CN106574273B - β-内酰胺酶的基于大肠杆菌的生产 - Google Patents

Abstract

本发明部分涉及用于使用大肠杆菌(E.coli)细胞生产β‑内酰胺酶的改进的方法。使用本发明的方法实现β‑内酰胺酶的高产率生产。

Description

β-内酰胺酶的基于大肠杆菌的生产

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年8月28日提交的美国临时专利申请号62/043,360的权益，所述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

发明领域

本发明部分涉及用于使用大肠埃希菌(Escherichia coli)(大肠杆菌(E.coli))细胞生产β-内酰胺酶的改进的方法。使用本发明的方法实现β-内酰胺酶的高产率生产，所述β-内酰胺酶包括适用于药物制剂的那些β-内酰胺酶。

电子提交的文本文件的描述

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背景技术

β-内酰胺类抗生素的特征在于在其分子结构中的β-内酰胺环。β-内酰胺环的完整性对于生物活性是重要的，所述生物活性导致催化肽聚糖合成的最终交联反应的一组转肽酶的失活。β-内酰胺类抗生素家族的成员包括青霉素类、头孢菌素类、克拉维烷类(或氧青霉烷类)、头霉素类以及碳青霉烯类。

β-内酰胺酶是水解β-内酰胺类抗生素的细菌防御性酶。革兰氏阴性细菌产生β-内酰胺酶来实现对β-内酰胺类抗生素的抗性。具体地说，β-内酰胺酶能够有效催化β-内酰胺环的酰胺键的不可逆水解，从而产生生物学失活的产物。

人类可被视为“超级生物体”，其为哺乳动物和微生物细胞的聚集体，其中据估计后者在数目上超过前者10比1。此微生物组分及其微生物遗传库微生物组大于人类宿主约100倍。引人注目地，尽管外来生物体具有此巨大的多样性，人类免疫系统通常仍维持协同状态。对于远侧胃肠道尤其如此，其容纳多至1000种不同细菌物种和据估计超过1×10¹⁴个微生物，并且看起来是限定人类宿主健康状态的核心。失去在微生物组中，尤其是在胃肠道中的仔细平衡可以导致各种疾病。

治疗疾病的某些方面所需要的抗生素医学治疗可以诱导在微生物组中，包括在胃肠道中的破坏，并且导致另外的疾病。例如，某些非肠内施用的β-内酰胺如氨苄西林、头孢曲松、头孢哌酮以及哌拉西林通过胆汁排泄到小肠的近侧部分(十二指肠)来部分消除。肠道内残余的未吸收β-内酰胺可引起对正常肠道微生物群的生态平衡的不良效应，从而导致例如艰难梭菌感染(CDI)、抗生素相关性腹泻、病原性细菌诸如耐万古霉素肠球菌(VRE)、产超广谱β-内酰胺酶的革兰氏阴性杆菌(ESBL)和真菌的过度生长以及在正常肠道微生物群和潜在病原体细菌两者中的抗生素抗性菌株的选择。

一种用于避免或重新平衡正常肠道微生物群的生态平衡的方法是β-内酰胺酶的治疗使用，例如，通过灭活胃肠道内分泌或未吸收的抗生素，从而维持正常肠道微生物群，并且防止其与潜在病原性微生物的过度生长。

因此，仍需要以商业规模生产用于治疗性干预的β-内酰胺酶的有效方法。

发明概述

本发明提供一种用于在大肠杆菌(E.coli)细胞中生产β-内酰胺酶多肽的改进的方法。所述方法包括提供用包含编码所述β-内酰胺酶多肽的序列的载体转化的宿主大肠杆菌细胞。对所述大肠杆菌细胞进行培养，以诱导所述β-内酰胺酶在细胞质内的表达。随后由所述大肠杆菌细胞制备可溶性级分以回收所述β-内酰胺酶多肽。

本发明的方法允许以高产率生产β-内酰胺酶。在一个实施方案中，所述方法在每升培养物中产出至少10克的所述β-内酰胺酶多肽。在另一个实施方案中，所述方法在每升培养物中产出至少15克的所述β-内酰胺酶多肽。

对于本发明，可采用大肠杆菌细胞的各种菌株。例如，大肠杆菌细胞可选自BL21(DE3)或W3110。所述β-内酰胺酶多肽主要在大肠杆菌的细胞质中表达。在某些实施方案中，通过向所述培养物中添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导所述多肽的表达。

可利用所公开的方法来生产β-内酰胺酶及其衍生物。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶多肽包含与P1A具有至少60％同一性的序列。在另一个实施方案中，所述β-内酰胺酶多肽包含与P2A具有至少60％同一性的序列。在又一个实施方案中，所述β-内酰胺酶多肽包含与P3A具有至少60％同一性的序列。在另一实施方案中，所述β-内酰胺酶多肽包含与P4A具有至少60％同一性的序列。在各种实施方案中，本发明方法用于产生对微生物组保护治疗有用的β-内酰胺酶。

附图简述

图1示出批次时间(小时)相对于气流(AIRFL(l/min)，顶部第二条线)、温度(TEMP(℃)，顶部线)、搅拌速率(STIRR(RPM)，底部第二条线)、pH(第三条线)以及氧百分比(PO₂，底部线)的多发酵罐计算机系统(MFCS)CLD977发酵曲线图。

图2示出批次时间(小时)相对于气流(AIRFL(l/min)，顶部第二条线)、温度(TEMP(℃)，顶部线)、搅拌速率(STIRR(RPM)，底部第二条线)、pH(第三条线)以及氧百分比(PO₂，底部线)的MFCS CLD990发酵曲线图。

图3示出批次时间(小时)相对于CLD977(3/13C039)和CLD990(4/13C040)的摄氧速率(OUR)和二氧化碳释放速率(CER)(mM/l/h)的MFCS发酵出口气体分析曲线图。从左向右标记，第一条线对应于CLD977OUR，第二条线对应于CLD977CER，第三条线对应于CLD990OUR并且第四条线对应于CLD990CER。

图4示出对于CLD977(3/13C039)和CLD990(4/13C040)的批次时间(小时)相对于OD₆₀₀和干细胞重量(DCW(g/L))的生物质曲线图。CLD977OD₆₀₀和DCW线分别对应于顶部线和底部第二条线。CLD990OD₆₀₀和DCW线分别对应于顶部第二条线和底部线。

图5示出在分批阶段结束时和在发酵完成之后(最终样品)CLD977和CLD990的细菌革兰氏染色。

图6示出与对照标准相比从诱导前到发酵结束的CLD977(3/13CO39)时间过程样品的SDS PAGE分析。

图7示出与对照标准相比从诱导前到发酵结束的CLD990(4/13C040)时间过程样品的SDS PAGE分析。

图8示出与对照标准相比来自CLD977(3/13C039)和CLD990(4/13C040)的超声处理样品的SDS PAGE分析。CLD977和CLD990主要产出可溶性蛋白质。对于不溶性级分仅看到微弱的产物带。

图9示出时间(秒)相对于对照1和2以及0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L和4mg/L的参考标准稀释液的吸光度的标准曲线。对照1和2是作为一式两份运行的1.0μg/mL的预设稀释液。

图10示出标准浓度(mg/L)相对于终点吸光度的标准终点曲线。在时间＝60秒时测量标准吸光度，减去在时间＝0秒时的标准吸光度。具体地说，在时间＝60秒时测量酶反应。在时间＝0秒时测量吸光度，然后将其从60秒的测量值中减去。对参考标准的若干稀释液进行测试以生成标准曲线。

图11示出时间(秒)相对于在12小时、24小时、48小时的CLD981(3/13C037(也称为37))以及周质渗透压休克级分(OS2)的吸光度的标准曲线。具体地说，OS2是由大肠杆菌沉淀制备的第二缓冲液级分，并且代表周质间隙级分。

图12示出时间(秒)相对于CLD981(3/13C037)OS1样品的吸光度的标准终点曲线。

图13示出时间(秒)相对于诱导后12h、24h、48h的CLD982(4/13C038(也称为38))以及48h的OS1和OS2的吸光度的标准曲线。

图14示出时间(秒)相对于对照1和2(组合成对照标准)以及0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L和4mg/L的参考标准材料稀释液的吸光度的标准曲线。

图15示出标准浓度(mg/L)相对于终点吸光度的标准终点曲线。在时间＝60秒时测量标准吸光度，减去在时间＝0秒时的标准吸光度。

图16示出时间(秒)相对于诱导后48h的CLD981(37)和CLD982(38)OS1和OS2的吸光度的标准曲线。表3是对CLD981和CLD982OS1和OS2以及对照1和2的测定板2活性和滴度结果的汇总。

图17示出时间(秒)相对于对照1和2(作为对照标准组合)以及0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L和4mg/L的参考标准材料稀释液的吸光度的标准曲线。

图18示出标准浓度(mg/L)相对于终点吸光度的标准终点曲线。在时间＝60秒时测量标准吸光度，减去在时间＝0秒时的标准吸光度。

图19示出时间(秒)相对于诱导后倒数第二个时间点和最后时间点(未标记＝超声处理)以及诱导后的最后时间点(Bug buster)的CLD977(39)和CLD990(40)的吸光度的标准曲线。

详细描述

本发明部分基于β-内酰胺酶多肽可以在大肠杆菌细胞中以高产率过量产生的惊人发现。具体地说，通过在大肠杆菌细胞的细胞质中表达多肽，并且随后从由所述细胞制备的可溶性级分回收多肽来实现高产率生产。

在本发明之前，已经确定β-内酰胺酶，诸如来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的β-内酰胺酶主要见于大肠杆菌细胞的细胞被膜和周质级分中。参见Mezes等，J Biol Chem(1983)，258(18):11211-11218。具体地说，发现来自地衣芽孢杆菌的β-内酰胺酶在细胞质中完全不存在。同上。

另外，由大肠杆菌生产β-内酰胺酶通常是低效的，引起的总产率规模为每升培养物若干毫克酶。参见，例如，Shaw等，Protein Expr Purif。(1991),2(2-3)：151-157。考虑到β-内酰胺酶来自地衣芽孢杆菌，预期在芽孢杆菌菌株(Bacillus strains)中生产这些酶可提供较高的产率。然而，本文中示出的研究表明即使当在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞中生产时，β-内酰胺酶的产率较低。因此，本发明实现每升培养物若干克规模的β-内酰胺酶总产率是令人意外的。

因此，本发明提供一种用于在大肠杆菌(E.coli)细胞中生产β-内酰胺酶多肽的改进的方法。所述方法包括提供用包含编码所述β-内酰胺酶多肽的序列的载体转化的宿主大肠杆菌细胞。对所述大肠杆菌细胞进行培养，以诱导所述β-内酰胺酶在细胞质内的表达。随后由大肠杆菌细胞制备可溶性级分以用于回收β-内酰胺酶多肽。

本发明允许在大肠杆菌细胞中高产率生产β-内酰胺酶多肽。在各种实施方案中，本发明的方法提供每升培养物中以下重量的β-内酰胺酶多肽的产率：至少约1克、约2克、约3克、约4克、约5克、约6克、约7克、约8克、约9克、约10克、约11克、约12克、约13克、约14克、约15克、约16克、约17克、约18克、约19克、约20克、约22克、约24克、约26克、约28克、约30克、约35克、约40克、约45克或约50克。在一个实施方案中，每升培养物中回收至少约10克的β-内酰胺酶多肽。在另一个实施方案中，每升培养物中回收至少约15克的β-内酰胺酶多肽。在另一实施方案中，每升培养物中回收至少约18克的β-内酰胺酶多肽。

