CN111378674B - 异宗毁丝霉糖化酶MhglaA及其编码基因和在葡萄糖生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的嗜热真菌糖化酶MhGlaA，及其编码基因；通过FMDV 2A肽介导的包含该基因和GFP基因的表达盒和重组表达载体；还公开了提高嗜热毁丝霉中的生产糖化酶的方法，以及在在水解淀粉中的应用。本发明所提供的糖化酶pH值适用范围广，热稳定性好，对淀粉的水解效果显著，尤其通过获得的最优嗜热毁丝霉重组菌株，其生产糖化酶的产量比野生型菌株提高约12.5倍，其糖化酶活力比野生型提高约8.5倍，其发酵液对淀粉的水解效果显著优于野生型发酵液，因而具有较高的应用价值。

Description

异宗毁丝霉糖化酶MhglaA及其编码基因和在葡萄糖生产中的 应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域。具体地，本发明涉及涉及一种异宗毁丝霉糖化酶MhGlaA及其基因和生产应用。

背景技术

糖化酶全称为葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，EC 3.2.1.3)，广泛应用于啤酒、味精、淀粉糖、抗菌素等要求淀粉最大限度转化为葡萄糖的工业领域，是工业生产中最重要的酶类之一。糖化酶的主要生产菌种为霉菌，我国多用红曲霉、黑曲霉以及根霉。我国糖化酶主要是由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成。我国淀粉加工用酶行业经过几十年的发展，虽然已经可以自主生产糖化酶等大宗酶制剂品种，但是仍然存在酶制剂性能不高，发酵水平偏低的问题。

大多数糖化酶并不耐高温，目前工业应用的糖化酶其耐受温度一般在85℃以下，超过该温度后，酶活力损失巨大，甚至完全失活；另外，大多数真菌糖化酶的pH作用范围较窄，最适反应pH值一般为4.0-5.0，在酸性条件下稳定，因此需要调整温度和pH后才能进入糖化过程，这些均从一定程度上限制了糖化酶的应用(Kumar P,Satyanarayana T(2009)Microbial glucoamylases:characteristics and applications.Crit Rev Biotechnol29:225-255)。如CN1284129A中公开一种适合于淀粉转化过程的来源于Talaromycesemersonii的分离的热稳定葡糖淀粉酶，在70℃下在50mM NaOAc、0.2AGU/ml、pH4.5中具有至少100分钟的T1/2(半衰期)，与黑色曲霉AMG相比，在60℃下针对麦芽糖具有增加的比活性。US4247637公开了一种来源于Talaromyces duponti热稳定葡糖淀粉酶，当在70℃、pH4.5下保持10分钟时，保留酶活至少约90％。

可见目前，如何进一步提高糖化酶的热稳定性、低pH稳定性，降低转苷活性等是糖化酶研究的热点。Volkov PV等(Glucoamylases from Penicillium verruculosum andMyceliophthora thermophila:analysis of differences in activity againstpolymeric substrates based on 3D model structures of the intactenzymes.Biochimie,2015,110:45-51)研究了嗜热毁丝霉糖化酶MYCTH_72393，其是通过最传统的直接嗜热毁丝霉菌株发酵液中进行分级纯化得到酶，然后质谱检测发现是MYCTH_72393，仅研究该酶的最适pH、底物水解特性和3D结构，但并没有涉及任何分子克隆技术和基因工程的改造研究。

因此，有必要开发一种性能优良的糖化酶，提高其耐热性能及pH作用范围，从而降低能源消耗及生产成本，以及糖化酶生产能力优异的重组菌株，以满足我国淀粉加工工业对高性能、低成本酶制剂的需求，具有重要的商业价值。

发明内容

本发明人经过广泛而深入的研究，提供一种来源于异宗毁丝霉的新型糖化酶MhGlaA及其编码基因和应用，设计和开发了一种基于手足口病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)2A肽介导的糖化酶MhglaA基因表达系统(如图1所示)，利用本发明构建的MhglaA基因表达系统可以快速、高效的在嗜热丝状真菌-嗜热毁丝霉实现糖化酶MhGlaA表达分泌。同时基于本发明构建的重组菌株OE-MhglaA-gfp实现了糖化酶MhGlaA的制备和酶学特性分析，还基于CRISPR-Cas9编辑技术对获得的重组菌株OE-MhglaA-gfp进行基因工程的改造(如图6所示)，能够极显著提升糖化酶生产能力。在此基础上，完成了本发明。

