CN103409457A

CN103409457A - 一种新型枯草杆菌表达系统及产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌

Info

Publication number: CN103409457A
Application number: CN2013101971126A
Authority: CN
Inventors: 陆兆新; 张充; 吕凤霞; 别小妹; 陈琳
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-05-23
Also published as: CN103409457B

Abstract

本发明涉及一种新型枯草杆菌表达系统及产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌。一种新型枯草杆菌表达系统，包括基因工程菌株BS-T710与表达载体pBT-23a。一株产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB，是将来基因gadB插入至所述的表达载体pBT-23a，获得重组表达载体pBT-23a-gad，利用化学转化法，将pBT-23a-gad转化入所述的基因工程菌株BS-T710，获得所述的产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB。该系统可用于高效表达外源基因，并且只需使用一种诱导物。重组工程菌BS‐T710‐gadB细胞，能够将MSG高效地转化为γ‐GABA。

Description

一种新型枯草杆菌表达系统及产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及一种新型枯草杆菌表达系统及产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌。

背景技术

枯草杆菌（Busillus.subtilis）被公认为是安全菌株（GRAS），拥有一套高效的分泌信号及分子伴侣系统，可赋予其高效分泌目的蛋白的能力；同时，B.subtilis生长迅速、培养条件简单、遗传背景了解较清晰。B.subtilis具备开发为食品级高效表达系统的潜力。多种来源的外源基因在B.subtilis表达系统中的实现了表达，但是与大肠杆菌相比仍存在很大差距，表达效率过低仍是制约其发展的瓶颈。

存在该问题一个重要的原因是B.subtilis表达系统缺乏能够高效转录外源基因的启动子。启动子是外源基因发生转录过程的调控元件，是外源基因在B.subtilis实现表达的第一步，也是最为重要的一步。在提高外源基因在B.subtilis表达效率问题上，有关启动子方面的研究有不少报道。如组成型强启动子有淀粉酶基因启动子P_amyE和P43启动子，诱导型启动子如sacB启动子、IPTG诱导的来自于大肠杆菌lac操纵元的P_spac杂合启动子。此外，对天然启动子的改造的研究也有过报道。Lee等从Bacillus thuringiensis克隆到启动子cry3Aa，通过对该启动子-35区和-10定点突变改造，及两区间缩短一个碱基的距离获得突变启动子P52、P82、P92，分泌表达AprE蛋白酶能力分别较天然启动子提高了3.4、3.8和3.7倍。然而目前的启动外源基因转录的水平，仍达不到能够在生产实践中应用的要求。

T7噬菌体含有一套高效启动基因转录的启动子系统：T7RNA聚合酶和其专一性识别的T7启动子。T7元件构成的T7转录系统专一性高、反应速度快、效率高。通过对E.coli进行溶源性改造，使宿主能够产生T7RNA聚合酶，以及构建基于T7启动子构建表达载体，目前最为著名的pET系列载体就是以T7系统为核心。T7系统既然能够成功应用于E.coli中，为什么不能移植于B.subtilis呢？实际上已经有学者开始尝试这方面的研究了。然而他们的问题是，诱导过程中必须使用双元载体，而且需使用两种诱导物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种新型枯草杆菌表达系统。

本发明的另一目的是提供一种产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种新型枯草杆菌表达系统，包括基因工程菌株BS-T710与表达载体pBT-23a，所述的表达载体pBT-23a是将T7启动子基因插入枯草杆菌表达载体pHT43的KpnI/XbaI酶切位点间所得；所述的基因工程菌株BS-T710通过如下方法构建：

（1）将启动子Pgrac，T7RNA聚合酶基因T7plo，及枯草杆菌色氨酸终止子Ter融合，构成T7pol的完整表达元件，并将T7pol的完整表达元件插入枯草杆菌整合载体pDG1730的EcoRI酶切位点，得到T7RNA聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol；

（2）将T7RNA聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol转化入枯草杆菌168菌株得到基因工程菌株BS-T710。

所述的启动子Pgrac优选以SEQ ID NO.3所示的P3和以SEQ ID NO.4所示的P4为引物，以pHT01质粒为模板PCR扩增获得。

所述的T7RNA聚合酶基因T7plo优选以SEQ ID NO.1所示的P1和以SEQ ID NO.2所示的P2为引物，以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS基因组DNA为模板PCR扩增获得。