在各种实施方案中，与基于芽孢杆菌的表达系统，例如像在美国专利号7,319,030描述的那些表达系统相比，本发明方法提供更大的产率和提高的纯度中的一种或多种，所述专利的全部内容以引用的方式并入本文。在各种实施方案中，与用于使用非孢子化枯草芽孢杆菌菌株(其中至少150个核苷酸的缺失区域已从其sigG基因中缺失)产生所需多肽产物的方法相比，本发明方法提供更大产率和提高的纯度中的一种或多种，所述方法涉及使用编码重组多肽的多核苷酸构建体来转化菌株、表达所述多核苷酸构建体以及回收重组多肽。在一些实施方案中，所述方法包括缺失sigG基因的两个功能区域(即，编码氨基酸67至80或229至248的区域)中的任一个的至少一部分。

在各种实施方案中，相对于基于芽孢杆菌的表达系统，例如像美国专利号7,319,030中描述的那些表达系统，本发明方法在大肠杆菌中提供约5倍、或约7.5倍、或约10倍、或约15倍的产率提高。

本发明可以使用各种大肠杆菌细胞。说明性大肠杆菌细胞包括但不限于BL21(DES)、W3110、DH5α、HMS174及其衍生物。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞是BL21(DES)菌株。在另一个实施方案中，大肠杆菌细胞是W3110菌株。W3110的基因型是大肠杆菌K12F-、λ-、IN(rrnD-rrnE)1、rph-1。它是革兰氏阴性的棒状兼性厌氧菌，并且其系谱已良好地描述(Bachmann,BJ 1972.Pedigrees of some mutant strains of Escherichia coli K-12.Bacteriol.修订版36(4):525-57)。在使用B3214质粒转化之前没有对此菌株进行修饰。

本发明用于以高产率生产β-内酰胺酶多肽。在各个方面中，所述β-内酰胺酶多肽具有SEQ ID NO:1(地衣芽孢杆菌PenP，即P1A)的序列，或者通过SEQ ID NO:1的一个或多个突变产生。本文提供P1A酶的263个氨基酸序列(在N末端去除31个氨基酸信号序列和QASKT(Gln-Ala-Ser-Lys-Thr)五肽之后，参见SEQ ID NO:3)。如本文所描述的，可对此序列进行突变，以生成可通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶衍生物。

SEQ ID NO:1

EMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGK。

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:1可在序列的第一个残基之前具有Met和/或Thr。在各种实施方案中，Met可裂解。如本文所描述的，可对在第一个残基之前包含Met和/或Thr的序列进行突变，以生成β-内酰胺酶衍生物。

本文还提供在N末端去除31个氨基酸信号序列和QASKT(Gln-Ala-Ser-Lys-Thr)五肽之前的P1A酶的299个氨基酸序列，以作为SEQ ID NO:3：

SEQ ID NO:3

MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAQASKTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGK

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

另外，所述β-内酰胺酶多肽可包含来自SEQ ID NO:1的第一个残基的附加上游残基(参见，例如，JBC 258(18):11211,1983，所述文献的内容以引用的方式并入本文-包括penP和penP1的大外型和小外型版本)。另外，所述β-内酰胺酶多肽还可包含来自SEQ IDNO:1的最后残基的附加下游残基。

提供P1A的多核苷酸序列(在N末端去除31个氨基酸信号序列和QAKST五肽之后)，以作为SEQ ID NO:2。如本文所描述的，可对此序列进行突变，以生成β-内酰胺酶衍生物(包括将遗传密码的简并性考虑在内)。

SEQ ID NO:2

gagatgaaagatgattttgcaaaacttgaggaacaatttgatgcaaaactcgggatctttgcattggatacaggtacaaaccggacggtagcgtatcggccggatgagcgttttgcttttgcttcgacgattaaggctttaactgtaggcgtgcttttgcaacagaaatcaatagaagatctgaaccagagaataacatatacacgtgatgatcttgtaaactacaacccgattacggaaaagcacgttgatacgggaatgacgctcaaagagcttgcggatgcttcgcttcgatatagtgacaatgcggcacagaatctcattcttaaacaaattggcggacctgaaagtttgaaaaaggaactgaggaagattggtgatgaggttacaaatcccgaacgattcgaaccagagttaaatgaagtgaatccgggtgaaactcaggataccagtacagcaagagcacttgtcacaagccttcgagcctttgctcttgaagataaacttccaagtgaaaaacgcgagcttttaatcgattggatgaaacgaaataccactggagacgccttaatccgtgccggtgtgccggacggttgggaagtggctgataaaactggagcggcatcatatggaacccggaatgacattgccatcatttggccgccaaaaggagatcctgtcgttcttgcagtattatccagcagggataaaaaggacgccaagtatgatgataaacttattgcagaggcaacaaaggtggtaatgaaagccttaaacatgaacggcaaataa

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性。

还提供在N末端去除31个氨基酸信号序列和QASKT五肽之前的P1A的多核苷酸序列，以作为SEQ ID NO:4。如本文所描述，可对此序列进行突变，以生成β-内酰胺酶衍生物(包括将遗传密码的简并性考虑在内)。

SEQ ID NO:4

atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcgcaagcttccaagacggagatgaaagatgattttgcaaaacttgaggaacaatttgatgcaaaactcgggatctttgcattggatacaggtacaaaccggacggtagcgtatcggccggatgagcgttttgcttttgcttcgacgattaaggctttaactgtaggcgtgcttttgcaacagaaatcaatagaagatctgaaccagagaataacatatacacgtgatgatcttgtaaactacaacccgattacggaaaagcacgttgatacgggaatgacgctcaaagagcttgcggatgcttcgcttcgatatagtgacaatgcggcacagaatctcattcttaaacaaattggcggacctgaaagtttgaaaaaggaactgaggaagattggtgatgaggttacaaatcccgaacgattcgaaccagagttaaatgaagtgaatccgggtgaaactcaggataccagtacagcaagagcacttgtcacaagccttcgagcctttgctcttgaagataaacttccaagtgaaaaacgcgagcttttaatcgattggatgaaacgaaataccactggagacgccttaatccgtgccggtgtgccggacggttgggaagtggctgataaaactggagcggcatcatatggaacccggaatgacattgccatcatttggccgccaaaaggagatcctgtcgttcttgcagtattatccagcagggataaaaaggacgccaagtatgatgataaacttattgcagaggcaacaaaggtggtaatgaaagccttaaacatgaacggcaaataa

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸与SEQ ID NO:4具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性。

在一些实施方案中，对β-内酰胺酶(例如，A类β-内酰胺酶)进行诱变以得到有利的酶(例如，可以靶向广谱抗生素的那些酶)。在一些实施方案中，通过定点诱变、随机诱变和/或定向进化方法获得β-内酰胺酶衍生物。在一些实施方案中，突变设计尤其基于以下的结构数据(例如，晶体结构数据、同源模型等)：P1A晶体结构(Knox和Moews,J.Mol Biol.,220,435–455(1991))、CTX-M-44(1BZA(Ibuka等Journal of Molecular Biology第285卷，第52079–2087(1999)期、1IYS(Ibuka等Biochemistry,2003,42(36):10634-43)、1IYO、1IYP以及1IYQ(Shimamura等2002J.Biol.Chem.277:46601-08)、普通变形杆菌K1(1HZO,Nugaka等JMol Biol.2002年3月15日；317(1):109-17)以及彭氏变形菌HugA(Liassine等AntimicrobAgents Chemother.2002年1月；46(1):216-9.2002)，并且在Bonnet,Antimicrob.AgentsChemother48(1):1-14(2004)(针对CTM-X)中综述，所有这些文献的内容均以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，通过分析以下β-内酰胺酶中任一种的结构数据(例如，晶体结构数据、同源模型等)来告知存在的诱变：P1A(参见，例如，美国专利号5,607,671，其内容以引用的方式并入本文)、P2A(参见，例如，WO 2007/147945，其内容以引用的方式并入本文)、P3A(参见，例如，WO2011/148041，其内容以引用的方式并入本文)、CTX-M-3、CTX-M-4、CTX-M-5、CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14、CTX-M-15、CTX-M-16、CTX-M-18、CTX-M-19、CTX-M-25、CTX-M-26、CTX-M-27、CTX-M-32、CTX-M-44、CTX-M-45以及CTX-M-54。这些信息对于本领域的技术人员而言可在已知数据库中获得，例如，Swiss-Prot蛋白质序列数据库、NCBI以及PDB。

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含一个或多个相对于以下序列的突变(例如，约1个、或约2个、或约3个、或约4个、或约5个、或约6个、或约7个、或约8个、或约9个、或约10个、或约15个、或约20个、或约30个、或约40个、或约50个、或约60个、或约70个、或约80个、或约90个、或约100个、或约110个、或约120个、或约130个、或约140个、或约150个)：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少30％、35％、40％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％同一性的序列(或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有约60％、约65％、约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的同一性)。在各种实施方案中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸由天然存在的氨基酸取代，所述天然存在的氨基酸诸如亲水性氨基酸(例如，极性和带正电荷的亲水性氨基酸，诸如精氨酸(R)或赖氨酸(K)；极性和带中性电荷的亲水性氨基酸，诸如天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)以及半胱氨酸(C)；极性和带负电荷的亲水性氨基酸，诸如天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；或者芳香族极性和带正电荷的亲水性氨基酸，诸如组氨酸(H))或疏水性氨基酸(例如，疏水性脂肪族氨基酸，诸如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)或缬氨酸(V)；疏水性芳香族氨基酸，诸如苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)；或者非经典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA以及δ-氨基乙酰丙酸，4-氨基苯甲酸(PABA)、常见氨基酸的D型异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计者氨基酸(designer amino acids)，诸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸以及一般的氨基酸类似物)。

