DE2407840A1

DE2407840A1 - Kondensationsprodukt

Info

Publication number: DE2407840A1
Application number: DE19742407840
Authority: DE
Inventors: Regula Boeniger; Victor Dr Krasnobajew
Original assignee: L Givaudan and Co SA
Current assignee: Givaudan SA
Priority date: 1973-02-22
Filing date: 1974-02-19
Publication date: 1974-08-29
Also published as: CH579109A5; CA1022864A; AT341781B; JPS49117593A; FR2219185A1; BE811426A; IT1012114B; ATA141074A; GB1391172A; IL43904A; DK138750B; SE397960B; DK138750C; NL7400492A; IL43904A0; FR2219185B1

Description

19. Feb. 1974 Dr. fng. A. von der Werft
Dr. Franz Lederer

PATENTANWALT·

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L. Givaudan & Qe Societe Anonyme, Vernier-Geneve (Schweiz)

Kondensationeprodukt

Es ist bekannt, Proteine, insbesondere Enzyme, an feste Trägermaterialien zu binden und dadurch unlösliche Produkte mit vorteilhaften Eigenschaften zu erhalten. Die gebundenen, unlb'slichgemachten aber biologisch aktiven Proteine lassen sich beispielsweise einfacher handhaben als in ihrer nativen löslichen Form. An Träger gebundene Enzyme lassen sich wegen ihrer leichten Rückgewinnung bei stationären Verfahren mehrmals oder, mit besonderem Vorteil, in kontinuierlich arbeitenden Verfahren einsetzen.

So ist beispielsweise die Herstellung eines Eondensationsharzes mit einer grossen Bindungskapazität für Proteine durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin und Formaldehyd 3owie Diazotierung des PLeaktionsproduktes· bekannt.

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Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man ein in Bezug auf die Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Proteinen wesentlich aktiveres Produkt erhält, wenn man 1,3-Phenylendiamin mit Glutardialdehyd kondensiert. Die Erfindung betiäfft demgemäss ein neues, durch Kondensation von 1,3-Phenylendiamin und Glutardialdehyd erhaltenes Kondensationsprodukt.

Dieses Produkt weist gegenüber dem bereits bekannten, vorstehend erwähnten Kondensationsprodukt aus 1,3-Phenylendiamin und Formaldehyd eine Reihe von sehr vorteilhaften Eigenschaften auf, die es als Trägermaterial zur Fixierung von Proteinen verschiedenster Art und Provenienz hervorragend geeignet machen: Es werden grössere Partikel gebildet, die besser fOzoerbar sind, schneller sedimentieren und daher allgemein besser zu handhaben sind; die Bindungskapazität für Proteine ist "wesentlich grosser; das Kondensationsprodukt stellt bereits einen aktivierten Träger dar, der sofort eingesetzt werden kann und auf Grund der hohen Aktivität kann die Fixierung des Proteins in sehr einfacher Weise erfolgen. Schliesslich ist das Produkt, sehr billig.

Die Erfindung betrifft ferner das Verfahren zur Herstellung des 1,3-Phenylendiamin-G-lutardialdehyd-Harzes (PAG-Harz), das dadurch gekennzeichnet ist, dass man 1,3-Phenylendiamin mit Glutardialdehyd umsetzt, sowie die Verwendung des erhaltenen PAG-Harzes zur Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Proteinen, ein Verfahren zur Fixierung von Proteinen an das PAG-Harz und schliesslich an das PAG-Harz fixierte Proteine.;.

Als Proteine, die an das erfindungsgemässe Kondensationsprodukt gebunden werden können,"kommen Polypeptide, Antigene, Antikörper, Proteininhibitoren und insbesondere Enzyme in Betracht. Die Enzyme können pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Ursprungs sein. Es kommen in Betracht Hydrolasen

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(Peptidasen, Proteinasen, Desamj,nasen, Carbohydrasen, Esterasen), Lyasen bzw. Desmolasen (Hydrolyasen, Decarboxylasen, Aldolasen), Transferasen, Isomerasen, Oxidoreduktasen und Ligasen. Beispiele von Enzymen, von denen erfindungsgemäss unlösliche Enzympräparate hergestellt werden können, sind Alkoholdehydrogenase, Naringinase, Hesperidinase, ß-Glucosidase, α-Amyläse, Invertase, Amyloglucosidase, Urease, Trypsin, Ficin, Papain, Bromelin und Cytochrome.

