CN112391373A - 一种高产γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ1及其基因和应用 - Google Patents

一种高产γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ1及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高产γ‑氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ1及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，本发明的谷氨酸脱羧酶的具有以下性质：最适pH 5.0，最适温度40℃。在37℃下反应2小时，含有谷氨酸脱羧酶GADZ1的大肠杆菌细胞可以将1 M的l‑谷氨酸全部转化成γ‑氨基丁酸，转化率为100%。

Description

一种高产γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ1及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高产γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ1及其基因和应用。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)于1949年首次在植物中被发现，次年富兰克林等在哺乳动物的大脑中发现了GABA（Frankel et al., 1950）。由此，GABA作为一种抑制性神经递质逐渐进入大家的视野。GABA通过增加氧气供应，激活脑血流量来促进脑细胞的新陈代谢，并通过作用于延髓的血管舒缩中心来抑制血管加压素的分泌。除了具有利尿、抗抑郁和抗氧化作用外，它还调节生长激素的分泌，通过扩张血管来降低血压。除大脑外，GABA在胰腺产胰岛素的β细胞中也有较高水平的分泌。GABA可以与胰岛α细胞相邻的胰岛受体结合并抑制胰高血糖素的分泌。它还可以刺激β细胞的复制和存活，并且还有助于将α细胞转化为β细胞，由此引发了一种新的糖尿病治疗方法。因此GABA在医药领域得到越来越多的关注。此外，GABA可减少畜禽动物的活动量、促进其生长，还可以作为一种新型饲料添加剂应用于畜牧业。
生物组织中，GABA的浓度非常低，很难从天然生物中提取获得。因此，在过去的二十年中，研究人员转向化学和生物领域，并取得了不错的成绩。因为化学合成方法存在腐蚀性反应物的弊端，所以生物学方法在GABA研究中得到了重视。微生物发酵转化率高，使用方便，被认为是生产GABA的有效方法。谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)依赖于磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate，PLP)，可以将l-谷氨酸或谷氨酸盐催化脱羧生成GABA，并释放出CO2。利用微生物中的GAD生物转化生产GABA不受资源、环境和空间等因素的限制，具有显著的优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的谷氨酸脱羧酶。
本发明的再一目的是提供编码上述谷氨酸脱羧酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述谷氨酸脱羧酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述谷氨酸脱羧酶的应用。
本发明从芽孢杆菌中分离得到一种谷氨酸脱羧酶GADZ1，其氨基酸序列如SEQ IDNO: 1所示。该酶包括489个氨基酸，不含信号肽序列。
本发明提供了编码上述谷氨酸脱羧酶的基因gadz1，具体地，该基因的基因组序列如 SEQ ID NO: 2所示。
本发明还提供了包含上述谷氨酸脱羧酶GADZ1编码基因的重组载体，优选为pET28a-gadz1。
本发明还提供了包含上述谷氨酸脱羧酶GADZ1编码基因的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组表达质粒转化至大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/gadz1。
本发明还提供了一种制备谷氨酸脱羧酶GADZ1的方法，包括以下步骤：
1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2）培养重组菌株，诱导重组谷氨酸脱羧酶表达；
3）回收并纯化所表达的谷氨酸脱羧酶GADZ1。
本发明还提供了上述谷氨酸脱羧酶GADZ1的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品工业中应用的新型谷氨酸脱羧酶。本发明获得一种谷氨酸脱羧酶GADZ1，最适温度40℃，最适pH 5.0。这些性质符合畜禽动物消化生理特点，能提高饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染。
此谷氨酸脱羧酶的理论分子量为55.4 kDa。该谷氨酸脱羧酶GADZ1的最适pH为5.0，在pH 4.0-5.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60%以上。谷氨酸脱羧酶在pH4.0-5.5之间均很稳定。利用大肠杆菌异源表达并纯化后，比活为56.7 U/mg。
本发明还提供了编码上述谷氨酸脱羧酶GADZ1的基因gadz1。
本发明通过PCR的方法分离克隆了这一谷氨酸脱羧酶基因gadz1，DNA全序列分析结果表明，谷氨酸脱羧酶GADZ1结构基因gadz1全长1470bp，编码489个氨基酸和一个终止密码子，无信号肽序列。蛋白理论分子量为55.4 kDa，等电点为5.24。在GenBank数据库中的比对结果表明GADZ1是一个新的谷氨酸脱羧酶。
本发明还提供了包含上述谷氨酸脱羧酶基因的重组载体，优选为pET28a-gadz1。将本发明的谷氨酸脱羧酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将谷氨酸脱羧酶基因插入到质粒pET28a(+)上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET28a- gadz1。