在说明性实施方案中，发明性突变包括但不限于对以下序列的以下突变中的一个或多个(例如，约1个、或约2个、或约3个、或约4个、或约5个、或约6个、或约7个、或约8个、或约9个、或约10个、或约15个、或约20个、或约30个、或约40个、或约50个、或约60个、或约70个、或约80个、或约90个、或约100个、或约110个、或约120个、或约130个、或约140个、或约150个)，所述序列为：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少30％、35％、40％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％同一性的序列(或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的同一性)，所述突变为：Glu1Ala；Glu1Cys；Glu1Asp；Glu1Phe；Glu1Gly；Glu1His；Glu1Ile；Met1Lys；Glu1Leu；Glu1Met；Glu1Asn；Glu1Pro；Glu1Gln；Glu1Arg；Glu1Ser；Glu1Thr；Glu1Val；Glu1Trp；Glu1Tyr；Met2Ala；Met2Cys；Met2Asp；Met2Glu；Met2Phe；Met2Gly；Met2His；Met2Ile；Met1Lys；Met2Leu；Met2Asn；Met2Pro；Met2Gln；Met2Arg；Met2Ser；Met2Thr；Met2Val；Met2Trp；Met2Tyr；Lys3Ala；Lys3Cys；Lys3Asp；Lys3Glu；Lys3Phe；Lys3Gly；Lys3His；Lys3Ile；Lys3Leu；Lys3Met；Lys3Asn；Lys3Pro；Lys3Gln；Lys3Arg；Lys3Ser；Lys3Thr；Lys3Val；Lys3Trp；Lys3Tyr；Asp4Ala；Asp4Cys；Asp4Glu；Asp4Phe；Asp4Gly；Asp4His；Asp4Ile；Asp4Lys；Asp4Leu；Asp4Met；Asp4Asn；Asp4Pro；Asp4Gln；Asp4Arg；Asp4Ser；Asp4Thr；Asp4Val；Asp4Trp；Asp4Tyr；Asp5Ala；Asp5Cys；Asp5Glu；Asp5Phe；Asp5Gly；Asp5His；Asp5Ile；Asp5Lys；Asp5Leu；Asp5Met；Asp5Asn；Asp5Pro；Asp5Gln；Asp5Arg；Asp5Ser；Asp5Thr；Asp5Val；Asp5Trp；Asp5Tyr；Phe6Ala；Phe6Cys；Phe6Asp；Phe6Glu；Phe6Gly；Phe6His；Phe6Ile；Phe6Lys；Phe6Leu；Phe6Met；Phe6Asn；Phe6Pro；Phe6Gln；Phe6Arg；Phe6Ser；Phe6Thr；Phe6Val；Phe6Trp；Phe6Tyr；Ala7Cys；Ala7Asp；Ala7Glu；Ala7Phe；Ala7Gly；Ala7His；Ala7Ile；Ala7Lys；Ala7Leu；Ala7Met；Ala7Asn；Ala7Pro；Ala7Gln；Ala7Arg；Ala7Ser；Ala7Thr；Ala7Val；Ala7Trp；Ala7Tyr；Lys8Ala；Lys8Cys；Lys8Asp；Lys8Glu；Lys8Phe；Lys8Gly；Lys8His；Lys8Ile；Lys8Leu；Lys8Met；Lys8Asn；Lys8Pro；Lys8Gln；Lys8Arg；Lys8Ser；Lys8Thr；Lys8Val；Lys8Trp；Lys8Tyr；Leu9Ala；Leu9Cys；Leu9Asp；Leu9Glu；Leu9Phe；Leu9Gly；Leu9His；Leu9Ile；Leu9Lys；Leu9Met；Leu9Asn；Leu9Pro；Leu9Gln；Leu9Arg；Leu9Ser；Leu9Thr；Leu9Val；Leu9Trp；Leu9Tyr；Glu10Ala；Glu10Cys；Glu10Asp；Glu10Phe；Glu10Gly；Glu10His；Glu10Ile；Glu10Lys；Glu10Leu；Glu10Met；Glu10Asn；Glu10Pro；Glu10Gln；Glu10Arg；Glu10Ser；Glu10Thr；Glu10Val；Glu10Trp；Glu10Tyr；Glu11Ala；Glu11Cys；Glu11Asp；Glu11Phe；Glu11Gly；Glu11His；Glu11Ile；Glu11Lys；Glu11Leu；Glu11Met；Glu11Asn；Glu11Pro；Glu11Gln；Glu11Arg；Glu11Ser；Glu11Thr；Glu11Val；Glu11Trp；Glu11Tyr；Gln12Ala；Gln12Cys；Gln12Asp；Gln12Glu；Gln12Phe；Gln12Gly；Gln12His；Gln12Ile；Gln12Lys；Gln12Leu；Gln12Met；Gln12Asn；Gln12Pro；Gln12Arg；Gln12Ser；Gln12Thr；Gln12Val；Gln12Trp；Gln12Tyr；Phe13Ala；Phe13Cys；Phe13Asp；Phe13Glu；Phe13Gly；Phe13His；Phe13Ile；Phe13Lys；Phe13Leu；Phe13Met；Phe13Asn；Phe13Pro；Phe13Gln；Phe13Arg；Phe13Ser；Phe13Thr；Phe13Val；Phe13Trp；Phe13Tyr；Asp14Ala；Asp14Cys；Asp14Glu；Asp14Phe；Asp14Gly；Asp14His；Asp14Ile；Asp14Lys；Asp14Leu；Asp14Met；Asp14Asn；Asp14Pro；Asp14Gln；Asp14Arg；Asp14Ser；Asp14Thr；Asp14Val；Asp14Trp；Asp14Tyr；Ala15Cys；Ala15Asp；Ala15Glu；Ala15Phe；Ala15Gly；Ala15His；Ala15Ile；Ala15Lys；Ala15Leu；Ala15Met；Ala15Asn；Ala15Pro；Ala15Gln；Ala15Arg；Ala15Ser；Ala15Thr；Ala15Val；Ala15Trp；Ala15Tyr；Lys16Ala；Lys16Cys；Lys16Asp；Lys16Glu；Lys16Phe；Lys16Gly；Lys16His；Lys16Ile；Lys16Leu；Lys16Met；Lys16Asn；Lys16Pro；Lys16Gln；Lys16Arg；Lys16Ser；Lys16Thr；Lys16Val；Lys16Trp；Lys16Tyr；Leu17Ala；Leu17Cys；Leu17Asp；Leu17Glu；Leu17Phe；Leu17Gly；Leu17His；Leu17Ile；Leu17Lys；Leu17Met；Leu17Asn；Leu17Pro；Leu17Gln；Leu17Arg；Leu17Ser；Leu17Thr；Leu17Val；Leu17Trp；Leu17Tyr；Gly18Ala；Gly18Cys；Gly18Asp；Gly18Glu；Gly18Phe；Gly18His；Gly18Ile；Gly18Lys；Gly18Leu；Gly18Met；Gly18Asn；Gly18Pro；Gly18Gln；Gly18Arg；Gly18Ser；Gly18Thr；Gly18Val；Gly18Trp；Gly18Tyr；Ile19Ala；Ile19Cys；Ile19Asp；Ile19Glu；Ile19Phe；Ile19Gly；Ile19His；Ile19Lys；Ile19Leu；Ile19Met；Ile19Asn；Ile19Pro；Ile19Gln；Ile19Arg；Ile19Ser；Ile19Thr；Ile19Val；Ile19Trp；Ile19Tyr；Phe20Ala；Phe20Cys；Phe20Asp；Phe20Glu；Phe20Gly；Phe20His；Phe20Ile；Phe20Lys；Phe20Leu；Phe20Met；Phe20Asn；Phe20Pro；Phe20Gln；Phe20Arg；Phe20Ser；Phe20Thr；Phe20Val；Phe20Trp；Phe20Tyr；Ala21Cys；Ala21Asp；Ala21Glu；Ala21Phe；Ala21Gly；Ala21His；Ala21Ile；Ala21Lys；Ala21Leu；Ala21Met；Ala21Asn；Ala21Pro；Ala21Gln；Ala21Arg；Ala21Ser；Ala21Thr；Ala21Val；Ala21Trp；Ala21Tyr；Leu22Ala；Leu22Cys；Leu22Asp；Leu22Glu；Leu22Phe；Leu22Gly；Leu22His；Leu22Ile；Leu22Lys；Leu22Met；Leu22Asn；Leu22Pro；Leu22Gln；Leu22Arg；Leu22Ser；Leu22Thr；Leu22Val；Leu22Trp；Leu22Tyr；Asp23Ala；Asp23Cys；Asp23Glu；Asp23Phe；Asp23Gly；Asp23His；Asp23Ile；Asp23Lys；Asp23Leu；Asp23Met；Asp23Asn；Asp23Pro；Asp23Gln；Asp23Arg；Asp23Ser；Asp23Thr；Asp23Val；Asp23Trp；Asp23Tyr；Thr24Ala；Thr24Cys；Thr24Asp；Thr24Glu；Thr24Phe；Thr24Gly；Thr24His；Thr24Ile；Thr24Lys；Thr24Leu；Thr24Met；Thr24Asn；Thr24Pro；Thr24Gln；Thr24Arg；Thr24Ser；Thr24Val；Thr24Trp；Thr24Tyr；Gly25Ala；Gly25Cys；Gly25Asp；Gly25Glu；Gly25Phe；Gly25His；Gly25Ile；Gly25Lys；Gly25Leu；Gly25Met；Gly25Asn；Gly25Pro；Gly25Gln；Gly25Arg；Gly25Ser；Gly25Thr；Gly25Val；Gly25Trp；Gly25Tyr；Thr26Ala；Thr26Cys；Thr26Asp；Thr26Glu；Thr26Phe；Thr26Gly；Thr26His；Thr26Ile；Thr26Lys；Thr26Leu；Thr26Met；Thr26Asn；Thr26Pro；Thr26Gln；Thr26Arg；Thr26Ser；Thr26Val；Thr26Trp；Thr26Tyr；Asn27Ala；Asn27Cys；Asn27Asp；Asn27Glu；Asn27Phe；Asn27Gly；Asn27His；Asn27Ile；Asn27Lys；Asn27Leu；Asn27Met；Asn27Pro；Asn27Gln；Asn27Arg；Asn27Ser；Asn27Thr；Asn27Val；Asn27Trp；Asn27Tyr；Arg28Ala；Arg28Cys；Arg28Asp；Arg28Glu；Arg28Phe；Arg28Gly；Arg28His；Arg28Ile；Arg28Lys；Arg28Leu；Arg28Met；Arg28Asn；Arg28Pro；Arg28Gln；Arg28Ser；Arg28Thr；Arg28Val；Arg28Trp；Arg28Tyr；Thr29Ala；Thr29Cys；Thr29Asp；Thr29Glu；Thr29Phe；Thr29Gly；Thr29His；Thr29Ile；Thr29Lys；Thr29Leu；Thr29Met；Thr29Asn；Thr29Pro；Thr29Gln；Thr29Arg；Thr29Ser；Thr29Val；Thr29Trp；Thr29Tyr；Val30Ala；Val30Cys；Val30Asp；Val30Glu；Val30Phe；Val30Gly；Val30His；Val30Ile；Val30Lys；Val30Leu；Val30Met；Val30Asn；Val30Pro；Val30Gln；Val30Arg；V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he；Ala248Gly；Ala248His；Ala248Ile；Ala248Lys；Ala248Leu；Ala248Met；Ala248Asn；Ala248Pro；Ala248Gln；Ala248Arg；Ala248Ser；Ala248Thr；Ala248Val；Ala248Trp；Ala248Tyr；Glu249Ala；Glu249Cys；Glu249Asp；Glu249Phe；Glu249Gly；Glu249His；Glu249Ile；Glu249Lys；Glu249Leu；Glu249Met；Glu249Asn；Glu249Pro；Glu249Gln；Glu249Arg；Glu249Ser；Glu249Thr；Glu249Val；Glu249Trp；Glu249Tyr；Ala250Cys；Ala250Asp；Ala250Glu；Ala250Phe；Ala250Gly；Ala250His；Ala250Ile；Ala250Lys；Ala250Leu；Ala250Met；Ala250Asn；Ala250Pro；Ala250Gln；Ala250Arg；Ala250Ser；Ala250Thr；Ala250Val；Ala250Trp；Ala250Tyr；Thr251Ala；Thr251Cys；Thr251Asp；Thr251Glu；Thr251Phe；Thr251Gly；Thr251His；Thr251Ile；Thr251Lys；Thr251Leu；Thr251Met；Thr251Asn；Thr251Pro；Thr251Gln；Thr251Arg；Thr251Ser；Thr251Val；Thr251Trp；Thr251Tyr；Lys252Ala；Lys252Cys；Lys252Asp；Lys252Glu；Lys252Phe；Lys252Gly；Lys252His；Lys252Ile；Lys252Leu；Lys252Met；Lys252Asn；Lys252Pro；Lys252Gln；Lys252Arg；Lys252Ser；Lys252Thr；Lys252Val；Lys252Trp；Lys252Tyr；Val253Ala；Val253Cys；Val253Asp；Val253Glu；Val253Phe；Val253Gly；Val253His；Val253Ile；Val253Lys；Val253Leu；Val253Met；Val253Asn；Val253Pro；Val253Gln；Val253Arg；Val253Ser；Val253Thr；Val253Trp；Val253Tyr；Val254Ala；Val254Cys；Val254Asp；Val254Glu；Val254Phe；Val254Gly；Val254His；Val254Ile；Val254Lys；Val254Leu；Val254Met；Val254Asn；Val254Pro；Val254Gln；Val254Arg；Val254Ser；Val254Thr；Val254Trp；Val254Tyr；Met255Ala；Met255Cys；Met255Asp；Met255Glu；Met255Phe；Met255Gly；Met255His；Met255Ile；Met255Lys；Met255Leu；Met255Asn；Met255Pro；Met255Gln；Met255Arg；Met255Ser；Met255Thr；Met255Val；Met255Trp；Met255Tyr；Lys256Ala；Lys256Cys；Lys256Asp；Lys256Glu；Lys256Phe；Lys256Gly；Lys256His；Lys256Ile；Lys256Leu；Lys256Met；Lys256Asn；Lys256Pro；Lys256Gln；Lys256Arg；Lys256Ser；Lys256Thr；Lys256Val；Lys256Trp；Lys256Tyr；Ala257Cys；Ala257Asp；Ala257Glu；Ala257Phe；Ala257Gly；Ala257His；Ala257Ile；Ala257Lys；Ala257Leu；Ala257Met；Ala257Asn；Ala257Pro；Ala257Gln；Ala257Arg；Ala257Ser；Ala257Thr；Ala257Val；Ala257Trp；Ala257Tyr；Leu258Ala；Leu258Cys；Leu258Asp；Leu258Glu；Leu258Phe；Leu258Gly；Leu258His；Leu258Ile；Leu258Lys；Leu258Met；Leu258Asn；Leu258Pro；Leu258Gln；Leu258Arg；Leu258Ser；Leu258Thr；Leu258Val；Leu258Trp；Leu258Tyr；Asn259Ala；Asn259Cys；Asn259Asp；Asn259Glu；Asn259Phe；Asn259Gly；Asn259His；Asn259Ile；Asn259Lys；Asn259Leu；Asn259Met；Asn259Pro；Asn259Gln；Asn259Arg；Asn259Ser；Asn259Thr；Asn259Val；Asn259Trp；Asn259Tyr；Met260Ala；Met260Cys；Met260Asp；Met260Glu；Met260Phe；Met260Gly；Met260His；Met260Ile；Met260Lys；Met260Leu；Met260Asn；Met260Pro；Met260Gln；Met260Arg；Met260Ser；Met260Thr；Met260Val；Met260Trp；Met260Tyr；Asn261Ala；Asn261Cys；Asn261Asp；Asn261Glu；Asn261Phe；Asn261Gly；Asn261His；Asn261Ile；Asn261Lys；Asn261Leu；Asn261Met；Asn261Pro；Asn261Gln；Asn261Arg；Asn261Ser；Asn261Thr；Asn261Val；Asn261Trp；Asn261Tyr；Gly262Ala；Gly262Cys；Gly262Asp；Gly262Glu；Gly262Phe；Gly262His；Gly262Ile；Gly262Lys；Gly262Leu；Gly262Met；Gly262Asn；Gly262Pro；Gly262Gln；Gly262Arg；Gly262Ser；Gly262Thr；Gly262Val；Gly262Trp；Gly262Tyr；Lys263Ala；Lys263Cys；Lys263Asp；Lys263Glu；Lys263Phe；Lys263Gly；Lys263His；Lys263Ile；Lys263Leu；Lys263Met；Lys263Asn；Lys263Pro；Lys263Gln；Lys263Arg；Lys263Ser；Lys263Thr；Lys263Val；Lys263Trp；Lys263Tyr；Met 264Ala；Met 264Cys；Met264Asp；Met 264Glu；Met 264Phe；Met 264Gly；Met 264His；Met 264Ile；Met 264Lys；Met264Leu；Met 264Asn；Met 264Pro；Met 264Gln；Met 264Arg；Met 264Ser；Met 264Thr；Met264Val；Met 264Trp；Met 264Tyr；Asn 265Ala；Asn 265Cys；Asn 265Asp；Asn 265Glu；Asn265Phe；Asn 265Gly；Asn 265His；Asn 265Ile；Asn 265Lys；Asn 265Leu；Asn 265Met；Asn265Pro；Asn 265Gln；Asn 265Arg；Asn 265Ser；Asn 265Thr；Asn 265Val；Asn 265Trp；Asn265Tyr；Gly 266Ala；Gly 266Cys；Gly 266Asp；Gly 266Glu；Gly 266Phe；Gly 266His；Gly266Ile；Gly 266Lys；Gly 266Leu；Gly 266Met；Gly 266Asn；Gly 266Pro；Gly 266Gln；Gly266Arg；Gly 266Ser；Gly 266Thr；Gly 266Val；Gly 266Trp；Gly 266Tyr；Lys267Ala；Lys267Cys；Lys267Asp；Lys267Glu；Lys267Phe；Lys267Gly；Lys267His；Lys267Ile；Lys267Leu；Lys267Met；Lys267Asn；Lys267Pro；Lys267Gln；Lys267Arg；Lys267Ser；Lys267Thr；Lys267Val；Lys267Trp；以及Lys267Tyr。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1可在序列的第一个残基之前具有Met和/或Thr。这些残基可如以上类似地突变。