Das molare Verhältnis der beiden Kondensationspartner 1,3-Phenylendiamin und Glutardialdehyd liegt zweckmässigerweise zwischen "1:1 und 1:10, wobei ein Verhältnis von etwa 1:3 bevorzugt ist.

Die Umsetzung kann in an sich bekannter Weise, beispielsweise in wässriger Lösung, vorzugsweise unter Zusatz einer Säure, durchgeführt werden. In einer besonderen Ausführungsform wird in-Gegenwart eines inerten, feinkörnigen, vorzugsweise anorganischen, insbesondere silikathaltigen Hilfsmittels gearbeitet. Beispiele solcher Hilfsmittel sind Silicagel, Diatomeenerde, Kieselgur, Bentonit, Wollastonit, poröses Glas, aber auch Metalloxide,wie Aluminiumoxid oder Hydroxylapatit. Bevorzugt wird Silicagel verwendet, beispielsweise mit einer Partikelgrösse von 0,05 - 0,2 mm, 70 - 325 mesh. Durch die Anwesenheit eines solchen Hilfsmittels wird eine homogene Partikelbildung bei der Kondensation erreicht, was wiederum eine bessere Sedimentation zur Folge hat. Die Kondensation in Gegenwart eines Hilfsmittels wird zweckmässig so durchgeführt, dass man die Partikel zunächst mit einer der beiden Komponenten in Berührung bringt und dann die zweite Komponente unter gleichzeitigem oder anschliessendem leichten Ansäuern zusetzt.

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Die erfindungsgemässe Kondensation kann in homogener Phase oder vorzugsweise in einem Zweiphasensystem unter Zusatz einer Säure, vorzugsweise Salzsäure, unter kräftigem Rühren oder Schütteln vorgenommen werden. Die Verwendung eines Zweiphasensystems fördert die' Bildung von sphärischen, weitgehend homogenen, leicht filtrierbaren und gut sedimentierenden Partikeln,die als Trägermaterial besonders gut geeignet sind.

Als zweite Phase eignen sich inerte, mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel, wie Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol, Toluol, Aethylacetat, Dioxan, Schwefelkohlenstoff. Als bevorzugtes organisches Lösungsmittel kann Chloroform verwendet werden.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhält man ein bereits sehr aktives Trägermaterial, das jedoch durch direkte Diazotierung noch weiter aktiviert werden kann. Die Diazotierung kann in an sich bekannter Weise durch Behandlung des Kondensationsproduktes mit Hltrit und Säure erfolgen.

Zur Fixierung des Proteins an das Trägermaterial behandelt man dieses mit einer wässrigen, vorzugsweise einer gepufferten Lösung des Proteins (1-50 mg/ml) bei einer Temperatur von etwa 0-30⁰C, vorzugsvreise 4⁰C bis Zimmertemperatur, was durch Rühren oder Schütteln geschehen kann. Auf Grund der hohen Aktivität des erfindungsgemässen Trägermaterials kann die Fixierung von Proteinen vorteilhaft auch durch einfache Filtration der Proteinlösung durch eine Trägerschicht, vorzugsweise eine mit Träger gefüllte Säule, wie es z.B. in der Säulenchromatographie üblich ist, erfolgen. So kann man beispielsweise Kulturfiltrate von Mikroorganismen, die Proteine bzw. Enzyme enthalten , direkt über eine Trägersäule laufen lassen, wobei die Proteine bzw. Enzyme selektiv fixiert werden. Man wäscht noch mit etwas Pufferlösung und 1 M KCl-Lösung nach, um nicht fixierte Proteine zu entfernen.

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Die an den erfindungsgemässen Träger fixierten Proteine sind im allgemeinen sehr stabil und es werden bei Enzymen sehr hohe spezifische Aktivitäten (Einheit/g) erreicht. Man erreicht Beladungen von mindestens 1:3-10 Gewichtsteilen Protein/Träger.

