KR20210089699A - 산화성 세포질을 갖는 대장균 균주 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 trxB에 의해 코딩되는 티오레독신 리덕타아제 및 trxA에 의해 코딩되는 티오레독신 1, 및 gor에 의해 코딩되는 글루타티온 리덕타아제가 결핍된, 대장균 균주를 제공한다. 상기 대장균 균주는 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖는 돌연변이된 AhpC 단백질 및 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제를 발현한다. 대장균 균주는 산화성 세포질을 갖고 디술피드 결합을 갖는 단백질을 효율적으로 생산하기 위해 이용될 수 있다.

Description

산화성 세포질을 갖는 대장균 균주
관련 출원
본 출원은 2018년 11월 8일에 출원된, 미국 가출원 제62/757,498호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 가출원의 전체 내용은 모든 목적을 위해 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
상업적으로 가치있는 단백질, 예를 들면, 치료용 단백질은 종종 디술피드(disulfide) 결합을 갖는다. 이러한 디술피드 결합은 단백질 안정성 및 기능을 위해 중요하다. 단백질 생산을 위한 종래의 박테리아 숙주는 환원성 세포질을 갖고, 따라서 세포질에서 발현되는 단백질 중 디술피드 결합을 형성할 수 없다. 그 결과, 현재 다수의 단백질이 박테리아 세포질에서 쉽게 발현될 수 없고 대신에 진핵세포 또는 주변세포질(periplasmic) 발현 시스템에서 발현된다. 환원성 경로를 저해하기 위해 박테리아 숙주 게놈 내로 돌연변이를 도입하는 것에 의해 박테리아 세포질에서 디술피드 결합 형성을 촉진하기 위한 시도가 이루어졌으나, 이러한 노력은 제한적인 성공을 가져왔다. 따라서, 박테리아에서 디술피드-결합된 단백질(disulfide-bonded proteins)의 세포질 생산은 여전히 난제로 남아있다.
발명의 요약
본 명세서에 기재된 실시예 및 구체예는 단지 설명적 목적을 위한 것이고 그에 근거하여 다양한 변형 및 변경이 당업자에게 암시될 것이고 본 출원의 원리 및 영역 및 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 공개 문헌, 서열 등록 번호, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구체예에서, 본 개시는 trxB에 의해 코딩되는 티오레독신 리덕타아제 활성, trxA에 의해 코딩되는 티오레독신 1 활성, 및 gor에 의해 코딩되는 글루타티온 리덕타아제 활성이 결핍된 대장균 균주를 제공한다. 상기 대장균 균주는 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖는 돌연변이된 AphC 단백질 및 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제(cytosolic prokaryotic disulfide isomerase)를 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 AphC 단백질은 AhpC*이다. 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 야생형 AhpC 단백질 및 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖는 돌연변이된 AhpC 단백질을 모두 발현한다.
일부 구체예에서, 상기 균주는 목적 단백질(protein of interest)을 코딩하는 유전자를 더 포함한다. 상기 목적 단백질은 항체, 그의 단편, 또는 IgG로부터의 항체+ 경쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 재조합 프롤릴 이소머라아제를 더 발현한다.
일부 구체예에서, 상기 대장균에서 발현되는 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제는 DsbC이다.
일부 구체예에서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 유도성 프로모터(inducible promoter), 예를 들면, T7 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 상기 T7 프로모터는 아라비노오스에 의해 유도될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 대장균에서 ahpC* 유전자의 발현은 Pc0 프로모터에 의해 제어된다. 일부 구체예에서, 상기 대장균에서 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제의 발현은 MTL 프로모터에 의해 제어된다. 일부 구체예에서, 상기 대장균은 K-12 균주로부터 유래된다.
또한, 대장균 균주에서 가용성, 재조합 목적 단백질을 발현시키는 방법으로서: 산화성 세포질(oxidizing cytosol) 및 목적 단백질의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 대장균 균주를 상기 목적 단백질을 가용성 단백질로서 발현할 수 있게 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 균주는 하기와 같이 유전적으로 변형된 것인 방법이 제공된다: i) 티오레독신 리덕타아제 코딩 유전자, trxB가 기능하지 않고; ii) 티오레독신 1 코딩 유전자, trxA가 기능하지 않으며; iii) 글루타티온 리덕타아제 유전자(gor)가 기능하지 않고; iv) 발현되는 효소가 퍼옥시리덕타아제(peroxyreductase) 활성이 결핍되고, 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖도록 ahpC 유전자가 돌연변이되며; 및 v) 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제를 코딩하는 유전자가 상기 박테리아 균주 내로 재조합에 의해 도입된다. 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 기능성 유전자 ahpC 및 돌연변이된 ahpC 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 ahpC 유전자는 ahpC*이다. 일부 구체예에서, trxC 유전자는 비-기능성(non-functional)이다. 일부 구체예에서, trx B 유전자는 비-기능성이다.
일부 구체예에서, 상기 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제는 DsbC 또는 yPDI(yeast protein disulfide isomerase)이다. 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 하나 이상의 재조합 프롤릴 이소머라아제를 더 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 재조합 프롤릴 이소머라아제는 시클로필린(cyclophilin), FKBP, 파르불린(parvulin), SlyD, Tig 및 yCpr6으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 하나 이상의 응집 분해효소(deaggregase)를 더 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 응집 분해효소는 Skp, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, 및 GrpE로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 대장균은 IgG, IgG의 경쇄, 또는 IgG의 중쇄로 구성된 군으로부터 선택된 목적 단백질을 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 경쇄는 항-HER2 항체의 경쇄이다. 일부 구체예에서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 유도성 프로모터, 예를 들면, T7 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 T7 폴리머라아제를 더 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 T7 폴리머라아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, 상기 유도성 프로모터는 ParaBAD, lac, phoA, tetA, xylAB, tac, 또는 람노오스 프로모터이다. 일부 구체예에서, 상기 T7 폴리머라아제는 T7 프로모터를 인식할 수 있고, T7 프로모터가 목적 단백질의 발현을 제어한다.
일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 gshA 유전자에 의해 코딩된 GshA 단백질을 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 gshA 유전자는 TrxB의 유전자좌(locus)에 삽입되는 재조합 유전자이다.
또한, 전술된 구체예 중 하나의 대장균을 포함하는 키트로서, 상기 키트는 증식 배지(growth medium)를 더 포함하는 것인 키트가 제공된다. 상기 키트는 목적 단백질을 코딩하는 플라스미드를 더 포함할 수 있다.
개요
본 개시는 산화성 세포질을 포함하도록 유전적으로 조작된 대장균 균주를 제공한다. 그러한 산화성 세포질은 디술피드 결합을 갖는 단백질의 삼차원 구조 및 안정성을 유지하는데 필수적이다. 본 발명은 항체 경쇄(LC)와 같은 단백질을 고수율로 생산하기 위한 대장균에 기반한 생산 시스템을 제공한다.
이전에, 돌연변이 대장균 균주("셔플(Shuffle)")가 생성되었다. Lobstein et al., Microbial Cell Factories 2012, 11:56. 이 돌연변이 균주는 티오레독신 리덕타아제 활성 (TRXB) 및 글루타티온 리덕타아제 활성 (GOR)이 없다. Shuffle은 또한 신호 서열 없는 DsbC 및 퍼옥시리덕타아제 활성이 결핍되나 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 ahpC 유전자의 변이체 (ahpC*)를 과발현한다. Shuffle은 정확하게 폴딩된 디술피드 결합된 단백질을 생산하는 능력을 보이는 것으로 보고되었다.
Shuffle과 비교하여, 본 명세서에 개시된 대장균 균주는 티오레독신 1 활성 (TrxA)이 더 결핍되도록 더 조작되었다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 trxA, trxB, 및 gor에 널(null) 돌연변이를 포함한다. 결과적으로, 상기 균주는 티오레독신 리덕타아제 활성 (TrxB), 티오레독신 1 활성 (TrxA), 및 글루타티온 리덕타아제 활성 (GOR)이 결핍된다. 본 명세서에 개시된 대장균 균주는 또한 그의 신호 서열이 없는 DsbC를 과발현하고, 퍼옥시리덕타아제 활성이 결핍되나 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 ahpC 유전자의 변이체 (ahpC*)를 과발현한다.
놀랍게도, 본 명세서에 개시된 대장균 균주는 Shuffle에 비해 더 높은 수율로 일부 디술피드-결합된 단백질을 생산할 수 있다. trxB는 trxA에 의해 코딩된 산화된 티오레독신을 가역적으로 환원시키는 세포질 티오레독신 리덕타아제를 코딩한다는 것을 고려하고; 통상적인 사고에 따르면, 티오레독신 리덕타아제를 불활성화시키는 것은 기질인 티오레독신 1의 불활성화를 불필요하게 할 것이고, 이는 전자가 산화환원 생화학적 경로(redox biochemical pathway)에서 후자의 상류이기 때문이다. 따라서, TrxA 및 TrxB가 모두 결핍된 대장균 균주가 일부 디술피드 결합을 포함하는 가용성 생물학적 활성 단백질의 탁월한 수율을 제공하는 것은 놀라운 것이다.
정의
용어 "리덕타아제(reductase)"는 티오레독신 리덕타아제 (TrxB), 글루타티온 또는 글루타티온 리덕타아제 (Gor) 또는 티오레독신 또는 글루타레독신 시스템의 일원들을 환원시킬 수 있는 기타 효소를 의미한다.
용어 "티오레독신(thioredoxin)"은 Rietsch and Beckwith (1998) Ann. Rev. Genet. 32: 163에 기재된 바와 같은, 티오레독신 1 (TrxA) 및 티오레독신 2 (TrxC)를 포함한다. 티오레독신은 그들의 활성 부위에 모티프 Cys-Xaa-Xaa-Cys (식 중에서, Xaa는 임의의 아미노산을 나타낸다)의 존재를 특징으로 하는 작은 단백질이다. 티오레독신은 티오레독신 리덕타아제(trxB 유전자에 의해 코딩됨) 및 NADPH에 의해 재-환원된다. trxB 돌연변이체에서, 티오레독신은 산화된 형태로 축적된다. TrxA는 trxA 유전자에 의해 코딩되고 TrxB는 trxB 유전자에 의해 코딩된다.
용어 "gor"은 글루타티온 옥시도리덕타아제(oxidoreductase) 유전자를 의미하고, 용어 "GOR"은 글루타티온 옥시도-리덕타아제를 의미한다.
"DsbC"는 유전자 dsbC에 의해 코딩되는 단백질이고, 디술피드 결합 이성질체화(isomerization)를 촉매한다. DsbC 널 돌연변이체는 복수의 디술피드 결합을 갖는 단백질의 폴딩에서 결함을 갖는다.
용어 "글루타티온(glutathione)"은 시아노박테리아, 프로테오박테리아(proteobacteria), 그람-양성 박테리아의 일부 균주를 포함한 다수의 개체들, 및 미토콘드리아와 엽록체를 갖는 모든 진핵생물에서 발견되는 고도로 보존된 저분자량 티올인, γ-L-글루타밀-L-시스테이닐-글리신 (GSH)을 의미한다. 글루타티온은 2개의 효소: 글루타메이트-시스테인 리가아제 (gshA) 및 글루타티온 신테타아제 (gshB)의 작용에 의해 합성된다. 글루타메이트-시스테인 리가아제(glutamate-cysteine ligase)는 글루탐산과 시스테인 간의 반응을 촉매하여 γ-글루타밀 시스테인을 형성시키고, 이는 뒤이어 글루타티온 신테타아제에 의해 글리신에 접합되어 GSH를 형성한다.
핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때, 핵산은 또 다른 핵산에 "작동가능하게 연결된(operatively linked)" 것이다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 주는 경우, 프로모터 또는 인핸서는 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위가 번역을 촉진하도록 배치된 경우, 그 부위는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비성 리더(secretary leader)의 경우, 인접하고 판독상(reading phase)에 있다. 연결은 편리한 제한효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상적인 관례에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다.
AhpC는 알킬 히드로겐 퍼옥시드 리덕타아제(alkyl hydrogen peroxide reductase) AhpCF의 2개의 서브유닛 중 하나이다. AhpCF의 나머지 서브유닛은 플라보효소(flavoenzyme) AhpF이다. Tarataglia et al, J. Biol. Chem., Volume 265, 10535-10540, 1990; Smillie et al, Genbank submission NCBL gi; 216542, 1993). 이들 2종의 단백질은 함께 작용한다; AhpF는 AhpC로의 전자 공여체로서 NADH 또는 NADPH를 이용하고, AhpC는 생리적 지질 퍼옥시드(lipid peroxides), 예를 들면, 리놀레산 히드로퍼옥시드 및 티민 히드로퍼옥시드, 및 비생리적(nonphysiological) 알킬 히드로퍼옥시드를 그들의 개별적인 무독성 알코올 형태로 환원시킨다. 이 효소 복합체(또는 시스템)는 산소 및 그의 유도체를 제거한다. AhpC는, 반응성 질소 중간체의 제거도 일어나는 것으로 입증되었으나, 산소 라디칼 손상으로부터 보호하기 위한 특이적 알킬 히드로퍼옥시드-제거 효소(alkyl hydroperoxide-scavenging enzyme)로 작용하는 것으로 입증되었다. AhpF는 AhpC를 특이적으로 환원하기 위한 필수적인 신장된 추가적인 N-말단 단편을 갖는 티오레독신 리덕타아제와 관련된다.
단백질을 기술하기 위해 사용되는 경우, 용어 "세포질(cytosolic)"은 단백질이 세포의 세포질에 존재한다는 것을 의미한다.
"이종 기원 단백질 또는 폴리펩티드(heterologous protein or polypeptide)"는 정상적으로 숙주 세포에서 생산되지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이종 기원 폴리펩티드는 숙주 세포에 도입된 핵산으로부터 발현되는 경우, 숙주 세포와 동일한 종 및 타입으로부터 유래될 수 있다.
"외래 폴리펩티드(exogenous polypeptide)"는 세포에서 정상적으로 생산되지 않는 폴리펩티드를 의미한다.
"널 돌연변이(null mutation)"는 비기능성(nonfunctional) 유전자를 초래하는 유전자의 돌연변이를 의미한다. 널 돌연변이는 연관된 유전자 산물의 생산의 완전한 결핍 또는 제대로 기능하지 않는 산물을 유발할 수 있다.
용어 "디술피드 이소머라아제(disulfide isomerase)" 또는 "PDI"과 호환적으로 사용된, 용어 "단백질 디술피드 이소머라아제(protein disulfide isomerase)"는 디술피드 결합 형성 및 이성질체화를 촉매하는 효소를 의미한다. PDI는 인 비트로 데이터를 통해 디술피드 결합 형성 및 재배열의 촉매작용에 관여된 것으로 시사되었다(Creighton et al. (1980) J. Mol. Biol. 142:43; Feedman et al. (1989) Biochem. Soc. Symp. 5:167; 및 Bardwell and Beckwith (1993) Cell 74:899). PDI의 효모 돌연변이체는 카르복시펩티다아제 Y 중 디술피드 결합의 형성에서 결함을 갖는 것으로 확인되었다 (LaMantia and Lennarz (1993) Cell 74:899). 숙주 세포에서 이종 기원 단백질의 발현을 위한 PDI의 용도는 공개번호 WO 93/25676; WO 94/08012의 PCT 출원; 및 EP 509,841에 더 기재된다.
"펩티딜프롤릴 이소머라아제(peptidylprolyl isomerase)" 또는 "PPlase"와 호환적으로 사용된, 용어 "프롤릴 이소머라아제(prolyl isomerase)"는 아미노산 프롤린과의 펩티드 결합의 시스 이성질체와 트랜스 이성질체를 상호전환시키는, 원핵생물 및 진핵생물 모두에서 발견되는 효소를 의미한다. 프롤릴 이소머라아제 활성을 갖는 단백질은 시클로필린 (예를 들면, accession # Q13427), FKBP (예를 들면, accession # Q02790), 파르불린 (예를 들면, accession # Q9Y237), Tig (예를 들면, accession #P0A850 ), SlyD (예를 들면, accession # P0A9K9), 및 yCpr6 (예를 들면, accession #S000004206)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "응집 분해효소(deaggregase)"는 예를 들면, 박테리아 불포함 번역 시스템에서 생산된 목적 단백질을 분해하고 및/또는 가용화시키는 단백질 샤페론(protein chaperone)을 의미한다. 그러한 샤페론은, 그의 작용 메카니즘이 촉매적이기보다는 화학양론적(stoichiometric)이므로 고농도에서 특히 유용하고, 단백질이 폴딩되면서, 새롭게 합성된 단백질의 소수성 패치(hydrophobic patch)를 안정화시키는 것에 의해 작용하는 것으로 사료된다. 응집 분해효소의 비-한정적 예는 Skp (예를 들면, accession # P0AEU7), GroEL(예를 들면, accession #P0A6F5), GroES (예를 들면, accession #P0A6F9), DnaK (예를 들면, accession #P0A6Y8 ), DnaJ (예를 들면, accession #P08622　), GrpE (예를 들면, accession #P09372)를 포함한다.
"환원된 상태(reduced state)"에 있는 단백질을 지칭할 때, 이는 그의 산화된 형태보다 더 많은 전자를 갖는 단백질을 의미한다.
용어 "산화성 세포질(oxidative cytoplasm)"은 기질이 환원되기보다는 산화될 가능성이 더 높은 것인 세포의 세포질을 의미한다.
용어 "티오레독신 리덕타아제 활성(thioredoxin reductase activity)"은 티오레독신 1을 환원된 상태로 유지하는 티오레독신 리덕타아제 (TRXB)의 능력을 의미한다.
용어 "티오레독신 1 활성(thioredoxin 1 activity)"은 리보뉴클레오티드 리덕타아제를 환원된 상태로 유지하는 티오레독신 1 (TRXA)의 능력을 의미한다.
용어 "퍼옥시리덕타아제 활성(peroxyreductase activity)"은 생리학적 지질 산화물(physiological lipid oxide)을 환원시키는 AhpC의 능력을 의미한다.
용어 "글루타티온 리덕타아제 활성(glutathione reductase activity)"은 글루타티온 디술피드 (GSSG)의 티올 형태(sulfhydryl form) 글루타티온 (GSH)으로의 환원을 촉매하는 능력을 의미한다. 예를 들면, 글루타티온 리덕타아제 (GOR)는 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖는다.
용어 "재조합(recombinant)" 또는 "재조합에 의해(recombinantly)"는 그의 천연 환경으로부터 제거되었거나, (2) 해당 유전자가 자연적으로 발견되는 것인 폴리뉴클레오티드 전체 또는 그의 일부와 회합되지(associated) 않거나, (3) 자연적으로는 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결되거나, 또는 (4) 자연적으로 일어나지 않는 생분자, 예를 들면, 유전자 또는 단백질을 의미한다. 용어 "재조합(recombinant)"은 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 이종 기원 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 및 그러한 핵산에 의해 코딩된 단백질 및/또는 mRNA를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
대장균에서 환원성 경로의 변형
본 발명은 디술피드 결합을 갖는, 적합하게 폴딩된 세포질 단백질을 생산하기 위해 대장균에서 2개의 환원성 경로: 티오레독신 경로 및 글루타레독신(glutaredoxin)/글루타티온 경로를 변형한다.
티오레독신 경로에서, 티오레독신 리덕타아제(trxB 유전자의 산물)는 NADPH의 환원력을 이용하여, 환원된 상태의 티오레독신 1 (trxA 유전자의 산물)을 유지시키고, 그 후, 티오레독신 1이 리보뉴클레오티드 리덕타아제와 같은 기질 단백질을 환원시킬 수 있다. 세포 내에 글루타티온 또는 글루타레독신 경로가 존재하는 한, 이 경로는 제거될 수 있다. 이는 본 발명에서 trxA 및 trxB의 염색체로부터의 결실을 통해 달성되었다.
글루타티온/글루타레독신 경로에서, 글루타티온 옥시도리덕타아제(gor 유전자의 산물)는 글루타티온(gshA 및 gshB에 의해 코딩됨)을 환원시키기 위해 NADPH의 환원력을 이용한다. 그 후, 글루타티온은 (grxA, grxB, 및 grxC에 의해 코딩된) 3종의 글루타레독신을 환원시킬 수 있다. Stewart et al., EMBO J. Vol. 17 No. 19 pp.5543-5550 (1998). 본 발명에서, 이 경로는 글루타티온이 GOR이 아닌, 돌연변이된 퍼옥시리덕타아제를 통해 환원되도록 변형되었다.
본 명세서에 개시된 대장균 균주는 야생형 대장균 대비 상이한 환원성 경로를 갖도록 유전적으로 변형되었다. 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 돌연변이된 AhpC 단백질을 코딩하는 돌연변이된 ahpC 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 AphC 단백질은 글루타티온 리덕타아제의 활성을 얻고, 따라서, trxB gor 돌연변이 대장균 균주의 증식을 회복시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 돌연변이된 AphC 단백질은 야생형 AphC 단백질과 비교하여 165번 위치에 시스테인 잔기를 보유한다. 이러한 돌연변이체들은 전자를 티오레독신 경로보다, 글루타티온/글루타레독신 경로로 보낼 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이된 AphC 단백질은 야생형 AhpC 단백질이 보유한 퍼옥시리덕타아제 활성이 결핍된다. 일부 구체예에서, 돌연변이된 AphC 단백질은 야생형 AhpC 단백질이 보유한 퍼옥시리덕타아제 활성을 유지한다.
일부 구체예에서, 돌연변이된 AphC 단백질은 야생형 AphC 대비 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하고, 상기 하나 이상의 점 돌연변이는 165번 위치에 시스테인 잔기를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 점 돌연변이는 S159P, P161S, A167T, P166S, C46Y, C46F, R119C, 및 G141S로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 이들 돌연변이 AhpC 단백질은 야생형 AhpC가 갖는 퍼옥시리덕타아제 활성을 보유한다. 이들 돌연변이체 중 일부는, 참조에 의해 관련된 개시가 본 명세서에 포함된, Yamamoto et al., Mol. Cell. January 18; 29(1): 36-45 (2008)에 기재된다.
일부 구체예에서, 돌연변이된 aphC 유전자는 서열번호 4 (이하에서, "ahpC* 유전자"라 함)이고, 서열번호 5 (이하에서, "AhpC* 단백질이라 함)를 코딩한다. AhpC* 단백질은 야생형 AhpC 단백질이 보유한 퍼옥시리덕타아제 활성을 상실하나, 글루타티온 리덕타아제의 활성을 얻는다. AhpC*는 야생형 AhpC 단백질의 36번과 37번 잔기 사이에 페닐알라닌의 삽입을 포함한다. 일부 구체예에서, ahpC* 유전자가 그 유전자의 결실로부터 FLP 재조합효소에 의해 남겨진 자국(scar) 부위에 삽입된다. 일 실시예에서, ahpC*는 해당 유전자의 결실로부터 tnaA (tryptophanase) 유전자 좌에 있는 자국 부위로 삽입된다.