因而，本发明的目的是提供一种新型糖化酶MhGlaA及其基因和生产应用，本发明从异宗毁丝霉(Myceliophthora heterothallica)克隆得到糖化酶基因MhglaA，通过构建特别的重组表达载体，转入嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila，Synonym:Thermothelomyces thermophilus)，构建得到高效表达该糖化酶的重组菌株，显著提高了糖化酶的产量，有利于糖化酶的广泛应用。

本发明第一方面提供一种来源于异宗毁丝霉的新型糖化酶MhGlaA，是由序列表中如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。进而，还提供了上述糖化酶的编码基因MhglaA，优选该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明第二方面，进一步提供包含所述的基因的表达盒，优选地，表达盒的启动子是嗜热毁丝霉翻译延伸因子TEF1A的启动子Ptef1，所述表达盒的终止子是构巢曲霉trpC基因的终止子TtrpC。进一步优选地，表达盒还包括绿色荧光蛋白基因GFP构成串联表达，更进一步通过来源于手足口病毒的2A肽编码序列介导的GFP的表达，其中优选地所述2A肽编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；特别优选地所述表达盒依次含有嗜热毁丝霉翻译延伸因子TEF1A的启动子Ptef1、所述异宗毁丝霉糖化酶基因MhglaA、组氨酸标签序列(优选为9个组氨酸)、2A肽编码序列、绿色荧光蛋白基因GFP、构巢曲霉trpC基因的终止子TtrpC，更具体地所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明第三方面，更进一步提供含有所述的表达盒的重组表达载体，优选地的所述表达载体的骨架质粒为pAN52-bar；优选地所述菌株选自丝状真菌细胞、酵母细胞、芽孢杆菌或大肠杆菌细胞。进一步地，所述菌株为嗜热毁丝霉，更优选地，所述嗜热毁丝霉是敲除了碳分解代谢物阻遏效应转录因子Cre1、内质网压力响应的调控因子Res1和蛋白酶Alp1，和/或过表达淀粉酶转录因子AmyR，其中所述敲除是通过基因编辑技术实现，尤其是通过CRISPR-Cas9编辑技术实现。最优选地，所述嗜热毁丝霉是敲除了碳分解代谢物阻遏效应转录因子Cre1、内质网压力响应的调控因子Res1和蛋白酶Alp1，同时过表达淀粉酶转录因子AmyR。

本发明第四方面，还提供制备所述糖化酶MhGlaA的方法，其特征在于，利用所述的重组菌株，发酵制备糖化酶。更具体包括以下步骤：1)用上述任一所述糖化酶基因MhglaA的表达盒或重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组糖化酶MhGlaA的表达；3)以及回收并纯化所表达的糖化酶MhGlaA。

其中，所述宿主细胞选自丝状真菌细胞、酵母细胞、芽孢杆菌或大肠杆菌细胞，优选将重组表达载体转化嗜热毁丝霉细胞中。最优选地，是将上述含有糖化酶MhglaA表达盒的重组表达载体转化导入嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)中，并通过2A肽介导的GFP筛选系统，快速获得过表达糖化酶基因MhglaA的重组菌株，发酵所述重组菌株生产糖化酶。

本发明第五方面，提供一种提高嗜热毁丝霉生产糖化酶的方法，其特征在于，包括用上述糖化酶MhGlaA的重组表达载体转化宿主菌株嗜热毁丝霉，得到嗜热毁丝霉异源表达糖化酶MhGlaA的重组菌株；更进一步地，所述重组菌株进行了基因工程的改造，所述基因工程改造是基于CRISPR-Cas9编辑技术敲除上述的3个负调控因子(Cre1、Res1和Alp1)中的一个或多个，和/或过表达了正调控因子AmyR。更优选地，所述菌株中的碳分解代谢物阻遏效应转录因子Cre1、内质网压力响应的调控因子Res1和蛋白酶Alp1中均被敲除，并且淀粉酶转录因子AmyR被过表达。其中优选地所述重组表达载体包含的表达盒依次含有嗜热毁丝霉翻译延伸因子TEF1A的启动子Ptef1、所述异宗毁丝霉糖化酶基因MhglaA、组氨酸标签序列(优选为9个组氨酸)、2A肽编码序列、绿色荧光蛋白基因GFP、构巢曲霉trpC基因的终止子TtrpC，更具体地所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明第六方面，进一步提供利用如上述方法(第五方面)获得的重组菌株制备糖化酶MhGlaA的方法，优选地在40-50℃，最优选在45℃的发酵温度下培养所述重组菌株，收集所述糖化酶MhGlaA。

