorganischen Materialien dem Trägermaterial spezielle Eigenschaften verleihen. Eine besonders brauchbare Form von Trägermaterial besteht aus einem Keramikkörper, der den Porositätstyp haben kann, welcher hier für Materialien nach der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, oder er kann honigwabenartig aufgebaut sein mit verbindenden Macrokanälen in dem gesamten Körper, wobei solche Materialien allgemein als Monolithe bekannt sind und mit verschiedenen Typen poröser Tonerde, Zirkonoxid usw. beschichtet sein können. Die Verwendung solcher Trägertypen hat den besonderen Vorteil, daß sie den freien Fluß selbst hochviskoser Substrate gestattet, die oftmals industriellen enzymkatalysierten Reaktionen unterzogen werden.

Die anorganischen porösen Trägermaterialien, die als eine Komponente des kombinierten organisch-anorganischen Grundmaterials verwendet werden, sind beispielsweise bestimmte Metalloxide, wie Tonerde und besonders ^-Tonerde, Kieselsäure, Zirkonoxid oder Gemische der Metalloxide, wie Kieselsäure-Tonerde, Kieselsäure-Zirkonoxid, Kieselsäure-Magnesia, Kieselsäure-Zirkonoxid-Tonerde usw., oder ^-Tonerde, die andere anorganische Verbindungen, wie Borphosphat usw, enthält, Keramikkörper usw. sowie Kombinationen der obigen Materialien und eines der Materialien, die als Überzug für ein anderes Material dienen kann, welches selbst den Träger darstellt

Die Polymermaterialien, die in situ in solcher Weise gebildet werden, daß das Polymermaterial in den Poren des anorganischen Trägers des oben beschriebenen Typs teilweise adsorbiert und teilweise eingeschlossen ist, kann nach den oben beschriebenen allgemeinen Methoden hergestellt werden, d. h. indem zunächst eine Lösung mit 2 bis 25% des bi- oder polyfunktionellen Monomers oder Polymerhydrolysats adsorbiert wird, wobei das Monomer oder Polymerhydrolysat vorzugsweise in Wasser oder anderen Lösungsmitteln löslich ist, welche letztere gegenüber den anschließend verwendeten Reaktionen inert sind. Wie oben ausgeführt wurde, wird das zweite bifunktionelle Monomer dann in ähnlicher Weise zugesetzt, um durch Umsetzung mit dem auf dem anorganischen Träger adsorbierten ursprünglichen Zusatzstoff ein organisch-anorganisches Grundmaterial zu bilden. Die reaktiven Reste sind in der Lage, sich kovalent mit den anfänglichen Zusatzstoffen und anschließend, nach dem Auswaschen unumgesetzter Materialien, mit dem Enzym zu verbinden, das in der anschließenden Stufe zugegeben wird, wobei das Enzym dann kovalent an die funktioneile Gruppe im Endbereich oder nahe dem Endbereich der funktionellen Kette gebunden ist und gleichzeitig auch an das Grundmaterial adsorbiert ist. Nach Zugabe des Enzyms zu dieser Zusammensetzung bildet sich ein relativ stabiles trägerfixiertes Enzym, das hohe Aktivität und hohe Stabilität besitzt. Außerdem besitzt die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung auch sehr vielseitige Verwendbarkeit zusätzlich zu den anderen oben aufgezählten Vorteilen. Wie nachfolgend im einzelnen aufgeführt wird, behalten je nach den verwendeten Reaktionspartnern die trägerfixierten Enzyme ihre Stabilität in sauren oder alkalischen Medien. Durch diese Eigenschaften ist es möglich, die Verwendungen dieser trägerfixierten Enzyme auszuweiten.