所述的T7pol的完整表达元件优选以所述的T7RNA聚合酶基因T7plo和启动子Pgrac为模板，以SEQ ID NO.3所示的P3，SEQ ID NO.5所示的P5，SEQ ID NO.6所示的P6，SEQ IDNO.7所示的P7为引物，利用重叠延伸PCR将启动子Pgrac，基因T7plo，及枯草杆菌色氨酸终止子Ter融合，构成T7pol的完整表达元件。

本发明所述的新型枯草杆菌表达系统在高效表达外源基因中的应用。

一株产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB，将来源于Streptococcus thermophilus Y2的谷氨酸脱羧酶基因gadB插入至所述的表达载体pBT-23a，获得重组表达载体pBT-23a-gad，利用化学转化法，将pBT-23a-gad转化入所述的基因工程菌株BS-T710，获得所述的产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB。

所述的基因工程菌BS-T710-gadB在制备重组谷氨酸脱羧酶中的应用。

所述的基因工程菌BS-T710-gadB在细胞转化谷氨酸钠获得γ-氨基丁酸中的应用。

有益效果：

本发明针对现有技术的在的不足，以枯草杆菌168为出发菌株，通过同源整合的方式将T7RNA聚合酶表达元件整合至宿主基因组获得基因工程菌BS-T710，其中T7RNA聚合酶的表达受乳糖的诱导。同时本发明还构建携带T7启动子的枯草杆菌表达载体pBT-23a，也受乳糖的调控。BS-T710宿主菌与表达载体pBT-23a构成本发明中的新型枯草杆菌表达系统。该系统可用于高效表达外源基因，并且只需使用一种诱导物。同时本发明将来源于的Streptococcus thermophilus Y2的谷氨酸脱羧酶基因在建立的枯草杆菌表达系统中进行了表达，并提供了工程菌细胞转化获得γ-氨基丁酸的方法。

附图说明

图1本发明总体技术方案；

图2T7RNA聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol的构建；

图3BS-T710突变菌株的PCR扩增T7RNA聚合酶电泳检测图；

1.Maker;2，5为BS-T710模板扩增T7plo基因；3，4为枯草杆菌168模板扩增T7plo基因。图4pBT-23a表达载体的构建；

图5重组BS-T710(pBT-23a-gadB)工程菌PCR验证；

1-6以工程菌基因组为模板扩增T7pol基因；7-12扩增gadB基因；13.Maker。

图6γ-氨基丁酸的HPLC检测图。

具体实施方式

实施例1

（1）T7RNA聚合酶整合表达载体的构建

构建路线见图2。

1.大肠杆菌BL21(DE3)pLysS（购自Novagen公司）基因组DNA为模板以P1（SEQ ID NO.1）和P2（SEQ ID NO.2）为引物PCR扩增T7RNA聚合酶基因T7plo；

T7plo通过下述反应体系和反应程序获得：

PCR程序为94℃2min；30×(94℃45s;58℃50s；72℃4min)；72℃10min。

2.以P3（SEQ ID NO.3）和P4（SEQ ID NO.4）为引物，以pHT01质粒（购自Mo Bi Tec公司）为模板，PCR扩增启动子Pgrac基因（Pgrac是受乳糖诱导表达启动子，包含枯草杆菌groE启动子序列，lacO操纵区，以及gsiB SD序列）；

Pgrac基因通过下述反应体系和反应程序获得：

PCR程序为94℃2min；30×(94℃45s;58℃50s；72℃4min)；72℃10min。

3.以扩增获得的T7plo和Pgrac为模板，以P3（SEQ ID NO.3），P5（SEQ ID NO.5），P6（SEQ ID NO.6），P7（SEQ ID NO.7）为引物，利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术，将启动子Pgrac，基因T7plo，及枯草杆菌色氨酸终止子（Ter）融合，构成T7pol的完整表达元件；

T7pol的完整表达元件通过下述反应体系和反应程序获得：

PCR程序为94℃2min；30×(94℃45s;58℃50s；72℃4min)；72℃10min。

4.对T7表达元件、枯草杆菌整合载体pDG1730（购自BGSC）进行EcoRI酶切处理，用 T4连接酶连接酶切产物，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选重组子，试剂盒（上海生工）提取质粒，获得T7RNA聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol。