在所有这些突变体中，残基的编号对应于SEQ ID NO:1。可通过使用任何常规的生物信息学方法，例如通过使用BLAST(基本局部对比检索工具)或FASTA(FAST-AII)来将这些残基编号转换为Ambler编号(Ambler等，1991,A standard numbering scheme for theClass Aβ-lactamases,Biochem.J.276:269-272，其内容以引用的方式并入本文)。例如，残基244对应于Ambler 276。例如，可使用以下转换：

Ambler分类编号	SEQ ID NO:1残基
		F33	F6
I72	I44
		Q135	Q105
G156	G126
		T160	T130
A232	A202
		A237	A207
A238	A208
		S240	S209
T243	T212
		R244	R213
S266	S234
		D276	D244

此外，也可用这些常规的生物信息学方法来估计同一性百分比。

在一个方面中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列以及Ambler分类的以下突变中的一个或多个：F33X、Q135X、G156X、A232X、A237X、A238X、S240X、T243X、R244X、S266X以及D276X，其中X是任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，X是天然存在的亲水性或疏水性氨基酸残基或非经典氨基酸。

在另一方面，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQID NO:3具有至少60％序列同一性的氨基酸序列以及Ambler分类的以下突变中的一个或多个：在位置33处除苯丙氨酸(F)以外的疏水性残基；在位置135处除谷氨酰胺(Q)以外的疏水性残基；在位置156处除甘氨酸(G)以外的亲水性残基；在位置232处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基；在位置237处除丙氨酸(A)以外的亲水性残基；在位置238处除丙氨酸(A)以外的疏水性或亲水性残基；在位置240处除丝氨酸(S)以外的亲水性残基；在位置243处除苏氨酸(T)以外的疏水性残基；在位置244处除精氨酸(R)以外的疏水性残基；在位置266处除丝氨酸(S)以外的亲水性残基；以及在位置276处除天冬氨酸(D)以外的亲水性残基。

如通篇所用的，亲水性氨基酸残基可包括选自精氨酸(R)和赖氨酸(K)的极性和带正电荷的亲水性残基、选自天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)以及半胱氨酸(C)的极性和带中性电荷的亲水性残基、选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的极性和带负电荷的亲水性残基或者包括组氨酸(H)的芳香族极性和带正电荷的亲水性残基。如通篇所用的，疏水性氨基酸残基可包括选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)或缬氨酸(V)的疏水性脂肪族氨基酸或选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)的疏水性芳香族氨基酸。

可通过参考遗传密码，包括将密码子简并性考虑在内来对β-内酰胺酶的基因序列(例如，SEQ ID NO:2和4)进行突变。

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含在Ambler分类位置处的以下突变中的一个或多个：F33Y、Q135M、G156R、A232G、A237S、A238G或T、S240P或D、T243I、R244T、S266N、D276N或R或K。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含Q135M。在另一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含G156R和A238T。在另一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含F33Y和D276N。在另一实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含F33Y、S240P以及D276N。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含F33Y、A238T以及D276N。在另一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A232G、A237S、A238G以及S240D。在另一实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A232G、A237S、A238G、S240D以及R244T。在另一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A232G、A237S、A238G、S240D以及D276R。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A232G、A237S、A238G、S240D以及D276K。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A232G、A237S、A238G、S240D以及Q135M。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A238T。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含T243I、S266N以及D276N。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A232G、A237S、A238G、S240D以及D276N。

在各种实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含以下突变中的一个或多个：

在各种实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与正上方的表中提供的突变体中的一个或多个具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

在说明性实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的氨基酸序列以及Ambler分类中的以下突变：在位置276处除天冬氨酸(D)以外的残基。

在说明性实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:1具有至少90％或95％或97％或99％序列同一性的氨基酸序列以及在对应于根据Ambler分类的位置276的位置处除天冬氨酸(D)以外的亲水性氨基酸残基，其中：所述亲水性氨基酸残基是天冬酰胺(N)，并且所述β-内酰胺酶比SEQ ID NO:1的具有在对应于根据Ambler分类的位置276的位置处的天冬氨酸(D)的β-内酰胺酶基本上更有效分解头孢曲松。

在说明性实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:1具有至少90％或95％或97％或99％序列同一性的氨基酸序列以及在对应于根据Ambler分类的位置276的位置处除天冬氨酸(D)以外的亲水性氨基酸残基，其中：所述亲水性氨基酸残基是精氨酸(R)，并且所述β-内酰胺酶比SEQ ID NO:1的具有在对应于根据Ambler分类的位置276的位置处的天冬氨酸(D)的β-内酰胺酶基本上更有效分解头孢曲松。

在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:5(即，P3A)具有至少90％或95％或97％或99％或100％序列同一性的氨基酸序列：

SEQ ID NO:5

TEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK.

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

本发明的说明性多核苷酸是SEQ ID NO:6，其是P3A的全核苷酸序列：

SEQ ID NO:6：

atgactgagatgaaagatgattttgcgaagctggaagaacagtttgacgcaaaattgggcattttcgcgttggacacgggtacgaatcgtacggttgcctaccgtccggacgagcgcttcgccttcgcgagcacgatcaaagccctgaccgtcggcgtgctgctccagcaaaagagcatcgaggacctgaaccagcgcattacctacacccgtgatgatctggtgaactataatccgatcaccgagaaacacgttgataccggtatgaccctgaaagaactggcagatgcaagcctgcgctacagcgataacgcggctcagaatctgattctgaagcaaatcggtggtccggagagcttgaagaaagaactgcgtaaaatcggcgatgaagtcactaatccggagcgttttgagccggagctgaacgaagtgaatccgggtgaaacgcaagacacgagcaccgcgcgtgcgcttgtcacctccctgcgcgctttcgcactggaagataagctgccgtcggagaaacgcgagctgctgatcgactggatgaagcgcaatacgaccggcgacgcgctgattcgtgcgggcgttccggacggttgggaagtggctgacaagaccggtgcggcgagctacggcacccgtaacgatatcgcgatcatttggccacctaaaggtgacccggtcgtgctggccgtactgagcagccgtgacaagaaagacgcaaagtatgataacaagctgattgcagaggcgaccaaagttgttatgaaggcactgaacatgaatggtaag

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸与SEQ ID NO:6具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性。

在说明性实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的氨基酸序列以及Ambler分类的以下突变：在位置232处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基；在位置237处除丙氨酸(A)以外的亲水性残基；在位置238处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基；在位置240处除丝氨酸(S)以外的亲水性残基；以及在位置276处除天冬氨酸(D)以外的亲水性残基。在一些实施方案中，在位置232处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基是甘氨酸(G)。在一些实施方案中，在位置237处除丙氨酸(A)以外的亲水性残基是丝氨酸(S)。在一些实施方案中，在位置238处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基是甘氨酸(G)。在一些实施方案中，在位置240处除丝氨酸(S)以外的亲水性残基是天冬氨酸(D)。在一些实施方案中，在位置276处除天冬氨酸(D)以外的亲水性残基是天冬酰胺(N)。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A232G、A237S、A238G、S240D以及D276N中的一个或多个。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含A232G、A237S、A238G、S240D以及D276N中的所有，其序列是SEQ ID NO:7，即P4A。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:7具有至少90％或95％或97％或99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7

EMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8衍生自SEQ ID NO:7，并且还包含QASKT氨基酸的信号和添加(编码区加下划线)：

MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAQASKTEMKDDFAKLEEQFDAKLG

IFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLV

NYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGD

EVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDW

MKRNTTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVL SSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:8具有至少90％或95％或97％或99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

本发明的说明性多核苷酸是SEQ ID NO:9，其为A232G、A237S、A238G、S240D和D276N突变体、Hind III位点(AAGCTT以粗体显示)以及附加的K和T氨基酸的全核苷酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:9的加下划线部分被省略。前导序列和附加的核苷酸(HindⅢ位点以及K和T氨基酸—用于添加氨基酸序列QASKT)加下划线。

atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcag tttgccgattacaaaaacatcagcgc

ccaagacggagatgaaagatgattttgcaaaacttgaggaacaatttgatgcaaaactcgggatctttgcattggatacaggtacaaaccggacggtagcgtatcggccggatgagcgttttgcttttgcttcgacgattaaggctttaactgtaggcgtgcttttgcaacagaaatcaatagaagatctgaaccagagaataacatatacacgtgatgatcttgtaaactacaacccgattacggaaaagcacgttgatacgggaatgacgctcaaagagcttgcggatgcttcgcttcgatatagtgacaatgcggcacagaatctcattcttaaacaaattggcggacctgaaagtttgaaaaaggaactgaggaagattggtgatgaggttacaaatcccgaacgattcgaaccagagttaaatgaagtgaatccgggtgaaactcaggataccagtacagcaagagcacttgtcacaagccttcgagcctttgctcttgaagataaacttccaagtgaaaaacgcgagcttttaatcgattggatgaaacgaaataccactggagacgccttaatccgtgccggtgtgccggacggttgggaagtgggtgataaaactggaagcggagattatggaacccggaatgacattgccatcatttggccgccaaaaggagatcctgtcgttcttgcagtattatccagcagggataaaaaggacgccaagtatgataataaacttattgcagaggcaacaaaggtggtaatgaaagccttaaacatgaacggcaaataa

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸与SEQ ID NO:9(具有或没有下划线部分)具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性。

在各个方面中，所述β-内酰胺酶多肽具有SEQ ID NO:10(即，P2A)的序列或者由SEQ ID NO:10中的一个或多个突变衍生：

ETGTISISQLNKNVWVHTELGYFNGEAVPSNGLVLNTSKGLVLVDSSWDNKLTKELIEMVEKKFQKRVTDVIITHAHADRIGGITALKERGIKAHSTALTAELAKNSGYEEPLGDLQTITSLKFGNTKVETFYPGKGHTEDNIVVWLPQYQILAGGCLVKSAEAKDLGNVADAYVNEWSTSIENVLKRYGNINSVVPGHGEVGDKGLLLHTLDLLK.

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:10具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:10具有至少90％或95％或97％或99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

β-内酰胺酶(包括P1A、P2A、P3A以及P4A及其衍生物)的附加序列例如在WO 2011/148041和PCT/US2015/026457中进行描述，所述专利的全部内容以引用的方式并入本文。

本发明提供编码β-内酰胺酶多肽的多核苷酸，包括例如包含这些多核苷酸的载体。除编码本发明的β-内酰胺酶的序列之外，这些多核苷酸还可包含一个或多个表达控制元件。例如，所述多核苷酸可包含一个或多个启动子或转录增强子、核糖体结合位点、转录终止信号以及多聚腺苷酸化信号以作为表达控制元件。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含指导β-内酰胺酶在细胞质中的表达的表达控制元件。

所述多核苷酸可插入在合适的载体中，所述载体用于转化合适的宿主细胞例如大肠杆菌细胞以用于表达。所述载体可为可在宿主细胞之间转移DNA的任何自我复制DNA分子，包括例如质粒克隆载体。在一些实施方案中，只要编码治疗剂的插入片段可以被转录，所述载体就可以保持游离态或者整合到染色体。可以通过标准重组DNA技术来构建载体。载体可为例如质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、病毒或本领域已知的任何类型，其用于在原核细胞或真核细胞中的复制和表达(例如，腺病毒；逆转录病毒；慢病毒；scAAV；pGEX载体；pET载体；以及pHT载体)。可使用的示例性载体包括例如pAVE011载体。pAVE011载体的制备在欧洲专利号0502637、欧洲专利号2386642以及美国专利号6,537,779中描述，所述专利的全部内容以引用的方式并入本文。本领域的技术人员应理解，本领域中已知的广泛多种组分(例如表达控制元件)可包含在这些载体中，这些组分包括广泛多种的转录信号，诸如启动子和调控RNA聚合酶结合到启动子上的其他序列。已知在其中将表达所述载体的大肠杆菌细胞中有效的任何启动子可以用于引发治疗剂的表达。在一个实施方案中，启动子有效于指导β-内酰胺酶多肽在细胞质中的表达。合适的启动子可为诱导型或组成型的。合适的启动子的实例包括例如，pET系统(INVITROGEN)、lac启动子、tac、trc、T7、T7A3启动子、PhoA、噬菌体λpR、λpL启动子(参见，例如，J Ind Microbiol Biotechnol(2012)39:383–399；Curr OpinBiotech 2001,12:195，其内容以引用的方式并入本文)、Pspac、PgroES、Pgsi、Plux以及amyQ启动子和/或来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的amyQ信号肽(作为非限制性实例，Gen Bank ID No.J01542.1，其内容以引用的方式并入本文)。启动子可为诱导型的(例如，通过IPTG、代谢物、温度)。在一个实施方案中，β-内酰胺酶多肽的细胞质表达通过IPTG诱导型LacI启动子来驱动。在一个实施方案中，β-内酰胺酶多肽的细胞质表达通过向细菌培养物添加IPTG来诱导。

在各种实施方案中，转化的大肠杆菌在足以产生β-内酰胺酶多肽的细胞质表达的条件下生长一段时间。将支持大肠杆菌细胞在培养物中的生长和繁殖的任何类型的培养基适用于实践本发明的方法。在培养物生长之后，通常使用渗透压休克、超声处理或其他标准手段来对大肠杆菌细胞进行裂解，并且将表达的β-内酰胺酶多肽从可溶性级分中分离。出于此目的可采用任何蛋白质纯化方法，诸如渗析、凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱、电泳或步骤的组合。

在各种实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽具有使其对各种用途，包括治疗用途是所需要的功能特征。表征β-内酰胺酶的方法为本领中已知的(例如，如由O'Callaghan等，Antimicrob.Agents Chemother,1:283-288描述的头孢硝噻吩测定；Viswanatha等，Methods Mol Med.2008；142:239-60的各种方法)。

在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的β-内酰胺酶多肽水解青霉素和头孢菌素中的一种或多种。如通篇所用的，青霉素包括例如阿莫西林(例如，NOVAMOX、AMOXIL)；氨苄西林(例如，PRINCIPEN)；阿洛西林；羧苄西林(例如，GEOCILLIN)；氯唑西林(例如，TEGOPEN)；双氯西林(例如，DYNAPEN)；氟氯西林(例如，FLOXAPEN)；美洛西林(例如MEZLIN)；甲氧西林(例如，STAPHCILLIN)；萘夫西林(例如，UNIPEN)；苯唑西林(例如，PROSTAPHLIN)；青霉素G(例如，PENTIDS或PFIZERPEN)；青霉素V(例如，VEETIDS(PEN-VEE-K))；哌拉西林(例如，PIPRACIL)；替莫西林(例如，NEGABAN)；以及替卡西林(例如，TICAR)。如通篇所用的，头孢菌素包括例如第一代头孢菌素(例如，头孢羟氨苄(例如，DURICEF)；头孢唑啉(例如，ANCEF)；头孢特略馈(Ceftolozane)、头孢噻吩/头孢噻吩(Cefalothin)(例如，KEFLIN)；头孢氨苄(例如KEFLEX))；第二代头孢菌素(例如，头孢克罗(例如，DISTACLOR)；头孢孟多(例如，MANDOL)；头孢西丁(例如，MEFOXIN)；头孢丙烯(例如，CEFZIL)；头孢呋辛(例如CEFTIN、ZINNAT))；第三代头孢菌素(例如，头孢克肟(例如SUPRAX)；头孢地尼(例如，OMNICEF、CEFDIEL)；头孢托仑(例如，SPECTRACEF)；头孢哌酮(例如，CEFOBID)；头孢噻肟(例如，CLAFORAN)；头孢泊肟(例如，VANTIN)；头孢他啶(例如，FORTAZ)；头孢布烯(例如，CEDAX)；头孢唑肟(例如，CEFIZOX)；以及头孢曲松(例如，ROCEPHIN))；第四代头孢菌素(例如，头孢吡肟(例如，MAXIPIME))；或者第五代头孢菌素(例如，头孢洛林福沙米(例如，TEFLARO)；头孢吡普(例如，ZEFTERA))。在一个具体实施方案中，头孢菌素包括例如头孢哌酮、头孢曲松或头孢唑林。在一个具体实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，发明性β-内酰胺酶具有针对头孢菌素的提高的催化效率。

在各种实施方案中，β-内酰胺酶拥有所希望的酶动力学特征。例如，在一些实施方案中，β-内酰胺酶对于至少一种头孢菌素具有低K_M，包括例如小于约500μM、或约100μM、或约10μM、或约1μM、或约0.1μM(100nM)、或约0.01μM(10nM)、或约1nM的K_M。例如，在一些实施方案中，β-内酰胺酶对于至少一种青霉素具有低K_M，包括例如小于约500μM、或约100μM、或约10μM、或约1μM、或约0.1μM(100nM)、或约0.01μM(10nM)、或约1nM的K_M。在各种实施方案中，发明性β-内酰胺酶对于至少一种头孢霉素具有高V_max，包括例如大于约100s-1、或约1000s-1、或约10000s-1、或约100000s-1、或约1000000s-1的V_max。在各种实施方案中，发明性β-内酰胺酶对于至少一种头青霉素具有高V_max，包括例如大于约100s-1、或约1000s-1、或约10000s-1、或约100000s-1、或约1000000s-1的V_max。在各种实施方案中，发明性β-内酰胺酶对于至少一种头孢霉素具有大于约10⁶M^-1s^-1的催化效率。在各种实施方案中，发明性β-内酰胺酶对于至少一种青霉素具有大于约10⁶M^-1s^-1的催化效率。在各种实施方案中，发明性β-内酰胺酶对于头孢霉素和青霉素中的任一者或二者的至少一种具有所需要的酶动力学特征。