Die erfindungsgemässen trägergebundenen Proteine, insbesondere die Enzyme, können in an sich bekannter Weise verwendet werden, beispielsweise zu analytischen oder präparativen Zwecken oder in der Lebensmitteltechnologie beispielsweise bei der Bildung von Aromastoffen (siehe z.B. Scientific American 224, (No. 3) 26-33 (1971), Angew. Chemie 84, (8) 319-368 (1972¹ Chemiker Zeitung £6, (11), 595-602 (1972), C & EN, (15.2.71), 86-87). '

Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Die Mengenangaben des erhaltenen bzw. eingesetzten Trägers sind auf Trockengewicht bezogen.

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Beispiel 1

Zu einer Lösung von 5,0 g 1,3-Phenylendiamin in 50 ml Wasser und 10 ml konz. Salzsäure wurden 50 g G-lutardialdehyd (25$ige wässrige Lösung) unter kräftigem Rühren zugesetzt. Bei "beginnender Verfestigung des Re akt ions gemisches wurden 300 ml Wasser zugegeben. Es wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann über einen Büchner-Trichter unter vermindertem Druck abgesaugt. Die feinen polymeren Partikel wurden mit 0,1NlTaOH und Wasser gewaschen und in 0,01NITaOH aufbewahrt. Ausbeute: 13,8 g.

Beispiel 2

Zu einer Lösung von 5 g 1,3-Phenylendiamin in 300 ml Chloroform wurden unter kräftigem Rühren zunächst 50 g G-lutardialdehyd und nach weiteren 5 Minuten 20 ml 7 N Salzsäure zugesetzt. Das Reaktionsgemisch erstarrte sofort. Es wurde mit 100 ml Wasser versetzt und 5 Minuten geschüttelt, bis es wieder fliessfähig wurde. Nach Absaugen des Reaktionsgemisches über einen Büchner-Trichter wurden die polymeren Partikel mit 0,INNaOH gewaschen. Restliches Chloroform wurde durch Waschen mit etwas Aceton entfernt. Ausbeute: 14 g. Die so erhaltenen Trägerpartikel sind sphärisch, homogen und gut filtrierbar; sie wurden in Wasser oder in verdünnter Natronlauge aufbewahrt.

Beispiel 3

Zu einer Lösung von 2,0 g 1,3-Phenylendiamin in 50 ml Benzol wurden unter Rühren 30 g Silicagel gegeben. Nach 10-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Silicagel über einen Büchner-Trichter abfiltriert und trocken gesaugt. Am Silicagel noch haftendes Benzol stört den weiteren Reaktions-

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verlauf nicht. Die mit 1,3-Phenylendiamin imprägnierten Silicagelpartikel wurden dann schnell unter kräftigem Rühren zu einem Gemisch aus 50 g G-lutardialdehyd (25$ige Lösung in Wasser), 10 ml konz. Salzsäure und 340 ml Wasser gegeben. Es trat sofort Polymerisation ein. Das orange-rote Polymer wurde eine Stunde "bei Raumtemperatur gerührt, über einen Büchner-Trichter unter vermindertem Druck abfiltriert und mit Wasser neutralgewaschen. Das so erhaltene Trägermaterial wurde dann in einer schwach alkalischen Lösung (0,01N NaOH) aufbewahrt.

Beispiel 4

Zu 50 g Glutardialdehyd (2"5$ige wässrige Lösung) wurden 30 g Silicagel unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Masse wurde dann einer Lösung von 5 g l,3~Phenylendiamin in 300 ml Chloroform: unter kräftigem Schütteln zugegeben. Nach Zusatz von 10 ml 7N Salzsäure und 100 ml Wasser wurde nochmals 10 Minuten geschüttelt. Das Reaktionsprodukt wurde wie in Beispiel 2 beschrieben aufgearbeitet. Man erhielt homogene, sphärische Partikel, die schnell sedimentierten und sich ausgezeichnet filtrieren liessen.

Beispiel 5

Zu in Beispiel 3 und 4 analoger V/eise wurde weiteres Trägermaterial hergestellt, wobei anstelle von Kieselgel Diatomeenerde verwendet wurde.

