CN106480031B - 芽孢杆菌表达启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了芽孢杆菌表达启动子及其应用，为以下任一序列：(a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)能与上述(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(c)对上述(a)所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基取代、缺失或添加修饰所获得的核苷酸序列；(d)与上述(a)所示核苷酸序列具有90％同源性的核苷酸序列。本发明的启动子具有很强的特异表达活性，在不需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达，为芽孢杆菌属表达外源基因提供了有效的启动子表达元件。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域。具体而言，涉及一种来源于解淀粉芽孢杆菌的启动子及其在大肠杆菌及芽孢杆菌中的表达应用。
背景技术
目前，世界绝大多数酶制剂都是用微生物发酵生产获得，这是由于微生物发酵生产具有成本低、产量高、操作简单和周期短等优良特点。随着分子生物学的发展和基因工程技术的进步，越来越多的外源蛋白都是经过基因工程的方法表达。随着不同属种微生物的深入研究，科研人员已开发了表达蛋白的大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、酵母表达系统和丝状真菌表达系统。其中芽孢表达系统表达外源基因与其它几个系统相比具有以下几个优点：(1)多数芽孢杆菌无致病性，被认为是安全微生物(GRAS)；(2)芽孢杆菌具有高效分泌蛋白的能力，且多数情况下分泌的重组蛋白具有其天然构象和生物活性；(3)芽孢杆菌培养条件简单，易于掌握发酵技术和成套的生产技术，并且其遗传背景清楚。目前利用芽孢杆菌表达自身或外源的酶制剂占据了世界工业酶制剂产品的50％左右的份额，具有巨大的经济价值。
进一步提高在芽孢杆菌中重组酶的高效生产能力的一个重要手段是要提高其蛋白表达水平，其中选择高效转录的启动子是提高芽孢杆菌高产重组酶的有效方法。启动子是基因表达的一个重要组成元件，位于结构基因5′端上游，是RNA聚合酶识别、结合和启动转录合成mRNA的一段DNA序列。启动子与RNA聚合酶的正确结合，启动基因转录、控制基因表达的起始时间和表达程度。因此启动子启动和表达效率是影响酶基因表达的关键。文献报道(Wolfgang Schumann.Production of Recombinant Proteins in Bacillussubtilis.Advance in Applied Microbiology[J].2007.)芽孢杆菌中的启动子种类繁多，有诱导型启动子，如Pspac、Pxyl、PcitM、PsacB、Ptet等；有与生长阶段相关的启动子，如rpsF基因启动子、aprE基因启动子；有自诱导启动子，如Ppst、PgsiB等。尽管有各种类型的启动子，然而各种启动子均有严格的调控条件，比如添加IPTG等昂贵的诱导剂来诱导启动子的表达。因此，很有必要获得一些组成型表达、高强度的启动子调控元件，能进一步简化和提高目的基因表达、目的蛋白的产量。所以挖掘和优化更多强启动子用于工业化生产中是非常必要的。
解淀粉芽孢杆菌是工业酶基因来源和表达常见的宿主，比如α-淀粉酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶等的生产(Marcus Schallme et al.Developments in the use ofBacillus species for industrial production.Canadian Journal of Microbiology[J].2004,50:1-17.)。文献报道(Weker N.K and Campbell L.L.Unrelatedness ofBacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis.Journal of Bacteriology[J].1967,94(4):1124-30.)解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌是同源性非常高的属种。而解淀粉芽孢杆菌的启动子的研究比其它芽孢杆菌属相对较少。因此，选择解淀粉芽孢杆菌作为启动子的筛选宿主挖掘芽孢杆菌内源性的强启动子将更有利于内源或外源蛋白在芽孢杆菌属的表达。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种来源于解淀粉芽孢杆菌的启动子，并加以改造，能运用于蛋白的表达。