（2）BS-T710突变菌株的构建

采用电转化法将载体pDG1730-T7pol转化入枯草杆菌168菌株（购自BGSC）。电转化方法如下：

1、枯草杆菌168感受态细胞的准备：

过夜培养枯草杆菌168菌体，稀释16倍置于生长培养基（LB含有0.5M的山梨醇），37℃培养至OD600为0.85-0.95，将菌体细胞在冰水中冷冻10分钟。4℃5000ⅹG离心5分钟收集菌体细胞，在冰冷的电转化液中洗四次。（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%的甘油）。用培养量的1/40电转化液重新悬浮菌体细胞。使细胞浓度达到1-1.3ⅹ1010cfu/ml；

2、转化：

在60μL枯草杆菌168感受态细胞中加如1μL（50ng克/μL）DNA，转移到电转杯中（1mm的电击杯），保温1-1.5分钟，加电压25μF、200Ω。时间4.5-5.0ms。释放电压后，立即象转化过的细胞中加入1mL恢复培养基（LB含0.5M山梨醇、0.38M甘露醇），37℃恢复培养3h后，涂布壮观霉素（spc，100μg/ml）选择培养基平板，37℃过夜培养。

3、BS-T710菌株鉴定方法

挑取选择培养基平板上长出的单菌落，在含spc（100μg/ml）的液体LB培养基中37℃培养14－16h，离心收集菌体，得基因工程菌BS-T710。试剂盒（上海生工）提取工程菌BS-T710基因组。以P3，P7为引物，以提取获得的基因组为模板进行PCR。琼脂糖凝胶电泳检测，BS-T710基因组为模板可扩增获得2700bp左右基因（T7pol表达元件），而未发生整合的菌株基因组模板的PCR反应，电泳无此条带的出现。（见图3）

（3）pBT-23a表达载体的构建

构建路线见图4。

1.以P8（SEQ ID NO.8）和P9（SEQ ID NO.9）为引物，大肠杆菌表达载体pET-23a（购自Novagen公司）为模板，PCR扩增T7启动子基因（T7promoter）；

2.对T7promoter、枯草杆菌表达载体pHT43（购自Mo Bi Tec公司）分别进行KpnI/XbaI双酶切处理，用T4连接酶连接酶切产物，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α（购自Novagen公司），挑选重组子，试剂盒（上海生工）提取质粒，获得T7RNA聚合酶整合表达载体pBT-23a。

（4）谷氨酸脱羧酶基因重组工程菌的构建

根据谷氨酸脱羧酶基因序列（Genebank No.DQ871217），委托南京金斯瑞公司合成该基因（gadB）。通过BamHI酶切位点与载体pBT-23a连接，转化大肠杆菌DH5α。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序，测序正确的质粒命名为pBT-23a-gadB。

将含有gadB基因的表达质粒pBT-23a-gadB电转化宿主菌株BS-T710，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氯霉素（10μg/ml）的100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加乳糖(终浓度100μg/ml)诱导，6小时后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，经以(NH₄)₂SO₄分级沉淀，以及DEAE–Sephacel、Sephadex G–100、Ni-NTA agarose柱层析技术，对重组谷氨酸脱羧酶进行分离纯化定谷氨酸脱羧酶酶活，纯化结果见表1。

表1重组谷氨酸脱羧酶分离纯化表

Figure 2013101971126100002DEST_PATH_IMAGE001

（5）谷氨酸脱羧酶酶活测定方法

1.GABA含量的测定方法

GABA含量的测定采用高效液相色谱法。

采用HPLC法，色谱条件如下:

色谱柱:C18柱;进样量:10μL;紫外检测波长:254nln;柱温:25℃;

流动相A:甲醇,流动相B:四氢呋喃:甲醇:0.05M，pH6.2醋酸钠溶液(v:v:v)=5:75:420

衍生化条件:采用丹磺酞氯(DNS-Cl)衍生化

样品预处理:取样品10μL，190μL碳酸氢钠缓冲溶液，混匀，再加入200μL DNS-Cl丙酮(4g/L)溶液，避光，37℃保存lh，检测。

梯度洗脱程序如表2：

表2

2.谷氨酸脱羧酶酶活测定方法

重组谷氨酸脱羧酶液与1mL150mmol/LMSG溶液（溶于pH4.5的1.5mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液）混合，于40℃恒温反应30min，立即加入－20℃预冷的无水乙醇8mL，再在4℃、8000×g离心15min，收集上清液，按照上述方法测定GABA含量。

GAD活力单位定义：在上述测定条件下1h生成1μmol GABA所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。