Infolge des großen Überschusses der bifunktionellen Moleküle mit Abstandshalterfunktion, die verwendet werden, enthält das Polymergrundmaterial, das gebildet wird, daran hängende Gruppen, die die Abstandshaltermoleküle umfassen, wobei sich diese Moleküle von dem Grundmaterial aus erstrecken und reaktive Reste ha-

ben, die in ihren Endbreichen oder nahe diesen vorliegen und in der Lage sind, mit dem Enzym zu reagieren und dieses über kovalente Bindungen an die Abstandshaltermoleküle zu binden. Außerdem wird das Enzym konkurrierend auch teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert, wenn es zugegeben wird, nachdem die unumgesetzten Reagentien durch Waschen von dem organisch-anorganischen Grundmaterial entfernt wurden. Bindung des Enzyms lediglich an das organische Grundmaterial beeinflußt gewöhnlich nicht die Abhängigkeit der Löslichkeit des Aggregats von dem pH-Wert der Lösung, doch wenn der anorganische Träger entsprechend den obigen Angaben eingeschlossen wird, zeigt die Gesamtzusammensetzung bzw. das trägerfixierte Enzym hohe Stabilität über einen relativ weiten pH-Bereich von 3 bis 9, wobei die Stabilität natürlich auch eine Funktion der optimalen pH-Eigenschaften des verwendeten speziellen Enzyms und des verwendeten anorganischen Trägers ist Daher ist leicht ersichtlich, daß ein geeignetes organisch-anorganisches Grundmaterial, das in vielen Situationen anwendbar ist, mit dem Trägermaterial gebildet wird, indem man irgendeine der oben beschriebenen Materialtypen adsorbiert und dann mit dem bifunktionellen Molekül behandelt, um es mit dem ursprünglichen Zusatzstoff umzusetzen, vorausgesetzt, daß ein genügend großer Überschuß des bifunktionellen Moleküls verwendet wird, um an dem Polymer hängende Gruppen zu liefern, die in der Lage sind, anschließend mit dem zu immobilisierenden Enzym zu reagieren. Durch Benützung dieser funktionellen, an dem Polymer hängenden Gruppen als Bindungsstellen für die Enzyme bekommen die Enzyme eine größere Mobilität, so daß die katalytische Aktivität des Enzyms über eine relativ längere Zeit auf einem hohen Stand bleibt, als dies möglich ist, wenn das Enzym nach irgendwelchen anderen Methoden immobilisiert wurde, wie durch Einschluß in ein Gelgitter, Adsorption auf einer festen Oberfläche oder Vernetzung des Enzyms mit Hilfe bifunktioneller Reagentien. Selbstverständlich ergeben jedoch nicht alle Rezepturen gleichwertige Ergebnisse hinsichtlich der Stabilität oder Aktivität

Beispiele von Enzymen, die durch eine kovalente Bindungsreaktion immobilisiert werden könneii und die eine Aminogruppe enthalten, welche mit einem Aldehydrest oder Isocyanatorest der an dem Polymer hängenden Gruppe reagieren kann, während das Polymermaterial in den Poren eines porösen Trägermaterials eingeschlossen und adsorbiert ist, sind beispielsweise Trypsin, Papain, Hexokinase, ^-Galactosidase, Ficin, Bromelain, Milchsäuredehydrogenase, Glucoamylase, Chymotrypsin, Pronase, Acylase, Invertase, Amylase, Gluyoseoxidase, Pepsin, Rennin, Pilzprotease usw. Im allgemeinen kann jedes Enzym verwendet werden, dessen aktive Stelle nicht in die kovalente Bindung eingeschlossen ist Die Herstellung der Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung erfolgt bevorzugt ansatzweise, wie bereits im einzelnen beschrieben wurde, obwohl es innerhalb des Erfindungsgedankens liegt, das fertige zusammengesetzte Produkt gegebenenfalls auch in kontinuierlicher Betriebsweise herzustellen. Wenn ein kontinuierliches Verfahren angewendet wird, wird eine Menge des porösen festen Trägermaterials in eine geeignete Apparatur, gewöhnlich eine Säule, gegeben. Das poröse feste Trägermaterial kann in irgendeiner erwünschten Form vorliegen, wie als Pulver, Pellets, Monolithe und dergleichen, und wird in die Säule eingeführt, wonach eine vorzugsweise wäßrige Lösung, beispielsweise eines anspruchsgemäßen polyfunktionelkn Amins, in Berührung mit dem porösen Träger gebracht wird, bis letzterer mit der Aminlösung gesättigt ist, und den Überschuß läßt man dann ablaufen. Das bifunktionelle Molekül, wie Glutardialdehyd, wird dann in Berührung mit dem gesättigten Träger gebracht. Die Bildung des polymeren Grundmaterial erfolgt somit in einem wäßrigen System, wobei die Umsetzung während einer Zeit erfolgt, diie im Bereich von 1 bis 10 Stunden liegen kann, gewöhnlich aber von kurzer Dauer ist. Nach Entfernung