该方法涉及运用启动子探针质粒捕抓解淀粉芽孢杆菌在对数生长后期基因组DNA表达基因的具有启动子活性的片段，筛选高表达的启动子。克隆所筛选的高表达耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)对应的启动子序列，通过测定bgaB的活性，证明筛选的启动子在解淀粉芽孢杆菌中具有高活性。应用于木聚糖酶(Xyn)的表达，通过SDS-PAGE电泳图验证其蛋白表达。
一种芽孢杆菌表达启动子，为以下任一序列：
(a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或者其互补序列；
(b)能与上述(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
(c)对上述(a)所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基取代、缺失
或添加修饰所获得的核苷酸序列；
(d)与上述(a)所示核苷酸序列具有90％同源性的核苷酸序列。
一种核酸片段，其上述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因来源相同或不同。
一种载体，所述载体包含上述的启动子或核酸片段。
一种质粒，为上述的启动子或核酸片段与启动子探针质粒pBE-bgaB经重组得到的质粒；所述启动子探针质粒有大肠杆菌和芽孢杆菌的复制子，是大肠杆菌-芽孢杆菌的穿梭质粒；有多克隆位点；有异源编码的耐热β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，序列来源为好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)。
一种重组细胞，所述重组细胞含有上述的启动子或核酸片段或载体或质粒，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。
筛选SEQ ID NO:1所示的启动子方法，包括以下步骤：
以解淀粉芽孢杆菌DNA为模板，通过权利要求4的启动子探针质粒进行启动子活性筛选，筛选启动子活性最高的权利要求5的重组细胞，提取重组细胞中的权利要求3的载体，分析其启动子活性片段，构建权利要求2的核酸片段，优化启动子元件，提高启动子活性，得到优化后的SEQ ID NO:1所示的启动子。优化启动子元件主要是指优化核糖体结合位点之间的信使RNA稳定文库，提高启动子调控效率。
一种启动子调控目的蛋白表达的方法，所述方法包括：将上述的启动子或核酸片段或载体导入宿主细胞。所述宿主细胞为芽孢杆菌，优选为解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。所得到的目的蛋白优选为蛋白酶，如β-半乳糖苷酶或木聚糖酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种启动子，具有很强的特异表达活性，在不需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达，为芽孢杆菌属表达外源基因提供了有效的启动子表达元件。
附图说明
图1是实施例1中用启动子探针质粒筛选生长对数后期的解淀粉芽孢杆菌的启动子(A：启动子探针质粒示意图；B：生长对数后期的解淀粉芽孢杆菌基因组DNA酶切产物电泳胶图；C：有活性启动子在大肠杆菌中的初筛结果)。
图2是实施例2中启动子在解淀粉芽孢杆菌中的复筛。
图3是实施例3中启动子的序列分析(a:启动子P41组成；b：启动子P41片段的启动子强度；c:启动子P41-3的DNA序列)。
图4是实施例4中优化启动子P41运用于耐热β-半乳糖苷酶和木聚糖的表达(a:β-Gal的SDS-PAGE检测；b:Xyn的SDS-PAGE检测；c:优化后的启动子序列)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段酶切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW,Janssen K,Argentine J.黄培堂等译,2002,北京：科学出版社)。
从一株解淀粉芽孢杆菌培养的生产对数后期提取细菌DNA。对细菌DNA进行酶切，酶切产物与启动子探针质粒混合、连接并转化至大肠杆菌宿主，根据平板上蓝白斑初步筛选有活性的启动子，通过测定启动子探针质粒内参基因耐热β-半乳糖苷酶的酶活精确筛选出强启动子。进一步将大肠杆菌筛选的强启动子在解淀粉芽孢杆菌宿主中进行复筛，获得能用于芽孢杆菌表达的得到的强启动子，并分析强启动子活性片段。同时，将所选的强启动子进行核糖体结合位点的优化改造，得到更高活性的启动子并用于木聚糖酶的表达。
实施例所用到的引物见表1。
表1
实施例1启动子探针质粒pBE-bgaB的构建：