대장균 균주는 또한 티오레독신 리덕타아제 활성이 결핍되도록 유전적으로 조작되었다. 일 구체예에서, 대장균은 trxB 유전자에 널 돌연변이를 포함하여, 티오레독신 리덕타아제 활성이 결핍된 박테리아를 초래한다.
대장균 균주는 또한 티오레독신 1 활성이 결핍되도록 유전적으로 조작되었다. 일 구체예에서, 대장균은 trxA 유전자에 널 돌연변이를 포함하여, 티오레독신 리덕타아제 활성이 결핍된 박테리아를 초래한다.
대장균 균주는 또한 글루타티온 리덕타아제 유전자 (gor)가 기능하지 않도록 유전적으로 조작되었다. 일 구체예에서, 대장균은 gor 유전자에 널 돌연변이를 포함하여, 글루타티온 리덕타아제 활성이 결핍된 박테리아를 초래한다.
일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 gshA 유전자를 발현한다. GshA는 글루타티온 생합성의 첫 단계를 담당하고, 기능성 GshA 단백질을 발현하는 것은 세포가 여전히 기능성 글루타티온 합성 경로를 갖는 것을 보장하고 세포 생존을 보장할 수 있다.
대장균 균주는 또한 재조합 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제를 발현하도록 변형되었다. 재조합 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제는 단백질 폴딩을 촉진할 수 있고, 이는 특히 보다 도전적인 LC를 위해 중요하다. 일부 구체예에서, 샤페론은 세포로부터의 분비를 위한 리더 서열의 제거에 의해 세포질에 국소화된다. 일 구체예에서, 디술피드 이소머라아제는 DsbC이다. 일 구체예에서, 상기 디술피드 이소머라아제는 yPDI(yeast protein disulfide isomerase), 예를 들면, Groff et al., MAbs 6(3): 671-678 (2014)에 기재된 것과 같은 yPDI이고, 이는 yPDI와 DsbC가 원핵성 시스템(prokaryotic system)에서 면역글로불린 단백질의 폴딩을 위해 기능적으로 호환적이라는 것을 보여준다. 따라서, 인간 단백질 디술피드 이소머라아제 및 기타 밀접하게 관련된 단백질도 이 균주에서 DsbC의 기능적 치환을 위해 적합할 것으로 예상된다. 일부 구체예에서, 상기 단백질 이소머라아제는 프롤릴 이소머라아제이고, 적합한 피롤릴 이소머라아제는 시클로필린, FKBP, 파르불린, 응집 분해효소 skP 또는 slyD, groEL/groES, danK, dnaJ, 또는 grpE를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
분비 샤페론을 세포질 샤페론으로 전환시키기 위해 제거되어야 하는 신호 서열은 다양한 방법으로 확인될 수 있다. 대장균 및 인간과 같은 잘 규명된 개체의 경우, 대부분의 단백질에 대해 신호 서열이 알려져 있다. 이는 분비 서열을 제거하는 일을 단순히 클로닝 동안 이 서열을 제거하는 것으로 경감시킨다. 기타 박테리아 또는 동물과 같은 덜 연구된 개체의 경우, 신호 서열은 여전히 그들의 박테리아 또는 인간 동족체(homolog)에 대한 상동성을 통해 추론될 수 있다. 공지된 신호 서열과의 동족체가 없는 경우, 약 70% 정도 정확한, 신호 서열을 예측하는 알고리즘이 있다(Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, and von Heijne G. Protein Eng. 1997 Jan;10(1):1-6).
목적 단백질
본 명세서에서 제공된 방법은 그의 생물학적 활성 구조(confirmation)에서 하나 이상의 디술피드 결합을 갖거나, 또는 성숙 형태에서 디술피드 결합을 포함하지 않으나, 그의 전구체은 하나 이상의 디술피드 결합을 포함하는 임의의 단백질에 대해 이용될 수 있다.
디술피드 결합은 일반적으로 2개의 시스테인 곁사슬 간에 공유 결합을 초래하는 술프히드릴기의 산화에 의해 형성된다. 디술피드 결합은 잔기들을 공유결합 방식으로 연결하여 폴딩 유닛(folding unit)을 안정한 구조로 고정(lock)시키는 것에 의해 삼차 단백질 구조를 안정화시킬 수 있다. 다수의 디술피드-결합된 단백질은 분비되거나 원형질 막에 부착되어, 환경에 노출된다. 디술피드-결합된 단백질의 이러한 특징들은 그들이 약학 산업을 위한 탁월한 치료제 또는 표적이 되게 한다.
원핵세포에서, 디술피드 결합은 DsbA 단백질이 그의 디술피드 결합을 고유한(native) 구조에서 디술피드 결합을 포함하는 새로 합성된 폴리펩티드에 공여할 때 형성된다. 내재성 막 단백질(integral membrane protein) DsbB는 그 자체 내에 디술피드 결합을 형성하고, 그 결합이 DsbA에 전달된다. DsbC는 디술피드 결합 이성질체화를 촉매하는 단백질이다. 야생형 대장균 균주에서, DsbC는 주변 세포질로 보내지고, 따라서, 세포질의 디술피드-함유 단백질의 제조를 위해 적합하지 않다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 일부 구체예에서, 변형된 대장균 균주는 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제, 예를 들면, DsbC를 발현한다. 이 세포질 DsbC 단백질은 그의 신호 서열 없이 발현된다; 그 결과, 이 DsbC 단백질은 목적 단백질의 디술피드 조립을 촉진하기 위해 세포질에 유지된다. 일부 진핵 세포에서, 주요한 디술피드 경로는 막-결합 플라보단백질(membrane-associated flavoprotein) EroI 및 가용성 티오레독신-유사 단백질 PDI으로 구성된다. 그의 시스테인 쌍의 산소에 의한 재산화를 매개하기 위해 플라빈 보조인자를 사용하는 EroI은 그 자체 내에 디술피드 결합을 생성하고, 그 후, 그 결합을 PDI로 전달한다. 차례로, PDI는 디술피드 결합을 그의 고유한 구조를 취하지 않은 새로 합성된 폴리펩티드에 적접적으로 전달한다.
디술피드 결합은 분비 단백질, 면역 단백질, 세포외 기질 단백질, 당단백질(glycoprotein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 및 막 단백질을 포함하나, 그에 한정되지 않는 다수의 단백질에 존재한다. 디술피드 결합 및 디술피드 결합을 갖는 단백질의 상세한 설명을 예를 들면, Fass, D. Annu. Rev. Biophys., 2012, 41:63-79, Sevier, C.S. 및 Kaiser, C.A. Antioxidants & Redox Signaling, 2006, 8(5):797-811 and de Marco, A., Microbial Cell Factories, 2009, 8:26에서 찾을 수 있다. 이러한 단백질은 또한 본 명세서에 개시된 시스템을 이용하여 생산될 수 있다.
목적 단백질은 진핵 단백질, 원핵 단백질, 바이러스 단백질, 또는 식물 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 목적 단백질은 마우스, 소, 양, 고양이, 돼지, 개, 염소, 말, 및 영장류 기원을 포함한 포유류 기원이다. 일부 구체예에서, 목적 단백질은 인간 기원이다.
일부 구체예에서, 목적 단백질은 항체, 예를 들면, 단쇄항체, 항체의 단편, 및 복수 개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 항체이다. 일부 구체예에서, 목적 단백질은 항체의 경쇄 또는 중쇄이다. 일부 구체예에서, 목적 단백질은 scFv이다. 일부 구체예에서, 목적 단백질은 Fab 단편이다. 예시적인 항체는 항-HER2 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 경쇄는 항-HER2 항체의 경쇄, 예를 들면, 트라스투주맙 경쇄를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
생산될 수 있는 목적 단백질의 추가적인 예는 하기 단백질을 포함한다: 분자, 예를 들면, 레닌, 성장 호르몬, 호르몬 또는 성장 인자의 수용체를 포함하는 포유동물 폴리펩티드; CD 단백질, 예를 들면, CD-3, CD4, CD8, 및 CD-19; 인터루킨; 인터페론; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; DAF(decay accelerating factor); 바이러스 항원, 예를 들면, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질(transport protein); 호밍 수용체(homing receptor); 어드레신(addressin); 조절 단백질; 항체; 및 전술된 폴리펩티드의 단편.
본 발명에 의해 생산된 단백질은 하기 목적 또는 효과 중 하나 이상을 위해 이용될 수 있다: 박테리아, 바이러스, 균류 및 기타 기생물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 감염체의 증식, 감염, 또는 기능 억제, 또는 사멸; 신장, 체중, 헤어 컬러, 안구 색, 피부, 지방 대 근육비(fat to lean ratio) 또는 기타 조직 착색, 또는 기관 또는 신체 부분 크기 또는 형태(예를 들면, 가슴 확대 또는 축소, 골 형태 또는 모양의 변화)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 신체적 특징의 초래(effecting)(억제 또는 강화); 바이오리듬 또는 활동일 주기 또는 일주율(circadian cycles or rhythms) 초래; 수컷 또는 암컷 개체의 생식능(fertility) 달성; 식이 지방, 지질, 단백질, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 보조인자, 또는 기타 영양 인자 또는 성분의 대사, 동화, 이화, 처리, 이용, 축적, 또는 제거의 초래; 식욕, 성욕, 스트레스, 인지(인지 장애 포함), 우울증(우울 장애 포함) 및 폭력적 행동을 포함하나, 이에 한정되지 않는 행동적 특징의 초래; 진통 효과 또는 기타 통증 경감 효과의 제공; 조혈 계통 이외의 계통의 배아 줄기 세포의 분화 및 증식 촉진; 체액성 또는 내분비 활성; 효소의 경우, 효소의 결핍 시정 및 결핍-관련 질환의 치료; 과증식 질환(예를 들면, 건선)의 치료; 면역글로불린-유사 활성(예를 들면, 항원 또는 보체에 결합하는 능력); 및 단백질 또는 그러한 단백질과 교차-반응성인 또 다른 물질 또는 독립체(entity)에 대한 면역 반응을 일으키기 위해 백신 조성물에서 항원으로 작용할 수 있는 능력.
본 발명에 의해 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 목적을 위해 이용될 수 있다. 바람직한 용도는 진단 용도, 예방 용도, 및 치료 용도를 포함한 의약 용도를 포함한다. 예를 들면, 단백질은 국소 투여 또는 기타 유형의 투여를 위해 제조될 수 있다. 또 다른 바람직한 의약 용도는 백신의 제조용이다. 따라서, 본 발명에 의해 생산된 단백질은 개체로의 투여를 위한 약제학적 조성물을 형성하기 위해 약리학적으로 허용가능한 용액에 가용화되거나 또는 현탁된다. 의약 용도 및 약학적 조성물의 투여 방법을 위해 적합한 완충액이 하기에 더 기재된다. 의약 조성물은 또한 예를 들면, 수의학적 목적을 위해 인간이 아닌 개체에게 투여될 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
일반적 방법
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 실시자들은 특히, 당해 기술 분야의 정의 및 용어에 대해, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Green, M.R., and Sambrook, J., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), and Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 99), John Wiley & Sons, New York (2012)를 참조한다. 표준 방법들은 또한, RNA 조작 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술하고, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Bindereif, Schun, & Westhof (2005) Handbook of RNA Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim, Germany에 기재된다. 재조합 핵산을 생성하기 위한 적합한 분자적 기법, 및 당업자가 다수의 클로닝 실습을 수행하도록 안내하기에 충분한 설명의 예를, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Green, M.R., and Sambrook, J., (Id.); Ausubel, F. M., et al., (Id.); Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 1987); 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, San Diego, Calif. 1990)에서 찾을 수 있다.