ίο des überschüssigen Glutardialdehyds durch Ablaufenlassen und Auswaschen wasserlöslicher und unumgesetzter Materialien, was vorzugsweise mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 4 erfolgt, wird eine w äßrige Lösung des Enzyms in Kontakt mit dem Träger gebracht oder durch die Säule im Kreislauf geführt, und diese Stufe bewirkt eine kovalente Bindung des Enzyms an die endständigen Aldehydgruppen der an dem Polymer hängenden Moleküle mit funktionellen Resten, welche sich von dem Grundmaterial aus erstrecken. Dies geschieht so lange, bis es keine weitere physikalische Adsorption und/oder kovalente Bindung des Enzyms an das organisch-anorganische Grundmaterial und die daran hängenden Moleküle mehr gibt. Das überschüssige Enzym wird in dem Auslauf nach Ablaufenlassen und V/aschen der Säule zurückgewonnen. Die Säule ist jetzt fertig für die Verwendung in chemischen Reaktionen, worin die katalytische Wirkung des Enzyms auftritt. Die Verfahren werden meistens in Zeit-, Temperatur- und Konzentrationsparametern durchgeführt, wie sie oben irn Zusammenhang mit dem Ansatzverfahren beschrieben wurden, und führen zu vergleichbaren immobilisierten Enzymkomplexen. Es liegt auch innerhalb des Erfindungsgedankens, daß mit geeigneten Modifikationen des pH-Werts und der Temperatur, die für den Fachmann auf der Hand liegen, das Verfahren für eine große Vielzahl anorganischer poröser Träger und Enzyme angewendet werden kann.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläutemng der Erfindung.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wurden 2 g einer porösen Kiesels;äure-Tonerdemasse mit darin eingelagertem Borphosphat, mit einer Teilchengröße von 40 bis 80 Maschen (US-Siebreihe), mit einem Porendurchmesser im Bereich von etwa 100 bis etwa 55 000 A und mit einer Oberfläche von etwa 150 bis 200 m²/g als der anorganische Träger für die neue Zusammensetzung nach der Erfindung verwendet. Dieser Träger wurde bei einer Temperatur von etwa 260" C (500° F) caiciniert, um darin enthaltene adsorbierte Feuchtigkeit zu entfernen. Danach wurde der Träger mit 55 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von Tetraäthylenpentamin bei Umgebungstemperatur während 1 Stunde im Vakuum behandelt, um die Eindringung der Lösung in die Poren des Trägers zu erleichtern. Die überschüssige nichtadsorbierte Lösung wurde dann abgegossen, wobei etwa 25% des Tetraäthylenpentamins in den Poren des Trägers adsorbiert waren. Danach wurde der feuchte Träger mit 25 ml einer 5%igen wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd bei Umgebungstemperatur behandelt, und es fand eine fast unmittelbare Reaktion unter Bildung eines unlöslichen Reaktionsproduktes auf der Oberfläche und in den Poren des Trägers statt Die überschüssige Glutardialdehydlösung wurde dann abgegossen und der organisch-anorganische Komplex gewaschen, um unumgesetzte und unadsorbierte Reaktanten zu entfernen, wo-