（6）谷氨酸脱羧酶基因重组工程菌细胞转化生产γ-氨基丁酸

1.工程菌种子液接种于含有氯霉素（10μg/ml）的100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加乳糖(终浓度100μg/ml)诱导，6小时后离心收集菌体。

2.用9g/L NaCl溶液洗涤菌体3次，离心条件1000rmp，5min。将洗涤好的细胞用含15％甘油的9g/L NaCl溶解，菌体浓度约10mg/mL，于-20℃冰箱中保存备用。

3.反应转化液：150mmol/L MSG（谷氨酸钠），1.5mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，pH4.5。反应转化液中加入5～10g/L菌体细胞，进行细胞转化反应。

4.转化反应条件：37℃，180rpm振荡反应4-6小时

5.转化产物γ-氨基丁酸的检测：转化反应结束后，离心收集上清液，离心条件，10000rpm，10min。上清液进行衍生，用HPLC进行检测。

检测结果见图6的HPLC图，反应液样品在28min左右未出现峰；反应液加入GABA的样品，在28min左右未出现峰；宿主菌BS-T710细胞转化液样品，在28min左右未出现峰；转入pBT-23a-gadB的工程菌细胞的样品，在28min左右出现特征峰。证明工程菌细胞可以转化MSG产生GABA，工程菌细胞转化谷氨酸钠生成GABA的能力为320-350μM/h×g细胞。

本发明中所述的启动子Pgrac，T7RNA聚合酶基因T7plo，及枯草杆菌色氨酸终止子Ter均是已知基因，除了通过PCR获得外，还可以通过化学合成的方式获得。

Claims

1.一种新型枯草杆菌表达系统，其特征在于包括基因工程菌株BS-T710与表达载体pBT-23a，所述的表达载体pBT-23a是将T7启动子基因插入枯草杆菌表达载体pHT43的KpnI/XbaI酶切位点间所得；所述的基因工程菌株BS-T710通过如下方法构建：

（1）将Pgrac基因，T7RNA聚合酶基因T7plo，及枯草杆菌色氨酸终止子Ter融合，构成T7pol的完整表达元件，并将T7pol的完整表达元件插入到枯草杆菌整合载体pDG1730的EcoRI酶切位点，得到T7RNA聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol；

2.根据权利要求1所述的新型枯草杆菌表达系统，其特征在于所述的Pgrac基因是以SEQ IDNO.3所示的P3和以SEQ ID NO.4所示的P4为引物，以pHT01质粒为模板PCR扩增获得；所述的T7RNA聚合酶基因T7plo是以SEQ ID NO.1所示的P1和以SEQ ID NO.2所示的P2为引物，以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS基因组DNA为模板PCR扩增获得；所述的T7pol的完整表达元件是以所述的T7RNA聚合酶基因T7plo和Pgrac基因为模板，以SEQ ID NO.3所示的P3，SEQ ID NO.5所示的P5，SEQ ID NO.6所示的P6，SEQ ID NO.7所示的P7为引物，利用重叠延伸PCR将Pgrac基因，基因T7plo，及枯草杆菌色氨酸终止子Ter融合，构成T7pol的完整表达元件。

3.根据权利要求2所述的新型枯草杆菌表达系统，其特征在于所述的Pgrac基因通过下述反应体系和反应程序获得：

PCR程序为94℃2min；30×(94℃45s;58℃50s；72℃4min)；72℃10min；

所述的T7RNA聚合酶基因T7plo通过下述反应体系和反应程序获得：

PCR程序为94℃2min；30×(94℃45s;58℃50s；72℃4min)；72℃10min；

所述的T7pol的完整表达元件通过下述反应体系和反应程序获得：

PCR程序为94℃2min；30×(94℃45s;58℃50s；72℃4min)；72℃10min。

4.权利要求1所述的新型枯草杆菌表达系统在高效表达外源基因中的应用。

5.一株产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB，其特征在于将来源于Streptococcusthermophilus Y2的谷氨酸脱羧酶基因gadB插入至权利要求1中所述的表达载体pBT-23a，获得重组表达载体pBT-23a-gad，利用化学转化法，将pBT-23a-gad转化入权利要求1所述的基因工程菌株BS-T710，获得所述的产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB。

6.权利要求5所述的基因工程菌BS-T710-gadB在制备重组谷氨酸脱羧酶中的应用。

7.权利要求5所述的基因工程菌BS-T710-gadB在细胞转化谷氨酸钠获得γ-氨基丁酸中的应用。