단백질 정제, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 위한 방법이 Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York에 기술된다. 무세포 합성(cell-free synthesis)을 위한 방법이 Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Germany에 기술된다. 무세포 합성을 이용하여, 비-고유한 아미노산을 단백질로 결합시키는 방법이 Shimizu et al (2006) FEBS Journal, 273, 4133-4140에 기술된다.
PCR 증폭 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. San Diego, Calif., 1990에 기술된다. 증폭 반응은 일반적으로 증폭될 DNA, 열안정성 DNA 폴리머라아제, 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTPs), 반응 완충액, 및 마그네슘을 포함한다. 통상적으로, 열 사이클의 바람직한 회수는 1 내지 25이다. 프라이머 설계 및 PCR 조건의 최적화 방법이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 표준 분자생물학 교과서, 예를 들면, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 5th Edition, Wiley, 2002, 및 Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, 1990에서 찾을 수 있다. 컴퓨터 프로그램이 원하는 특이성 및 최적 증폭 특성을 갖는 프라이머의 설계에서 유용하다 (예를 들면, Oligo Version 5.0 (National Biosciences)). 일부 구체예에서, PCR 프라이머는 증폭된 DNA 단편을 벡터 중 특정한 제한효소 부위에 삽입하는 것을 촉진하기 위해, 제한효소에 대한 인식 부위를 추가적으로 포함할 수 있다. 제한효소 부위가 PCR 프라이머의 5' 말단에 첨가되는 경우, 상기 효소에 의한 보다 효율적인 절단을 가능하게 하기 위해 수개(예를 들면, 2개 또는 3개)의 추가적인 5' 염기를 포함하는 것이 선호된다. 일부 구체예에서, PCR 프라이머는 또한 후속 인 비트로 전사를 가능하게 하기 위해 RNA 폴리머라아제 프로모터 부위, 예를 들면, T7 또는 SP6을 포함할 수 있다. 인 비트로 전사를 위한 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들면, Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1663-1667, 1990; Eberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3010-3014, 1992 참조).
본 명세서에 기재된 단백질이 명칭으로 지칭될 때, 이는 유사한 기능 및 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질들을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 단백질은 야생형 프로토타입 단백질, 및 동족체, 다형 변형체(polymorphic variation), 및 재조합에 의해 생성된 뮤테인(mutein)을 포함한다. 예를 들면, 명칭 "DsbC 단백질"은 대장균으로부터의 야생형 프로토타입 단백질 (예를 들면, 서열번호 1), 및 다른 종으로부터의 동족체, 다형 변형체, 및 재조합에 의해 생성된 뮤테인을 포함한다. DsbC와 같은 단백질은, 그들이 야생형 단백질과 실질적으로 동일한(예를 들면, 80% 이상) 생물학적 활성 또는 기능적 능력(functional capacity)을 갖는 경우, 유사한 기능을 갖는 것으로 정의된다. DsbC 및 AhpC*와 같은 단백질이 프로토타입 단백질과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경우, 그들은 유사한 아미노산 서열을 갖는 것으로 정의된다. 단백질의 서열 동일성은 3의 디폴드 워드길이(defaults wordlength), 10의 기대값(E) 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스로 BLASTP 프로그램을 이용하여 결정된다 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992 참조).
단백질 동족체, 다형 변이체(polymorphic variant), 또는 재조합 뮤테인이 본 명세서에 기재된 기능을 갖는 단백질에 포함되는지 여부를 결정하는 용이한 관례적 테스트는 프로토타입 단백질에 대해 생성된 다중클론 항체에 의한 특이적 결합에 의한 것이다. 통상적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 적어도 백그라운드 신호 또는 잡음의 2배 이상이고, 보다 통상적으로, 백그라운드의 10 내지 100배를 초과한다. 예를 들면, DsbC 단백질은 서열번호 1의 프로토타입 단백질에 대해 생성된 다중클론 항체에 결합하는 단백질을 포함한다.
대장균에 돌연변이를 도입하는 방법
일부 구체예에서, 유전자 변형, 예를 들면, trxA 및 trxB의 넉-아웃(knock-out)이 부위-특이적 재조합에 의해 수행될 수 있다. 부위-특이적 재조합은 엔도뉴클레아제(endonuclease) 활성 및 리가아제 활성을 갖는 효소를 이용하고, 상기 효소는 DNA 서열의 특정 부분을 인식하고 그를 임의의 상응하는 DNA 서열로 치환한다. Yang W. and Mizuuchi K., Structure, 1997, Vol. 5, 1401-1406(9)을 참조한다. 부위-특이적 재조합 시스템이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, 박테리오 λ 파아지로부터의 Int/att 시스템, PI 박테리오파아지로부터의 Cre/LoxP 시스템, 및 효모로부터의 FLP-FRT 시스템은 잘 개발된 부위-특이적 재조합 시스템이다.
본 명세서에 개시된 다양한 단백질에 부위-특이적 재조합을 도입하는 방법의 비-한정적 예는 Cre/Lox 및 Flp/Frt 재조합 시스템을 포함한다. 두 시스템은 모두 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 박테리아 염색체로의 부위-특이적 통합이 보고되었다(예를 들면, Sauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. 85. 5166-5170 (1988); Fukushige et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89. 7905-7907 (1992); Baubonis et al., Nucleic Acids Research. 21, 2025-2029 (1993); Hasan et al., Gene, 150. 51-56 (1994); Golic et al., Cell. 5_9, 499-509 (1989); Sauer, Mol. Cell. Biolo. 1_, 2087-2096 (1987); Sauer et al., Methods: Companion to Methods in Enzymol.. 4., 143-149 (1992); Sauer et al., The New Biologist. 2., 441-449 (1990); Sauer et al., Nucleic Acids Res.. 17. 147-161 (1989); Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91. 1706-1710 (1994); Orban et al., Proc. Natl.. Acad. Sci., 89, 6861-6865 (1992) 참조). 염색체 서열의 특이적 결실 및 재배열도 공학적으로 이루어졌고(engineered), λ 벡터로부터 플라스미드로서 외래 DNA의 제거도 현재 가능하다 (예를 들면, Barinaga, Science. 265, 27-28 (1994); Sauer, Methods in Enzvmol.. 225. 890-900 (1993); Sauer et al., Gene, 70. 331-341 (1988); Brunelli et al., Yeast, 1309-1318 (1993); Invitrogen (San Diego, CA) 1995 Catalog, 35; Clontech (Palo Alto, CA) 1995/1996 Catalog, 187-188 참조). 재조합이 재조합 부위들 간의 서열의 결실 또는 역위(inversion)에 의해 기능성 전사 유닛을 재구성하거나 또는 불활성화시키도록 클로닝 체계(cloning scheme)가 생성되었다 (예를 들면, Odell et al., Plant Phvsiol.. 106. 447-458 (1994); Gu et al., Cell. 73. 1155-1164 (1993); Lakso et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.. 89. 6232-6236 (1992); Fiering et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90. 8469-8473 (1973); O'Gorman et al., Science. 251, 1351-55 (1991); Jung et al., Science, 259, 984-987 (1993) 참조).　
Cre 또는 Flp 재조합효소(recombinase)를 코딩하는 유전자는 구성적(constitutive), 유도성, 또는 발생적으로 조절되는(developmentally-regulated) 프로모터의 제어 하에 트랜스로 제공될 수 있거나, 또는 정제된 재조합효소가 도입되었다 (예를 들면, Baubonis et al., supra; Dang et al., Develop. Genet.. 13, 367-375 (1992); Chou et al., Genetics. 131. 643-653 (1992); Morris et al., Nucleic Acids Res.. 19. 5895-5900 (1991) 참조).　
일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 게놈 조작(genomic manipulation)은 Kirill A. Datsenko and Barry L. Wanner Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6; 97(12): 6640-6645로부터의 변형된 부위-특이적 재조합 프로토콜을 이용하여 수행된다. 일 구체예에서, 유전자, 예를 들면, trxA를 넉 아웃시키는 것은 하기와 같이 수행될 수 있다. 2개의 FRT 부위, 및 넉아웃될 유전자의 양 말단에 상동성인, 상동성 신장부 (homology extension) (H1 및 H2)에 의해 플랭킹된(flanked) 항생제 내성 유전자를 포함하는 PCR 앰플리콘을 생성했다. 세포를 이 PCR 산물로 형질전환시킨 후에, 넉아웃될 유전자가 이 플랭킹 상동성 영역에서 Red-매개 재조합을 통해 항생제 내성 유전자로 치환된다. 선택 후에, 내성 유전자는 상기 내성 유전자를 플랭킹하는 직접 반복 FRT(FLP 인식 표적)에 작용하는, FLP 재조합효소를 발현하는 헬퍼 플라스미드를 이용하여 제거될 수 있다. Red 및 FLP 헬퍼 플라스미드는 온도-민감성 레플리콘(replicon)이므로, 이들은 37℃에서의 증식에 의해 간단하게 치유된다. 유전자, 예를 들면, dsbC를 넉인시키는 것은 당업자에게 잘 알려진 표준 분자 클로닝 기법에 의해 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 유전자를 넉아웃시키는 것은 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 수행된다. CRISPR/Cas 시스템은 유전자를 제거하기 위해 Cas 단백질 및 상기 Cas 단백질을 표적 유전자, 예를 들면, gor 중 서열로 인도할 수 있는 적어도 1개 내지 2개의 리보핵산을 이용한다. 유전자 발현을 제거하기 위해 CRISPR/Cas 시스템을 이용하는 방법이 잘 알려져 있고, 예를 들면, 그 개시가 참조에 의해 전체로 본 명세서에 포함된, 미국특허출원 공개 2014/0170753에 기술된다.
표적 유전자를 넉아웃시키는 추가적인 방법은 상동성 재조합 기술, 이펙터(effector) 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN), ZFN (Zinc-Finger Nuclease, ZFN)의 전사 활성화 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 방법도 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
벡터 및 프로모터
목적 단백질, 샤페론 (예를 들면, DsbC), 또는 기타 단백질 (예를 들면, AhpC*)을 코딩하는 핵산이 적절한 원핵성 프로모터의 제어 하에 대장균에서 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입될 수 있다. 이 목적을 위해 다수의 벡터가 이용가능하고, 당업자는 적합한 벡터의 선택을 용이하게 결정할 수 있다. 목적 유전자 외에, 벡터는 통상적으로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열, 복제원점, 하나 이상의 마커 유전자, 및 프로모터.