以Geobacillus kaustophilus CGMCC 1.3655基因组为模板，SEQID NO:4-SEQIDNO:5为引物扩增bgaB基因，扩增的片段5′端带有Kpn I、Bcl I酶切位点，3′端带有Sal I酶切位点。以构建的pBE衍生质粒pBE-MCS为载体，用相同的Kpn I和Sal I双酶切，通过切胶回收得到载体片段。纯化后的载体片段和bgaB基因片段连接，并转化E.coli Mach1T1，构建启动子探针质粒pBE-bgaB(质粒结构示意图如图1A所示)。
实施例2启动子的初筛：
将解淀粉芽孢杆菌(-80℃)甘油管取出划线于LB固体平板上37℃过夜培养，挑取单菌落于LB液体培养基中,37℃，200rpm培养至对数生长后期。收集1-3mL细胞于10000g快速离心1min用于提取细菌总DNA。具体的提取方法参考广州飞扬生物工程有限公司的细胞细菌基因组DNA小提试剂盒。提取解淀粉芽孢杆菌基因组，用mbo Ⅰ酶不完全消化提取的基因组，回收消化产物(如图1B所示回收酶切消化200～400bp的DNA片段)。用Bcl Ⅰ酶切启动子探针质粒pBE-bgaB，同时进行载体去磷酸化处理。mbo Ⅰ酶消化的解淀粉芽孢杆菌基因组，与Bcl Ⅰ酶单酶切处理的pBE-bgaB切胶回收的载体连接，连接产物转化E.coli DH5α。复苏培养后将培养液涂布于β-Gal筛选平板上初步筛选显色的克隆子。挑取在上述β-Gal筛选平板上蓝色的克隆子，点板于新鲜配置的β-半乳糖苷酶筛选平板上，37℃培养18-24h，选择仍然出现蓝色的克隆子接种于LB液体培养基中(100μg/mL Amp)，过夜培养。以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物，在405nm处测定β-半乳糖苷酶酶活(如图1C所示初筛选的265个克隆子的酶活，其中筛选了比p43启动子活力更高的p41，p86，p43(B.a)，p71，p40用于下一步复筛工作)。
实施例3启动子在芽孢杆菌属中复筛情况：
提取大肠杆菌中筛选的40号、41号、43号、71号和86号克隆子质粒为模板，以SEQIDNO:6-SEQID NO:7、SEQID NO:8-SEQID NO:9、SEQID NO:10-SEQID NO:11、SEQID NO:12-SEQID NO:13、SEQID NO:14-SEQID NO:15为引物扩增，扩增带有枯草芽孢杆菌核糖体结合位点的40号、41号、43号、71号和86号启动子PCR片段纯化后用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切(71号启动子片段用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切)，亚克隆于穿梭质粒pBEP43-bgaB的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点之间，构建了pBEP40-bgaB、pBEP41-bgaB、pBEP40-bgaB、pBEP43(B.a)-bgaB、pBEP71-bgaB、pBEP86-bgaB质粒。并将这些质粒转入解淀粉芽孢杆菌中，通过测定其β-半乳糖苷酶酶活判断启动子在解淀粉芽孢杆菌中的活力高低。结果如图2所示，其中启动子p41表现了最高的β-半乳糖苷酶酶活。
实施例4启动子的序列分析：
以SEQID NO:16-SEQID NO:17、SEQID NO:18-SEQID NO:19、SEQID NO:20-SEQIDNO:21为引物，41号克隆子质粒为模板扩增组成启动子P41的三个片段(图3A所示)，PCR片段纯化后用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切亚克隆于质粒pBEP43-bgaB的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点之间，构建了pBEP41-f1-bgaB、pBEP41-f2-bgaB、pBEP41-f3-bgaB质粒。质粒转入解淀粉芽孢杆菌中，通过测定其β-半乳糖苷酶酶活判断不同启动子片段在解淀粉芽孢杆菌中的活力，以确定活性启动子片段。结果如图3B所示，其中只有pBEP41-f3-bgaB表现出β-半乳糖苷酶酶活，表明只有片段3才是所需的活性的启动子片段，并测序确定其核苷酸序列(图3C)。
实施例5启动子的优化改造和应用：
以SEQID NO:22-SEQID NO:21、SEQID NO:22-SEQID NO:23为引物，构建的pBEP41-f3-bgaB质粒为模板，扩增带有不同RBS的P41启动子片段，PCR片段纯化后用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切亚克隆于质粒pBEP43-bgaB的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点之间，构建了pBEP41-core-bgaB和pBEP41-382-bgaB质粒。质粒转入解淀粉芽孢杆菌中，通过测定其β-半乳糖苷酶酶活和SDS-PAGE检测判断启动子活力强弱。结果如图4A所示，经过优化后的382号启动子所构建的pBEP41-382-bgaB质粒表达明显更粗的β-半乳糖苷酶条带。
