DE2535951A1 - Enzympraeparat, verfahren zu seiner herstellung und seine anwendung - Google Patents
Enzympraeparat, verfahren zu seiner herstellung und seine anwendungInfo
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Description
"Enzympräparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Anwendung"
Priorität: 13. August 1974 - Großbritannien - Nr. 35 556/74
26. April 1975 - Großbritannien - Nr. 17 434/75
Die Erfindung betrifft ein Enzympräparat, insbesondere Präparate
zur Durchführung chemischer Umsetzungen, wobei die Präparate, aus dem Reaktionsmedium zur Wiederverwendung gewonnen werden können.
Enzymatisch katalysierte Umsetzungen stellen bei zahlreichen chemischen Verfahren wichtige Stufen dar. Als Beispiele seien
genannt die Verseifung von Lipoiden unter Verwendung einer Hydrolase,
wie Lipase, der Proteinabbau unter Verwendung eines proteo-Iytischen
Enzyms, wie Trypsin, die Erzeugung von Steroiden unter Verwendung einer Dehydrogenase, die Erzeugung von Glukosesirupen
aus Stärke unter Verwendung von Hydrolase und .die Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen, wie Benzylpenicillin
oder Phenoxymethylpenicillinsäure unter Verwendung von Penicillin-
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Acylase.
Gewöhnlich werden die enzymatischen Umsetzungen mit dem Enzym in Lösung in einem solchen Medium durchgeführt, das ein Substrat enthält
(der Ausdruck "Substrat" bedeutet bei vorliegender Erfindung eine Substanz, die ein Enzym umwandelt, um das Produkt zu liefern).
Da das Enzym im Reaktionsmedium gelöst ist, ist es häufig sehr schwierig, das Enzym vom Substrat oder, wenn die Umsetzung
beendet ist, vom Umsetzungsprodukt zu trennen. Wenn das Produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird, führt das Trennverfahren
gewöhnlich zur einer Desaktivierung des Enzyms. Dies beeinträchtigt natürlich das Enzym in einer nicht wiedergutzumachenden
Weise.
Um diese Schwierigkeit einer Trennung zu beheben und ein Enzymsystem
zu schaffen, das wiederverwendbar ist, ist es bekannt, das Enzym an einen unlöslichen festen Trägerstoff entweder durch
Adsorption (vgl. GB-PS 1 264 147) oder durch kovalente Bindung entweder direkt oder indirekt über Brückenglieder zu binden (vgl.
GB-PS 1 349 498, 1 387 460 und 1 365 886). Derartige unlösliche
Präparate zeigen 1 Jedoch verschiedene Nachteile. Zunächst sind sie,
wenn es sich um Feststoffe handelt, einem mechanischen Zerfall und gegebenenfalls einem Auseinanderbrechen unterworfen. Zweitens
ist das Aufbringen des Enzyms auf die Oberfläche des festen Trägerstoffes und somit die spezifische Aktivität des Präparats oft
ungenügend. Drittens ist die Zugänglichkeit des Substrats zur aktiven Stelle des Enzyms häufig gehindert. Versuche zur Verbesserung
der spezifischen Aktivität derartiger unlöslicher Enzym-Polymerisat-Präparate durch Vergrößern des äußerlichen Oberflächenbereiches
des Feststoffes erfordern eine Herabsetzung der
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Teilchengröße der festen Präparate, was die Handhabung und insbesondere
die Abtrennung durch Abfiltrieren schwieriger gestaltet, und erzeugt andererseits, wenn der innere Oberflächenbereich erhöht
wird, indem die Teilchen stärker porös gemacht werden, Teilchen mit einer geringeren mechanischen Festigkeit.
Des weiteren sind bestimmte wasserlösliche Enzym-Polymerisat-Komplexe
gefunden worden (vgl. GB-PS 1 284 925 und die britischen
Patentanmeldungen 53 822/72 und 44 542/73), wobei das Enzym
entweder direkt oder indirekt über ein Brückglied an einen wasserlöslichen
polymeren Trägerstoff gebunden ist. Diese Enzym-Polymerisat-Komplexe
kann man aus dem wässrigen Reaktionsmedium durch Ultrafiltration wiedergewinnen. Jedoch stellt die Ultrafiltration
eine schwierige und kostspielige Technik dar, insbesondere im großen Maßstab und ist aus diesem Grunde für eine industrielle
Anwendung unerwünscht.
Es ist jetzt gefunden worden, daß bestimmte Enzyme an nicht-polare
Gruppen gebunden werden können, um das Präparat aus wässrigen Medien dank seiner Affinität zu mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeiten
abtrennbar zu machen.
Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Enzympräparat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Enzym an .ausreichend nicht"
polare Gruppen gebunden ist, so daß sich beim In-Berührung-Bringen
des Präparats in einem wässrigen Medium mit einer inerten, mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit das Präparat mit der inerten,
mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit assoziiert und dadurch aus dem wässrigen Medium abtrennbar ist.
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Der hierin verwendete Ausdruck "inerte, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit/' bedeutet, daß die Flüssigkeit mit dem Enzympräparat
nicht reagiert und demzufolge auch nicht die Enzymaktivität wesentlich ändert.
Der weiterhin hier verwendete Ausdruck "assoziiert" umfaßt jede Form einer Wechselwirkung -zwischen den nicht-polaren Gruppen des
Enzympräparats und den Molekülen der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, wobei die Form ausreichend stabil ist, um ein Mittel
zur Abtrennung des Enzympräparats aus dem wässrigen Medium zu schaffen.
Zur Einarbeitung in die Präparate vorliegender Erfindung sind gewöhnlich alle bei Herstellungsverfahren verwendeten Enzyme
geeignet. Beispiele derartiger Enzyme sind Amylase, Asparaginase, neutrale und alkalische Proteasen, Chymotrypsin, Cellulase, Dextranase,
Lipase, Oxynitrilase, Pepsin, Penicillin-Acylase und Trypsin.
Bevorzugt sind die Enzyme Lipase, Penicillin-Acylase und Trypsin.
Geeignete nicht-polare Gruppen, die mit den Enzymen verbunden
sein können, sind Kohlenwasserstoffreste mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen, zweckmäßigerweise Alkylreste mit 6 bis JO Kohlenstoffatomen,
z.B. die n-Hexyl-, n-Heptyl-, n-Octyl-, n-Nonyl-, n-Decyl-,
n-Dodecyl-, n-Octadecyl-, 4-Methylpentyl-, 4,4-Dimethyl-pentyl-
und die 3-Äthylhexylgruppe, ferner Alkenylreste mit 6 bis 50 Kohlenstoffatomen,
wie die Uhdeca-10-enyl-, Oleyl- oder die Linoleylgruppe,
dann Cycloalkyl- und Cycloalkenylreste mit 6 bis 20 Koh-
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■5" 2 b 3 5 9 51
lenstoffatomen, dann Aryl- und substituierte Arylreste, z.B.
die Phenylgruppe, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Alkylreste
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann, sowie Aralkylreste, z.B. die Benzyl-, 2-Phenyläthyl-, 4-Phenylbutyl-
und die 2-Tolyläthylgruppe.
Das Enzym kann entweder direkt mit der nicht-polaren Gruppe verbunden
sein oder indirekt über ein Brückenglied.
Bei einigen Enzymen erzeugt die unmittelbare Verknüpfung zahlreicher
nicht-polarer Gruppen an das Enzymmolwcül eine Änderung
hinsichtlich der Conformation und eine Änderung hinsichtlich der Aktivität des Enzyms. Deswegen und auch in einigen Fällen wegen
der Struktur des Enzyms ist es manchmal nicht möglich, geeignete nicht-polare Gruppen an das Enzym zu binden, um das Präparat aus
den wässrigen Medien abtrennbar zu machen, ohne die Aktivität des Enzyms in unannehmbarer Weise herabzusetzen.
Um diese Schwierigkeit zu umgehen, bevorzugt man häufig, ein Enzympräparat herzustellen, bei dem das Enzym an einen polymeren
Trägerstoff gebunden oder adsorbiert ist. Letzterer kann dann die nicht-polaren Gruppen anstelle derjenigen des Enzyms selbst oder
zusätzlich zu denjenigen des Enzyms tragen. Darüber hinaus schafft dies einen einfachen Weg zur Regulierung der relativen Anteile
von nicht-polaren Gruppen zum Enzym in dem Präparat. Es ist natürlich
auch möglich, ein bereits zum Abtrennbarmachen aus wässrigen Medien genügend nicht-polare Gruppen tragendes Enzym an einen
polymeren Trägerstoff zu binden, der gegebenenfalls weitere nichtpolare Gruppen tragen kann.
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Gegenstand der Erfindung ist deshalb ferner ein Enzympräparat wie vorstehend definiert, bei dem das Enzym an einen polymeren
Trägerstoff gebunden ist.
Die Bindung des Enzyms an das Polymerisat schließt gemäß vorliegender
Erfindung sowohl eine kovalente Bindung als auch eine Adsorption an den polymeren Trägerstoff ein, sofern die Adsorption
ausreichend stark genug ist, um das Enzym auf dem Trägerstoff zurückzuhalten, wenn das Präparat mit der mit Wasser nicht
mischbaren Flüssigkeit zusammengebracht wird.
Der zur Verwendung in den vorgenannten Präparaten geeignete Trägerstoff
kann in Wasser löslich oder unlöslich sein.
Wenn ein in Wasser unlösliches polymeres Material bei den Präparaten
vorliegender Erfindung angewendet wird, liegt es vorzugsweise in feinteiliger Form vor, so daß es einen großen Oberflächenbereich
für die Bindung des Enzyms darstellt und somit dem Präparat eine hohe spezifische Aktivität verleiht.
Beispiele von geeigneten, in Wasser unlöslichen Materialien sind Cellulosepulver und Cellulosederivate, wie Carboxymethylcellulose-Ionenaustauscherharze,
Polyamide, hochmolekulare Polysaccharide, wie Agarose und vernetzte Dextrane, ferner solche Polysaccharide,
die mit Modifizierungsmitteln, wie Epichlorhydrin, oder durch Einarbeiten von Carboxymethyl- oder Aminoäthylgruppen
modifiziert sind, sowie Polyacrylate und Polymethacrylate. Besonders bevorzugt sind Agarose und makrorektikular vernetzte Polyacrylate
und Polymethacrylate.
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-?- 2S359S1
Beispiele von wasserlöslichen Materialien sind Polymerisate natürlichenUrsprungs,
z.B. Polysaccharide, wie Dextran, Dextrine oder Stärke, sowie solche Polymerisate natürlichen Ursprungs, die modifiziert
worden sind, wie teilweise abgebaute stärke oder Cellulose, ferner Polysaccharide, Oligosaccharide und Saccharide, die
mit Modifizierungsmitteln, wie Epichlorhydrin, modifiziert worden sind, sowie Cellulose, die durch Einführen von Carboxymethyl-
oder Aminoäthylgruppen modifiziert worden ist.
Von den vorgenannten modifizierten Sacchariden und Oligosacchariden
ist festgestellt worden, daß Copolymerisate von Epichlorhydrin und entweder Lactose, Dextrose oder Saccharose, besonders
zweckmäßig sind. Ein bevorzugtes Polymerisat ist ein Saccharose-Epichlorhydrin-Polymerisat,
das unter dem Warenzeichen "Picoll" bekannt ist und insbesondere ein solches mit einem Molekulargewicht
von etwa 400 000.