사용될 수 있는 프로모터는 전사 활성을 보이고, 돌연변이된 프로모터, 절단된(truncated) 프로모터, 및 하이브리드(hybrid) 프로모터를 포함한, 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 위해 적합한 임의의 프로모터 서열일 수 있고, 이들은 세포에 내재되거나(고유) 또는 이종 기원(외래)인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 수득될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
일부 구체예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 본 발명의 실시를 위해 유용한 적합한 원핵세포 프로모터는 Pc0, PL59, MTL, ParaBAD, lac, T3, T7, 람다 Pr'P1', trp, spc 리보좀 단백질 오페론 프로모터 Pspc, 플라스미드 pBR322의 β-락타마아제 유전자 프로모터 Pbla, 파아지 λ의 PL 프로모터, 플라스미드 pBR322의 복제 제어 프로모터 PRNAI 및 PRNAII, rrnB rRNA 오페론의 P1 및 P2 프로모터, tet 프로모터, 및 pACYC 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 테트라사이클린-조절 전사 조절제(Tetracycline-regulated transcriptional modulator) 및 CMV 프로모터가 WO 96/01313, 미국특허 제5,168,062호 및 제5,385,839호에 기재되고, 이들의 전체 개시는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구체예에서, 프로모터는 생성할 수 있는 발현의 양의 측면에서 상이한 강도를 가질 수 있다. 프로모터는 중간 강도(medium strength) 프로모터, 약한 강도 프로모터, 및 강한 프로모터일 수 있다. 프로모터의 강도는 적절한 대조군 대비, 해당 프로모터로부터 개시된 유전자 산물의 전사의 양으로서 측정될 수 있다. 발현 구조체(expression construct)에서 유전자 산물의 발현을 지시하는 구성적 프로모터의 경우, 프로모터의 '야생형' 버전 또는 '하우스키핑(housekeeping)' 유전자로부터의 프로모터가 테스트될 프로모터 대신 사용된다는 것을 제외하고는, 적절한 대조군은 동일한 발현 구조체를 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 프로모터 강도는 대조군 프로모터 대비 그 프로모터로부터의 전사체의 양을 측정하는 것에 의해 결정된다. 예를 들면, 테스트될 프로모터를 갖는 발현 구조체를 포함하는 숙주 세포('테스트 숙주 세포') 및 대조군 발현 구조체를 포함하는 대조군 숙주 세포를 복수의 재현물로(replicates) 배양에서 증식시킬 수 있다. 숙주 세포 및 대조군의 총 RNA를 추출하고 260 nm에서의 흡광도에 의해 측정할 수 있다. 그 후, 테스트 숙주 세포 및 대조군 숙주 세포로부터의 총 RNA의 동일량으로부터 cDNA를 합성할 수 있다. 프로모터로부터 생성된 전사체에 상응하는 cDNA를 증폭시키기 위해 RT-PCR을 수행할 수 있다. 예시적 방법이 De Mey et al. ("Promoter knock-in: a novel rational method for the fine tuning of genes", BMC Biotechnol 2010 Mar 24; 10:26)에 기술된다.
일부 구체예에서, 재조합 단백질, 예를 들면, AhpC* 단백질 및 DsbC 단백질이 적절한 수준으로 발현된다는 것을 보장하기 위해, 다양한 형질전환 유전자를 상이한 강도의 프로모터의 제어 하에 대장균에서 발현시킨다. 이는 박테리아에서 산화성 세포질을 유지하고, 생존, 활력(증식 속도)을 보장하기 위해 대안적인 환원 경로를 구축하는데 유용하다. 일 구체예에서, ahpC* 유전자는 중간 강도 프로모터인 Pc0 프로모터에 의해 제어된다. gshA 유전자의 발현을 지시하기 위해 PL59 프로모터 (약한 프로모터) 및 WT gshA 프로모터 (중간 강도 프로모터)가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 최대 수율을 보장하기 위해 목적 단백질의 발현을 지시하도록 강한 프로모터 T7을 이용할 수 있다. 일부 구체예에서, 대장균 균주는 paraBAD 프로모터의 제어 하에 재조합 T7 폴리머라아제를 발현하고, 이는 예를 들면, 아라비노오스의 첨가 또는 부재를 통해 목적 단백질의 엄격한 조절 및 제어를 가능하게 한다. Guzman et al., J. Bacteriol. July 1995 177 (14): 4121-4130.
선택적으로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 원하는 변형을 갖는 대장균의 클론을 제한 희석(limited dilution)에 의해 선택할 수 있다. 선택적으로, 원하는 돌연변이가 다양한 유전자에 존재하거나, 또는 원하는 형질전환 유전자, 예를 들면, dsbC 및 ahpC*가 게놈 내로 삽입된다는 것을 확인하기 위해 이러한 클론들을 시퀀싱할 수 있다. 일부 경우에, 염색체에서 삽입 또는 돌연변이의 위치를 결정하기 위해 전체 게놈 시퀀싱(whole genome sequencing)을 수행할 수 있다.
숙주 세포
본 개시에서 대장균 균주는 당업자에게 알려진 임의의 대장균 균주일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 대장균 균주는 A (K-12), B, C 또는 D 균주이다.
효소 활성의 측정
일부 구체예에서, 하나 이상의 유전자, 예를 들면, trxA에 도입된 돌연변이가 단백질 발현 또는 mRNA 발현을 제거하지 않으나, 상응하는 야생형 단백질이 갖는 활성, 예를 들면, TrxA의 티오레독신 활성이 결핍된 뮤테인을 초래한다. 종종 유전자를 넉 아웃시키는 것이 그의 활성을 완전히 제거하는 것을 요구하지 않는다는 것이 당업자에 의해 이해되고, 따라서, 본 개시의 목적을 위해, 활성을 결핍한다는 것은 해당 뮤테인이 대조군 단백질, 예를 들면, 야생형 단백질의 활성의 85-100%를 상실한다는 것을 의미한다. 생성된 다양한 뮤테인이 야생형 단백질의 활성을 결핍한다는 것을 확인하기 위해 이들을 테스트할 수 있다. 예를 들면, 뮤테인에 대한 코딩 서열 각각을 숙주 균주에서 개별적으로 발현시킬 수 있고, 뮤테인을 정제하고, 하기에 기재된 바와 같이 그들의 활성에 대해 테스트할 수 있다.
티오레독신 리덕타아제 활성의 상실 확인
일 구체예에서, 티오레독신 리덕타아제 활성은 NADPH의 존재 하에 DTNB(5,5-디티오비스(2-니트로벤조산))을 환원시키는 활성에 의해 측정될 수 있다. 그 반응은 통상적으로 DTNB를 티오레독신 리덕타아제 (TrxR), 티오레독신 (Trx) 및 NADPH와 혼합하는 것에 의해 개시되고, 시간의 경과에 따라 412 nm에서 흡광도의 증가를 모니터링한다. 활성은 흡광도 증가의 속도로 정의될 수 있다. 티오레독신 리덕타아제 활성을 검출하는 구체예가 미국특허 제8,592,468호에 개시된다.
티오레독신 활성의 상실 확인
티오레독신 활성을 결정하는 방법도 잘 알려져 있다. 일 구체예에서, 분석은 Sung-Jong Jeon et al., European Journal of Biochemistry, Vol. 269, No. 22에 기재된 것과 같은 인슐린 침전 분석법이다. 티오레독신은 인슐린의 디술피드 리덕타아제의 활성을 갖는 것으로 알려져 있고; 인슐린 디술피드 결합의 환원은 유리 인슐린 B-사슬의 침전에 의한 탁도의 증가에 의해 측정될 수 있다. 하나의 예시적 구체예에서, 표준 분석 혼합물은 재조합 단백질의 부재 또는 존재 하에 0.1M 인산칼륨 (pH 7.0), 1 mm EDTA, 및 0.13 mm 소 인슐린(bovine insulin)을 포함하고, 반응은 1mm 디티오트레이톨의 첨가시 개시되었다. 650 nm에서의 흡광도 증가를 30℃에서 모니터링하였다.
글루타티온 리덕타아제 활성의 상실 확인
AhpC*의 글루타티온 리덕타아제 활성 또는 뮤테인(mutein) GOR의 글루타티온 리덕타아제 활성의 상실이 또한 모니터링될 수 있다. 일부 구체예에서, 글루타티온 리덕타아제 활성은 시스테인을 환원시키는 활성에 의해 측정된다. 예를 들면, 시스테인을 보조인자(co-factor)의 존재 하에 후보 단백질, 예를 들면, AhpC* 또는 돌연변이 GOR을 포함하는 환원 용액과 함께 인큐베이션시켰다. 바람직하게는, 상기 보조인자는 조효소이다. 바람직하게는, 상기 보조인자는 NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 또는 NADH(nicotinamide adenine dinucleotide)이다. 반응은 시스틴을 시스테인으로 환원시킨다. 도식적(schematic) 반응은 하기와 같다:
CYS - CYS + 2GSH→ 2CYS + GSSG
GSSG + NADPH→ 2GSH + NADP + H
활성은 시스테인의 생산을 측정하는 것에 의해 측정될 수 있다. 하나의 특정한 예에서, 환원성 시스테인의 측면에서 글루타티온 리덕타아제 활성이 WO2018114576에 기재된다.
AhpC의 퍼옥시리덕타아제 활성의 상실 확인
AhpC*의 퍼옥시리덕타아제 활성의 부재는 NADH의 존재 하에 단백질을 유기 히드로과산화물(organic hydroperoxides) 또는 과산화수소와 함께 인큐베이션시키는 것에 의해 확인될 수 있다. 기능성 퍼옥시리덕타아제가 NADH-의존적 메카니즘에서 이 기질들을 물로 전환시킬 것이다; 그러한 전환의 증거의 부재는 퍼옥시리덕타아제 활성의 부재를 나타낸다.
대장균 균주의 세포질이 산화성 상태라는 것의 확인
본 명세서에 개시된 대장균 균주는 산화성 세포질을 포함한다. 이는 디술피드 결합을 갖는 단백질, 예를 들면, 야생형 대장균 균주에서 발현시키기 어려운 LC의 생물학적 활성에 의해 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 대장균이 산화성 세포질을 갖는다는 것을 확인하는 것은 박테리아를 일반적으로 하나 이상의 디술피드 결합을 포함하는 폴리펩티드("테스트" 폴리펩티드)를 코딩하는 유전자에 의해 형질전환시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 테스트 폴리펩티드 또는 단백질은 세포로부터 정상적으로 분비되는 것들 또는 막 단백질인 것들이다. 일부 경우에, 이러한 폴리펩티드는 신호 서열(signal sequence)의 결실 또는 돌연변이에 의해 변형되어, 해당 단백질이 세포의 세포질 외부로 이동되지 않는다.
하나의 예시적 실시예에서, LC 단백질, 예를 들면, 전술된 항-MUC1 항체 경쇄의 코딩 서열(서열번호 15)이 적절한 프로모터 하에 발현 카세트 내로 도입되도록 조작되고(engineered), 변형된 대장균 균주 내로 형질전환될 수 있다. LC를 포함하는 가용성 단백질 분획이 측정된다. 적절한 대장균 균주는 적어도 1 mg/100 mL의 LC를 가용성 형태로 발현할 수 있을 것이다. 박테리아 용해물을 제조하고, 용해물 중 단백질 발현(예를 들면, LC의 발현)의 양을 측정하는 방법이 잘 알려져 있다. 일부 구체예에서, 용해물을 제조하기 위해 대장균 세포를 용해제(lysis agent)로 처리할 수 있다. 용해물을 효소, 예를 들면, 벤조나아제(benzonase) 및 난백 리소자임(egg white lysozyme)으로 처리하는 것에 의해 세포질 단백질이 방출될 수 있다. 불용성 단백질 분획을 예를 들면, 원심분리에 의해 가용성 분획으로부터 분리할 수 있다. 가용성 단백질 분획(LC 포함)을 수집하고 SDS-PAGE에 의해 분석할 수 있다. 가용성 단백질 분획 중 LC 단백질의 양은 예를 들면, 농도계(densitometry)에 의해 정량할 수 있다. LC 발현을 분석하는 하나의 구체적 예가 실시예 2에 기술되고, 이는 세포질이 산화성 상태인지 여부를 평가하기 위해 이용될 수 있다.