本发明第七方面，提供用于将淀粉类底物转化为含有葡萄糖的方法，其特征在于，所说的方法包括将本发明所述的糖化酶MhGlaA的存在下糖化淀粉类底物的步骤。所述淀粉类底物是可溶性淀粉、支链淀粉、葡聚糖和糖原。

优选地，其中在5至6的pH下以及在60-80℃的温度下、优选在63-75℃下50-80μg/mL所述重组菌株的粗酶液对可溶性淀粉进行所述的糖化，优选在5.5的pH下以及在70℃的温度下，进行所述的糖化，所述糖化酶MhGlaA用量优选为50-80μg/mL。更优选在5.5的pH下以及在70℃的温度下，进行所述的糖化，其中在一个具体实例中，用80μg/mL的糖化酶MhGlaA分别对2.5mg/mL淀粉类底物，包括可溶性淀粉、支链淀粉、葡聚糖和糖原进行所述的糖化，反应10分钟后葡萄糖的含量分别达到41.2％、27.6％、25.2％、25.6％。

其中，本发明中所用的术语“重组”被用于指代菌株、细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该菌株、细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组菌株是表达在天然(非重组)形式的该菌株中不曾发现的基因，或者表达天然基因。本发明所用的术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、目的基因的序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列，本发明的表达载体还优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。所用的术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的糖化酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。所用的“CRISPR-Cas9编辑技术”是指Cas9蛋白能够在引导sgRNA的指导下在生物基因组中切割特定的DNA序列，制造DNA双链断裂，从而引发细胞自身的修复机制，在DSB部位进行非同源末端连接修复(Non-homologous endjoining，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)修复，从而进行基因敲除、基因灭活、基因敲入和基因替换，实现基因组高效编辑的目的。

本发明获得下述有益效果：

本发明提供的糖化酶基因，所编码的糖化酶的最适作用温度为70℃，在60℃-70℃范围内处理20min能保持80％以上的酶活；最适作用pH为5.5，且在pH 4.0-9.0范围处理60min能保持79％以上的酶活；在5.5的最适pH下以及在70℃的最适温度下，该糖化酶对淀粉类底物包括可溶性淀粉、支链淀粉、葡聚糖和糖原分别进行糖化，反应仅10分钟后，葡萄糖的含量就能达到41.2％、27.6％、25.2％、25.6％。该糖化酶具有良好的耐热性，作用pH范围广，适合作为一种新型的糖化酶进行工业应用。由此，将所述糖化酶用于将淀粉转化为含有葡萄糖的方法，具有更高效等优点。

进一步地，本发明将糖化酶MhGlaA重组表达载体导入嗜热毁丝霉后，通过FMDV 2A肽介导的GFP筛选系统，能够快速获得糖化酶基因MhglaA强表达的阳性重组菌株OE-MhglaA-gfp，不仅其表达分泌糖化酶水平显著提高，而且省去了大量筛选转化子的过程和时间。其中按序串联表达糖化酶基因和GFP蛋白，在糖化酶羧基末端添加了9个组氨酸His标签，然后再与2A、GFP连接，就可以直接通过发酵上清液western检测糖化酶(基于GFP的荧光强度直接能够表征糖化酶表达水平)，并且能够用上清液直接纯化糖化酶。通过实验证明，本发明中的重组菌株，GFP的荧光强度与MhGlaA表达分泌一致，成正相关。因此，本发明构建的FMDV 2A肽介导的双基因共表达体系可以对嗜热毁丝霉转化子进行高通量的筛选，能够快速、高效获得高产MhGlaA重组菌株。而且，基于本发明的糖化酶热稳定性，通过嗜热毁丝霉重组菌，可以在40-50℃(最优为45℃)下发酵来获得所述糖化酶，更为高效快速制备糖化酶。

更进一步地，本发明利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除糖化酶表达分泌的负调控因子Cre1、Res1或Alp1，或者过表达正调控因子AmyR，得到的一系列组合突变工程菌株，该系列突变菌株能够极为显著提升糖化酶的生产能力，其中含有五个基因突变的重组菌株(2OEΔaΔrΔc：OE-MhglaA-gfpOE-amyRΔalp-1Δres-1Δcre-1)生产糖化酶的产量比野生型菌株提高约12.5倍，其糖化酶活力比野生型提高约8.5倍，其发酵液对淀粉的水解效果显著优于野生型发酵液，比野生型菌株的降解效果提高了4倍，具有较大的应用价值。