bei das Waschen zunächst mit Wasser und dann mit einer 0,02molaren Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,2 erfolgte und das Waschen auf einer Temperatur von 45° C durchgeführt wurde. Danach wurde eine Enzymlösung mit einem Gehalt von etwa 200 mg Glucoamylase je 25 ml Wasser zugesetzt, und man ließ diese Lösung mit der Zusammensetzung bei Umgebungstemperatur während 1 Stunde reagieren. Am Ende dieser 1 stündigen Periode wurde die überschüssige Glucoamylaselösung abgegossen, und das trägerfixierte Enzym wurde mit Wasser gewaschen, um ungebundenes und/oder unadsorbiertes Enzym zu entfernen. Die Zusammensetzung wurde dann 24 Stunden mit einer Acetatpufferlösung, ähnlich der oben beschriebenen, ausgelaugt. Die Menge an adsorbiertem und/oder kovalent gebundenem Enzym wurde durch Dumas-Mikrogaschromatographieanalysen vor und nach der Zugabe des Enzyms bestimmt. Die Aktivität des trägerfixierten Enzyms wurde dann an Hand der Glucosemenge bestimmt, die unter Verwendung einer 30%igen verdünnten Stärkelösung als Substrat bei pH 4,2 und 6O⁰C und unter Verwendung des Worthingtons's Glucostatverfahrens zur Analyse der Glucose gebildet wurde, wobei letzteres Verfahren als das zuverlässigere Verfahren zur Bestimmung der Brauchbarkeit des trägerfixierten Enzyms angesehen wird. Eine Aktivität von 28 Einheiten/ Gramm Träger mit einer Enzymbeladung von 29 mg/g Träger wurde nach diesem Verfahren erhalten (eine Einheit bedeutet die Produktion von 1 g Glucose/Std, bei 6O⁰C gemäß den Testbestimmungen). Es sei bemerkt, daß trotz der bekannten Löslichkeit bei pH 4,2 des trägerfixierten Enzyms bei Herstellung in Abwesenheit eines anorganischen Trägers während der Auslaugung mit einer Pufferlösung von pH 4,2 ein vernachlässigbarer Enzymverlust aus dem kombinierten anorganisch-organischen Komplex auftrat Dies wurde durch Analyse des Auslaufs aus der Behandlung demonstriert.

Beispiel 4 Beispiel 2

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In diesem Beispiel wurde das Verfahren des Beispiels 1 mit der Ausnahme wiederholt, daß der anorganische poröse Träger eine Teilchengröße von 10 bis 30 Maschen besaß. Die Kieselsäure-Tonerdemasse mit einem Gehalt an darin eingelagertem Borphosphat wurde mit Tetraäthylenpentamin, Glutardialdehyd und Glucoamylase in ähnlicher Weise wie oben behandelt Man erhielt einen aktiven immobilisierten Enzymkomplex, jedoch mit verminderter Aktivität, wahrscheinlich wegen eines Diffusionsproblems durch die größere Teilchengröße

Beispiel 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden 2 g einer Kieselsäure-Tonerdemasse, die die gleichen physikalischen Eigenschaften der Teilchengröße, des Porendurchmessers und der Oberfläche wie in Beispiel 1 besaß, mit einer Acetonlösung von Tetraäthylenpentamin behandelt und anschließend erfolgte die Behandlung mit einer Tolyldiisocyanatlösung auch in Aceton statt der wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd. Nach dem Abgießen der überschüssigen Diisocyanatlösung und nach Waschen mit Wasser wurde der organisch-anorganische Komplex weiter mit einer wäßrigen Glucoamylaselösung behandelt Wie in Beispiel 1, umfaßte das fertige Produkt einen aktiven, vollständig unlöslichen Enzymkomplex.