발현 확인
대장균에서 다양한 변형된 유전자의 단백질 발현 수준을 결정하고 및/또는 유전자가 넉아웃되거나 또는 삽입되었는지 여부를 확인하기 위해 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 예를 들면, 유전자의 발현이 mRNA의 전사를 정량하는 통상적인 노던 블롯팅에 의해 측정될 수 있다. 다양한 표지들이 이용될 수 있고, 가장 흔하게는 방사성 동위원소가 이용될 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드로의 도입을 위해 비오틴-변형 뉴클레오티드를 사용하는 것과 같은 다양한 기법들이 또한 이용될 수 있다. 비오틴은 이때 아비딘 또는 항체로의 결합을 위한 부위로 작용하고, 이들은 다양한 표지, 예를 들면, 방사성 핵종, 형광 물질, 효소, 등으로 표지될 수 있다.
일부 구체예에서, 발현된 단백질은 겔 전기영동 (예를 들면, PAGE), 웨스턴 분석(Western analysis) 또는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) (예를 들면, Caliper LabChip)을 이용하여 정제되고 정량될 수 있다. 무세포 번역 반응(cell-free translation reaction)에서 단백질 합성은 방사성표지된 아미노산, 통상적으로, 35S-표지 메티오닌 또는 14C-표지 루이신의 내포(incorporation)에 의해 모니터링될 수 있다. 방사성표지된 단백질은 전기영동 후 자기방사법(autoradiography)에 의해 분자 크기에 대해 시각화되고 정량되거나, 또는 면역침전에 의해 단리될 수 있다. 재조합 His 택(tag)의 내포는 Ni2+ 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제의 또 다른 수단을 제공한다. 발현 시스템으로부터의 단백질 생산은 가용성 단백질 수율로 측정될 수 있거나, 또는 효소 활성 또는 결합 활성의 분석을 이용하여 측정될 수 있다.
일부 구체예에서, 정량할 단백질이 정의된 생물학적 활성, 예를 들면, 효소 활성(예를 들면, 알칼리 포스파타아제) 또는 증식 억제 활성을 갖는 경우, 목적 단백질의 발현은 적절한 기질과 인큐베이션시키는 것에 의해 그의 활성을 측정하는 것에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 키트
본 개시는 또한 본 발명의 숙주 세포, 및 선택적으로 증식 배지, 목적 단백질을 코딩하는 플라스미드, 프로브, 항체, 및/또는 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 생물학적 활성이거나 적절하게 폴딩된 디술피드 함유 단백질을 생산하는데 필요한 하나 이상의 요소들을 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 키트는 본 발명의 숙주 세포의 제조를 위해 필요한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 그러한 키트는 숙주 세포의 하나 이상의 리덕타아제에 돌연변이를 도입하기 위해 필요한 리덕타아제 또는 작용제의 발현을 감소시키기 위해 필요한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 키트는 숙주 세포의 증식을 개선하기 위해 필요한 작용제, 예를 들면, 환원제, 또는 증식을 개선하는 단백질을 코딩하는, 선택적으로 플라스미드에 담긴, 유전자를 포함할 수 있다.
예시적인 구체예
본 개시는 하기의 비-한정적 구체예를 포함한다:
1. 대장균(E. coli) 균주로서:
i) 상기 균주는 trxB에 의해 코딩되는 티오레독신 리덕타아제의 활성이 결핍되고;
ii) 상기 균주는 trxA에 의해 코딩되는 티오레독신 1의 활성이 결핍되며;
iii)　상기 균주는 gor에 의해 코딩되는 글루타티온 리덕타아제의 활성이 결핍되고;
iv) 상기 균주는 돌연변이된 AhpC 단백질을 발현하고, 상기 돌연변이된 AhpC 단백질은 글루타티온 리덕타아제 활성을 가지며; 및,
v) 상기 균주는 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제(cytosolic prokaryotic disulfide isomerase)를 발현하는 것인 대장균 균주.
2. 구체예 1에 있어서, 상기 균주는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인 대장균 균주.
3. 구체예 2에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체, 그의 단편, 또는 IgG로부터의 항체+ 경쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 대장균 균주.
4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제는 DsbC인 것인 대장균 균주.
5. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 대장균은 재조합 프롤릴 이소머라아제 및/또는 응집 분해효소를 더 발현하는 것인 대장균 균주.
6. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서,
상기 프롤릴 이소머라아제는 시클로필린, FKBP, 파르불린, SlyD, Tig 및 yCpr6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
상기 응집 분해효소는 Skp, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, 및 GrpE로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 대장균 균주.
7. 구체예 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 구성적(constitutive) 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 대장균 균주.
8. 구체예 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 대장균 균주.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌연변이된 ahpC 유전자의 발현은 Pc0 프로모터에 의해 제어되는 것인 대장균 균주.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제의 발현은 MTL 프로모터에 의해 제어되는 것인 대장균 균주.
11. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 대장균 균주는 K-12 균주인 것인 대장균 균주.
12. 대장균 균주에서 가용성, 재조합 목적 단백질을 발현시키는 방법으로서:
a. 산화성 세포질 및 목적 단백질의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 대장균 균주를 상기 목적 단백질을 가용성 단백질로서 발현할 수 있게 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 균주는 기능성 티오레독신 리덕타아제 코딩 유전자, trxB;; 기능성 티오레독신 1 코딩 유전자, trxA, 기능성 티오레독신 2 코딩 유전자, trxC; 기능성 글루타티온 리덕타아제 유전자(gor) 및 기능성 ahpC 유전자를 갖는 야생형 박테리아 균주로부터 유래되고, 상기 균주는 하기와 같이 유전적으로 변형된 것인 방법:
i) 티오레독신 리덕타아제 코딩 유전자, trxB가 작동하지 않고;
ii) 티오레독신 1 코딩 유전자, trxA가 작동하지 않으며;
iii) 글루타티온 리덕타아제 유전자(gor)가 작동하지 않으며;
iv) 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖도록 ahpC 유전자가 돌연변이되며; 및
v) 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제 코딩하는 유전자가 상기 균주 내로 재조합에 의해 도입된다.
13. 구체예 12에 있어서, 상기 대장균 균주는 trxC에 널(null) 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
14. 구체예 12 및 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 대장균 균주는 trxB에 널 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
15. 구체예 12 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 대장균 균주는 trxA에 널 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
16. 구체예 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 목적 단백질은 IgG, IgG의 경쇄 또는 IgG의 중쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
17. 구체예 12 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 세포질 디술피드 이소머라아제는 DsbC 또는 yPDI(yeast protein disulfide isomerase), 또는 hPDI(human protein disulfide isomerase)인 것인 방법.
18. 구체예 12 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 대장균 균주는 재조합 프롤릴 이소머라아제 및/또는 재조합 응집 분해효소를 더 발현하는 것인 방법.
19. 구체예 18에 있어서, 상기 재조합 프롤릴 이소머라아제는 시클로필린, FKBP, 파르불린, SlyD, Tig 및 yCpr6으로 구성된 군으로부터 선택되고; 상기 응집 분해효소는 Skp, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, 및 GrpE로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
20. 구체예 12 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법..
21. 구체예 12 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
22. 구체예 16에 있어서, 상기 항체 경쇄는 항-HER2 항체의 경쇄인 것인 방법.
23. 구체예 12 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 또는 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 대장균 균주는 gshA 유전자에 의해 코딩된 GshA를 발현하는 것인 방법 또는 대장균 균주.
24. 구체예 12 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 또는 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 gshA 유전자는 TrxB의 유전자 좌에 삽입된 것인 방법 또는 대장균 균주.
25. 구체예 12 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 또는 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 대장균 균주는 T7 폴리머라아제를 더 발현하는 것인 방법 또는 대장균 균주.
26. 구체예 12 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 또는 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 T7 폴리머라아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인 방법 또는 대장균 균주.
27. 구체예 26에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 ParaBAD, lac, lacUV5 phoA, tetA, xylAB, tac, 또는 람노오스 프로모터인 것인 방법.
28. 구체예 1 내지 11 중 하나의 대장균을 포함하는 키트로서, 상기 키트는 증식 배지를 더 포함하는 것인 키트.
29. 구체예 27에 있어서, 상기 키트는 목적 단백질을 코딩하는 플라스미드를 더 포함하는 것인 키트.
도 1a는 항-Muc1 항체의 항체 경쇄(LC), Muc1 G09k LC를 발현하는 7종의 변형된 대장균 균주로부터의 세포 용해물의 가용성 분획 및 불용성 분획의 SDS PAGE 분석의 결과를 보여준다. 이들 대장균 균주에서의 다양한 돌연변이가 SDS-PAGE 결과 위에 있는 표에 표시된다.
도 1b는 항 CD74 IgG의 경쇄, 7219 LC를 발현하는 3종의 변형된 대장균 균주로부터의 세포 용해물의 가용성 분획의 SDS-PAGE 분석의 결과를 보여준다. 이들 대장균 균주의 유전형이 SDS-PAGE 결과 위에 있는 표에 표시된다.
도 1c는 발현된 LC가 발현시키는 것이 비교적 용이한 단백질인 트라스투주맙의 경쇄인 것을 제외하고는, 도 1a의 결과와 유사한 SDS-PAGE 분석의 결과를 보여준다.
도 2는 Shuffle 및 Snuggle 대장균 균주에서 78-92% 서열 동일성을 갖는 4개의 상이한 LC의 상대적 발현의 결과를 보여준다. Snuggle 균주는 Shuffle 균주 대비 LC 생산에서 20-110% 새선을 보였다.
실시예 1. 일반적인 방법
모든 게놈 조작, 넉-인, 및 넉-아웃을 Kirill A. Datsenko and Barry L. Wanner Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6; 97(12): 6640-6645로부터의 변형된 부위-특이적 재조합 프로토콜로 수행하였다. 이 방법들은 넉-인될 목적 유전자의 통합 또는 그로부터 넉-아웃될 유전자의 제거에서와 같이, 특정한 부위에서 교환이 일어날 수 있게 한다. 부위 특이적 재조합은 특이적, 역위 반복 서열(inverted repeat sequence), 예를 들면, Cre-LoxP 시스템을 포함한다. 삽입을 위해, 통합 카세트는 loxP 부위에 의해 플랭킹된 선택 마커에 인접하게 삽입될 유전자, 예를 들면, DsbC (NP_417369)로 구성된다. 전체 카세트를 염색체에 넉킹시킨 후에, 선택 마커 유전자를 뒤이어 Cre 재조합효소를 코딩하는 플라스미드에 의한 전기천공에 의해 수행된 Cre 재조합효소로의 일시적 노출에 의해 제거하고, 목적 유전자는 게놈에 통합되게 하였다. 넉 아웃의 경우, 결실 카세트는 loxP 부위에 의해 플랭킹된 선택 마커로 구성되었다. 상기 카세트를 염색체 내로 넉킹(knock)시킨 후에, 선택 마커 유전자를 뒤이어 Cre 재조합효소를 코딩하는 플라스미드에 의해 전기천공에 의해 수행된 Cre 재조합효소로의 일시적 노출에 의해 제거하였다.