附图说明

图1为2A系统介导的糖化酶MhGlaA和GFP在嗜热毁丝霉中重组表达的示意图(A)、不同转化子表达GFP的荧光强度值(B)和重组菌株OE-MhglaA-gfp分生孢子和菌丝表达绿色荧光蛋白情况(C)。

图2为Western检测重组菌株分泌重组蛋白MhGlaA-9×His的结果图(A)，RT-qPCR检测重组菌株糖化酶MhglaA基因的考倍数值(B)，重组菌株和野生菌株WT在2％水溶性淀粉生长条件下发酵上清的蛋白分泌(C)和糖化酶活力(D)。

图3为重组糖化酶MhGlaA的SDS-PAGE分析(A)，其中，M是分子量蛋白质Marker，1是嗜热毁丝霉野生型WT未表达糖化酶MhGlaA，2是嗜热毁丝霉重组菌株表达的未纯化的糖化酶MhGlaA，3是纯化后的糖化酶MhGlaA；糖化酶MhGlaA的最适反应温度(B)；糖化酶MhGlaA的最适反应pH值(C)；糖化酶MhGlaA的pH稳定性曲线(D)；糖化酶MhGlaA的热稳定性曲线(E)；糖化酶MhGlaA的阳离子和不同底物稳定性曲线(F)。

图4通过CRISPR-Cas9编辑技术敲除重组菌株靶基因cre1、res1、alp-1和过表达转录因子amyR的示意图(A)和PCR鉴定核酸电泳图(B)及其RT-qPCR检测突变菌株转录因子amyR的考倍数值(C)。

图5为糖化酶MhGlaA重组表达载体在嗜热毁丝霉蛋白酶五基因突变菌株MtL51中重组表达结果图，其中(A)为不同转化子表达GFP的荧光强度值，(B)为RT-qPCR检测重组菌株MhglaA基因的考倍数值，(C)为Western检测重组菌株分泌的MhGlaA-9×His的结果图。

图6通过基因工程改造嗜热毁丝霉生产糖化酶MhGlaA的示意图(A)，嗜热毁丝霉系列突变菌株和野生型WT在水溶性淀粉条件下发酵上清的蛋白SDS-PAGE电泳分析图(B)，发酵上清的蛋白浓度(C)和糖化酶活力(D)图。

图7为重组糖化酶MhGlaA水解淀粉的应用(A)，嗜热毁丝霉突变菌株和野生型菌株的发酵粗酶液水解淀粉生成葡萄糖的应用(B)。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例中所采用的原始出发菌株嗜热毁丝霉ATCC 42464购自美国模式培养物集存库(American type culture collection)，实施例中所采用的原始出发菌株异宗毁丝霉CBS 203.75均购买于Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS FungalBiodiversity Centre真菌生物多样性中心，为商业渠道获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。其中，所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分浓度。所用引物和核酸测序均由由苏州金唯智生物科技有限公司GENEWIZ完成。其中，“MYCTH_……”为嗜热毁丝霉的基因位点编号；“MYCHE_……”为异宗毁丝霉的基因位点编号。

实施例1、构建FMDV 2A肽介导的嗜热毁丝霉重组表达糖化酶MhGlaA体系

1、糖化酶MhGlaA重组表达载体的构建

以质粒pAN52-bar(Gu SY,Li JG,Chen BC,Sun T,Liu Q,Xiao DG,TianCG.Metabolic engineering of the thermophilic filamentous fungusMyceliophthora thermophila to produce fumaric acid.Biotechnology forBiofuels.2018,11:323.)为骨架构建表达载体。以嗜热毁丝霉糖化酶(Mycth_72393；XuGB,Li JG,Liu Q,Sun WL,Jiang M,Tian CG.Transcriptional analysis ofMyceliophthora thermophila on soluble starch and role of regulator AmyR onpolysaccharide degradation.Bioresource technology.2018,265:558-562.)序列为参照，在异宗毁丝霉编码蛋白序列中进行生物信息的分析比对，发现了异宗毁丝霉糖化酶MhGlaA(Myche_756000)，MhGlaA氨基酸序列和核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