So gut wie die Polymerisate natürlichen Ursprungs ist es auch möglich, wasserlösliche synthetische Polymerisate zu verwenden,
wie Polymerisate von Polyvinylalkohol und Mischpolymerisate von Maleinsäure- oder Acrylsäureanhydriden mit Äthylen, Styrol, Methylvinyläther,
Divinyläther oder Vinylacetat. Derartige Polymerisate sind z.B. in den DT-OS 1 948 177 und 1 948 298 und in den
GB-PS 1 290 701 und 1 223 281 beschrieben.
Eine zweckmäßige Klasse von wasserlöslichen Mischpolymerisaten sind die unter dem Warenzeichen "Gantrez AN" bekannten Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisate.
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"8 " 2b35951
Das Enzym kann unmittelbar an das eine nicht-polare Gruppe tragende
Polymerisat gebunden sein. Gegebenenfalls kann es auch an einen polymeren Trägerstoff mit Brückengliedern, an die das Enzym geknüpft
sein kann, gebunden werden. Geeignete Brückenglieder sind aliphatisch^ <X, CO-Di amine mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie das
I,j5-Diaminopropan oder das 1,6-Diaminohexan. Die eine Aminogruppe
des Brückengliedes ist an das Polymerisat gebunden und das andere ist frei zur Kupplung mit dem Enzym, z.B. über einen wasserlöslichen
Dialdehyd, wie Glyoxal oder Glutaraldehyd. Die Verwendung derartiger bifunktioneller Brückenglieder ergibt auch eine gewisse
Vernetzung zwischen den Enzym-Polymerisat-Einheiten. Die Brükkenglieder
können zwischen Enzym und .Trägerstoff oder zwischen Enzym und nicht—polarer Gruppe (mit oder ohne zusätzlichem Vorliegen
eines Trägerstoffes) oder zwischen Trägerstoff und nicht-polarer
Gruppe angewendet werden.
Die Anzahl der nicht-polaren Gruppen, die in die Präparate vorliegender
Erfindung eingearbeitet werden, hängt von einer Anzahl Paktoren ab. Ein Verknüpfen der nicht-polaren Gruppen an ein Polymerisat
und/oder ein Enzym ruft eine hydrophobe Umgebung in der unmittelbaren Nähe des Enzyms hervor. Bei einigen Enzymen ergibt "
sich bei einem zu hohen Hydrophobizitätsgrad eine Desaktivierung
des Enzyms infolge gleichzeitiger Änderung bei der Conformation.
Es ist ein Gleichgewicht zwischen der Verknüpfung der geringsten
Anzahl von erforderlichen nicht-polaren Gruppen, um eine Abrennung aus wässrigen Medien zu gestatten, und der größtmöglichen
Anzahl, die mit der Stabilität des Enzyms verträglich ist, erforderlich. Die Bestimmung dieses Gleichgewichts muß notgedrungen
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eine Routineangelegenheit von Versuchen und Fehlern bleiben. Die Kriterien, durch die das Gleichgewicht bestimmt werden kann, sind
folgende:
(1) Das Molekulargewicht des polymeren Trägerstoffes;
(2) das Molekulargewicht der Monomeren-Einheiten;
(3) der prozentuale Anteil an Monomer-Einheiten in dem durch nicht-polare Gruppen substituierten Polymerisat;
(4) die Größe der nicht polaren Gruppen;
(5) die Identität des Enzyms und
(6) der Substitutionsgrad des Polymerisats durch das Enzym.
Wenn z.B. der Trägerstoff "Gantrez AN 119" (Polymerisat mit einem
Molekulargewicht von 230 000 und Monomer-Einheiten vom Molekulargewicht 156) verwendet wird, wobei 1 Mol dieses Trägerstoffes
durch 1 Mol Penicillin-Acylase substituiert ist, tritt die geringstmögliche
Substitution, die zur wirksamen Abtrennung aus wässrigen Medien erforderlich ist, auf, wenn etwa 25 % der Monomer-Einheiten
durch n-Decylgruppen substituiert sind. Andererseits
tritt die größtmögliche Substitution zur Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität auf, wenn etwa 50 % der Monomer-Einheiten
durch n-Octadecylgruppen substituiert sind.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
der vorstehend genannten Enzympräparate, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I
R-X (I)
in der R eine nicht-polare Gruppe und X eine funktionelle Gruppe
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ist, mit einem Enzym in Berührung bringt, das eine aktive Gruppe
gebunden enthält, die mit der Gruppe X reagieren kann,
Die Gruppe X kann beispielsweise eine Amino-, Carboxyl-, Aldehyd-,
Hydroxy-, Thiol-r oder Azogruppe sein. Die Gruppe X kann sich auch
von reaktionsfähigen Vernetzungsgruppen ableiten, z.B. von Dialdehyden,
wie Glyoxal oder Glycerinaldehyd, und/oder Diaminen, wie 1,6-Hexamethylendiamin oder Äthylendiamin, und/oder aliphatischen
c£,u>-Diaminocarbonsäuren, wie Glycin oder Lysin, oder einem polymeren
Trägerstoff, der derartige funtionelle Gruppen enthält. Vorzugsweise ist X die A^inogruppe oder ein Rest mit einer Aminogruppe.
Die an das Enzym gebundene und zur Umsetzung mit der Gruppe X befähigte aktive Gruppe kann eine im Enzym vorhandene Gruppe sein,
die entweder von Anfang an vorliegt oder durch Modifikation entstanden ist, wie beispielsweise die Carboxyl-, Amino-, Thiol-
oder die phenolische Hydroxylgruppe, oder Anhydridbindungen oder ein derartiger aktive Gruppen enthaltender polymerer Trägerstoff
oder ein reaktionsfähiges Brückenglied, wie es hinsichtlich der Gruppe X vorstehend beispielhaft erläutert worden ist.
Die Umsetzung zwischen einer Verbindung der allgemeinen Formel I und dem Enzym wird am vorteilhaftesten bei einem im wesentlichen
neutralen pH-Wert, zweckmäßigerweise im Bereich von pH 4 bis pH
9, und bei einer Temperatur im Bereich von -4°C bis +40°C je nach
dem verwendeten Enzym durchgeführt. Vorzugsweise liegt der pH-Wert bei etwa 7,0 und die Temperatur im Bereich von 0 bis 5°C.
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Wenn das Enzympräparat im wesentlichen nur aus dem Enzym und
nicht-polaren Gruppen besteht, ist es vorteilhaft, daß sich die Gruppe X von einem Dialdehyd und/oder einem ok,w_Dlamin ableitet,
so daß die nicht*-polaren Gruppen an das Enzym über ein Brückenglied
gebunden sind.
Beim Herstellen eines erfindungsgemäßen Enzympräparats, das auch einen polymeren Trägerstoff enthält, ist es vorteilhaft, daß das
Trägermaterial zuerst modifiziert wird, um eine nicht-polare Gruppe zu erhalten, und sofern erforderlich, ein Brückenglied,
bevor die Verbindung mit dem Enzym erfolgt. Bei dieser Ausführungsform stellt die Gruppe X in der allgemeinen Formel I den polymeren
Trägerstoff dar, der an die nicht-polare Gruppe R und an eine funktioneile Gruppe gebunden ist.
Die Enzym-modifizierten Polymerisat-Präparate können dann nach an sich bekannten Verfahren zur Bindung von Enzymen an Polymerisate
hergestellt werden. Derartige Verknüpfungsverfahren sind beschrieben,
z.B. in der GB-PS 1 325 912, und umfassen das Kuppeln des
Enzyms an das Polymerisat unter Verwendung von Reagentien, wie Cyanhalogeniden, insbesondere Cyanbromid, s-Triazinen, insbesondere
2-Amino-4,6-dichlor-s-triazin, Acylaziden, Diazoniumverbindungen,
z.B. 2-Hydroxy-3-(p-aiazophenyl)-propyläther., organischen
Cyanaten, wie Phenylcyanat, und Carbodiimiden. Häufig werden derartige
Verknüpfungsmittel zuerst zur umsetzung mit dem Polymerisat verwendet, um reaktionsfähige Gruppen am Polymerisat zu schaffen,
wobei diese Gruppen dann zur Umsetzung mit dem Enzym dienen. In einigen Fällen können die Enzyme unmittelbar mit dem Polymerisat
reagieren, z.B. wenn dieses aktive Gruppen, wie Anhydridbin-
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düngen oder Säureazidgruppen, enthält oder durch Modifizieren
erhalten hat.
erhalten hat.
Es wird deshalb als vorteilhaft angesehen, daß die zur Herstellung
der modifizierten Polymerisate und zu deren Bindung an die Enzyme angewendeten Umsetzungsverfahren und -bedingungen je nach der Art
des Enzyms und des polymeren Trägerstoffes variieren.
Für die meisten Enzym-Polymerisat-Präparate ist ein zweckmäßiges
Verfahren im Schema I veranschaulicht. Bei der ersten Stufe wird
das Polymerisat (a) an die nicht-polaren Gruppen, vorzugsweise
über ein primäres oder sekundäres Amin R.NHp oder Rg.NH und (b)
an Brückenglieder, wie oO,u/_Diamine, für eine anschließende Verknüpfung des Enzyms über Dialdehydgruppen gebunden. Diese Reaktionen werden zweckmäßigerweise in wässriger Lösung oder Suspension bei einem alkalischen pH-Wert, zweckmäßigerweise bei pH 8 bis 12, und bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Dialdehydgruppen tragende Enzym kann dann mit dem modifizierten Polymerisat in wässrigen Medien bei im wesentlichen neutralen pH-Werten gebunden werden.
Verfahren im Schema I veranschaulicht. Bei der ersten Stufe wird
das Polymerisat (a) an die nicht-polaren Gruppen, vorzugsweise
über ein primäres oder sekundäres Amin R.NHp oder Rg.NH und (b)
an Brückenglieder, wie oO,u/_Diamine, für eine anschließende Verknüpfung des Enzyms über Dialdehydgruppen gebunden. Diese Reaktionen werden zweckmäßigerweise in wässriger Lösung oder Suspension bei einem alkalischen pH-Wert, zweckmäßigerweise bei pH 8 bis 12, und bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Dialdehydgruppen tragende Enzym kann dann mit dem modifizierten Polymerisat in wässrigen Medien bei im wesentlichen neutralen pH-Werten gebunden werden.
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- 13 Schema I
Polymer
Enzym
RNH2 or
+
+
(CH
CKO(CH2) CHO
\
~7
~7
Polymer
Polymer
Enzym
NH.R
N=CH(CH2) CHO NH. R NH-(CH2Jx-N
N^CH-(CH2J-CH
wobei R die vorstehend beschriebene, nicht-polare Gruppe ist,
NH0(CH0) NH0 ein ot,U/-Diamin bedeutet und CHO(CHp) CHO einen
Dialdehyd darstellt.
Es ist häufig erforderlich, die Gruppen am Polymerisat zu aktivieren,
vorzugsweise mit Cyanbromid, bevor eine Bindung an die nicht-polaren Gruppen möglich ist.