실시예 2. 스너글(Snuggle) 균주의 생산
산화성 세포질을 가진 모든 균주의 백그라운드는 S97이다. 이 균주는 무세포 단백질 합성 시스템에서 NNAA 내포를 촉진하기 위해 개발된 ompT 민감성 RF1(Yin et al, Sci Rep. 2017 Jun 8;7(1):3026.)과 함께 균주 KGK10 (Knapp KG, Goerke AR and Swartz J, Biotechnol Bioeng. 2007 Jul 1;97(4):901-8)에 존재하는 모든 돌연변이를 갖는다. 또한, 이 균주는 강한 T7 프로모터로부터 단백질의 엄격하게 제어된 발현을 위해 ParaBAD 프로모터의 제어 하에 염색체로 통합된 T7 RNA 폴리머라아제의 염색체 카피를 갖는다. 하기에 기술된 바와 같이 제조된 모든 균주의 생존력은 하기의 변형과 함께 본질적으로 Ritz et al, Science, 2001에 기재된 플레이트 분석법(plate assay)를 이용하여 확인하였다. 염색체 변형(chromosomal modification) 후에 세포를 직접 부영양 배지 플레이트(rich media plate)에 도말하였다.
5개의 추가적인 돌연변이를 S97 균주 내로 도입했다. 이 돌연변이들은 티오레독신 리덕타아제 또는 글루타티온 리덕타아제의 부재 하에 생존력을 위해 요구되는 소분자를 위한 대안적 환원성 경로의 생성을 가져왔다. 첫째로, ahpC 유전자의 돌연변이 변이체, ahpC*를 tnaA 유전자의 결실 후에 tnaA 유전자 좌에 남은 Frt 재조합효소 자국(scar)에 넉인시키는 것에 의해 ahpC 변이를 도입했다. 이 유전자를 약한 프로모터 PL57 또는 중간 강도 프로모터 Pc0의 제어 하에 테스트하였다. 표 2에 표시된 바와 같이, 36번 및 37번 잔기에 2개의 페닐알라닌을 포함하는 야생형 단백질을 코딩하는, 야생형 ahpC 유전자와 비교하여, ahpC*는 이 위치에 3개의 페닐알라닌을 포함하는 뮤테인을 코딩한다. ahpC* 뮤테인은 (야생형 ahpC 단백질에 의해 보여지는) 퍼옥시리덕타아제 활성을 상실하나, 글루타티온 리덕타아제 활성을 얻는다. ahpC△는 이 위치에 단 하나의 페닐알라닌을 갖고, 기능성 퍼옥시리덕타아제를 코딩하지 않는다. ahpC△ 돌연변이체는 trxB 및 gor가 결핍된 대장균의 돌연변이체 B 균주 ("B 균주")까지 증식을 회복하는 것으로 보고되었다.
둘째로, 대장균의 전구체 균주(precursor strain)로부터 이전에 결실되었던, gshA 유전자를 약한 프로모터 PL59 또는 중간 강도 프로모터 WT gshA 프로모터 하에 위에서 생성된 돌연변이 균주의 trxB에 넉인시켰다. 두 프로모터 모두로 실행가능한 조합을 수득하였다. 이는 새로운 AhpC*- 글루타티온 환원 경로를 완성시키고, 티오레독신-매개 경로를 제거하는 동시 효과를 가졌다. 본 발명자들은 이 단백질들에 대한 발현 수준이 실행가능한 대안적 환원 경로를 구축하는데 있어서 중요할 것으로 예상했다.
PL59 또는 WT gshA 프로모터로의 gshA 넉-인으로 실행가능한 조합을 달성하였다. 그러나, Pc0 프로모터 하에 ahpC* 를 갖는 세포들(www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1134079에 기재됨)만이 생존가능하여, 이 단백질의 더 높은 수준이 결정적이고, GshA의 더 광범위한 농도 범위가 성장을 위해 충분하다는 것을 나타낸다. 앞서 제조된 이 균주는 3개의 상이한 돌연변이, ahpC* 및 gshA 넉-인 및 trxB 넉아웃을 포함했고, 이는 디술피드 형성을 가능하게 하는 산화성 세포질의 생성에 충분하다.
세째로, 리더없는(leaderless) DsbC 유전자를 강한 MTL 프로모터와 함께 염색체 내로 넉인시켰다. 리더없는 DsbC 단백질은 분비 신호 펩티드를 결핍하고, 세포질에서 디술피드 이소머라아제로 기능하며, 이는 세포질 단백질의 고유한 디술피드 조립을 촉진한다. 따라서, "Shuffle"로 불리는, 이러한 3개의 돌연변이, 즉, trxB 넉 아웃, DsbC 넉-인 및 ahpC* 돌연변이를 갖도록 제조된 균주는 LC 폴딩 조립을 할 수 있었다.
다른 보고서에서 디술피드 결합된 포유류 단백질의 고 역가를 생산하는 것으로 보고되었으나, Shuffle 대장균을 제조하기 위해 요구되는 돌연변이는 고수준의 LC 생산을 가져오지 않았다. 따라서, 이 문제를 해결하기 위해, 티오레독신 1(TrxA)을 넉 아웃시키는 것에 의해 제 4 돌연변이를 도입시켰다. 이 돌연변이는 모든 LC를 높은 수준으로 발현할 수 있는 원하는 LC 균주를 초래했다. 이러한 변형 중 하나가 결핍된 균주들은 그 만큼의 LC를 생산할 수 없었다. "Snuggle"로 명명된, 모든 5개의 돌연변이를 갖는, 이러한 새로운 균주(표 2에서 "419"로 표시됨)는 디술피드 결합된 단백질의 생산에 대해 이전의 "Shuffle" 균주보다 더 높은 수율을 가져왔다. 이 결과는 TrxA를 위한 주요한 리덕타아제, TrxB가 이미 결실되었다는 것을 고려할 때 특히 놀랍고, 따라서, TrxA는 세포질 리덕타아제로서 기능적이지 않았어야 한다.
디술피드 결합 형성 및 환원은 친-산화성(pro-oxidative) 단백질과 소분자, 예를 들면, DsbA와 O2 및 친-환원성 단백질과 소분자, 예를 들면, 시스테인과 티오레독신에 의해 영향을 받는 역동적 과정이다. 이 때문에, 주어진 단백질의 어느 정도의 활성 수준이 주어진 표현형을 생성하기 위해 요구되는지를 말하는 것은 어렵다. 그러므로, TrxB, TrxA가 존재한 경우, 또는 DsbC가 존재하지 않는 경우 생산하기 어려운 LC에 대해 훨씬 더 낮은 LC 생산능(production potential)이 관찰되었다. 그러한 현저한 차이는 낮은 수준의 trxA 또는 trxB 활성이라도 어느 정도까지 세포질의 산화환원(redox) 환경 및 LC 폴딩을 붕괴시키기에 충분할 것이라는 것을 나타낸다. trxA 또는 trxB의 경우, 내생 수준의 25% 미만의 단백질 발현 또는 활성 수준은 유해한 효과를 유발할 것으로 예상된다. DsbC의 경우, Snuggle 및 Shuffle이 세포질 DsbC 생산을 위해 상이한 프로모터를 사용하므로, LC 폴딩을 위해 요구되는 세포질 농도는 덜 명확하다. DsbC가 샤페론 및 디술피드 이소머라아제로서 기능하기 때문에, 여전히 Snuggle에 존재하는 것의 적어도 25% 수준에서 이 단백질의 과발현이 요구된다.
실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된, 7종의 대장균 균주가 하기 표 1에 열거된 표현형을 갖는 것으로 확인하였다:
표 1. 균주 표현형
Shuffle 347 410 413 414 417 419
trxB 델타
(ahpC*, gsh+)		 + - + + - + +
trxA 델타 - - - + - - +
세포질 DsbC + - - - + + +
"+"는 제1 컬럼에 기재된 돌연변이가 상응하는 행에 존재했다는 것을 나타냄.
각 균주를 대장균 발현을 위해 코돈 최적화된, LC 유전자 (Muc1 G09k LC, 7219 LC, 또는 트라스투주맙 LC)를 포함하는 Atum (Newwark, California)으로부터의 플라스미드 pJ411로 형질감염시켰다. 세포를 37℃에서 40 mg/L 카나마이신으로 보충된 TB(Terrific Broth) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 밤새 증식시켰다. 다음 날, 세포를 신선한 카나마이신 함유 TB로 1:100으로 희석시키고 2.0의 OD에 도달할 때까지 37℃에서 배양했다. 이 시점에, 세포를 0.2% 아라비노오스의 첨가에 의해 유도하고, 25℃로 옮겼다. 밤샘 유도 후에, 세포를 아침에 회수했다. 세포를 가용성, 세포질 단백질을 방출시키기 위해 1 ㎕/ml 벤조나아제 뉴클레아제(benzonase nuclease) 및 10 mg/ml 암탉 난백 리조자임(hen eggwhite lysozyme)을 포함하는 BPER 세균 용해 시약 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에 재현탁시켰다. 100 ㎕의 총 세포 용해물을 새로운 튜브로 옮기고, 세포 파쇄물 및 불용성 단백질을 20,000 x G에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 가용성 단백질을 포함하는 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 그 후, 펠렛을 100 ㎕ 1x LDS 샘플 완충액에 재현탁시키고 용해시켰다. 각 분획 중 LC의 분석을 위해, 10 ㎕의 가용성(Sol) 및 불용성(Insol) 단백질 시료를 NuPAGE SDS 겔에 로딩하고 염료 앞쪽(dye front)이 겔의 하단에 도달할 때까지 전개시켰다. 겔을 블루 세이프 스테인(blue safe stain)으로 염색하고, 물로 탈-염색시키고, Biorad GelDoc EZ로 영상화하였다. 농도계(densitometry)를 이용하여 겔 강도 및 상대적 단백질 정량을 측정하였다.
도 1a는 불량하게 거동한(poorly behaved) LC, 항-Muc1 항체의 경쇄, Muc1 G09k LC에 대한 발현 프로파일을 보여준다. Muc1 G09k LC는 HT186-D11로도 알려져 있고, Thie et al., PloS One, 2011 Jan 14; 6 (1): e15921에 기술되며, 상기 문헌의 관련된 개시는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 이 시료들의 경우, 상업적으로 입수가능한 Shuffle 균주가 가용성 단백질의 합당한 생산을 제공한다. 놀랍지 않게, 환원성 세포질을 갖는 모든 돌연변이체, 또는 세포질 DsbC가 결핍된 돌연변이체는 합당한(reasonable) 역가로 LC를 생산하지 못했다. 놀랍게도, 세포질 DsbC 및 산화성 세포질을 포함하는 Shuffle에 유사한 유전형을 갖는 Sutro 균주 돌연변이체 (S417)는 합당한 역가로 이 LC를 발현하지 못했다. 그러나, TrxA의 추가적인 돌연변이를 포함한 S419는 Shuffle 균주보다 높은 수준으로 LC 생산을 가능하게 하여, 이 균주에 이루어진 변화들이 이 균주를 LC 생산을 위한 탁월한 숙주가 되게 했다는 것을 보여주었다.
도 1b는 환원성 세포질을 갖는 전구체 Sutro 균주인 Shuffle 세포 및 Snuggle에서 제조된 도전적인(challenging) LC의 또 다른 예, 7219 LC를 보여준다. 7219 LC는 그의 전체 개시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된 WO/2016/014434에 기재된 항 CD74 IgG이다. 이 시료들의 경우, 전술된 방법으로 가용성 단백질만 분석했다. 다시, 본 발명자들은 환원성 세포질을 갖는 균주에서 LC 발현이 거의 관찰하지 못했고, 반면에, Snuggle 균주는 Shuffle 균주보다 뚜렸하게 더 높은 역가를 생성했다.