为了能够快速高效的筛选重组表达MhGlaA的转化子，本发明构建了基于2A肽介导的MhGlaA表达盒，所选的2A肽来源于手足口病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)2A肽(其NCBI编号为AAT01756)，该FMDV 2A多肽含有66个核苷酸，编码22个氨基酸：VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP，其在嗜热毁丝霉中进行重组表达的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。利用该FMDV 2A多肽将糖化酶基因MhglaA和绿色荧光蛋白egfp基因按照前后顺序串联在一起，为了便于检查和纯化糖化酶MhGlaA，在蛋白质的羧基末端添加9个组氨酸His标签，构建为融合蛋白MhGlaA-9×His-2A-eGFP。将该融合蛋白置于翻译延伸因子TEF1A(MYCTH_2298136)的启动子Ptef1下进行转录表达，并选用构巢曲霉TtrpC为终止子，从而构建为糖化酶MhGlaA的表达盒Ptef1-MhGlaA-9×His-2A-eGFP-TtrpC，示意图如图1A所示。

表达盒构建所需的PCR引物对为Ptef1-F/Ptef1-R，MhglaA-F/MhglaA-R和2AGFP-F/2AGFP-R，引物序列如表1所示，PCR反应体系为：5×phusion HF buffer 10μL，10mMdNTPs 1μL，10mM引物-F和引物-R各2.0μL，模板DNA 1μL，Phusion DNA polymerase 0.5μL，水33.5μL。PCR反应条件为：先98℃ 30s；然后98℃ 10s，65℃ 30s，72℃ 1.5min，35个循环；最后72℃ 10min，4℃ 10min。采用Gibson Assembly技术体系对上述多个PCR片段进行快速组装到由限制性内切酶Bgl II和BamH I双酶切的骨架质粒pAN52-bar上，从而构建MhGlaA重组表达载体pAN52-MhGlaA，其中所述MhGlaA表达盒的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.4所示。

2.糖化酶MhGlaA在嗜热毁丝霉中重组表达

将10μg由限制性内切酶Hind III线型化重组表达载体pAN52-MhGlaA转化导入嗜热毁丝霉野生型菌株ATCC 42464原生质体细胞后中，通过在平板中加入草丁膦(PPT)筛选出转化子。

A.嗜热毁丝霉菌株的培养

将嗜热毁丝霉ATCC 42464在MM培养基上45℃培养10天后待用。

MM培养基：50×Vogel’s盐20mL，蔗糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高压灭菌。50×Vogel’s盐(1L)：柠檬酸三钠(1/2H2O)150g，无水KH₂PO₄ 250g，无水NH₄NO₃ 100g，MgSO₄·7H₂O 10g，CaCl₂·2H₂O 5g，微量元素盐溶液5mL，生物素(0.1mg/mL)2.5mL，定容体积到1L。

B.嗜热毁丝霉原生质体转化

a)菌丝体准备

将成熟的毁丝霉孢子，用0.05％吐温-80灭菌水收集，经擦镜纸过滤出去菌丝后，涂布于铺有玻璃纸的MM平板，45℃培养16h。

b)原生质体制备

将带有菌丝的玻璃纸放置于30mL裂解液(配方：0.15g裂解酶，无菌操作加入30mL溶液A，过滤除菌；溶液A：1.0361g磷酸二氢钾，21.864g山梨醇，溶于90mL去离子水，氢氧化钾调pH到5.6，定量至100mL，高温灭菌)中，30℃裂解2h，每隔20min轻轻摇动。而后经过玻璃纸过滤后，2000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入4mL溶液B(0.735g氯化钙，18.22g山梨醇，1mL Tris-HCl 1M pH 7.5，溶于90mL去离子水，盐酸调pH到7.6，定量至100mL，高温灭菌)，2000rpm 4℃离心10min；弃上清，按200μL/质粒加入一定体积溶液B。

c)原生质体转化

预冷的15mL离心管，依次加入50μL预冷PEG(12.5g PEG 6000，0.368g氯化钙，500μL Tris HCl 1M pH 7.5)，将转化的DNA片段加入200μL原生质体。放置冰上20min后加入2mL预冷PEG，室温5min，加入4mL溶液B，轻轻混匀。取3mL上述溶液加入12mL融化的含相应抗生素MM培养基中，置于平板中，35℃培养，3d后于挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长。

C.嗜热毁丝霉转化子验证

a)基因组提取：

采用酚氯仿法从上述转化中挑选的转化子提取基因组DNA，具体包括以下操作：

1)在2.0mL无菌的DNA提取管中加入200mg的锆珠及1mL的裂解液(lysis buffer，配方：0.2M Tris·HCl(pH7.5)，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％SDS(w/v))，挑取平板中生长的嗜热毁丝霉菌丝于DNA提取管中；