在各种实施方案中，发明性β-内酰胺酶在胃肠道中是稳定的和/或有活性的，所述胃肠道是例如在以下中的一种或多种中：口腔、食管、胃、十二指肠、小肠、十二指肠、空肠、回肠、大肠、横结肠、降结肠、升结肠、乙状结肠、盲肠和直肠。在一个具体实施方案中，所述β-内酰胺酶在大肠中是稳定的，所述大肠任选地选自横结肠、降结肠、升结肠、乙状结肠以及盲肠中的一种或多种。在一个具体实施方案中，所述β-内酰胺酶在小肠中是稳定的，所述小肠任选地选自十二指肠、空肠以及回肠中的一种或多种。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶对胃肠道中的蛋白酶有抗性，所述胃肠道包括例如小肠。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶在以下pH下是基本上有活性的：约6.0至约7.5，例如，约6.0、或约6.1、或约6.2、或约6.3、或约6.4、或约6.5、或约6.6、或约6.7、或约6.8、或约6.9、或约7.0、或约7.1、或约7.2、或约7.3、或约7.4、或约7.5(包括例如通过配制，如本文所描述的)。在各种实施方案中，本发明的β-内酰胺酶对一种或多种β-内酰胺酶抑制剂有抗性，所述抑制剂任选地选自阿维巴坦、他唑巴坦、舒巴坦以及克拉维酸。在一些实施方案中，稳定是指具有足够长的半衰期并且对治疗有效性维持足够活性的酶。

本发明还通过以下非限制性实施例进行说明。

实施例

实施例1：在芽孢杆菌菌株中生产β-内酰胺酶

在约10,000升分批补料发酵中通过枯草芽孢杆菌RS310生产菌株生产P1A蛋白。枯草芽孢杆菌RS310菌株是不产生孢子的色氨酸营养缺陷型菌株，并且将P1A蛋白分泌到培养物发酵液中。具体地说，P1A蛋白的细胞培养包括摇瓶中的两个接种物(1％)扩增阶段(WCB小瓶→100mL→2x1200mL)和接着的种子发酵阶段(220L，2.5％)。在约10,000L工作体积中进行主分批补料发酵。主发酵作为分批发酵开始，其中初始体积为9,000L的生长培养基。在约9个小时之后，当生长培养基中的大部分葡萄糖消耗时，开始用含有葡萄糖和磷酸盐的进料溶液(约1500-2000L)进料。为了在进料阶段期间使葡萄糖保持在足够的水平(0.5-5mg/mL)下，使用预定的进料策略，其可基于葡萄糖测量在过程期间进行调整。P1A蛋白为组成型产生的，并且在细胞外分泌到培养物发酵液中。

在发酵期间，监测并控制关键性操作参数，包括葡萄糖浓度、pH(7±0.2)、溶解氧水平(10％-20％)、温度(37±1℃)以及泡沫水平。控制搅拌速率，以轻微混合开始，并且增加到138-145rpm的最大值。将进入到容器中的气流调整为0.5-1vvm。通过P1A含量(酶活性测量)和细胞密度测量(OD 600nm)监测发酵的进展。通常在16-22个小时之后，主发酵实现约1-1.2mg/mL的P1A滴度(通过HPLC)。最终细胞密度通常为约OD 50(d.w.16-17g/L)。在培养完成之后，将发酵罐的内容冷却低至11℃±3℃。

在发酵之后，通过连续离心，接着微量过滤，将细胞从含有P1A蛋白的发酵液中去除。通过超滤对含有P1A的滤液进行浓缩，并且将P1A浓缩物进一步渗滤、调节并以流通模式穿过一次性阴离子交换滤筒，在此之后，将滤液进一步渗滤以去除NaCl。这样就制备了用于随后的两阶段P1A-蛋白结晶的溶液，所述结晶包括结晶、晶体收获、洗涤和溶解。最后，在第二个结晶步骤之后，将P1A蛋白晶体悬浮在水中并溶解，并且对P1A蛋白溶液的最终浓度进行调整。对蛋白溶液进行过滤(0.2um)以减少生物负载，并最终分配到无菌塑料容器中，在-70℃下冷冻并储存。

实施例2：用于表达P3Aβ-内酰胺酶的细胞内基因设计

此研究的目的在于提高β-内酰胺酶表达。为此，在大肠杆菌中采用pAVEway^TM高级蛋白表达系统。在整个此研究中使用P3A以用于测试β-内酰胺酶表达。用于指导P3A的细胞内表达的基因序列是SEQ ID NO:6。

将P3A基因克隆到pAVEway^TM细胞间(细胞质)构建体pAVE011中，并且使用PCR和DNA测序验证质粒。所设计的P3A表达构建体提供相对均一的N末端，其中N末端甲硫氨酸在约95％的时间内被去除。

在构建细胞间表达质粒之后，将构建体转化在以下大肠杆菌菌株内：CLD977(W3110大肠杆菌宿主)和CLD990(BL21大肠杆菌宿主)。在构建β-内酰胺酶细胞内表达菌株之后，分别如实施例2和3中进一步描述的，对P3A进行表达和表征。

另外，将P3A基因克隆到pAVEway^TM周质构建体pAVE029+基因1或基因7中(基因1和基因7是不同的分泌前导序列)。再次使用PCR和DNA测序验证质粒。

在构建周质表达质粒之后，将构建体转化在以下大肠杆菌菌株内：CLD981(基因1前导序列，W3110大肠杆菌宿主)和CLD982(基因7前导序列，BL21大肠杆菌宿主)。在构建周质β-内酰胺酶表达菌株之后，分别如在实施例2和3中进一步描述的，对P3A进行表达和表征。

实施例3：P3Aβ-内酰胺酶发酵

使用细胞内表达菌株CLD977和CLD990以及周质菌株CLD981和CLD982进行一式两份的发酵。具体地说，在3个阶段中进行发酵分析：摇瓶(SF)接种阶段、发酵罐阶段以及SDS-PAGE分析阶段。为了进行SF接种阶段，将RCB小瓶接种到具有标准培养基的一式两份的摇瓶中，并且在37℃下以200rpm孵育约10小时。接下来，测定样品的纯度和OD₆₀₀(汇总在表1中)。最后，将大肠杆菌材料从SF转移到发酵容器中。

表1.来自细胞内菌株CLD977和CLD990的摇瓶接种阶段的结果。SF1和SF2分别对应于CLD977和CLD990的一式两份反应。

使用标准pAVEway^TM细胞内方案进行发酵罐阶段。具体地说，当OD₆₀₀＝50±5时，使用0.5mM IPTG来诱导培养物。在诱导之后，再继续发酵12个小时，之后停止。在诱导前和停止时，确认样品的纯度。

对于CLD977，发酵控制参数步骤为：i)在7.33小时的氧补充；ii)当进料开始时在9.46小时的分批阶段结束；iii)当OD₆₀₀＝50.1时在10.27小时的诱导；iv)在停止之前再继续发酵12个小时。

如图1(CLD977发酵的多发酵罐计算机系统(MFCS)曲线图)所示，在约20小时，气流开始减弱，怀疑这是由于容器内的压力引起的。另外，在图1中示出，在约21小时并且在停止之前1.5小时，pO2下降到20％以下。

对于CLD990，发酵控制参数步骤为：i)在10.95小时的氧补充；ii)当进料开始时在12.27小时的分批阶段结束；iii)当OD₆₀₀＝50.1时在13.14小时的诱导；iv)在停止之前再继续发酵12个小时。

CLD990发酵的MFCS曲线图在图2中示出。

CLD977和CLD990发酵的摄氧速率(OUR)和二氧化碳释放速率(CER)的出口气体分析的MFCS曲线图在图3中示出。对于两种菌株观察到类似分布，其中由于观察到的较长分批阶段，在CLD990菌株上看到延迟。不希望受到理论的束缚，在CLD977发酵结束时的分布可能与容器中减少的气流(出口过滤器堵塞)相关。

诱导后多至12个小时，两种菌株的生物质分布是类似的，虽然CLD990菌株由于延长的分批阶段而延迟(见图4)。不希望受到理论的束缚，此延迟可能是由于较低SF OD₆₀₀或减小的初始生长速率引起的。

在分批阶段结束时和在发酵完成之后还对CLD977和CLD990进行革兰染色(见图5)。结果指示在培养结束时培养物是纯的且均一的。

在发酵之后，在样品裂解、离心和重悬之后，使用SDS-PAGE对从诱导前到发酵结束的选定的时间过程样品进行分析(见图6-图8)。

如由SDS-PAGE结果所证实的，两种菌株中的蛋白产物水平超过10g/L(见图6和图7)：CLD977SDS PAGE指示12.1–14.0g/L，而CLD990SDS PAGE指示13.2–13.7g/L。另外，CLD977和CLD990总蛋白产物(超声处理后)大部分是可溶的(见图8)。与先前用于表达β-内酰胺酶的系统(其产出约0.5至1g/L)相比，本发明利用β-内酰胺酶在大肠杆菌菌株的细胞内表达的方法证明是远远优异的。与显示周质β-内酰胺酶表达的先前研究相反，在周质结构域中表达β-内酰胺酶的尝试不成功，并且产生生物失活的β-内酰胺酶(参见实施例3)。

实施例4：通过CENTA方法的发酵样品的β-内酰胺酶活性

使用CENTA方法对前述发酵样品(参见实施例2)的P3Aβ-内酰胺酶活性进行分析，所述方法在下文中进行描述。在整个此方法中，使用不同的标准物，并且称为：参考材料(32mg/mL)；标准曲线：x1000稀释的参考标准材料(使用的标准物为由x1000储备液制成的0.6mg/l、0.8mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.0mg/l和4.0mg/l)；对照标准：稀释至1mg/l并作为对照运行的参考标准物；1mM CENTA储备溶液：溶解在50ml的50mM磷酸二氢钠中的25mgCENTA内酰胺酶底物(在-20℃储存)；以及CENTA工作溶液：溶解在25ml磷酸二氢钠中的3.34ml CENTA储备溶液。

CENTA方法采用易于被β-内酰胺酶水解的显色头孢菌素，并且允许对粗提取物和色谱级分中的酶进行动力学研究和检测(Bebrone,C.等(2001)Antimicrobial Agents andChemotherapy,45(6)1868-1871)。由于CENTA可以从可商购获得的药物头孢噻吩制备，因此此方法也是有用的。对于此研究，使用FFDB板读出器在CENTA工作溶液存在下监测β-内酰胺酶样品活性。首先，将β-内酰胺酶样品稀释至1mg/l(使用Bradford测定来确定浓度)。然后，将50μL每个样品加载到板上，并且在25℃下孵育20分钟。最后，将200μL的CENTA工作溶液添加到每个样品，并且读出样品如下：板读出器设置：测量温度＝25℃；摇动＝缓慢；摇动时间＝2秒；测量时间＝60秒；读取次数＝每3秒；并且波长＝405nm。

通过连续记录在405nm处的吸光度变化(排出的发色团的外观)来监测CENTA的水解。来自此测定的结果在图9-图19中呈现并且在表2-4中汇总。

将CENTA实验分为3个测定板。测定板1对应于：诱导后12h、24h、48h的CLD981、24h的渗透休克缓冲液1(OS1)和24h的渗透休克缓冲液2(OS2)以及诱导后12h、24h、48h的CLD982、24h的OS1和24h的OS2。测定板2对应于：诱导后48h的CLD981OS1和48h的OS2，以及诱导后48h的CLD982OS1和48h的OS2。测定板3对应于诱导后倒数第二个时间点和最后时间点(超声处理)两者以及诱导后最后时间点(Bug buster)的CLD977和CLD990。OS1含有20％蔗糖。在制备OS1级分之后，将细胞沉淀物用于制备含有MgSO₄的OS2。