Um zu erläutern, daß verschiedene Konzentrationen von Lösungen verwendet werden können, um das erwünschte Produkt herzustellen, wurde das obige Beispiel 1 mit der Ausnahme wiederholt, daß höher konzentrierte Lösungen der verschiedenen Reagcnticn verwendet wurden. Beispielsweise wurden 2 g einer Kieselsäure-Tonerdemasse von 10 bis 30 Maschen mit 25 ml einer 20%igen Tetraäthylenpentaminlösung behandelt, und nach dem Abgießen wurden 50 ml einer 25%igen Glutardialdehydlösung zugesetzt Dieser Komplex wurde nach dem Waschen dann mit einer wäßrigen Lösung von Glucoamylase behandelt, um ein immobilisiertes trägerfixiertes Enzym herzustellen, das eine Aktivität von etwa 12 Einheiten/Gramm, bezogen auf den Glucostattest, besaß.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wurde eine Kieselsäure-Tonerdemasse mit einer Teilchengröße von 10 bis 30 Maschen, einem Porendurchmesser im Bereich von etwa 100 bis etwa 55 000 Ä und mit einer Oberfläche von etwa 150 bis 200 m²/g durch Zugabe von Tetraäthylenpentamin in einer l°/oigen teilhydrolysierten wäßrigen Kollagenlösung behandelt, wobei das Kollagen als zusätzliches Bindemittel benützt wurde. Nach dem Ablaufenlassen und Umsetzen mit Glutardialdehyd wurde das organisch-anorganische Grundmaterial dann mit einer Glucoamylaselösung nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 1 behandelt, um ein aktives trägerfixiertes Enzym herzustellen.

Beispiel 6

Um zu erläutern, daß verschiedene Enzyme bei der Herstellung der erwünschten Zusammensetzungen verwendet werden können, wurde eine Kieselsäure-Tonerdemasse, die darin eingelagert Borphosphat enthielt, mit einer Tetraäthylenpentaminlösung behandelt, dekantiert und gewaschen, und dann wurde eine Glutardialdehydlösung zugesetzt, und die resultierende Zusammensetzung wurde nun mit einer wäßrigen Lactaseiösung behandelt Dies ergab ein aktives trägerfixiertes Enzym. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um Enzyme, wie Proteasen, Glucoseisomerasen und Glucoseoxidasen, zu binden und aktive trägerfixierte Enzyme zu bekommen.

Beispiel 7

In diesem Beispiel enthielt eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm 14,2 g eines aktiven trägerfixierten Enzyms, das aus Glucoamylase hergestellt worden war, welche an einen porösen Kieselsäure-Tonerdeträger von 10 bis 30 Maschen mit darin eingelagertem Borphosphat gebunden war, wobei das trägerfixierte Enzym in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war. Die Säule wurde kontinuierlich während 30 Tagen bei einer Temperatur von 45° C verwendet um eine wäßrige 30%ige verdünnte Stärkelösung zu hydrolysieren, die auf pH 4,2 gepuffert worden war. Der Auslauf wurde hinsichtlich der Glucoseproduktion unter Verwendung des Worthington-Glucostatverfahrens analysiert Es wurde gefunden, daß es während dieses Zeitraumes keinen erkennbaren Verlust an Enzymaktivität gab und daß der Prozentsatz der Umwandlung von

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Stärke in Glucose bei dieser Temperatur und bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 150 ml/h 62% betrug.

Beispiel 8

Um die Tatsache zu erläutern, daß verschiedene Substrate oder Träger benützt werden können, um die erwünschten Zusammensetzungen herzustellen, wurde ein mit Tonerde überzogener Monolith, der aus einem honigwabenartigen Keramikkörper mit verbindenden Macrokanälen bestand, in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, d. h. der Monolith wurde mit Lösungen von Tetraäthylenpentamin, Glutardialdehyd und einem Glucoamylaseenzym behandelt, wobei die Behandlung mit einem Stufenverfahren erfolgte, das das oben is beschriebene Dekantieren, Waschen und Auslaugen umfaßte. Der ursprüngliche Keramikmonolith besaß ein Trockengewicht von 256 g, wovon 13% aus Tonerdeüberzug bestanden. Das fertige immobilisierte trägerfixierte Enzym wurde zu einer Säule in einer Glasrohre mit einem Innendurchmesser von 70 mm gemacht, um kontinuierlich mit Hilfe einer geeigneten Pumpapparatur in einem temperaturkontrollierten Behälter arbeiten zu können, wobei der Behälter auf einer Temperatur von 45°C gehalten wurde. Während einer 40tägigen Periode kontinuierlicher Benutzung für die Hydrolyse einer 30%igen gepufferten verdünnten Stärkelösung fand man, daß nur etwa 3% der ursprünglichen Aktivität des trägerfixierten Enzyms verlorengingen, während eine Fließgeschwindigkeit von etwa 85 ml/h aufrechterhalten wurde. Außerdem wurde gefunden, daß während der 40tägigen Periode etwa 80% der Stärke in Glucose umgewandelt wurden. Um die Eigenschaften des Systems weiter zu studieren, wurden anschließend Veränderungen der Fließgeschwindigkeit vorgenommen, wobei gefunden wurde, daß es bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 38 ml/h möglich war, eine Umwandlung im Bereich von 92 bis 93% der Stärke in Glucose zu bekommen. Die relativ lange Zeit, während der dieses Enzym verwendet wurde, um Stärke in Glucose umzuwandeln, ohne daß ein wesentlicher Verlust an Enzymaktivität entweder durch Desorption oder Deaktivierung auftrat, zeigte die lange Lebensdauer des Katalysators.