Beispiel 6

Eine Suspension von 1 g des gemäss den Beispielen 1-5 erhaltenen Kondensationsproduktes in 30 ml Wasser wurde mit 1,15 nil konz. Salzsäure bei 0° angesäuert. Zu der eiskalten Suspension wurde tropfenweise und unter Rühren eine IE Natrium-

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nitrit-Lösung zugegeben. Nach beendeter Umsetzung wurde das schwarz-violett gefärbte Trägermaterial abfiltriert, mit kaltem Wasser und einer Pufferlösung (pH 4-8,5, je nach dem pH-Wert der Lösung des Proteins, das anschliessend fixiert werden soll) gewaschen.

Beispiel 7

0,23 g des gemäss Beispiel 2 erhaltenen Trägermaterials wurden in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise diazotiert und in eine Chromatographiesäule (1,5 x 15 cm) gefüllt. Eine Lösung von 1 g Amyloglucosidase (107 Einheiten/mg) in 100 ml 16 mMol Acetatpuffer (pH 4,8) wurde bei Zimmertemperatur und mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde über die Säule gegeben. Das fixierte Enzym wies eine Aktivität von 14*300 Einheiten/g Trägermaterial auf.

Beispiel 8

Eine Suspension von 1 g diazotiertem

Trägermaterial (hergestellt nach Beispiel 3 oder 4) in 20 mMol Phosphatpuffer (pH 5,2) wurde in eine Chromatographiesäule (1,5 x 15 cm) gefüllt. Eine Lösung von 500 mg Invertase (150 Einheiten/mg) in 50 ml 20 mMol Phosphatpuffer (pH 5,2) wurde bei Raumtemperatur und mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde durch die Säule gegeben. Die Säule wurde mit 50 ml 20 mMol Phosphatpuffer (pH 5,2) und 50 ml lNKaliumchloridlösung gewaschen. Fixierte Enzymmenge: 349 mg. Aktivität des fixierten Enzyms: 4'280 Einheiten/g Träger. Die Aktivität des gebundenen Enzyms war 8,5$ verglichen mit der des löslichen Enzyms. Das Gewichtsverhältnis Enzym zu Trägermaterial war etwa 1:3. Ein aus 20 g diazotiertem Trägermaterial

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in analoger Weise hergestelltes Invertasepräpa-rat zeigte eine Aktivität von 17_t6?o verglichen mit der des löslichen Enzyms.

Beispiel 9

1 g diazotiertes Trägermaterial (hergestellt gemäss Beispiel 3 oder 4) in 0,1M Phosphatpuffer (pH 7fO) wurde in eine Chromatographiesäule (1,5 x 15 cm) gefüllt. Eine lösung von 600 mg Picin in 60 ml einer Lösung aus 0,1 H Phosphatpuffer, 7 mMol Mercaptoäthanol und 1 mMol EDTA (pH 7,0) wurde bei Zimmertemperatur und mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde durch die Säule gegeben. Es wurde mit 50 ml der gleichen Pufferlösung und 50 ml 1 M Ealiumchlorid-Lösüng nachgewaschen. Fixiertes Enzym: 459 mg. Die mit Casein als Substrat bestimmte Aktivität des fixierten Enzyms betrug 15$ der Aktivität des löslichen Enzyms.

Beispiel 10

Durch eine Säule mit 2 g diazotierten^ gemäss den Beispielen 3 oder 4 erhaltenem Trägermaterial wurde eine Lösung von 4 g Uaringinase in 100 ml 0,05M Citratpuffer (pH 6,5) bei Raumtemperatur mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde gegeben. Die trägergebundene. Naringinase zeigte eine Aktivität von 32?° verglichen mit dem löslichen Enzym.

Beispiel 11

2 g diazotiertes, gemäss Beispiel 3 oder 4 erhaltenes Trägermaterial wurde 1 Stunde bei 4° mit einer Lösung von 600 mg Naringinase in 50 ml 0,05 M Citratpuffer (pH 6,5) geschüttelt. Die Aktivität der fixierten Naringinase betrug 50% verglichen mit der des löslichen Enzyms.