本发明还提供了上述谷氨酸脱羧酶的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品工业中应用的新型谷氨酸脱羧酶。谷氨酸脱羧酶在室温有较高的活性，因其不需要外加能量供酶促反应，所以在工业和农业上的应用可以节省大量的能源。本发明的谷氨酸脱羧酶最适pH为5.0，在pH4～5都有较高的酶活性。因此本发明的谷氨酸脱羧酶可作为饲料添加剂使用，减少畜禽活动量，减少应激反应，从而促进生长。与序列一致性较高的谷氨酸脱羧酶GADZ20相比，酶活显著增加。
附图说明
图1显示在大肠杆菌中表达的重组谷氨酸脱羧酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：诱导的含有空载体的大肠杆菌培养上清液；2：诱导的含有谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌培养上清液浓缩液；3：通过镍柱纯化的达到电泳纯的GADZ1蛋白。
图2显示重组谷氨酸脱羧酶的最适pH。
图3显示重组谷氨酸脱羧酶的最适温度。
图4显示l-Glu转化成γ-氨基丁酸的转化率试验。
图5显示GADZ1与GADZ20氨基酸序列比对图。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株Escherichia coli BL21 (DE3)购自于南京诺唯赞生物科技有限公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。γ-氨基丁酸、磷酸吡哆醛（PLP）购自Sigma公司，其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
3、培养基：
（1）LB培养基（g/l）：酵母粉 5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH7.0。
（2）平板筛选培养基（g/l）：酵母粉 5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂15.0，pH7.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 芽孢杆菌Z1的基因组DNA提取
枯草芽孢杆菌Z1在LB培养基中30 ℃过夜培养后，在12,000 ×g高速离心2分钟以收集菌体，然后将离心得到的沉淀按照天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提供的方法进行基因组DNA的提取。
实施例2 枯草芽孢杆菌Z1来源的谷氨酸脱羧酶编码基因gadz1的克隆
根据序列设计合成了扩增引物EcoRI F/NotI R：
EcoRI F：（SEQ ID NO: 3）;
NotI R：（SEQ ID NO:4）。
以上述的基因组总DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为：95℃变性5 min；95℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸5 min，25个循环，4℃保温10 min。得到一约1500 bp片段，将该片段回收后与pET28a(+)载体相连送测序。通过序列拼接获得该片段的完整序列，全序列共长1470 bp，编码489个氨基酸和一个终止密码子。gadz1编码蛋白预计分子量为55.4kDa，等电点为5.24。
实施例3 重组谷氨酸脱羧酶的制备。
将表达载体pET28a(+)进行双酶切 (EcoRI+NotI)，同时将编码谷氨酸脱羧酶的基因gadz1双酶切（EcoRI+NotI），酶切好的谷氨酸脱羧酶基因片段与表达载体pET28a(+)连接，获得含有谷氨酸脱羧酶基因gadz1的重组质粒pET28a-gadz1并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/gadz1。
取含有重组质粒的BL21菌株，接种于40 mL LB(50 µg/mL的卡那酶素)培养液中，37℃培养过夜。按1%的接种量接菌于400 mL LB(含有50 µg/mL的卡那酶素)培养基，于37℃振荡培养约2~3 h后(OD600达到0.6)，加入终浓度0.5 mM的诱导剂IPTG。在16℃震荡培养16h后，于8000 rpm离心15 min，收集菌体，并选用20 mM Tris-HCl（含0.5 M NaCl）缓冲液重悬菌体，置于冰上后，以50%的功率超声破碎2小时，12000 rpm离心10 min，收集上清。谷氨酸脱羧酶的活力采用HPLC法测定。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组谷氨酸脱羧酶在大肠杆菌中得到了表达。所表达的谷氨酸脱羧酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。
实施例4 重组谷氨酸脱羧酶的活性分析、性质测定
HPLC法：具体方法如下：在pH 5.0，40℃条件下，1 mL的反应体系包括50 μL酶液，500 μL 底物l-Glu（0.1 M），400 μL 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（0.2 M），50 μL PLP（0.4 mM）。反应30 min，加入1 mL 80%的乙醇终止反应。样品离心后取500 µL，加100 µL的NaHCO3（40 g/L）和200 µL的4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯（DABS-Cl，1 g/L）乙腈溶液，然后70℃衍生20min，0 .02μm孔径的滤膜过滤后，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：岛津液相色谱仪，测定条件包括：Agilent Zorbax SB-Aq柱(5×150mm)；检测波长436nm；流动相A＝乙腈，B＝50 mM的乙酸钠溶液；流速＝1mL/min。梯度洗脱条件：35％的乙腈，65％的50 mM的乙酸钠溶液；进样量10μL。
1、重组谷氨酸脱羧酶GADZ1的最适pH的测定方法如下:
将实施例3纯化的重组谷氨酸脱羧酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物l-Glu用不同pH的0.1 M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中40℃下进行谷氨酸脱羧酶活力测定。结果(图2)表明，GADZ1的最适pH为5.0, 在pH 4.0～5.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60%以上。