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Beispiel 9

In diesem Beispiel wurde ein Monolithtyp von trägerfixiertem Enzym in einer Säule ähnlich wie in Beispiel 8 hergestellt, wobei die Ausnahme darin bestand, daß das Enzym, das zur Herstellung des Komplexes verwendet wurde, Lactase statt Glucoamylase war. Das trägerfixierte Enzym wurde hinsichtlich der Stabilität unter kontinuierlichem Fluß geprüft, wobei die Temperatur während 29 Tagen auf 37° C gehalten wurde. Es wurde wiederum gefunden, daß kein merklicher Verlust an Aktivität des immobilisierten trägerfixierten Enzyms eintrat Dieses immobilisierte Enzym wurde bei der Behandlung einer 5%igen Lactoselösung verwendet, die auf pH 4,2 gepuffert worden war, wobei die Lactoselösung der Säule mit einer Geschwindigkeit von 54 ml/h zugeführt wurde. Während der 29tägigen Periode wurde gefunden, daß es eine etwa 35%ige Umwandlung von Lactose in Glucose und Galactose ergab.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten, trägerfixierten Enzymen durch Tränken eines anorganischen porösen Trägers mit einer ersten Lösung eines bi- oder polyfunktione'Jen Momomers, PoIymerhydrolysates oder Polymers, Entfernung der nicht adsorbierten ersten Lösung, anschließende Umsetzung mit einer zweiten Lösung eines bifunktionellen Monomere zu einem organischen Polymer und daran anschließende Zugabe einer Enzymlösung zu dem resultierenden orgamisch-anorganischen Grundmaterial und Entfernung der unumgesetzten Materialien, wobei man als Monomer der ersten Lösung Tetraäthylenpentamin oder Pentaäthylenhexamin und als Monomer der zweiten Lösung Glutardialdehyd oder als Monomer der ersten Lösung Tetraäthylenpentamin und als Monomer der zweiten Lösung Tolyldiisocyanat oder als Monomer und Polymerhydrolysat der ersten Lösung ein Gemisch von Tetraäthylenpentamin und teilhydrolysiertem Kollagen und als Monomer der zweiten Lösung Glutardialdehyd verwendet, dadurch gekennzeichnet, daß man die zweite Lösung mit einem genügend großen Überschuß des bifunktionelien Monomere verwendet, der an dem Polymer hängende Gruppen dieses zweiten Monomere liefert, die in der Lage sind, anschließend mit dem Enzym zu reagieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als anorganisches poröses Trägermaterial ^-Tonerde oder Kieselsäure-Tonerde, besonders Borphosphat enthaltende Kieselsäure-Tonerde, oder einen mit poröser Tonerde überzogenen honigwabenartigen Keramikkörper mit verbindenden Makrokanälen verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Glucoamylase, Lactase, Pilzprotease, Glucoseisomerase und/oder Glucoseoxidase enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sein anorganisches poröses Trägermaterial Porendurchmesser im Bereich von 100 bis 55 000 Ä mit so viel wie 25 bis 60% des porösen Trägermaterials mit Durchmessern oberhalb 20 000 Ä und eine Oberfläche im Bereich von 150 bis 200 m²/g besitzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Lösung, als zweite Lösung und als Enzymlösung wäßrige Lösungen verwendet.