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Beispiel 12

In gleicher Weise wie in Beispiel 11 beschrieben_twurden 40 mg Hesperidinase in 50 ml 0,05 M Citratpuffer (pH 6,5) an das Trägermaterial gebunden. Die Aktivität des fixierten Enzyms betrug 27$ derjenigen des löslichen Enzyms.

Beispiel 13

Eine Lösung von ungereinigter Glueöseisomerase, erhalten aus dem teilweise gereinigten Kulturfiltrat eines Mikroorganismus (Streptomyces glaucescens), wurde über eine Säule, enthaltend 50 g diazotiertes, gemäss Beispiel 3 oder 4 hergestelltes Trägermaterial gegeben. Es wurde mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,5) und 1 M Kaliumchlorid-Lösung gewaschen. Die Aktivität der fixierten G-lucoseisomerase betrugt 74$ der des löslichen Enzyms, bestimmt durch Messung der &u Fructose isomerisierten Glucose einer 10$igen Lösung.

Beispiel 14 -

Eine Lösung von 100 mg Rinderserumalbumin in 50 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,5) wurde bei Raumtemperatur und einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde über eine Chromatographiesäule (1,5 x 5 cm), enthaltend 0,5 g diazotiertes, gemäss Beispiel 3 oder 4 erhaltenes Trägermaterial gegeben. Es wurden 68,4 mg des Albumins an das Harz gebunden, sodass das Gewichtsverhältnis von gebundenem Protein zu Trägermaterial etwa l,4ilO betrug.

Unter Verwendung von nicht diazotiertem Trägermaterial wurde etwa dasselbe Kupplungsverhältnis erhalten.

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Claims

Patentansprüche

JL Verfahren zur Herstellung eines Kondensationsproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass man 1,3-Phenylendiamin mit Glutardialdehyd umsetzt.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 1 Mol 1,3-Phenylenamin mit 1-10 Molen Glutardialdehyd umgesetzt wird.
3. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kondensation in Gegenwart eines feinkörnigen, festen inerten Hilfsmittel stattfindet.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Hilfsmittel ein Silikat oder ein silikathaltiges
Material ist.
5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Silicagel als Hilfsmittel verwendet wird.
6. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kondensation in einem Zweiphasensystem durchgeführt wird.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Zweiphasensystem aus einer wässrigen und einer
organischen, mit Wasser nicht mischbaren Phase besteht.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die organische, mit Wasser nicht mischbare Phase Chloroform ist.

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9. Verfahren geraäss den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Kondensationsprodukt diazotiert.
10. Verfahren zur Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass man diese an ein gemäss den Verfahren der Ansprüche 1-9 erhältliches Kondensationsprodukt bindet.
11. Verfahren zur Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass man diese an ein gemäss den Verfahren der Ansprüche 1-9 erhältliches Kondensationsprodukt bindet.
12. Verfahren zur Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass man diese unter Verwendung der Säulentechnik an ein gemäss den Verfahren der Ansprüche 1-9 erhältliches Kondensationsprodukt bindet.
IJ. Verwendung der gernäss den Verfahren der Ansprüche 1-9 erhältlichen Kondensationsprodukte zur Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Proteinen.
14. Verwendung der gemäss den Verfahren der Ansprüche 1-9 erhältlichen Kondensationsprodukte zur Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Enzymen.
15. Verwendung der gemäss den Verfahren der Ansprüche 1-9 erhältlichen Kondensationsprodukte zur Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Enzymen mittels Säulentechnik.

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l6. Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs Γ erhältliche Kondensationsprodukt.
17· Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs 2 erhältliche Kondensationsprodukt.
18. Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs 3 erhältliche Kondensationsprodukt.
19· Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs 4 erhältliche Kondens ationsprodukt.
20. Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs 5 erhältliche Kondensationsprodukt.
21. Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs 6 erhältliche Kondensationsprodukt.
22. Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs 7 erhältliche Kondensationsprodukt.
23· Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs 8 erhältliche Kondens at ionsprodukt.
24. Das gemäss dem Verfahren des Anspruchs 9 erhältliche Kondensationsprodukt.

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