以pBEP41-core-bgaB质粒为模板，SEQID NO:24-SEQID NO:25为引物扩增P41-core片段，以pBEP43-xyn质粒为模板扩增SEQID NO:26-SEQID NO:27为引物扩增xyn片段，胶回收纯化两个片段，以纯化后的两个片段为模板，SEQID NO:24-SEQID NO:27为引物扩增融合得到P41-core-xyn片段。以pBEP41-382-bgaB质粒为模板，SEQID NO:24-SEQID NO:28为引物扩增P41-382片段，以pBEP43-xyn质粒为模板扩增SEQID NO:29-SEQID NO:27为引物扩增xyn片段，胶回收纯化两个片段，以纯化后的两个片段为模板，SEQID NO:24-SEQID NO:27为引物扩增融合得到融合得到P41-382-xyn片段。两个融合片段5′和3′端分别带有EcoRⅠ和Xba Ⅰ两个限制性酶切位点，片段纯化、双酶切后连接于载体质粒pBEP43-smyQ相同酶切位点处，测序验证得到构建正确的pBEP41-core-xyn和pBEP41-382-xyn质粒。质粒转入枯草芽孢杆菌WB800中，通过SDS-PAGE检测判断启动子活力强弱。结果如图4B所示，经过优化后的382号启动子所构建的pBEP41-382-xyn质粒比未经过优化的p41启动子构建的pBEP41-core-xyn表达更多的木聚糖酶，显示在蛋白胶图上37.5kDa处有明显的更粗的蛋白条带。图4C所示是优化后382号启动子的核苷酸序列。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司
<120> 芽孢杆菌表达启动子及其应用
<130> 2016
<160> 29
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 153
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<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
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Claims (8)
1.一种芽孢杆菌表达启动子，其序列为SEQ ID NO:1序列。
2.一种核酸片段，其包含权利要求1的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因来源相同或不同。
3.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的启动子或权利要求2的核酸片段。
4.一种质粒，其特征在于，为权利要求1所述的启动子或权利要求2的核酸片段与启动子探针质粒pBE-bgaB经重组得到的质粒；所述启动子探针质粒有大肠杆菌和芽孢杆菌的复制子，是大肠杆菌-芽孢杆菌的穿梭质粒；有多克隆位点；有异源编码的耐热β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，序列来源为嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)；所述探针质粒pBE-bgaB是以Geobacillus kaustophilus CGMCC 1.3655基因组为模板，SEQID NO:4-SEQID NO:5为引物扩增bgaB基因，扩增的片段5′端带有Kpn I、Bcl I酶切位点，3′端带有Sal I酶切位点；以构建的pBE衍生质粒pBE-MCS为载体，用相同的Kpn I和Sal I双酶切，通过切胶回收得到载体片段；纯化后的载体片段和bgaB基因片段连接，并转化E.coliMach1T1，构建启动子探针质粒pBE-bgaB。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求1的启动子或权利要求2的核酸片段或权利要求3的载体或权利要求4的质粒，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。
6.一种筛选SEQ ID NO:1所示启动子的方法包括以下步骤：
以解淀粉芽孢杆菌DNA为模板，通过权利要求4的启动子探针质粒进行启动子活性筛选，筛选启动子活性最高的权利要求5的重组细胞，提取重组细胞中的权利要求3的载体，分析其启动子活性片段，构建权利要求2的核酸片段，优化启动子元件，提高启动子活性，得到优化后的SEQ ID NO:1所示的启动子。
7.一种启动子调控目的蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸片段或权利要求3所述的载体导入宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为芽孢杆菌。
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