Andererseits weisen einige Polymerisate Gruppen auf, die zur Verbindung
mit nicht-polaren Gruppen und/oder Enzymen gegebenenfalls ohne Zwischenschalten von Brückengliedern verwendet werden können.
Den auf diese Weise hergestellten erfindungsgemaßen Enzympräparaten fehlt dann die mit der Verwendung von Brückengliedern
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verbundene Vernetzung. Häufig besitzen derartige Enzympräparate vorteilhafte Eigenschaften, wie nachstehend noch beschrieben wird.
Bei auf Maleinsäureanhydrid-Monomeren beruhenden Polymerisaten, wie beispielsweise den "Gantrez"-Polymerisaten, können die entlang
der Hauptkette befindlichen Anhydridgruppen zur Bindung sowohl nicht-polarer Gruppen als auch der Enzyme verwendet werden.
Zweckmaßigerweise wird das Polymerisat zuerst durch Bindung nichtpolarer
Gruppen modifiziert. Dann werden die restlichen Anhydridgruppen im Polymerisat unmittelbar mit dem Enzym gebunden. Dieses
Verfahren ist im Schema II veranschaulicht:
Schema II
OCH3
CH0-CH-CH-CH-
* · I C C
0 0 0
OCHx
I 3
-CH9-CH-CH-CH-
* I I HO2C C=O
NHR
+ m RNH,
OCH3
-CH0-CH-CH-CH-2
I I C C
0 0 0
x ENZ-NH.
H2O
| OCH3 | m | OCH | OCH, I D |
| - CHo-CH-CH-CH--, | - PW PH- PfT PH | I -CH0-CH-CK-CH— Il |
|
| I I |
ΙίΠΛ-νΠ"Viii·" \j Π·—
Il |
HO2C CO2H | |
| • ι HO C C=O 2 I |
HO0C C=O ^ I |
||
| NHR | NH | ||
| EN2 | |||
n-(m+x)
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Bei di-esem Schema II stellt der Rest R die vorgenannte nichtpolare
Gruppe dar, während der Rest ENZ-NHp ein eine Aminogruppe tragendes Enzym bedeutet.
"Gantrez"-Polymerisate, z.B. "Gantrez AN 119" und "Gantrez AN l49", haben weiterhin den Vorteil, daß sie sich ohne Reaktion in
bestimmten aprotonischen, nicht-wässrigen Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid, lösen, die ebenfalls gute Lösungsmittel für die
Amine RNHp und RpNH sind. Ein homogenes Reaktionsgemisch ist möglich, und deshalb schaffen derartige Lösungsmittel vorteilhafte
Reaktionsmedien für eine Verknüpfung der nicht-polaren Gruppen an diese Polymerisate, wenn die Enzympräparate vorliegender Erfindung
hergestellt werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzym-Polymerisat-Präparate
vorliegender Erfindung durch Umsetzen eines Polymerisats mit Anhydridgruppen an der Hauptkette mit .einem Amin der
allgemeinen Formeln RNHp oder RpNH in einem aprotonischen nichtwässrigen polaren Lösungsmittel hergestellt, wobei R die nichtpolare
Gruppe ist. Anschließend wird das modifizierte Polymerisat an das Enzym gebunden.
Bevorzugt wird das Amin mit dem Polymerisat in Gegenwart einer tertiären Base, z.B. Pyridin, umgesetzt. Der hier verwendete Ausdruck
"tertiäre Base" bedeutet ein tertiäres Amin oder ein aromatisches heterocyclisches Amin.
Vorzugsweise ist das nicht—wässrige aprotonische Lösungsmittel
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N,N-Dimethylformamid oder die tertiäre Base selbst. Die Temperatur,
bei der die Reaktion durchgeführt wird, hängt von der Identität des polymeren Trägerstoffes und des Amins ab. Im allgemeinen
wird die Reaktion jedoch bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und 1000C durchgeführt.
Der modifizierte polymere Trägerstoff kann auch aus dem Medium,
in dem er hergestellt wird, durch Ausfällen mit einem weniger polaren Lösungsmittel, am zweckmäßigsten Diäthyläther, oder durch
Zugeben der Lösung zu Wasser, wenn ein Aufquellen und eine Anhydridhydrolyse
auftritt, und durch Isolieren des. hydro Iy si er ten
modifizierten Polymerisats aus dem wässrigen Medium unter Verwendung einer mit Wasser nicht mischbare η Flüssigkeit, oder durch
Zentrifugieren isoliert werden.
Das Enzym wird dann an den vorstehend genannten isolierten modifizierten
Trägerstoff durch In-Berührung-Bringen dieses modifizierten Trägerstoffes mit dem Enzym in wässriger.Lösung, gegebenenfalls
mit einem Kupplungsmittel, z.B. einem substituierten Carbodiimid, verknüpft. Gegebenenfalls kann das nicht hydrolysierte
Reaktionsgemisch oder das nicht hydrolysierte modifizierte Polymerisat, das in einem geringen Volumen eines polaren nichtwässrigen
Lösungsmittels gelöst ist, unmittelbar zu einer wässrigen Lösung des Enzyms gegeben werden.
Gegebenenfalls kann das Kupplungsmittel dadurch erhalten werden,
daß man zuerst den vorgenannten nicht hydrolysieren Trägerstoff durch Behandeln mit Hydrazinhydrat in Dimethylformamid-Lösung
anpaßt. Ein derartig angepaßter Trägerstoff, der dann hydrolysiert
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und aus dem wässrigen Medium durch Zentrifugieren isoliert wird, kann mit dem Enzym in wässrigen Medien unter Verwendung von
Natriumnitrit als Aktivator gekuppelt werden.
Weiterhin ist Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Durchführung der enzymatischen Umsetzung, wobei man in einem
wässrigen Medium das zuvor beschriebene Enzympräparat mit einem Substrat für das Enzym in Berührung bringt, danach dieses Enzympräparat
aus dem wässrigen Reaktionsgemisch mittels In-Berührung-Bringen mit einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit auftrennt,
das Reaktionsprodukt aus der wässrigen Phase gewinnt und gegebenenfalls das abgetrennte Enzympräparat durch In-Berührung-Bringen
mit weiterem Substrat wiederverwendet.
Es können zahlreiche, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeiten zur Abtrennung des Enzympräparats aus dem wässrigen Medium verwendet
werden. Beispiele geeigneter Flüssigkeiten sind Alkane, wie Heptan, Octan, Nonan, Decan, Hexadecan, aromatische Kohlenwasserstoffe,
höhere aliphatische Ester, wie Glycerin-trioleat, sowie aliphatische Alkohole mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie n-Decanol.
Bei der Berührung mit solch einer Flüssigkeit bildet das Enzympräparat
eine Oberflächenschicht im dazwischen liegenden Berührungsbereich aus. Um einen möglichst großen Berührungsbereich zu
haben, wird bei dieser Berührungsstufe gewöhnlich eine Bewegung angewendet, z.B. durch Rühren oder Schütteln, um die mit Wasser
nicht mischbare Flüssigkeit in kleinste Tröpfchen zu überführen. Jedes Tröpfchen wird dann von dem Enzympräparat umhüllt, das an
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der Oberfläche haftet.
Diese Berührung des Enzympräparats mit der mit Wasser nicht mischbaren
Flüssigkeit kann vor, während oder nach der Durchführung der enzymatischen Reaktion erfolgen. Vorzugsweise wird sie vor
der enzymatischen Reaktion durch Dispergieren mittels Bewegen des Enzympräparats mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit
in einem das Substrat enthaltenden wässrigen Medium durchgeführt. Während der enzymatischen Reaktion wird somit das Präparat mit
Tröpfchen der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, die als Emulsion in den wässrigen Medien vorliegt, assoziiert, und die
Dispersion wird während der Reaktion mittels Bewegen aufrecht erhalten. Wenn eine Abtrennung des Enzympräparats gewünscht wird,
unterbricht man das Bewegen und läßt die Phasen sich vereinigen.
Gegebenenfalls kann das Enzympräparat in dem wässrigen Reaktionsgemisch als Lösung oder Suspension vorliegen und nach der Reaktion
mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit in Berührung gebracht werden, wenn eine Abtrennung des Enzympräparats gewünscht
wird.
Die Art der Assoziation des Enzympräparats zur mit Wasser nicht
mischbaren Flüssigkeit variiert je nach dem polymeren Material und/oder den in das Enzympräparat eingebrachten nicht—polaren
Gruppen. Bei den Enzym-Polymerisat-Präparaten, die im wesentlichen
vernetzt sind, bilden sich z.B. feste Aggregate aus, und diese Teilchen haften an den Tröpfchen der mit Wasser nicht mischbaren
Flüssigkeit. Bei nicht-vernetzten Präparaten jedoch, wie
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sie sich mit den vorgenannten "Gantrez"-Trägermaterialien bilden
(und auch bei keine Polymerisate enthaltenden Präparaten), tritt gewöhnlich keine große Haftung von Peststoffen an die Tröpfchen
auf, und es bildet sich auf den Tröpfchen eine monomolekulare Schicht des Enzympräparates aus. Dies ist besonders vorteilhaft,
wenn die Enzymreaktion nach dem ersten In-Berührung-Bringen des
Enzympräparates mit der mit V/asser nicht mischbaren Flüssigkeit, um ein solches System zu erzeugen, durchgeführt wird.
Was auch immer die Art der Assoziation betrifft, so befähigt die Berührung zwischen dem Enzympräparat und der mit Wasser nicht
mischbaren Flüssigkeit (gewöhnlich in Form von Tröpfchen) die Abtrennung des Enzympräparats vom wässrigen Medium. Die mit dem
Enzympräparat überzogenen Tröpfchen haben annähernd die gleiche Dichte wie diejenige der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit.
Wenn man die Tröpfchen stehenläßt, so sammeln sie sich entweder an der Oberfläche des wässrigen Mediums (für Flüssigkeiten einer
geringeren Dichte als Wasser) an oder sinken zu Boden (bei Flüssigkeiten mit höherer Dichte als Wasser). Somit wird eine gesonderte
Schicht erzeugt, die aus der mit dem Enzympräparat vergesellschafteten
mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit besteht, und die in einfacher Weise aus dem wässrigen Medium gewonnen
werden kann.
Bei Flüssigkeiten, die auf den wässrigen Medien nicht rasch genug
obenauf schwimmen oder sich davon absetzen, können andere Trennverfahren
angewendet werden. Beispielsweise seien genannt Zentrifugieren oder das Filtrieren des Gemisches durch ein wasserabweisendes
Filter, das das wässrige Medium durchlaufen läßt und die
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mit Wässer nicht mischbare Flüssigkeit (zusammen mit dem Enzympräparat)
zurückbehält und dadurch abtrennt. Ein bevorzugtes enzymatisches Verfahren vorliegender Erfindung ist die Herstellung von
6-Aminopenicillansäure aus Penicillin unter Verwendung eines Präparats, das auf dem Enzym Penicillln-Acylase basiert. In diesem
Fall wird das Enzym-Acylase vorzugsweise aus Bakterien erhalten, z.B. Stämmen von Escherichia coil, wenn es zur Aufspaltung von
Benzylpenicillin eingesetzt wird, oder Fungi von Actinomyceten, wenn es zur Aufspaltung von Phenoxymethylpenicillin verwendet
wird. Derartige Enzyme sind allgemein bekannt. Sie werden zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure innerhalb eines pH-Bereiches
von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise von 7*0 bis 8,5* verwendet. Da die
Desacylierung eines Penicillins zu einer Freisetzung einer freien Säure aus der Penicillin-Seitenkette führt, ist es erforderlich,
den vorgenannten pH-Bereich während des Verfahrens zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch die Zugabe einer erforderlichen
Menge Alkali, wie einer Lösung von Natrium- odör Ammoniumhydroxid oder Triäthylamin, aufrecht zu erhalten.
Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung der Enzympräparate vorliegender
Erfindung besteht in der einfachen Anwendung auf ein kontinuierliches Verfahren einer enzymatisehen Reaktion, die in
einer Vorrichtung durchgeführt werden kann, die in der Zeichnung in Fig. 3 dargestellt ist, die ein schematisches Diagramm eines
geeigneten Reaktionsgefäßes zeigt.
Unter Bezugnahme auf Fig. 3 1st das Reaktionsgefäß 1 mit Mitteln
zum Bewegen in Form eines Rührers 2, Einleitungsrohren 3, 4 und 5
für Substrat, Alkali und die Enzymphase und einem Auslaß 6 versehen,
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Das Reaktionsgefäß 1 enthält weiterhin eine Sonde 7 zur Peststellung
des pH-Wertes, die ein Ventil 8 steuert, das in Verbindung mit dem Alkali-Einlaßrohr 4 steht. Aus dem Auslaß 6 wird das Reaktionsgemisch
über die Pumpe 9 und das Einlejfcungsrohr 11 in ein gesondertes Gefäß 10 geleitet. Das Gefäß 10 hat einen oberen Auslaß
12, der in Verbindung steht mit dem Einlaßrohr 5 des Reaktionsgefäßes, einen unteren Auslaß 13* um das Reaktionsprodukt mittels
einer Pumpe 14 zu entfernen, und ein Filter in Form einer Sinterglasplatte 15, die oberhalb des unteren Auslasses 13 angeordnet
ist. Das Substrat wird durch das Einleitungsrohr 3 über eine Pumpe 16 geführt, die mit der gleichen Fließgeschwindigkeit wie
die Pumpe l4 betrieben wird und auch verbunden ist.
Bei der Arbeitsweise wird das Reaktionsgefäß 1 durch das Einleitungsrohr
3 mit dem Substrat in einem wässrigen Medium zusammen mit dem Enzympräparat vorliegender Erfindung und der mit Wasser
nicht mischbaren Flüssigkeit beschickt. Das Gemisch wird mittels des Rührers 2 dispergiert, so daß eine Emulsion entsteht. Das
Reaktionsgefäß 1 kann auf einer konstanten Temperatur gehalten werden, z.B. mittels eines (hier nicht gezeigten) Wassermantels,
um das Reaktionsgefäß herum. Alkali wird der Emulsion in den Tank durch das Einleitungsrohr 4 zugegeben. Die Zuführgeschwindigkeit
wird durch das Ventil 8 bestimmt, das durch die Sonde 7 gesteuert wird, so daß der pH-Wert des Reaktionsgemisches im erforderlichen
pH-Bereich für eine bestmögliche Umsetzung gehalten wird. Im Verlauf der Reaktion wird die Pumpe 9 betrieben und das Gemisch aus
dem Auslaß 6 abgezogen und durch das Einleitungsrohr 11 in das getrennte Gefäß 10 überführt. Im Gefäß 10 bildet die mit V/asser
nicht mischbare Flüssigkeit (in diesem Fall mit einer geringeren
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Dichte als Wasser) eine gesonderte obere Schicht 17, die das Enzympräparat mit enthält. Die untere wässrige Schicht l8 mit
dem Gehalt an dem Reaktionsprodukt wird durch das Filter 15 und danach durch den Auslaß 13 mittels der Pumpe l4 abgezogen. Die
obere Schicht 17 mit einem Gehalt an dem Enzympräparat assoziiert mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit wird durch den
Auslaß 12 fließen gelassen und kehrt somit durch das Einleitungsrohr 5 In das Reaktionsgefäß 1 zurück. In dem Maße, wie das Produkt
durch den Auslaß 13 abgezogen wird, wird weitere Substratlösung
dem Reaktionsgefäß 1 durch das Einleitungsrohr 3 mittels der Pumpe 16 zugeführt. Die Pumpen l4 und 16 sind koordiniert, so daß
die Einleitungsgeschwindigkeit des Substrats gleich der Ausflußgeschwindigkeit des Produkts ist.
Die Fließgeschwindigkeiten, die Verweilzeit im Reaktionsgefäß und andere Parameter der Reaktion hängen von den betreffenden einzelnen
Enzympräparat-Substrat-Systemen ab. Aus Vorversuchen war ersichtlich, daß ein 10000-Liter-Reaktionsgefäß unter Verwendung von
1000 kg eines Enzympräparats auf Basis von einer an "Gantrez AN l49"-Trägerstoff gebundenen Penicillin-Acylase täglich etwa 2000
kg Penicillin G in einer Konzentration von 5 Gewichtsprozent, bezogen
auf das Volumen, bei 22°C und einem pH-Wert von 7,8 liefern konnte, obwohl dieser Zahlenwert mit Enzympräparaten höherer
spezifischer Aktivität verbessert werden konnte.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Bei diesen Beispielen werden die folgenden Abkürzungen zur Bezeichnung
der Polymerisate und modifizierten Polymerisate, der
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Enzyme, der Brückenglieder, der nicht-polaren Gruppen und der Verbindungssubstanzen
angewendet:
| Enzyme: | Lipase | • | "Ficoil" |
| L : | Penicillin-Acylase | "Gantrez" | |
| PA : | Trypsin | "Sepharose" | |
| T : | "Dextran T.2000" | ||
| Trägerstoffe | |||
| F : | |||
| GAN : | |||
| SR : | |||
| T2000 | |||
Enzym und Trägerstoff verknüpfende Gruppe; HD : 1,6-Diaminohexan
nicht polare Gruppen;
D : n-Decylaminogruppe
DD : n-Dodecylaminogruppe
OD : n-Octadecylaminogruppe
DD : n-Dodecylaminogruppe
OD : n-Octadecylaminogruppe
Verbindungssubstanzen und Aktivierungsmittel und aktivierte gruppen;
CMC : !-Cyclohexyl-^-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-
methano-p-toluolsulfonat
G : Glutaraldehyd
A : Hydrazid
A : Hydrazid
Die Zahl hinter der Bezeichnung gibt die Ansatznummer wieder«
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Beispielsweise wird das Enzympräparat des Beispiels 1 mit PAFHDDG bezeichnet. Das Enzym ist demnach die Penicillin-Acylase
(PA). Der Trägerstoff ist "Ficoll" (F), der Hexamethylendiamlngruppen
(HD) zur Verknüpfung des Enzyms und weiterhin Decylgruppen (D) als nicht polare Gruppen trägt. Die Verknüpfung
zwischen der freien Aminogruppe des Hexamethylendiaminrestes und des Enzyms wird unter Verwendung von Glutaraldehyd (G) durchge führt.
Des weiteren bezeichnet "GAN 149 HDOD" einen modifizierten Trägerstoff,
der aus einem mit 1,6-Diaminohexan und uetadecylamin modifizierten
"Gantrez l49" hergestellt worden ist, und die Bezeichnung
"PAGAN l49 HDOD-G" den vorgenannten modifizierten Trägerstoff,
an den in Gegenwart von Glutaraldehyd Penicillin-Acylase geküpft ist.
(a) n-Decylamino-(6-aminohexylamino)-Ficoll (FHDD-I)
5 g "Ficoll" werden in 300 ml Wasser gelöst und auf einen pH-Wert
von 11,0 eingestellt. Dann wird 1 g Cyanbromid zugegeben. Während der Reaktion wird der pH-Wert mittels 2-n Natronlauge aufrecht
erhalten. Die Reaktion ist nach 20 Minuten bei Raumtemperatur beendet, und es werden 4 g n-Decylamin und 0,5 g 1,6-Diaminohexan,
das in 10 ml Methanol gelöst ist, zugegeben. Der pH-Wert ■wird mittels 2-n Salzsäure auf 9*5 eingestellt. Das Gemisch wird
l6 Stunden bei 4°C gerührt. Die erhaltene kolloidale Lösung wird bei 22000 g/Stunde zentrifugiert. Man erhält ein weißes Sediment
(35 g Feuchtgewicht), das aufgehoben wird. Die trübe über-
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stehende Flüssigkeit wird verworfen.
(b) Penicillin-Acylase-Zn-decylärnino-fo-aminohexylamino^Ficoll/
(PAFHDDG-I)
21,6 g FHDD-I (Feuchtgewicht) werden mit 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 6,0 vermischt. Der pH-Wert wird mit 2-n Salzsäure auf 6,2 eingestellt. Dann wird eine Lösung von
Escherichia coli-Penicillin-Acylase (50 ml, 340 mg teilweise gereinigtes
Protein) auf pH 6,2 bei O0C eingestellt und mit 5 ml
einer 25gewichtsprozentigen wässrigen Lösung von Glutaraldehyd
versetzt. Nach 30minütigem Rühren bei 00C wird die FHDD-I-Suspension
zugegeben. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 00C und dann 4
Stunden bei 4°C gerührt und dann 16 Stunden bei -20°C eingefroren. Nach dem Auftauen wird die Suspension 45 Minuten bei 4°C mit
20000 g zentrifugiert. Man erhält ein braunes gelartiges Sediment. Das Gel wird in JO ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7iO suspendiert und dann 30 Minuten bei 4°C bei
20000 g zentrifugiert. Die überstehenden Lösungen werden vereinigt,
und das braune Sediment (Feuchtgewicht an etwa 6,3 g) wird in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7*0 suspendiert und dann
bei 4°C gelagert. Die Sedimentr-Suspension schwimmt, wenn sie schließlich mit dem gleichen Gewicht n-Decanol vermischt wird,
zusammen mit dem Decanol auf der Oberfläche der wässrigen. Lösungen, wobei diese darunter schwimmenden Lösungen frei von den
Enzymteilchen sind. Die Enzymaktivität des Sediments, der überstehenden Lösung und des gelagerten Enzyms sind in Tabelle I angegeben.
Annähernd 4-3 % der ursprünglichen Enzymaktivität werden
wiedergewonnen und tatsächlich alles in der Verbindung. Die Akti-
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vitat des Komplexes kann im wesentlichen aus den Penicillinlösungen
entweder durch Aufschwimmen oder übliches Zentrifugieren wiedergewonnen werden.
Tabelle I
Penicillin-Acylase-Aktivität von PAFHDDG-I
Penicillin-Acylase-Aktivität von PAFHDDG-I
Versuchsverlauf: Das Natriumsalz des Penicillins G wird in einer geeigneten Konzentration in 20 ml 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7,8 bei 37°C gelöst. Dann wird die Enzymprobe zugegeben.
Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,1-n oder 0,5-n Natronlauge
aufrecht erhalten. Die Aktivität wird ausgedrückt als Anfangsgeschwindigkeit
der 6-Aminopenicillansäure-Erzeugung. Beim Wiederholungsversuch 1 werden 2 ml n-Decanol zu dem gerührten
Reaktionsgemisch gegeben. Nach der Bestimmung läßt man die Suspension
sich in zwei Schichten trennen. Die obere Schicht wird mit einem Spritzgerät entfernt und wiederverwendet. Beim Wiederholungsversuch
2 wird die Endsuspension 15 Minuten bei 2000 g zentrifugiert.und das Sediment· wiederverwendet.
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2 b 3 5 9 51
Material
Menge
Gewichtsprozent Penicillin G im Versuch
Anfangsgeschwindigkeit der 6-APS-Erzeugung
Mole/Min, χ 10"^
Ausgangsenzym
1 ml
0,885
| PAFHDDG-I Überstehendes |
1. | 1 ml | g | 5 | 0,008 |
| PAFHDDG-I | 2. | 0,5 | 5 | 1,500 | |
| 3. | g | ||||
| PAFHDDG-I (Wieder holungen) |
1. | 0,5 | g | 5 | 0,860 |
| Verfahren 1: | 2. | 0,5 | g | 5 | 0,550 |
| 3· | 0,5 | g | 5 | 0,500 | |
| 4. | 0,5 | g | 5 | 1,300 | |
| Verfahren 2: | 0,5 | g | 5 | 1,210 | |
| 0,5 | g | 5 | 1,110 | ||
| 0,5 | 5 | 1,030 | |||
(a) n-0ctadecylamino-(6-aminohexylamino)-Ficoll (FODHD-I)
5 g "Ficoll" werden in 300 ml Wasser gelöst. Die Losung wird mit
1 g Cyanbromid bei pH 11,0 wie vorstehend beschrieben behandelt. Nach 20 Minuten wird die Lösung mit 2-n Salzsäure auf pH 10,0
eingestellt. Dann wird die Lösung mit 5 g n-Octadecylamin und
0,5 g 1,6-Diaminohexan in 20 ml Methanol versetzt. Dar pH-Wert
wird mittels 2-n Salzsäure wieder auf pH 10,0 eingestellt. Das Gemisch wird 72 Stunden bei 4°C gerührt. Das Produkt wird 45 Minuten
bei 4°C bei 20000 g zentrifugiert. Es bilden sich ein freies
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weißes Sediment (25 ml) und eine klare überstehende Lösung mit
einem oberflächlichem Schaum (Octadecylamin).
(b) Penicillin-Acylase-/n-octadecylamino-(6-aminohexylamino)-Ficoll7 (PAFODHDG-I)
25 ml Penicillin-Acylase (170 mg Protein) werden bei Raumtemperatur
auf einen pH 6,2 eingestellt und dann mit 2,5 ml einer 25prozentigen
Lösung von Glutaraldehyd versetzt. Das Gemisch wird 15
Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden 10 ml FODHD-I zugegeben. Die Suspension wird mittels 2-n Salzsäure auf einen
pH-Wert von 6,2 eingestellt. Nach J5stündigem Rühren bei 4°C wird das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei 4°C mit 20000 g zentrifugiert.
Das rosafarbene Sediment wird in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7*0 suspendiert und dann bei 4 0C gelagert. Die Suspension
wird mittels n-Decanol wirksam aufschwimmen gelassen. Die Aktivität ist in Tabelle II angegeben. Die Wiedergewinnung
der Aktivität beträgt annähernd 60 %.
Tabelle II Aktivität des PAFODHDG-I
Versuchsverlauf: wie bei Tabelle I angegeben. Es werden insgesamt 5 Gewichtsprozent Penicillin G, bezogen auf das Volumen, eingesetzt.
Material Menge Anfangsgeschwindigkeit der
e 6-APS-Erzeugung
Mole/Min, χ 10"^
0,885 O,94o
| Ausgangsenzyra | 1. | 1 | ml |
| PAFODHDG-I | 2. | 0, | 5 g |
| Wiederholungen | |||
| •(Verfahren 2) | 0, | 5 g | |
| 0, | 5 g | ||
o,8oo 0,585
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Beispiel 3
(a) n-Decylamino-fo-aminohexylamino)-Dextran T2000) (T200QHDD-1)
10 g Dextran vom mittleren Molekulargewicht 2 000 000 werden in 800 ml Wasser gelöst und wie zuvor beschrieben mit 2,5 g Cyanbromid
aktiviert. Nach 20 Minuten werden 5 g n-Decylamin und 1,0 g 1,6-Diaminohexan zugegeben.Der pH-Wsrt wird auf 10,0 eingestellt.
Die Lösung wird 16 Stunden bei 4°C gerührt und dann 90 Minuten bei 4°C mit 20000 g zentrifugiert. Das gebildete Sediment
wird in 100 ml 0,1-n Salzsäure nochmals suspendiert und 1 Stunde bei 20000 g zentrifugiert. Das zweite Sediment (50 g
Peuchtgewicht) wird aufbewahrt.
(b) Penicillin-Acylase-/n-decylamino-(6-aminohexylamino)-Dextran T2000.7 (PAT2000HDDG-I)
10 g T2000HDD-1 (Peuchtgewicht) werden in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 6,0 homogenisiert. Die Suspension wird auf pH 6,2 eingestellt. Dann werden 50 ml Penicillin-Acylase (31I-O mg
Protein) auf pH 6,2 eingestellt und mit 5 ml einer 25gewichtsprozentigen
Glutaraldehydlösung versetzt. Die Lösung wird 45 Minuten
bei 40C gerührt und dann mit T2000HDD versetzt. Das Gemisch wird
weitere 30 Minuten bei 4°C gerührt und dann 16 Stunden bei -200C
gelagert. Nach dem Auftauen wird die Suspension 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann 30 Minuten bei 22°C mit 6000 g zentrifugiert.
Das überstehende wird aufbewahrt, und das Sediment wird in 75 ml 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7*0 suspendiert
und homogenisiert. Dann wird wie zuvor beschrieben zentrifugiert, dann wiederum suspendiert und nochmals zentrifugiert. Man
erhält 8,0 g eines braunen Sediments (Peuchtgewicht), das wirksam
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durch n-Decanol und weniger wirksam durch n-Heptan aufschwimmen
gelassen wird. Die Aktivität dieses Präparats ist in Tabelle III angegeben. Annähernd 10 % der ursprünglichen Enzymaktivität liegen
in der Verbindung vor.
Tabelle III
Aktivität von PAT2000HDDG-1
Versuchsanordnung: wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 5 Gewichtsprozent Penicillin G, bezogen auf das Volumen.
Material
Menge
Anfangsgeschwindigkeit der 6-APS-Erzeugung
Mole/Min.,
r
10
| Ausgangsenzym | 1 | ml |
| PAT2000HDDG-1 | ||
| Überstehendes | 1 | ml |
| PAT2000HDDG-1 | 0, | 5 g |
| Wiederholungen | ||
| (Verfahren 2) | 0, | 5 g |
0,875
0,022 0,270
0,155
Beispiel 4
(a) n-Decylamino-(6-aminohexylamino)-Sepharose 4B (SRHDD-I)
2 g einer mit Cyanbromid aktivierten "Sepharose 4b" (Trockengewicht)
werden 15 Minuten bei 4°C in 50 ml einer 10~-^-n Salzsäure
angequollen und dann auf einem Sinterglas 2 mal mit je 100 ml 10"" -n Salzsäure gewaschen. Das Gel wird zu 20 ml einer 0,1-m
Natriumbicarbonatlösung, 5 ml Äthanol, 0,5 g n-Decylamin und
0,1 g 1,6-Diaminohexan gegeben. Das Gemisch wird langsam l6 Stunden
bei 40C gerührt und dann an einer Glasfritte filtriert. Das
"Gel wird unter Absaugen 4 mal mit je 20 ml 10~ -n Salzsäure,
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4 mal mit je 20 ml Äthanol und 4 mal mit je 50 ml Wasser gewaschen
und dann in Wasser suspendiert und bei 4°C gelagert.
(b) Penicillin-Acylase-^-decylamino-(6-aminohexylamino)-Sepharose 4b7 (PASRHDDG-I)
1*5 g trockengesaugtes Gel von SRHDD-I werden in 5 ml einer 0,1-m
Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 suspendiert und dann mit 0,5 ml einer 25gewichtsprozentigen Glutaraldehydlösung, bezogen
auf das Volumen, versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann auf einer Glasfritte trockengesaugt.
Das Gel wird dann zu einem Gemisch von 2 ml Penicillin-Acylase (13,6 mg) und J5 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom
pH 6,0 gegeben. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4°C gerührt, trockengesaugt und auf der Glasfritte 5 mal mit je 20 ml einer
0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7*0 gewaschen. Dann
wird das Produkt in 5 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert.
Die erhaltenen Perlchen werden mit n-Decanol aufschwimmen gelassen,
im Gegensatz zur nicht modifizierten "Sepharose", die sich
aus wässrigen Suspensionen mit einem Gehalt an n-Decanol absetzt. Die Aktivität dieses Präparats ist in Tabelle IV angegeben.
Annähernd 72 # der ursprünglichen Aktivität sind in der Verbindung
vorhanden.
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Tabelle IV
Penicillin-Acylase-Aktlvität von PASRHDDG-I
Penicillin-Acylase-Aktlvität von PASRHDDG-I
| Versuchsanordnung 5 Gewichtsprozent |
: wie in Beispiel 1, unter Verwendung von Penicillin G, bezogen auf das Volumen |
Anfangsgeschwindigkeit der 6-APS-Erzeugung Mole/Min, χ 10~4 |
| Material | Menge | 0,885 |
| Ausgangsenzym | 1 ml | 0,505 |
| PASRHDDG-I | 2 ml | |
| Wiederholungen | 0,410 | |
| Verfahren 2. | 1. 2 ml | 0.575 |
| 2. 2 ml | 0,270 | |
| Verfahren 1. | 3. 2 ml |
n-Decylaminoglutaral-Penicillin-Acylase (PADDG-I)
4o ml Penicillin-Acylase (272 mg) werden auf pH 6,2 eingestellt
und dann mit 4 ml einer 25gewichtsprozentigen Glutaraldehydlösung,
bezogen auf das Volumen, versetzt. Nach 20minütigem Rühren bei O0C werden 6 ml n-Decanol und 0,6 ml n-Decylamin zugegeben. Das
Gemisch wird weitere 6 Stunden bei 00C und dann 1 Stunde bei Raumtemperatur
lebhaft gerührt. Dann wird das Gemisch 10 Minuten bei 22°C mit 2000 g zentrifugiert. Man erhält 30 ml einer in 0,1-m
Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7*0 suspendierten braunen
überstehenden Lösung, die entfernt und gelagert wird. Das Material schwimmt spontan an die Oberfläche wässriger Suspensionen auf,
doch ist es etwas weniger dispergierbar als die Polymerisatverbindungen und neigt auch zur Bildung größerer Aggregate. 1 ml
der Suspension zeigt, entsprechend der Bestimmung nach Beispiel l,
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eine Aktivität von 0,49 χ 10" Mol/Minute, was eine 42prozentige
Retention der Acylase-Aktivität in der Verbindung anzeigt.