도 1c는 대장균에서 비교적 더 용이하게 생산되는 LC의 예, 트라스투주맙 LC를 보여준다. 이 LC의 경우, 숙주에 관계없이 탁월한 가용성 발현(soluble expression)이 있었다. 이 경우, LC는 폴딩이나 안정성을 위해 디술피드 결합 형성을 필요로 하지 않는다. 불용성 분획이 되는 LC는 거의 없었다.
실시예 3. △gor/trxB 균주에서 증식을 회복하는 돌연변이체 AphC
야생형 AhpC 단백질은 36번 및 37번 잔기로 2개의 페닐알라닌을 포함하는, 퍼옥시리덕타아제이다. 표 2의 마지막 행을 참조한다. K12 기반 균주에서 증식을 회복하는 돌연변이, AhpC*가 표 2에서 제3행에 표시된다. AhpC* 돌연변이 균주는 36번과 37번에 있는 2개의 페닐알라닌 사이에 삽입된 추가적인 페닐알라닌을 포함했다. B 균주까지 증식을 회복하는 것을 보고된 aphC 돌연변이체, AhpC △가 중간에 표시된ㄷ. ahpC 돌연변이 균주는 표 2에 표시된 바와 같이 단 하나의 페닐알라닌을 갖는다; 편의를 위해, 37번 잔기가 결실된 것으로 표시되나, 원칙적으로, 결실은 36번 또는 37번 잔기로 지정될 수 있었다. Snuggle 균주의 생산 동안, gor 및 trxB의 결실을 갖는 대장균 K12 유래 세포의 염색체 상에 이들 돌연변이를 도입시켰다. 이 세포들에서 AhpC* 돌연변이체만이 생존력을 회복했고, 이 균주가 K12 계통(lineage)를 갖기 때문인 것으로 사료된다.
아미노산 # 34 35 36 37 38 39 40
균주 AhpC
돌연변이		 아미노산 Ser Val Phe Phe Phe Tyr Pro
K12
Δgor/trxB		 ahpC* AGC GTC TTC TTC TTC TTC TAC CCG
BL21
Δgor/trxB		 ahpCΔ AGC GTC TTC TTC TAC CCG
WT B 및 K12 WT AGC GTC TTC TTC TTC TAC CCG
AhpC 돌연변이체가 산화된 글루타티온 (GSSG)를 환원된 글루타티온 (GSH)로 전환하는 능력에 기초하여 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 AhpC 돌연변이체를 분석했다. 그 방법은 Yamamoto et al., Mol. Cell. January 18; 29(1): 36-45 (2008)에 기술된다. 요약하면, 5 μM의 정제된 AhpC 뮤테인을 1 mM GSSG, 0.5 μM의 단백질 알킬 히드로퍼옥시드 리덕타아제 서브유닛 F (AhpF), 10 μM의 단백질 글루타레독신 1 (grxA) 및 0.8 mM NADH를 포함하는 반응 혼합물과 인큐베이션시켰다. 결과는 AhpC* 돌연변이체가 유리 글루타티온, GSH를 생성했다는 것을 보여주어, 상기 돌연변이체가 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. WT 단백질 및 이 활성이 결핍된 ahpC 델타 돌연변이체는 GSSG로부터 GSH를 생산할 수 없었다.
실시예 4. Shuffle 및 Snuggle 대장균 균주에서의 재조합 LC 발현
4개의 상이한 LC (LC-1, LC-2, LC-3, 및 LC-4)를 코딩하는 플라스미드를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산된 Snuggle 대장균 균주 및 Shuffle 대장균 균주 (C3026J, New England Biosciences) 내로 형질전환시켰다. 이러한 4개의 LC는 상호 간에 78-92% 서열 동일성을 공유한다. 세포를 37℃에서 진탕 플라스크에서 TB 중에 1.5의 OD까지 증식시키고, 0.1% 아라비노오스 (Snuggle) 또는 1% 아라비노오스 및 1 mM IPTG (Shuffle)로 유도시켰다. 25℃에서 16시간 동안 단백질 발현을 수행하였다. 벤치탑 원심분리기(benchtop centrifuge)에서 21,000Хg로 10분 동안 발효 배지 1 mL의 원심분리에 의해 세포를 회수하였다. 결과적으로 수득된 펠렛을 50 mg/L Lysozyme (L6876, Sigma Aldrich) 및 25 U/mL Benzonase (E1014, Sigma Aldrich)를 함유한 B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent (78248, Thermo Fisher)에 10 mL/g 세포 습중량(wet cell weight)의 비율로 재현탁시키고 용해시켰다. 불용성 물질을 벤치탑 원심분리기에서 10분 동안 21,000Хg로 원심분리하여 제거하였다. 환원성 SDS page 겔을 웰당 결과적으로 수득된 용해물 4 ㎕로 전개시키고, 쿠마시 염색된(Coomassie stained) LC 밴드의 상대적 발현량을 밀도계(densitometry)에 의해 결정했다.
도 2에 도시된 바와 같이, Snuggle 균주는 Shuffle 균주와 비교하여 수율의 측면에서 LC 생산에서 20-110% 개선을 보였다.
예시적 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> SUTRO BIOPHARMA, INC. <120> E. COLI STRAINS HAVING AN OXIDATIVE CYTOPLASM <130> 091200-1165216-006710PC <140> PCT/US2019/060345 <141> 2019-11-07 <150> 62/757,498 <151> 2018-11-08 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 711 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgaagaaag gttttatgtt gtttactttg ttagcggcgt tttcaggctt tgctcaggct 60 gatgacgcgg caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag 120 cccgcgcctg tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc 180 gatgatggta aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc 240 aatgtcacca ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt 300 tataaagcgc cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac 360 tgccacaaac tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat 420 cttgctttcc cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg 480 tgtgcgaaag ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca 540 gccagttgcg acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc 600 ggtactccgg cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca 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Tyr Ile Glu Val Arg Ser Leu Asp Ile Asn Pro 325 330 335 Phe Ser Pro Ile Gly Val Asp Glu Gln Gln Val Arg Phe Leu Asp Leu 340 345 350 Phe Met Val Trp Cys Ala Leu Ala Asp Ala Pro Glu Met Ser Ser Ser 355 360 365 Glu Leu Ala Cys Thr Arg Val Asn Trp Asn Arg Val Ile Leu Glu Gly 370 375 380 Arg Lys Pro Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Cys Glu Thr Ala Gln Phe 385 390 395 400 Pro Leu Pro Gln Val Gly Lys Asp Leu Phe Arg Asp Leu Lys Arg Val 405 410 415 Ala Gln Thr Leu Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Ala Tyr Gln Lys Val 420 425 430 Cys Asp Glu Leu Val Ala Cys Phe Asp Asn Pro Asp Leu Thr Phe Ser 435 440 445 Ala Arg Ile Leu Arg Ser Met Ile Asp Thr Gly Ile Gly Gly Thr Gly 450 455 460 Lys Ala Phe Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Leu Leu Arg Glu Glu Pro Leu 465 470 475 480 Glu Ile Leu Arg Glu Glu Asp Phe Val Ala Glu Arg Glu Ala Ser Glu 485 490 495 Arg Arg Gln Gln Glu Met Glu Ala Ala Asp Thr Glu Pro Phe Ala Val 500 505 510 Trp Leu Glu Lys His Ala 515 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 15 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ala Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

Claims (29)

  1. 대장균(E. coli) 균주로서:
    i) 상기 균주는 trxB에 의해 코딩되는 티오레독신 리덕타아제의 활성이 결핍되고;
    ii) 상기 균주는 trxA에 의해 코딩되는 티오레독신 1의 활성이 결핍되며;
    iii)　상기 균주는 gor에 의해 코딩되는 글루타티온 리덕타아제의 활성이 결핍되고;
    iv) 상기 균주는 돌연변이된 AhpC 단백질을 발현하고, 상기 돌연변이된 AhpC 단백질은 글루타티온 리덕타아제 활성을 가지며; 및,
    v) 상기 균주는 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제(cytosolic prokaryotic disulfide isomerase)를 발현하는 것인 대장균 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 목적 단백질(protein of interest)을 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인 대장균 균주.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체, 그의 단편, 또는 IgG로부터의 항체 경쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 대장균 균주.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제는 DsbC인 것인 대장균 균주.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 재조합 프롤릴 이소머라아제 및/또는 응집 분해효소(deaggregase)를 더 발현하는 것인 대장균 균주.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 프롤릴 이소머라아제는 시클로필린(cyclophilin), FKBP, 파르불린(parvulin), SlyD, Tig 및 yCpr6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    상기 응집 분해효소는 Skp, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, 및 GrpE로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 대장균 균주.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 대장균 균주.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 T7 프로모터인 것인 대장균 균주.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 돌연변이된 ahpC 유전자의 발현은 Pc0 프로모터에 의해 제어되는 것인 대장균 균주.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제의 발현은 MTL 프로모터에 의해 제어되는 것인 대장균 균주.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균 균주는 K-12 균주인 것인 대장균 균주.
  12. 대장균 균주에서 가용성, 재조합 목적 단백질을 발현시키는 방법으로서:
    a. 산화성 세포질 및 목적 단백질의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 대장균 균주를 상기 목적 단백질을 가용성 단백질로서 발현할 수 있게 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 균주는:
    i) 티오레독신 리덕타아제의 활성이 결핍되고;
    ii) 티오레독신 1의 활성이 결핍되며;
    iii)　gor에 의해 코딩되는 글루타티온 리덕타아제의 활성이 결핍되고;
    iv) ahpC 유전자로부터 발현된 효소가 글루타티온 리덕타아제 활성을 갖도록 돌연변이된 ahpC 유전자를 발현하며; 및,
    v) 세포질 원핵성 디술피드 이소머라아제를 코딩하는 유전자를 발현하는 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 대장균 균주는 trxC에 널(null) 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 대장균 균주는 trxB에 널 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 대장균 균주는 trxA에 널 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 12에 있어서, 상기 목적 단백질은 IgG, IgG의 경쇄 또는 IgG의 중쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 청구항 12에 있어서, 상기 세포질 디술피드 이소머라아제는 DsbC 또는 yPDI(yeast protein disulfide isomerase)인 것인 방법.
  18. 청구항 12에 있어서, 상기 대장균 균주는 재조합 프롤릴 이소머라아제 및/또는 재조합 응집 분해효소를 더 발현하는 것인 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 재조합 프롤릴 이소머라아제는 시클로필린, FKBP, 파르불린, SlyD, Tig 및 yCpr6으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    상기 응집 분해효소는 Skp, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, 및 GrpE로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 청구항 12에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 T7 프로모터인 것인 방법.
  22. 청구항 16에 있어서, 상기 항체 경쇄는 항-HER2 항체의 경쇄인 것인 방법.
  23. 청구항 12에 있어서, 상기 대장균 균주는 gshA 유전자에 의해 코딩된 GshA 단백질을 발현하는 것인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 gshA 유전자는 TrxB의 유전자좌에 삽입되는 것인 방법.
  25. 청구항 12에 있어서, 상기 대장균 균주는 T7 폴리머라아제를 더 발현하는 것인 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 T7 폴리머라아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 ParaBAD, lac, lacUV5 phoA, tetA, xylAB, tac, 또는 람노오스 프로모터인 것인 방법.
  28. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 대장균을 포함하는 키트로서, 상기 키트는 증식 배지를 더 포함하는 것인 키트.
  29. 청구항 27에 있어서, 상기 키트는 목적 단백질을 코딩하는 플라스미드를 더 포함하는 것인 키트.
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