测定板1结果的结果在图9-图13和表2中示出。具体地说，图9示出时间(秒)相对于对照1和2(组合成对照标准)以及0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L和4mg/L的参考标准材料稀释液的吸光度的标准曲线。对照1和2是作为一式两份运行的1.0μg/mL的预设稀释液。图10示出标准浓度(mg/L)相对于终点吸光度的标准终点曲线。在时间＝60秒时测量标准吸光度，减去在时间＝0秒时的标准吸光度。具体地说，进行终点分析，其中在t＝0和在指定时间间隔结束时测量反应，并且减去t＝0的吸光度值。对于β-内酰胺酶的分析，在时间＝60秒时测量反应。在时间＝0秒时测量吸光度，然后将其从60秒的测量值中减去。对参考标准的若干稀释液进行测试以生成标准曲线。图11示出时间(秒)相对于诱导后12h、24h、48h的CLD981(3/13C037)和48h的OS2的吸光度的标准曲线。图12示出时间(秒)相对于CLD981OS1样品的吸光度的标准终点曲线。图13示出时间(秒)相对于诱导后12h、24h、48h的CLD982(4/13C038)和48h的OS1和OS2的吸光度的标准曲线。表2示出CLD981和CLD982(分别为分泌菌株37和38)以及对照1和2的测定板1活性和滴度结果的汇总。

测定板2结果在图14-图16和表3中示出。具体地说，图14示出时间(秒)相对于对照1和2(组合成对照标准)以及0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L和4mg/L的参考标准材料稀释液的吸光度的标准曲线。图15示出标准浓度(mg/L)相对于终点吸光度的标准终点曲线。在时间＝60秒时测量标准吸光度，减去在时间＝0秒时的标准吸光度。图16示出时间(秒)相对于诱导后48h的CLD981(37)和CLD982(38)OS1和OS2的吸光度的标准曲线。表3示出CLD981和CLD982OS1和OS2以及对照1和2的测定板2活性和滴度结果的汇总。

测定板3结果在图17-图19和表4中示出。具体地说，图17示出时间(秒)相对于对照1和2(作为对照标准组合)以及0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L和4mg/L的参考标准材料稀释液的吸光度的标准曲线。图18示出标准浓度(mg/L)相对于终点吸光度的标准终点曲线。在时间＝60秒时测量标准吸光度，减去在时间＝0秒时的标准吸光度。图19示出时间(秒)相对于诱导后倒数第二个时间点和最后时间点(未标记＝超声处理)两者以及诱导后的最后时间点(Bug buster)的CLD977和CLD990(分别为细胞内菌株39和40)的吸光度的标准曲线。表4示出CLD977和CLD990以及对照1和2的测定板3活性和滴度结果的汇总。

表2-4具体地示出与对照1和2相比的CLD981、CLD982、CLD977以及CLD990终点OD、活性浓度(mg/L)、测定稀释度、浓度x稀释度(g/L)、全细胞重量(WCW(g/L))、周质稀释因子、g/L P1A活性WB滴度、通过SDS PAGE评估的g/L P1A WB、SDS PAGE P以及可溶性SDS PAGE(如果适用的话)。

表2.与对照1和2相比来自用于不同时间点的周质菌株CLD981(37)和CLD982(38)的CENTA方法的结果。

表3.与对照1和2相比来自用于不同时间点的周质菌株CLD981(37)和CLD982(38)的CENTA方法的结果。

表4.与对照1和2相比来自用于不同时间点的细胞内菌株CLD977(39)和CLD990(40)的CENTA方法的结果。

如上所见，对于细胞内菌株，与菌株CLD977相比，在菌株CLD990中具有略微更大的活性。对于周质菌株，CLD981(基因1前导序列)的最佳分泌级分为1.3g/L的OS2级分(通过SDS-PAGE)，而CLD982(基因7前导序列)的最佳分泌级分为～1.0g/L的SN级分(其包括未处理形式)。最后，对于细胞内菌株，据观察应用Bug buster或超声处理对于这些制剂产生类似活性和SDS-PAGE结果。

总之，与分泌(周质)级分相比，细胞内活性和SDS-PAGE结果大10倍以上。这是令人意外的结果，因为通常所表达的蛋白质从周质收集。另外，细胞内表达在可溶性级分而不是包涵体中产出β-内酰胺酶。

实施例5：大规模P3A(SYN-004)生产

进行P3A(SYN-004)的cGMP制造。初始750升cGMP生产运行使用pAVEway^TM平台(FUJIFILM Diosynth Biotechnologies UK)。产量为5.5千克的>95％纯的SYN-004活性药物成分(API)药物物质。在成功评估之后，开始GMP制造工艺，其产生表现出一致的P3A(SYN-004)生物活性的高产细胞系。与先前用于SYN-004的第一代前驱物的芽孢杆菌平台(每升枯草芽孢杆菌培养物发酵液大约1克P1A，参见实施例1)相比，P3A(SYN-004)表达滴度提高了大于约15倍(每升大肠杆菌培养物发酵液14克P3A(SYN-004))。单个色谱柱纯化工艺可重复产生纯度水平大于95％的40％-50％P3A(SYN-004)药物物质回收率，这是超过先前纯化工艺的另一个显著的制造改进。

定义

以下定义结合本文所公开的发明来使用。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。

如本文所用的，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或多于一个。

另外，当与参考数字指示结合使用时，术语“约”意指参考数字指示加上或减去该参考数字指示的多至10％。例如，语言“约50”覆盖了45至55的范围。

当与医疗用途结合使用时，“有效量”为有效于提供对感兴趣疾病的可测量治疗、预防或其发病率的减小的量。

如本文所提及的，除非另外指定，否则所有组成百分比均按总组合物的重量计。如本文所用的，单词“包括”及其变型意图为非限制性的，以使得列表中的项目的详述不排除也可适用于此技术的组合物和方法的其他类似项目。类似地，术语“可以”和“可”及其变型意图为非限制性的，以使得实施方案可以或可包括某些元素或特征的详述不排除不包括那些元素或特征的本技术的其他实施方案。

尽管作为术语诸如包括、含有或具有的同义词，开放性术语“包含”在本文中用于描述并要求保护本发明，但是对本发明或其实施方案也可使用替代性术语诸如“由…组成”或“主要由…组成”可选地进行描述。

如本文所用的，单词“优选的”和“优选地”是指本技术在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可为优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详述并不意味着其他实施方案不适用的，并且并不意图从本技术的范围内排除其他实施方案。

本文描述的实现治疗效果所需要的组合物的量可出于特定目的根据常规程序凭经验确定。通常，对于施用用于治疗目的的治疗剂(例如，发明性β-内酰胺酶和/或药物组合物(和/或另外的药剂))，以药理学有效剂量提供治疗剂。“药理学有效量”、“药理学有效剂量”、“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生所需生理效果的量或能够实现所需结果，尤其是治疗病症或疾病的量。如本文所用的有效量包括足以例如延迟病症或疾病的症状的发展、改变病症或疾病的症状的进程(例如，减缓疾病症状的进展)、减少或消除病症或疾病的一个或多个症状或表现并且逆转病症或疾病的症状的量。例如，向患有胃肠道病症(例如，CDI)的患者施用治疗剂不仅在潜在病症得到消除或改善时提供益处，而且在患者报告与疾病相关联的症状的严重性或持续时间减少时提供益处。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，不论是否实现改善。

可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定有效量、毒性以及治疗效力，所述标准药物程序例如用于测定LD50(对约50％群体致死的剂量)和ED50(在约50％群体中治疗有效的剂量)。所述剂量可以根据所采用的剂型和使用的施用途径而改变。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数，并且可以表示为比例LD50/ED50。在一些实施方案中，表现出大治疗指数的组合物和方法为优选的。可以初始由体外测定，包括例如细胞培养物测定评估治疗有效剂量。另外，可以在动物模型中配制剂量，以实现循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包括如在细胞培养物中或在适当的动物模型中测定的IC50。可以例如通过高效液相色谱测量血浆中所述组合物的水平。可以通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的效果。可以由医师确定剂量，并且必要时进行调整以适合所观察到的治疗作用。

在某些实施方案中，所述效果将引起至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约90％的可量化变化。在一些实施方案中，所述效果将引起约10％、约20％、约30％、约50％、约70％或甚至约90％或更大的可量化变化。在某些实施方案中，所述效果将引起两倍或三倍或四倍或五倍或十倍的可量化变化。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展或减少毒性，不论是否实现改进。

等效方案

尽管本发明结合其具体实施方案进行描述，但是应了解能够对它进行另外的修改，并且此申请意图覆盖大体上根据本发明的原理而对本发明进行的任何变动、使用或适应性改变，并且包括属于本发明所属领域的已知或习用实施手段并且可适用于本文所列出的基本特征和如下在所附权利要求书范围内的此类偏离本公开的内容。

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文确切描述的具体实施方案的许多等效方案。这些等效方案意图涵盖在以下权利要求书的范围中。

以引用的方式并入

本文引用的所有专利和出版物以引用的方式整体并入本文。

本文中讨论的出版物仅仅提供它们在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容均不应被理解为承认由于先前发明而使本发明无权先于这些出版物。

如本文所用的，所有标题仅用于组织，并不意图以任何方式限制本公开。任何单个部分的内容可同样适用于所有部分。

序列表

<110> 合成生物制品有限公司

A•布里斯托尔

M•卡拉科

<120> β-内酰胺酶的基于大肠杆菌的生产

<130> SYN-005PC

<150> US 62/043,360

<151> 2014-08-28

<160> 10

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln Phe Asp Ala Lys

1 5 10 15

Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg Thr Val Ala Tyr

20 25 30

Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile Lys Ala Leu Thr

35 40 45

Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp Leu Asn Gln Arg

50 55 60

Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Thr Glu

65 70 75 80

Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Ser

85 90 95

Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile Leu Lys Gln Ile

100 105 110

Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Ile Gly Asp Glu

115 120 125

Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn Glu Val Asn Pro

130 135 140

Gly Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu Val Thr Ser Leu

145 150 155 160

Arg Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu Lys Arg Glu Leu

165 170 175

Leu Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp Ala Leu Ile Arg

180 185 190

Ala Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Ala Asp Lys Thr Gly Ala Ala

195 200 205

Ser Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp Pro Pro Lys Gly

210 215 220

Asp Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp Lys Lys Asp Ala

225 230 235 240

Lys Tyr Asp Asp Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Val Val Met Lys

245 250 255

Ala Leu Asn Met Asn Gly Lys

260

<210> 2

<211> 792

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 2

gagatgaaag atgattttgc aaaacttgag gaacaatttg atgcaaaact cgggatcttt 60

gcattggata caggtacaaa ccggacggta gcgtatcggc cggatgagcg ttttgctttt 120

gcttcgacga ttaaggcttt aactgtaggc gtgcttttgc aacagaaatc aatagaagat 180

ctgaaccaga gaataacata tacacgtgat gatcttgtaa actacaaccc gattacggaa 240

aagcacgttg atacgggaat gacgctcaaa gagcttgcgg atgcttcgct tcgatatagt 300

gacaatgcgg cacagaatct cattcttaaa caaattggcg gacctgaaag tttgaaaaag 360

gaactgagga agattggtga tgaggttaca aatcccgaac gattcgaacc agagttaaat 420

gaagtgaatc cgggtgaaac tcaggatacc agtacagcaa gagcacttgt cacaagcctt 480

cgagcctttg ctcttgaaga taaacttcca agtgaaaaac gcgagctttt aatcgattgg 540

atgaaacgaa ataccactgg agacgcctta atccgtgccg gtgtgccgga cggttgggaa 600

gtggctgata aaactggagc ggcatcatat ggaacccgga atgacattgc catcatttgg 660

ccgccaaaag gagatcctgt cgttcttgca gtattatcca gcagggataa aaaggacgcc 720

aagtatgatg ataaacttat tgcagaggca acaaaggtgg taatgaaagc cttaaacatg 780

aacggcaaat aa 792

<210> 3

<211> 299

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 3

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Gln

20 25 30

Ala Ser Lys Thr Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln

35 40 45

Phe Asp Ala Lys Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg

50 55 60

Thr Val Ala Tyr Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile

65 70 75 80

Lys Ala Leu Thr Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp

85 90 95

Leu Asn Gln Arg Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn

100 105 110

Pro Ile Thr Glu Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu

115 120 125

Ala Asp Ala Ser Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile

130 135 140

Leu Lys Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys

145 150 155 160

Ile Gly Asp Glu Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn

165 170 175

Glu Val Asn Pro Gly Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu

180 185 190

Val Thr Ser Leu Arg Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu

195 200 205

Lys Arg Glu Leu Leu Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp

210 215 220

Ala Leu Ile Arg Ala Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Ala Asp Lys