Trypsin-/n-octadecylamino-(6-aminohexylamino)~PicoliL7
(TFODHDG-I)
50 mg salzfreies Trypsin werden bei 0°C in 20 ml einer 0,1-m
Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 gelöst. Dann wird 1 ml einer 25gewichtsprozentigen Lösung von Glutaraldehyd, bezogen auf
das Volumen, zugegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 00C gerührt.
Dann werden 10 ml FODHD-I, hergestellt nach Beispiel 2(a),
zugegeben, und die Lösung wird mittels 2-n Salzsäure auf einen pH von 6,2 eingestellt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 4°C gerührt
und dann 30 Minuten bei 4°C mit 20000 g zentrifugiert. Das
Sediment wird in 20 ml Wasser suspendiert und unter Verwendung eines "Whatman IPS"-Phasentrennpapiers filtriert. Der Rückstand
wird in 20 ml einer 10 -m Salzsäure suspendiert und nochmals filtriert. Dann wird 2 mal eine nochmalige Suspension mit 10~^-m
Salzsäure und 20minütiges Zentrifugieren bei l4°C mit 10000 g durchgeführt. Man erhält 2,65 g eines braunen Gels. Dieses Material
schwimmt sowohl mit n-Decanol als auch mit n-Heptan auf. Die Aktivität der Verbindung ist in Fig. 1 angegeben. Die Versuchsanordnung
war wie folgt:
N-tf-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid wird in 5 ml Dimethylformamid
gelöst und mit 45 ml einer 0,05-m Tris-Pufferlösung vom
pH 8,3 mit einem Gehalt von 10 mMol CaCl2 versetzt. Man erhält
eine 2 χ 10~ -m-Lösung eines chromogenen Substrats,Dann werden
5 ml Heptan zugegeben. Das Gemisch wird bei 22°C kräftig gerührt.
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Das Enzymgemisch wird zugesetzt, und 5 ml aliquote Anteile des
werden
Gemische/in bestimmten Zeitintervallen entnommen. Beim kurzzeitigen
Stehenlassen oder schwachen Zentrifugieren trennt sich die Heptanschicht unter Mitnahme von TFODHDG-I ab. Man entfernt die
untere wässrige Phase und mißt ihre optische Dichte in einer Schichtdicke von 1 cm und bei 400 nm, um das freigesetzte ρ Nitroanilid
zu bestimmen. Heptan-Tröpfchen liefern einen bemerkenswerten
Absorptions-Blindwert. In einigen Fällen wird die untere Schicht verdünnt, um die Absorptionsablesungen zu erleichtern.
Nach der Ablesung werden sowohl die Heptan- als auch die wässrigen Schichten den gerührten Reaktionsgemisch zugegeben. Die
durch die Verbindung beibehaltene Gesamtaktivität beträgt 17 %
der ursprünglichen amidolytischen Aktivität.
Beispiel γ
Lipase-/n-decylamino-(6-aminohexylamino)-Dextran T2000/
(LT2000HDDG-1)
200 mg Lipase von Candida cylindracea werden in 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 gelöst. Die Lösung
wird auf pH 6,2 eingestellt und dann mit 2 ml einer 23gewichtsprozentigen
Glutaraldehydlösung> bezogen auf das Volumen, versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wird aus einer Suspension mittels Äthanol T2000HDD-1 (vgl. Beispiel jj) ausgefällt und die Ausfällung in Wasser aufgequollen.
10 g des erhaltenen Gels werden in 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 6,0 homogenisiert und mit dem Enzym-Glutaraldehyd-Gemisch versetzt. Der pH-Wert wird auf 6,2 eingestellt.
Das Gemisch wird 16 Stunden bei 4°C gerührt. Dann wird
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die Suspension J>0 Minuten bei 4°C mit 200G0 g zentrifugiert. Das
Sediment wird in 50 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7,0 suspendiert und dann nochmals zentrifugiert. Das Verfahren wird zwei weitere Male wiederholt. Das endgültige Sediment
mit einem Feuchtgewicht von 8,4 g wird in 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert. Die Suspension
ist sowohl mit n-Decanol als auch mit n-Heptan fIotierbar.
Die Aktivität der Verbindung ist in Fig. 2 gezeigt. Die Versuchsanordnung war wie folgt:
5 ml p-Nitrophenyl-laurat (10 -m in n-Heptan) werden bei
Raumtemperatur mit 20 mi einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 8,0 rasch verrührt. Unter diesen Bedingungen ist über 1 Stunde und mehr keine nicht enzymatische Esterhydrolyse feststellbar.
Nach der Zugabe des Enzyms werden 5 ml aliquote Anteile in bestimmten Zeitintervallen entnommen, die 90 Sekunden mit 4000 g
zentrifugiert werden. Die untere (wässrige) Schicht wird entfernt. Genau J Minuten nach dem Entfernen des ursprünglichen aliquoten
Anteils wird die optische Dichte in einer Schichtdicke von 1 cm und bei 400 nm bestimmt. Die wässrigen und Heptan-Schichten werden
dann zu dem gerührten Gemisch gegeben.(da das Substrat bei diesem Versuch in einer nicht wässrigen Phase vorliegt, muß die Rührgeschwindigkeit,
d.h. das Ausmaß der Dispersion, während des Versuchs konstant gehalten werden).
Annähernd 1 % der ursprünglichen Lipase-Aktivität liegt in dar
Verbindung vor.
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Beispiel 8
(a) GAN149HD0D-1
1 g n-Octadecylamin und 0,2 g 1,6-Diaminohexan werden in 10 ml
Methanol suspendiert und mit 200 ml einer 0,2-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 8,0 mit einem Gehalt von 4o ml Methanol versetzt.
Dann werden unter lebhaftem Rühren und in kleinen Anteilen
2 g "Gantrez 149" zugegeben. Das Gemisch wird 16 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt und dann 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 12000 g zentrifugiert. Schaum und überstehende Lösung werden verworfen.
Das Sediment wird in IOC ml 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7*0 suspendier.t und wie vorstehend angegeben nochmals
zentrifugiert. Das gelähnliche Sediment (80 g) wird bei 4°C gelagert.
(b) PAGAN149HD0D-1-G
20 ml einer Penicillin-Acylase-Lösung (1,26 χ 10""' Einheiten;
136 mg Protein) werden auf pH 6,2 eingestellt und dann mit 2 ml
einer 25gewichtsprozentigen wässrigen Glutaraldehydlösung, bezogen auf das Volumen, versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtempera7
tur gerührt und dann mit 10 g einer Suspension von GAN149HDOD-1 in 12 ml einer 0,1-m Natriumphasphat-Pufferlösung vom pH 6,0 versetzt.
Der pH-Wert wird auf 6,2 gehalten und das Rühren 2 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Suspension wird 1 Stunde bei
4°C mit 20000 g zentrifugiert. Man erhält ein Sediment von 14 g. Das Sediment wird in 10 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7,0 suspendiert und wiederholt zentrifugiert. Das "endgültige Sediment wird bei 4°C gelagert.
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Spezifische Aktivität: 3 χ ΙΟ"5 Mol 6-APS min"1 (5 % Penicillin
G, pH 7,8, 22°C);
Wiedergewonnene Aktivität: 21 %. Flotierbar mit n-Decanol oder
n-Decan.
(a) GAN149HD0D-2
5 g n-Octadecylamin werden in 50 ml Äthanol gelöst und zu 1 Liter
einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 9,0 mit einem Gehalt von 200 ml Äthanol gegeben. Dann werden 5 g "Gantrez l49"
in kleinen Anteilen während 45 Minuten unter Rühren zugegeben.
Mittels 2-n Natronlauge wird der pH-Wert zwischen 8 und 9 aufrecht
erhalten. Nach der Zugabe von "Gantrez l49" werden 5 g 1,6-Diaminohexan
zugesetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert wird dann mittels konzentrierter Salzsäure
auf 3,0 herabgesetzt, und die Suspension wird 1 Stunde bei Raumtemperatur
mit 12000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird verworfen. Das Sediment wird in 550 ml Wasser suspendiert
und nochmals zentrifugiert. Man erhält schließlich ein weißes Sediment von 150 g, das bei 4°C gelagert wird.
(b) PAGAN149HD0D-2-G
100 ml einer Peniciliin-Acylase-Lösung (9,8 χ 10 Einheiten,
88 mg Protein) werden mit 15 g GAN149HD0D-2, 20 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 6,0 und 1 ml einer 2gewichtsprozentigen
Natriumazidlösung, bezogen auf das Volumen, gemischt. Das Gemisch wird kurzzeitig bei O0C homogenisiert und dann für
4,5 Stunden bei 0°c auf einem pH 6,8 eingestellt und schließlich
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1 Stunde bei 4°C mit 20000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 1J1O suspendiert und
nochmals zentrifugiert. Diese Arbeitsweisen werden wiederholt. Man erhält ein endgültiges Sediment vom Gewicht 11,2 g, das bei
4°C gelagert wird.
Spezifische Aktivität: 1,8 χ 10~5 Mole 6-APS χ min"1 χ g"1.
Wiedergewonnene Aktivität: 55 %. Flotierbar mit n-Decanol oder
n-Decan.
1 g "Gantrez AN 119" wird unter kräftigem Rühren in 5 ml Dimethylformamid
gelöst. Dann werden 0,3 g n-Decylamin in 1 ml Dimethylformamid
zugegeben. Die^ Lösung wird viskoser. Nach lOminütigem
Rühren wird die Lösung zu JOO ml einer Lösung von Rindertrypsin in 60 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH
8,0 bei 220C zugetropft. Der pH-Wert wird mittels 2-n Natrium-"hydroxidlösung
aufrecht erhalten. Wenn keine weitere Änderung auftritt, werden 4 g Natriumchlorid zugegeben. Die erhaltene Suspension
wird in 175 nil einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,6 gegossen und das Gemisch auf 4°C gekühlt. Dann werden
50 g Ammoniumsulfat zugegeben. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 4°C gerührt, dann 1 Stunde bei 4°C mit 25000 g zentrifugiert und
das gelähnliche Sediment in 30 ml einer 0,1-m .Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7»6 homogenisiert. Das Zentrifugieren wird wiederholt mit anschließendem zweimaligen Homogenisieren und
Zentrifugieren, so daß man schließlich ein lockeres Gel von 7,5 g erhält. Die Herstellung wird spektrophotometrisch unter Verwen-
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dung von 2 mMol N-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid in einer
0,1-m Veronal-Pufferlösung vom pH 8,3 bei 22°C untersucht. Eine
Einheit ist ein Anstieg bei der optischen Dichte von 0,001 je Minute bei 4-00 nm. Da das Gel eine bemerkenswerte Lichtstreuung
verursacht, ist es erforderlich, die Cuvette (1 cm Weglänge) intermittierend
zu schütteln.
Gelaktivität: l68 Einheiten/mg Peuchtgewicht, 2000 Einheiten/mg
Trockengewicht (lyophilisiertes Gel). Wiedergewonnene Aktivität: 24,2 %.