2、谷氨酸脱羧酶的最适温度测定方法如下:
谷氨酸脱羧酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为谷氨酸脱羧酶在不同温度下处理不同时间，再在40℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明, 其最适温度为40℃。重组酶在30-45℃时稳定性较好。
3、谷氨酸脱羧酶的K m值测定方法如下:
用不同浓度的l-Glu为底物，在pH 5.0的l-Glu和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的混合体系中, 在40℃下测定酶活性，计算出K m值。经测定，GADZ1对l-Glu底物在40℃的动力学常数如表1所示。
表1. 谷氨酸脱羧酶GADZ1的动力学常数
Figure 470100DEST_PATH_IMAGE001
4、转化率试验
如图4所示，将携带基因gadz1的大肠杆菌菌株在16℃下诱导培养16 h后，在8000×g下离心10min，然后在水中以l-Glu为底物，在适当浓度下再悬浮。细胞密度用OD600值表示。反应混合物在37℃下孵育产生GABA。经测定在OD600 20的细胞浓度下，含GADZ1的工程菌可以在2小时内将1 M的l-Glu全部转化成γ-氨基丁酸，转化率达到100%。
实施例5 重组谷氨酸脱羧酶GADZ20的性质测定
谷氨酸脱羧酶GADZ20，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。如图5所示，与本发明的谷氨酸脱羧酶GADZ1的氨基酸序列一致性为96.52%，近20个氨基酸的差显著影响了两种谷氨酸脱羧酶的性质。
所述谷氨酸脱羧酶GADZ20的最适pH为5.0，在pH4.0-5.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60%以上。然而，利用大肠杆菌异源表达并纯化后，比活为13.5 U/mg，显著低于本发明的谷氨酸脱羧酶GADZ1的比活56.7 U/mg。
谷氨酸脱羧酶GADZ20的的K m 值测定方法如下:
用不同浓度的l-Glu为底物，在pH5.0的l-Glu和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的混合体系中, 在40℃下测定酶活性，计算出K m值。经测定，GADZ20对l-Glu底物在40℃的动力学常数如表2所示。
表2. 谷氨酸脱羧酶GADZ20的动力学常数
Figure 292562DEST_PATH_IMAGE002
由此可见，谷氨酸脱羧酶GADZ1与谷氨酸脱羧酶GADZ20与底物的结合特性差异显著。尽管谷氨酸脱羧酶GADZ1的K m值是谷氨酸脱羧酶GADZ20的3.4倍，意味着谷氨酸脱羧酶GADZ20与底物l-Glu的亲和力较谷氨酸脱羧酶GADZ1强，但谷氨酸脱羧酶GADZ1的k cat值是谷氨酸脱羧酶GADZ20的15.4倍，即单位时间内每个谷氨酸脱羧酶GADZ1分子催化底物l-Glu转变为产物GABA的速率是谷氨酸脱羧酶GADZ20的15.4倍，说明二者之间的差异氨基酸位点对谷氨酸脱羧酶GADZ1的高催化活力起到了关键作用，具体表征在谷氨酸脱羧酶GADZ1的酶催化效率（k cat/K m值）是谷氨酸脱羧酶GADZ20的4倍，证明谷氨酸脱羧酶GADZ1催化底物的能力远大于谷氨酸脱羧酶GADZ20。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种高产γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ1及其基因和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 489
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus)
<400> 1
Met Ser Lys Asp Arg Lys Ala Gly Thr Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Gly
1 5 10 15
Lys Glu Ile Lys Pro Asp Gln Gln Gln Arg Leu Pro His His Met Glu
20 25 30
Met Glu Leu Pro His Glu Leu Ser Ile Asn Pro Leu Phe Ala Arg Glu
35 40 45
Gly Glu Ser Thr Val Pro Arg Phe His Leu Ala Asp Val Gly Met Leu
50 55 60
Pro Glu Thr Ala Tyr Gln Ile Val His Asp Glu Ile Thr Leu Asp Gly
65 70 75 80
Asn Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Val Ser Thr Trp Met Glu Pro
85 90 95
Ala Ala Glu Arg Leu Tyr Thr Gln Ser Phe Asp Lys Asn Met Ile Asp
100 105 110
Lys Asp Glu Tyr Pro Gln Thr Ala Gln Ile Glu Glu Arg Cys Val Arg
115 120 125
Ile Leu Ala Asp Leu Trp His Ser Pro Glu Pro Leu Lys Thr Met Gly
130 135 140
Val Ser Thr Thr Gly Ser Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala
145 150 155 160
Leu Lys Arg Arg Trp Gln Asn Ala Arg Lys Lys Glu Gly Lys Pro Val
165 170 175
Asp Arg Pro Asn Ile Val Phe Ser Ser Ala Val Gln Val Val Trp Glu
180 185 190
Lys Phe Ala Asn Tyr Trp Glu Val Glu Pro Arg Tyr Val Lys Val Thr
195 200 205