225 230 235 240

Thr Gly Ala Ala Ser Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp

245 250 255

Pro Pro Lys Gly Asp Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp

260 265 270

Lys Lys Asp Ala Lys Tyr Asp Asp Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys

275 280 285

Val Val Met Lys Ala Leu Asn Met Asn Gly Lys

290 295

<210> 4

<211> 900

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 4

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60

tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcgcaagctt ccaagacgga gatgaaagat 120

gattttgcaa aacttgagga acaatttgat gcaaaactcg ggatctttgc attggataca 180

ggtacaaacc ggacggtagc gtatcggccg gatgagcgtt ttgcttttgc ttcgacgatt 240

aaggctttaa ctgtaggcgt gcttttgcaa cagaaatcaa tagaagatct gaaccagaga 300

ataacatata cacgtgatga tcttgtaaac tacaacccga ttacggaaaa gcacgttgat 360

acgggaatga cgctcaaaga gcttgcggat gcttcgcttc gatatagtga caatgcggca 420

cagaatctca ttcttaaaca aattggcgga cctgaaagtt tgaaaaagga actgaggaag 480

attggtgatg aggttacaaa tcccgaacga ttcgaaccag agttaaatga agtgaatccg 540

ggtgaaactc aggataccag tacagcaaga gcacttgtca caagccttcg agcctttgct 600

cttgaagata aacttccaag tgaaaaacgc gagcttttaa tcgattggat gaaacgaaat 660

accactggag acgccttaat ccgtgccggt gtgccggacg gttgggaagt ggctgataaa 720

actggagcgg catcatatgg aacccggaat gacattgcca tcatttggcc gccaaaagga 780

gatcctgtcg ttcttgcagt attatccagc agggataaaa aggacgccaa gtatgatgat 840

aaacttattg cagaggcaac aaaggtggta atgaaagcct taaacatgaa cggcaaataa 900

<210> 5

<211> 264

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 5

Thr Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln Phe Asp Ala

1 5 10 15

Lys Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg Thr Val Ala

20 25 30

Tyr Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile Lys Ala Leu

35 40 45

Thr Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp Leu Asn Gln

50 55 60

Arg Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Thr

65 70 75 80

Glu Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile Leu Lys Gln

100 105 110

Ile Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Ile Gly Asp

115 120 125

Glu Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn Glu Val Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu Val Thr Ser

145 150 155 160

Leu Arg Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu Lys Arg Glu

165 170 175

Leu Leu Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp Ala Leu Ile

180 185 190

Arg Ala Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Ala Asp Lys Thr Gly Ala

195 200 205

Ala Ser Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp Pro Pro Lys

210 215 220

Gly Asp Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp Lys Lys Asp

225 230 235 240

Ala Lys Tyr Asp Asn Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Val Val Met

245 250 255

Lys Ala Leu Asn Met Asn Gly Lys

260

<210> 6

<211> 795

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 6

atgactgaga tgaaagatga ttttgcgaag ctggaagaac agtttgacgc aaaattgggc 60

attttcgcgt tggacacggg tacgaatcgt acggttgcct accgtccgga cgagcgcttc 120

gccttcgcga gcacgatcaa agccctgacc gtcggcgtgc tgctccagca aaagagcatc 180

gaggacctga accagcgcat tacctacacc cgtgatgatc tggtgaacta taatccgatc 240

accgagaaac acgttgatac cggtatgacc ctgaaagaac tggcagatgc aagcctgcgc 300

tacagcgata acgcggctca gaatctgatt ctgaagcaaa tcggtggtcc ggagagcttg 360

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tccctgcgcg ctttcgcact ggaagataag ctgccgtcgg agaaacgcga gctgctgatc 540

gactggatga agcgcaatac gaccggcgac gcgctgattc gtgcgggcgt tccggacggt 600

tgggaagtgg ctgacaagac cggtgcggcg agctacggca cccgtaacga tatcgcgatc 660

atttggccac ctaaaggtga cccggtcgtg ctggccgtac tgagcagccg tgacaagaaa 720

gacgcaaagt atgataacaa gctgattgca gaggcgacca aagttgttat gaaggcactg 780

aacatgaatg gtaag 795

<210> 7

<211> 262

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 7

Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln Phe Asp Ala Lys

1 5 10 15

Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg Thr Val Ala Tyr

20 25 30

Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile Lys Ala Leu Thr

35 40 45

Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp Leu Asn Gln Arg

50 55 60

Ile Thr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Thr Glu Lys

65 70 75 80

His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Ser Leu

85 90 95

Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile Leu Lys Gln Ile Gly

100 105 110

Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Ile Gly Asp Glu Val

115 120 125

Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn Glu Val Asn Pro Gly

130 135 140

Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu Lys Arg Glu Leu Leu

165 170 175

Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp Ala Leu Ile Arg Ala

180 185 190

Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Gly Asp Lys Thr Gly Ser Gly Asp

195 200 205

Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp Pro Pro Lys Gly Asp

210 215 220

Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp Lys Lys Asp Ala Lys

225 230 235 240

Tyr Asp Asn Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Val Val Met Lys Ala

245 250 255

Leu Asn Met Asn Gly Lys

260

<210> 8

<211> 299

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 8

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Gln

20 25 30

Ala Ser Lys Thr Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln

35 40 45

Phe Asp Ala Lys Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg

50 55 60

Thr Val Ala Tyr Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile

65 70 75 80

Lys Ala Leu Thr Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp

85 90 95

Leu Asn Gln Arg Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn

100 105 110

Pro Ile Thr Glu Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu

115 120 125

Ala Asp Ala Ser Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile

130 135 140

Leu Lys Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys

145 150 155 160

Ile Gly Asp Glu Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn

165 170 175

Glu Val Asn Pro Gly Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu

180 185 190

Val Thr Ser Leu Arg Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu

195 200 205

Lys Arg Glu Leu Leu Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp

210 215 220

Ala Leu Ile Arg Ala Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Gly Asp Lys

225 230 235 240

Thr Gly Ser Gly Asp Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp

245 250 255

Pro Pro Lys Gly Asp Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp

260 265 270

Lys Lys Asp Ala Lys Tyr Asp Asn Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys

275 280 285

Val Val Met Lys Ala Leu Asn Met Asn Gly Lys

290 295

<210> 9

<211> 900

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 9

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60

tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcgcaagctt ccaagacgga gatgaaagat 120

gattttgcaa aacttgagga acaatttgat gcaaaactcg ggatctttgc attggataca 180

ggtacaaacc ggacggtagc gtatcggccg gatgagcgtt ttgcttttgc ttcgacgatt 240

aaggctttaa ctgtaggcgt gcttttgcaa cagaaatcaa tagaagatct gaaccagaga 300

ataacatata cacgtgatga tcttgtaaac tacaacccga ttacggaaaa gcacgttgat 360

acgggaatga cgctcaaaga gcttgcggat gcttcgcttc gatatagtga caatgcggca 420

cagaatctca ttcttaaaca aattggcgga cctgaaagtt tgaaaaagga actgaggaag 480

attggtgatg aggttacaaa tcccgaacga ttcgaaccag agttaaatga agtgaatccg 540

ggtgaaactc aggataccag tacagcaaga gcacttgtca caagccttcg agcctttgct 600

cttgaagata aacttccaag tgaaaaacgc gagcttttaa tcgattggat gaaacgaaat 660

accactggag acgccttaat ccgtgccggt gtgccggacg gttgggaagt gggtgataaa 720

actggaagcg gagattatgg aacccggaat gacattgcca tcatttggcc gccaaaagga 780

gatcctgtcg ttcttgcagt attatccagc agggataaaa aggacgccaa gtatgataat 840

aaacttattg cagaggcaac aaaggtggta atgaaagcct taaacatgaa cggcaaataa 900

<210> 10

<211> 216

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 10

Glu Thr Gly Thr Ile Ser Ile Ser Gln Leu Asn Lys Asn Val Trp Val

1 5 10 15

His Thr Glu Leu Gly Tyr Phe Asn Gly Glu Ala Val Pro Ser Asn Gly

20 25 30

Leu Val Leu Asn Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Val Asp Ser Ser Trp

35 40 45

Asp Asn Lys Leu Thr Lys Glu Leu Ile Glu Met Val Glu Lys Lys Phe

50 55 60

Gln Lys Arg Val Thr Asp Val Ile Ile Thr His Ala His Ala Asp Arg

65 70 75 80

Ile Gly Gly Ile Thr Ala Leu Lys Glu Arg Gly Ile Lys Ala His Ser

85 90 95

Thr Ala Leu Thr Ala Glu Leu Ala Lys Asn Ser Gly Tyr Glu Glu Pro

100 105 110

Leu Gly Asp Leu Gln Thr Ile Thr Ser Leu Lys Phe Gly Asn Thr Lys

115 120 125

Val Glu Thr Phe Tyr Pro Gly Lys Gly His Thr Glu Asp Asn Ile Val

130 135 140

Val Trp Leu Pro Gln Tyr Gln Ile Leu Ala Gly Gly Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Ser Ala Glu Ala Lys Asp Leu Gly Asn Val Ala Asp Ala Tyr Val Asn

165 170 175

Glu Trp Ser Thr Ser Ile Glu Asn Val Leu Lys Arg Tyr Gly Asn Ile

180 185 190

Asn Ser Val Val Pro Gly His Gly Glu Val Gly Asp Lys Gly Leu Leu

195 200 205

Leu His Thr Leu Asp Leu Leu Lys

210 215

Claims (13)

1.一种用于在大肠杆菌中生产β-内酰胺酶多肽的方法，其包括：

(a)提供用包含编码所述β-内酰胺酶多肽的序列的载体转化的宿主大肠杆菌细胞；

(b)对所述大肠杆菌细胞进行培养，以诱导所述β-内酰胺酶多肽在细胞质内的表达；以及

(c)从由所述大肠杆菌细胞制备的细胞质的可溶性级分回收所述β-内酰胺酶多肽，其中所述方法在每升培养物中产出至少约10克的所述β-内酰胺酶多肽，

其中所述β-内酰胺酶多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法在每升培养物中产出至少约15克的所述β-内酰胺酶多肽。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞选自BL21(DE3)或W3110。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述β-内酰胺酶多肽在细胞质内的表达通过向所述培养物添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶多肽的纯度至少约95％。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶多肽的纯度至少约96％。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶多肽的纯度至少约97％。

8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶多肽的纯度至少约98％。

9.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶多肽的纯度至少约99％。

10.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生产包括使用包含回文DNA环的表达载体。

11.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生产包括使用适用于严格控制的基因表达的表达载体。

12.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生产包括单个色谱柱步骤。

13.一种用于在大肠杆菌中生产β-内酰胺酶多肽的方法，其包括：

(a)提供用包含编码所述β-内酰胺酶多肽的序列的载体转化的宿主大肠杆菌细胞；

(b)对所述大肠杆菌细胞进行培养，以诱导所述β-内酰胺酶多肽在细胞质内的表达；以及

(c)从由所述大肠杆菌细胞制备的细胞质的可溶性级分回收所述β-内酰胺酶多肽；

其中：

所述β-内酰胺酶多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且

所述方法在每升培养物中产出至少约15克的所述β-内酰胺酶多肽。

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