Die Immobilisierung der■Enzymverbindung auf den Lösungsmitteltröpfchen
wird durch folgenden Versuch veranschaulicht:
1 g des Gels (Feuchtgewicht) wird in einer kleinen Gewebemahlvorrichtung
mit 2,5 ml n-Decan und 10 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 8,0 5 Minuten bei O0C mit 4000 UpM homogenisiert.
Die milchige Suspension teilt sich in eine' obere Schicht aus dichtgepackten Decantröpfchen und eine untere wässrige Schicht
innerhalb von 3 Stunden bei 00C auf. Beide Schichten werden unter
Anwendung der vorgenannten spektrophotometrisehen Methode untersucht.
Wieder wird die Cuvette in regelmäßigen Zeitabständen geschüttelt, wenn die obere Schicht untersucht und die Durchschnittsgeschwindigkeit
des Anwachsens der optischen Dichte gemessen wird.
Aktivität der oberen Phase: 2280 Einheiten/ml; Aktivität der unteren Phase: 57 Einheiten/ml.
Da die scheinbare Aktivität der oberen Phase wahrscheinlich viel geringer als die wirkliche Aktivität infolge der angewendeten
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Methode ist, zeigt das Ergebnis an, daß mindestens 90 % der
Trypsin-Aktiyität mit den Lösungsmitteltröpfchen vergesellschaftet
sind.
Penicillin-Acylase-(n-octadecylamino-Gantrez AN 119) (FAGANlI90D)
0,5 g "Gantrez AN 119" werden in 2,5 ml Dimethylformamid gelöst.
Die Lösung wird auf dem Wasserbad auf 80°C erwärmt. Dann werden 0,28 g Octadecylomin in 2,5 ml Dimethylformamid bei 80°C gelöst
und rasch zu der "Gantrez"-Lösung gegeben, während sie noch warm ist. Das Gemisch wird gerührt und mit 0,1 ml Pyridln versetzt.
Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur innerhalb 1 Stunde wird die Gesamtlösung zu 175 mg Penicillin-Acylase in 30 ml Wasser bei pH
7*0 gegeben und kurz bei 00C homogenisiert.
Die rosafarbene Mischung wird dann j5 Stunden bei"O0C gerührt. Der
"pH-Wert wird l6 Stunden bei 4°C aufrecht erhalten. Dann werden
5,8 g Natriumchlorid,in der Suspension gelöst. Das Gemisch wird
danach 1 Stunde bei 0°C mit 25000 g zentrifugiert. Das erhaltene rosafarbene Sediment wiegt 4,0 g und wird in 20 ml 0,1 -m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7*0 wiederum suspendiert.
Unter Verwendung von 5 Gewichtsprozent Penicillin G,- bezogen auf
das Volumen, in 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,8 bei 250C besitzt die Suspension eine spezifische
Aktivität von 4,0 χ 10"^ Mol/min/ml. Dies bedeutet annähernd
70 % wiedergewonnene Aktivität in der Verbindung. Die vorgenannte
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Suspension (4,0 ml) wird mit 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung
und mit 5 ml n-Decanol vermischt und dann 5 Minuten
bei 00C mit etwa 4000 UpM homogenisiert. Dann wird die Emulsion
20 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 g zentrifugiert und in eine obere organische Emulsion und in eine untere wässrige Schicht
aufgetrennt. Die untere Schicht wird beibehalten und die obere
wird wiederum in 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung suspendiert und nochmals zentrifugiert. Die ursprüngliche untere Schicht enthält eine Gesamtaktivität von 1,25 x 10"-5 Mol/min und die gewaschene obere Schicht eine solche von 9,5 x 10"-3 Mol/min. Das Verhältnis der spezifischen Aktivitäten (o.uf das Volumen bezogen) beträgt 21,6 (obere zu unterer Schicht). Nach der Aktivitätsbestimmung nach dem vorgenannten Verfahren wird die organische Schicht durch schwaches Zentrifugieren rückgeführt. Das Entfernen der wässrigen Schicht ist in Tabelle V gezeigt.
20 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 g zentrifugiert und in eine obere organische Emulsion und in eine untere wässrige Schicht
aufgetrennt. Die untere Schicht wird beibehalten und die obere
wird wiederum in 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung suspendiert und nochmals zentrifugiert. Die ursprüngliche untere Schicht enthält eine Gesamtaktivität von 1,25 x 10"-5 Mol/min und die gewaschene obere Schicht eine solche von 9,5 x 10"-3 Mol/min. Das Verhältnis der spezifischen Aktivitäten (o.uf das Volumen bezogen) beträgt 21,6 (obere zu unterer Schicht). Nach der Aktivitätsbestimmung nach dem vorgenannten Verfahren wird die organische Schicht durch schwaches Zentrifugieren rückgeführt. Das Entfernen der wässrigen Schicht ist in Tabelle V gezeigt.
Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGANl190D-n-Decanol-Phase
auf die nachfolgenden Flotations-Wiederverwendungszyklen
| Zyklus Nr. | % Aktivität | Zyklus Nr. | # Aktivität |
| 1 | 80 | 7 | 46 |
| 2 | 86 | 8 | 46 |
| 3 | 93 | 9 | 44 |
| 4 | 73 | 10 | 42 |
| 5 | 64 | 11 | 45 |
| 6 | 47 | 12 | 43 |
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Beispiel 12
0,25 g n-Dodecylamino-Gantrez AN 119 werden in 1 ml Dimethylformamid
gelöst und zu einer Lösung von Penicillin-Acylase gegeben (100 mg in 14 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH
7,0).
Nach einer kurzzeitigen Homogenisierung bei 0°C wird die Suspension
16 Stunden bei 4 0C gerührt. Dann werden 7,8 g Ammoniumsulfat
bei 4°C zu der nunmehr homogenen Lösung gegeben. Der pH-Wert wird mit 1-m Natriumcarbonatlösung auf 7,0 gehalten. Nach dem Lösen
des Ammoniumsulfats bildet sich eine trübe Suspension. Das Gemisch wird 1 Stunde bei O0C mit 25000 g zentrifugiert. Das Sediment
wird in einer Lösung vpn 7,8 g Ammoniumsulfat in 30 ml Wasser nochmals suspendiert und dann bei pH 7,0 nochmals zentrifugiert.
Das endgültige Sediment wiegt 1,36 g und wird in 10 ml Wasser nochmals gelöst. Man erhält eine viskose Lösung."Die Aktivität des
"Sediments (Versuch wie zuvor) beträgt 1,β2 χ 10~ Mol/min/g
(Feuchtgewicht), was einer 80prozentigen wiedergewonnenen Aktivität
entspricht. Die Immobilisierung der wasserlöslichen Verbindung an n-Decanol-Tröpfchen wird durch den folgenden Versuch veranschaulicht:
1 ml der vorgenannten Lösung wird in 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung
gelöst und 3 Minuten bei O0C mit 10 ml
n-Decanol bei 4ö00 UpM homogenisiert. Die Emulsion trennt sich
nach lOminütigem Zentrifugieren mit 300 g in zwei Schichten auf. Die obere Schicht hat eine Gesamtaktivität von I,l4 χ 10"^
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-4^- 253595Ί
Mol/min. Die Aktivität bei den anschließenden Zyklen ist in Tabelle VI gezeigt.
Bei einem zweiten Versuch werden 2 ml der Lösung der Enzymverbindung
unter den gleichen Bedingungen mit 2,5 ml n-Decanol und 10 ml
0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren
und Waschen mit 20 ml der gleichen Pufferlösung besitzt die obere Schicht eine Aktivität von 1,8 χ ΙΟ"-5 Mol/min und
die ursprüngliche untere Schicht eine Aktivität von 8,0 χ 10" Mol/min. Das Verhältnis der spezifischen Aktivität (obere zu
unterer Schicht, bezogen auf das Volumen) ist etwa 7*5·
Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGANl19DD-n-Decanol-Phase
auf die anschließenden Plotations-
Len Zyklus Nr. % Aktivität
1 96
2 66
3 66
4 53
Beispiel 13
Trypsin-(hydrolysiertes n-Octadecylamino-Gantrez AN l49)
(TGAN 149DCMC)
15 g eines angequollenen Polymerisatgels wird mit 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7»0 vermischt. Der pH-Wert wird mit 2-n Salzsäure auf 4,7 eingestellt. Dann werden 0,5 g 1-Cyclo-
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hexyl-3-(2-raorpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat
(CMC) zugegeben. Der pH-Wert wird mittels 2-n HCl auf 4,7
gehalten. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur werden 75 mg Rindertrypsin
in 2 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7*0 gegeben. Der pH-Wert des Gemisches wird auf 5,9 eingestellt
und während der nächsten Stunde mittels 2-n Natriumhydroxidlösung aufrecht erhalten. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wird das Gel
30 Minuten bei 4°C mit 25000 g zentrifugiert. Das Sediment wird
in 40 ml einer 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7*0 nochmals
suspendiert und danach zentrifugiert. Das Endsediment wird mit 15 ml der vorgenannten Pufferlösung und 10 ml n-Decan vermischt
und kurzzeitig homogenisiert. Dieses Verfahren liefert eine unvollständige Dispersion, und das Gemisch wird deshalb mit Ultraschall
bei 20 kHz in 5 Stoßen zu 5 Minuten mit intermittierendem
Kühlen in Eis behandelt. Die Endemulsion wird 15 Minuten mit 100 g zentrifugiert. Die obere Schicht wird 3 mal mit je 25 ml Phosphat-Pufferlösung
gewaschen. Das endgültige Volumen der oberen Schicht beträgt 11 ml. Diese obere Schicht hat eine Aktivität (Untersuchung
wie in Beispiel 3) von 1050 BANA-Einheiten/ml (BANA =
N-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid) . Die scheinbare wiedergewonnene
Aktivität beträgt etwa 5 %.
(a) Hydrolyslertes n-Octadecylamino-Gantrez AN 119-Hydrazid
(GANlI9ODH)
5 g 'Oantrez AN 119" werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und
auf dem Wasserbad auf 60°C erwärmt. Eine Lösung von 2,8 g ri-Octadecylamin
in 30 ml auf 800C erwärmtem Dimethylformamid wird zuge-
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geben. Das Gemisch wird 1 Stunde auf etwa 60°C gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Lösung zu einem Gemisch von
10 ml Hydrazinhydrat und 50 ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur
gegeben. Es bildet sich ein schwachbrauner Niederschlag. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt und dann mit 50° ml Wasser versetzt.
Es bildet" sich eine seifige grüne Lösung. Nach 15minütigem Rühren wird der pH-Wert mittels konzentrierter Salzsäure auf 7,0
eingestellt. Dann werden 50 g Natriumchlorid zugesetzt. Es tritt eine Ausflockung auf, und die Suspension wird 30 Minuten bei 4°C
mit 10000 g zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wird in 400 ml Wasser nochmals suspendiert und dann 16 Stunden bei 4°C gerührt
und anschließend wie vorstehend angegeben zentrifugiert. Man erhält ein blaugraues Sediment von 39 g (Feuchtgewicht).