Pro Glu His Pro Gln Leu Asn Pro Glu Gly Val Leu Ala Ala Val Asp
210 215 220
Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Ala Ile Leu Gly Glu Thr Tyr Thr Gly
225 230 235 240
Leu Tyr Glu Pro Ile Ala Ala Ile Ala Lys Ala Leu Asp Asp Leu Gln
245 250 255
Glu Lys Ser Gly Leu Asn Ile Pro Leu His Val Asp Ala Ala Ser Gly
260 265 270
Gly Phe Ile Ala Pro Phe Leu Gln Pro Asp Leu Val Trp Asp Phe Gln
275 280 285
Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu
290 295 300
Val Tyr Pro Gly Leu Gly Trp Ile Ile Trp Arg Glu Ala Lys Asp Leu
305 310 315 320
Pro Glu Glu Leu Ile Phe Arg Val Ser Tyr Leu Gly Gly Asn Met Pro
325 330 335
Thr Phe Ala Leu Asn Phe Ser Arg Pro Gly Ala Gln Val Leu Leu Gln
340 345 350
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Arg Leu Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Glu Val Gln
355 360 365
Lys Ala Ser Gln Asn Val Ala Leu Phe Leu Ser Lys Glu Ile Gln Asn
370 375 380
Met Gly Pro Phe Glu Leu Leu Ser Asp Gly Ser Asp Ile Pro Val Phe
385 390 395 400
Ala Trp Arg Leu Arg Asp Asp Ala Thr Ser His Trp Thr Leu Phe Asp
405 410 415
Leu Ser Arg Gln Met Arg Val Phe Gly Trp Gln Val Pro Ala Tyr Pro
420 425 430
Leu Pro Pro Asp Met Glu Thr Val Thr Ile Met Arg Val Val Val Arg
435 440 445
Asn Gly Phe Ser Met Asp Leu Ala His Leu Phe Leu Val Asn Leu Lys
450 455 460
Gln Ala Val Ala Phe Leu Asp Thr Leu Asp Ala Pro Met Pro His Asp
465 470 475 480
Thr Lys Tyr Asp Asn Gly Phe His His
485
<210> 2
<211> 1470
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus)
<400> 2
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gcttggcgac tgagagatga tgccacatcc cattggacgc tatttgattt atccagacaa 1260
atgcgtgtgt tcggctggca ggtccccgcc tatccattgc ctcctgacat ggaaacggtg 1320
acgataatgc gggtggtggt ccggaatggt ttctccatgg accttgccca tttatttttg 1380
gtgaacctca aacaggccgt tgcttttctc gatactctgg acgcacctat gccacatgat 1440
acgaagtatg ataatgggtt tcatcattag 1470
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgaattcat gtccaaggat cgaaaagcag 30
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcgccggcg aagcggccgc ctaatgatga aacccatt 38
<210> 5
<211> 489
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus)
<400> 5
Met Ser Lys Asp Arg Lys Ala Asp Arg Gln Asn Asp Thr Tyr Gly Gly
1 5 10 15
Lys Glu Ile Lys Pro Asp Gln Gln Gln Arg Leu Pro His Leu Met Glu
20 25 30
Met Glu Leu Pro His Glu Leu Ser Ile Asn Pro Leu Phe Ala Arg Glu
35 40 45
Gly Glu Ser Thr Val Pro Arg Phe His Leu Ala Asp Gly Gly Met Leu
50 55 60
Pro Glu Thr Ala Tyr Gln Ile Val His Asp Glu Ile Thr Leu Asp Gly
65 70 75 80
Asn Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Val Ser Thr Trp Met Glu Pro
85 90 95
Ser Ala Glu Arg Leu Tyr Ala Gln Ser Phe Asp Lys Asn Met Ile Asp
100 105 110
Lys Asp Glu Tyr Pro Gln Thr Ala Gln Ile Glu Glu Arg Cys Val Arg
115 120 125
Ile Leu Ala Asp Leu Trp His Ser Pro Glu Pro Leu Lys Thr Met Gly
130 135 140