(b) Penicillin-Acylase-Qi-Octadecylamino-Gantrez AN 119)-hydrazid
(PAGANl190DH)
6 g GANl190DH (Feuchtgewicht) werden in 50 ml 2-n Salzsäure suspendiert
und 15 Minuten bei 0°C gerührt. Dann wird eine Lösung
von 0,5 g Natriumnitrit in 5 ml Wasser zugegeben.und das Gemisch
10 Minuten bei 00C gerührt und dann 30 Minuten bei 00C mit 25000 g
zentrifugiert. Das Sediment wird bei 00C in 50 ml einer 0,1-m
Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 8,0 nochmals suspendiert. Diese Suspension wird zu einer Lösung von 100 ml Penicillin-Acylase
(mit einem Gehalt von 55 mg Protein) gegeben. Das Gemisch wird auf einen pH 8,0 eingestellt. Die Suspension wird 72 Stunden
bei 4°C gerührt und dann 1 Stunde bei O0C mit 25000 g zentrifugiert.
Anschließend wird das Sediment in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und nochmals zentrifugiert.
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Das Gewicht des endgültigen Sedimetns beträgt 3,74.g. Die spezifische
Aktivität (Untersuchung wie zuvor) beträgt 5,2 χ 1·θ"^
Mol/min/g. Die wiedergewonnene Aktivität beträgt 32,5 %.
Eine Suspension der vorgenannten Verbindung in 0,1-m Natriumphosphat-Pufferlösung
vom pH 7,0 (0,29 g/ml; 2,5 ml) wird mit 20 ml einer 0,02-m Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,8 vermischt
und 2 Minuten und 5000 UpM bei 00C mit 7,5 ml n-Decanol homogenisiert.
Ein lOminütiges Zentrifugieren mit 100 g ergibt zwei Schichten. Die untere Schicht hat eine Gesamtaktivität von 1,8 χ
10" Mol/min und die obere Schicht nach dem Waschen mit 20 ml der vorgenannten Pufferlösung eine Aktivität von 1,9 χ 10 Mol/min.
Das Verhältnis der spezifischen Aktivitäten (untere zu oberer Schicht, bezogen auf das Volumen) beträgt etwa 30· Di.e Ergebnisse
der Rückführung der oberen Phase sind in der Tabelle VII angegeben. .
Prozentuale ursprüngliche Aktivität der PAGANlI9ODH-n-Decanol-Phase
auf die nachfolgenden Flotations-
Zyklus Nr. % Aktivität
1 90
2 84
3 74
6 098 09/0989
Beispiel 15
Enzymatische Spaltung von Benzylpenicillin zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure
1,0 g "Gantrez AN 119" werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,56 g Octadecylamin versetzt. Das Gemisch wird über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
48 ml einer teilweise gereinigten Zubereitung von Penicillin-Acylase
werden mittels 1-m Natriumcarbonatlösung auf einen pH 9,0 eingestellt. Die Lösung des "Gantrez"-Harzes wird dann in
zwei gleichen Anteilen unter Homogenisieren und einem pH-Einstellen zwischen den beiden Zugaben zugegeben. Danach wird das
Gemisch 3 Stunden gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 1-m Natriumhydroxidlösung auf 9,0 gehalten wird.
Das Enzym-Harz wird dann durch Zentrifugieren wiedergewonnen, in 120 ml einer 0,1-m Phosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 suspendiert
und dann 30 Sekunden homogenisiert. Das Enzym-Harz wird durch Zentrifugieren
und wiederholtes Waschen wiedergewonnen.
20 g des Enzym-Gels werden mit 80 ml n-Decan und 20 ml 0,02-m Phosphat-Pufferlösung vom pH 7,8 1 Minute homogenisiert. Das
Homogenisat wird zu 250 ml destilliertem Wasser gegeben. Das Gesamtgemisch wird auf 37 C erwärmt, dann auf einen pH 7,8 eingestellt
und mit 21,8 g Kalium-benzylpenicillin versetzt. Das Gemisch wird 5 Stunden gerührt und der pH-Wert durch Zugabe von
4gewichtsprozentiger Natriumhydroxidlösung, bezogen auf das Volumen,
auf 7,8 gehalten. Nach Beendigung der Reaktion wird das
609809/0989
Gemisch in einen Scheidetrichter gegeben. Dann läßt man das Enzym
von der wässrigen Phase sich abtrennen- Dies dauert etwa 30 Minuten. Die wässrige Schicht wird dann entfernt, und die 6-Aminopenicillansäure
wird in der nachfolgenden Weise extrahiert: die Flüssigkeit wird auf ein Viertel des ursprünglichen Volumens eingeengt,
auf 5°C gekühlt und dann mit dem gleichen Volumen Isobuty!keton
unter Rühren versetzt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von konzentrierter Salpetersäure auf 4,3 herabgesetzt, woraufhin die
6-Aminopenicillansäure ausfällt. Der Peststoff wird abfiltriert, mit Wasser und Aceton gewaschen und über Nacht bei 4o°C getrocknet.
Man erhält 1J1 65 g 6-Aminopenicillansäure.
Fig.! veranschaulicht die Freisetzung von p-Nitroanilin aus N-cC-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid
durch
(a) I mg Trypsin (Kurve A) und
(b) 0,1 g des Trypsin-Komplexes TFODHDG-I des Beispiels 6;
und Fig. 2 veranschaulicht die Freisetzung von p-Nitrophenyllaurat
durch
(a) 0,1 g Lipase (Kurve A) und
(b) 420 mg des Lipase-Komplexes LT2000 HDDG-I des Beispiels 7.
609 8 0 9/0989
Claims (30)
- PatentansprücheEnzympräparat, dadurch gekennzeichne t, daß
das Enzym an ausreichend nicht-polare Gruppen gebunden ist, so
daß sich beim In-Berührung-Bringen des Präparats in einem wässrigen Medium mit einer inerten, mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit das Präparat mit der inerten, mit Wasser nicht mischbaren
Flüssigkeit assoziiert und dadurch aus dem wässrigen Medium abtrennbar ist. - 2. Enzympräparat r,«ch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym an einen polymeren Trägerstoff gebunden ist.
- ~Z>. Enzympräparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der polymere Trägerstoff ein Polysaccharid ist.
- 4. Enzympräparat nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß der polymere Trägerstoff Dextran oder Sepharose ist.
- 5. Enzympräparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der polymere Trägerstoff ein Mischpolymerisat eines Oligosaccharids und eines Epichlorhydrins ist.
- 6. Enzympräparat nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial ein Mischpolymerisat von Saccharose
und Epichlorhydrin ist. - 7. Enzympräparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial Anhydridgruppen an der Hauptkette des609809/0989Polymerisats aufweist.
- 8. Enzympräparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial ein Mischpolymerisat von Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid ist.
- 9· Enzympräparat nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Amylase, Asparaginase, neutrale oder alkalische Protease, Chimotrypsin, Cellulase, Dextranase, Lipase, Oxynitrilase, Pepsin, Penicillin-Acylase oder Trypsin ist.
- 10. Enzympräparat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Penicillin-Acylase ist.
- 11. Enzympräparat nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-polaren Gruppen Alkylreste mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, Alkenylreste mit 6 bis 50 Kohlenstoffatomen, Cycloalkylreste mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, Aryl,-, substituierte Aryl- oder Aralkylreste sind.
- 12. Enzympräparat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-polare Gruppe ein Alkylrest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen ist.
- 13· Enzympräparat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-polare Gruppe die n-Decyl-, n-Dodecyl- oder die n-0ctadecylgruppe ist.609809/ü989
- 14. Enzympräparat nach mindestens der vorstehenden Ansprüche2 bis'13, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein Brückenglied zwischen dem Enzym und dem polymeren Trägerstoff und/oder dem Enzym und der nicht-polaren Gruppe und/oder dem polymeren Trägerstoff und der nicht-polaren Gruppe befindet.
- 15. Enzympräparat nach Anspruch l4, dadurch gekennzeichnet, daß das Brückenglied sich von einem aliphatischen d ,W-Diamin mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und/oder einem in Wasser löslichen Dialdehyd ableitet.
- 16. Enzympräparat nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis I3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym unmittelbar an den polymeren Trägerstoff gebunden ist.
- 17. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats nach den Ansprüchen 1 bis l6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel IR-X (I)in der R eine nicht—polare Gruppe und X eine funktionelle Gruppe ist, mit einem Enzym in Berührung bringt, das eine aktive Gruppe gebunden enthält, die mit der Gruppe X reagieren kann.
- 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I verwendet, in der X eine Aminogruppe ist.
- 19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet,609809/0989daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I verwendet, in der X einen polymeren Trägerstoff darstellt, der mindestens eine funktioneile Gruppe aufweist.
- 20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 19.» dadurch gekennzeichnet, daß man es in wässriger Lösung oder Suspension durchführt.
- 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei einem pH-Wert im Bereich von pH 4 bis pH 9 durchführt.
- 22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man einen polymeren Trägerstoff mit Anhydridgruppen an der Hauptkette des Polymerisats mit einem Amin der allgemeinen FormelR.NHp oder RpNH in einem aprotonischen nicht-wässrigen polaren Lösungsmittel umsetzt, in denen R die nicht-polare Gruppe ist, und anschließend das erhaltene modifizierte Polymerisat an das Enzym bindet.
- 23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-wässriges aprotonisches Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid verwendet.
- 24. Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß 'man in einem wässrigen Medium ein Enzympräparat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16 mit einem Substrat für das Enzym in Berührung bringt, danach das
Enzympräparat aus dem wässrigen Reaktionsgemisch mittels In-Berührung-Bringen mit einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit60 9809/0 989abtrennt, das Reaktionsprodukt aus der wässrigen Phase gewinnt und gegebenenfalls das abgetrennte Enzympräparat durch In-Berührung-Bringen mit weiterem Substrat wiederverwendet. - 25· Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit ein Alkan, einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen höheren aliphatischen Ester oder einen aliphatischen Alkohol mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen verwendet.
- 26. Verfahren nach α«ι Ansprüchen 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Berührung zwischen dem Enzympräparat und der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit durch Rühren herstellt,
- 27· Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Berührung zwischen dem Enzym und der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit vor der Durchführung der enzymatischen Reaktion herstellt.
- 28. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 24 bis 27* dadurch gekennzeichnet, daß man ein auf Penicillin-Acylase beruhendes Enzympräparat verwendet.
- 29· Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin verwendet. .
- 30. Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin, dadurch gekennzeichnet, daß man Benzylpenicillin609809/0989in einem wässrigen Medium mit einer inerten, mit V/asser nicht mischbaren Flüssigkeit und einem Enzympräparat in Berührung bringt, das Penicillin-Acylase an ausreichend nicht-polare Gruppen gebunden enthält, so daß das Präparat mit der inerten, mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit assoziiert wird, danach das Reaktionsgemisch sich in wässrige und mit Wasser nicht mischbare Schichten auftrennen läßt, dadurch das Enzympräparat aus dem wässrigen Reaktionsgemisch mittels seiner Assoziation mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit abtrennt, die 6-Aminopenicillansäure aus der wässrigen Phase gewinnt und gegebenenfalls das abgetrennte Enzympräparat durch In-Berührung-Bringen mit weiterem Benzylpenicillin wiederverwendet.609809/0989
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Representative=s name: JUNG, E., DIPL.-CHEM. DR.PHIL. SCHIRDEWAHN, J., DI |
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