Val Ser Thr Thr Gly Ser Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala
145 150 155 160
Leu Lys Arg Arg Trp Gln Asn Ala Arg Lys Lys Glu Gly Lys Pro Thr
165 170 175
Asp Arg Pro Asn Ile Val Phe Ser Ser Ala Val Gln Val Val Trp Glu
180 185 190
Lys Phe Ala Asn Tyr Trp Glu Val Glu Pro Arg Tyr Val Lys Val Thr
195 200 205
His Glu His Pro Gln Leu Asn Pro Glu Gly Val Leu Ala Ala Val Asp
210 215 220
Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Ala Ile Leu Gly Glu Thr Tyr Thr Gly
225 230 235 240
Leu Tyr Glu Pro Ile Val Ser Ile Ala Lys Ala Leu Asp Asp Leu Gln
245 250 255
Glu Lys Ser Gly Leu Asn Ile Pro Met His Val Asp Ala Ala Ser Gly
260 265 270
Gly Phe Ile Ala Pro Phe Leu Gln Pro Asp Leu Val Trp Asp Phe Gln
275 280 285
Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu
290 295 300
Val Tyr Pro Gly Leu Gly Trp Ile Ile Trp Arg Glu Ala Lys Asp Leu
305 310 315 320
Pro Glu Glu Leu Ile Phe Arg Val Ser Tyr Leu Gly Gly Asn Met Pro
325 330 335
Thr Phe Ala Leu Asn Phe Ser Arg Pro Gly Ala Gln Val Leu Leu Gln
340 345 350
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Arg Leu Gly Lys Glu Gly Tyr Phe Glu Val Gln
355 360 365
Lys Ala Ser Gln Asn Val Ala Leu Phe Leu Ser Lys Glu Ile Gln Asn
370 375 380
Met Gly Pro Phe Glu Leu Leu Ser Asp Gly Ser Asp Ile Pro Val Phe
385 390 395 400
Ala Trp Arg Leu Lys Glu Asp Asp Thr Ser His Trp Thr Leu Phe Asp
405 410 415
Leu Ser Arg Gln Met Arg Val Phe Gly Trp Gln Val Pro Ala Tyr Pro
420 425 430
Leu Pro Pro Asp Met Glu Thr Val Thr Ile Met Arg Val Val Val Arg
435 440 445
Asn Gly Phe Ser Met Asp Leu Ala His Leu Phe Leu Val Asn Leu Lys
450 455 460
Gln Ala Val Ala Phe Leu Asp Thr Leu Asp Ala Pro Met Pro His Asp
465 470 475 480
Thr Lys Tyr Asp Asn Gly Phe His His
485

Claims (9)

1.一种谷氨酸脱羧酶GADZ1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.一种谷氨酸脱羧酶基因gadz1，其特征在于，其编码权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶GADZ1。
3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶基因gadz1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：2。
4.包含权利要求2所述谷氨酸脱羧酶基因gadz1的重组载体。
5.包含权利要求2所述谷氨酸脱羧酶基因gadz1的重组菌株。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，其所述重组菌株为重组大肠杆菌、重组酵母菌、重组芽孢杆菌或重组乳酸杆菌。
7.权利要求1所述谷氨酸脱羧酶GADZ1的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶GADZ1用作饲料添加剂。
9.一种生产谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
构建包含编码权利要求1所述谷氨酸脱羧酶GADZ1的基因的重组载体；
将上述获得的重组载体导入宿主细胞；
表达并回收谷氨酸脱羧酶。
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CN103305561A (zh) * 2012-03-15 2013-09-18 江苏纳克生物工程有限公司 一种利用微生物发酵法生产γ-氨基丁酸的方法
CN103409457A (zh) * 2013-05-23 2013-11-27 南京农业大学 一种新型枯草杆菌表达系统及产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌
CN111635898A (zh) * 2020-06-17 2020-09-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用

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GENPEPT: "NCBI Reference Sequence：WP_048014552.1", 《NCBI》 *
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