2)将所有DNA提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次；

3)65℃水浴30分，在水浴过程中每个几分钟取出漩涡振荡；

4)水浴结束后取出，每管加入80μL pH 7.5的1M的Tris·HCl中和；

5)加入400μL的酚：氯仿(1:1)，13000rpm离心5分钟；

6)取300μL上清液于新的1.5mL EP管中，加入600μL 95％的乙醇(DNA级)；

7)冰上孵育一小时，随后4℃、13000rpm离心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部；

8)用75％的酒精(DNA级)400μL清洗，4℃13000 rpm离心，轻轻取出上清液；

9)将EP管置于真空浓缩仪中，真空干燥酒精；

10)加入50μL ddH₂O溶解DNA，用NanoDrop测DNA浓度，测完浓度后将提取的DNA置于-20℃冰箱保存，以备下一步进行PCR验证。

b)PCR验证嗜热毁丝霉重组表达MhGlaA转化子：

以提取的基因组DNA为模版，用引物Ptef1-SF和TtrpC-SR(表1)对转化子进行基因PCR验证。PCR反应体系为：5×phusion GC buffer 4μL，10mM dNTPs 0.2μL，引物各1μL，基因组1μL，DMSO 0.6μL，Phusion DNA polymerase 0.1μL，水12.1μL。PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃ 10s，62℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃ 10min，4℃ 10min。

对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(120V电压，30分钟)，在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在上游引物Ptef1-SF和下游引物TtrpC-SR引导下经PCR扩增获得了3000bp目的条带，表明MhGlaA表达盒片段成功导入嗜热毁丝霉基因组中，进而得到24株T1-T24重组菌株OE-MhglaA-gfp。

c)酶标仪测定嗜热毁丝霉重组菌株的荧光值：

将得到的24株重组菌株MM培养基上进行培养7天后，收集成熟的毁丝霉孢子，使用SpectraMax M2e酶标仪(Molecular Devices)，条件为(激发光：480nm；发射光：520nm)，并用孢子密度测量值(OD420)进行标准化。结果如图1B所示，这24个重组菌株表现出不同的eGFP荧光信号，其中8株重组菌株OE-MhglaA-gfp(T2、T6、T9、T12、T14、T18、T20、T23)的eGFP荧光信号最强，每10⁶个分子孢子产生的其荧光强度(fluorescence intensity)大于等于150。

d)荧光显微观察嗜热毁丝霉重组菌株表达绿色荧光蛋白情况：

对所得的荧光值高的8株重组菌株OE-MhglaA-gfp(T2、T6、T9、T12、T14、T18、T20、T23)进行荧光显微镜观察其分生孢子和菌丝体表达GFP情况，将这8株重组菌株于2％(2g/100mL)水溶性淀粉培养基(配方：50×Vogel’s盐2mL，水溶性淀粉2g，蛋白胨提取物0.5g，定容体积到100mL，高压灭菌)上45℃ 150rpm进行培养，2d后观察菌丝中表达GFP，结果如图1C所示，发现重组菌株具有强烈的绿色荧光，融合蛋白MhGlaA-9×His-2A-eGFP已经成功在重组菌株中表达。

表1

实施例2、嗜热毁丝霉重组菌株生产糖化酶的表型分析

1、Western blot检测嗜热毁丝霉重组菌株中MhGlaA分泌情况

将这8株具有强eGFP荧光表达的重组菌株OE-MhglaA-gfp(T2、T6、T9、T12、T14、T18、T20、T23)和野生型菌株WT进行诱导产糖化酶培养，诱导培养条件为：在2％(2g/100mL)水溶性淀粉培养基(配方：50×Vogel’s盐2mL，水溶性淀粉2g，蛋白胨提取物0.5g，定容体积到100mL，高压灭菌)上45℃ 150rpm培养3d，样品离心取上清液，进行Western blot检测重组蛋白MhGlaA-9×His，所用一抗为His-Tag兔单克隆抗体，二抗为兔抗IgG HRP抗体。结果如图2A所示，重组蛋白MhGlaA-9×His成功表达分泌，大小约65kD，且分子大小与预期结果一致，并没有发现超过70kD的蛋白条件，表明FMDV 2A肽成功在重组菌株中对糖化酶MhGlaA和绿色荧光蛋白GFP进行了高效的切割，野生型菌株作为阴性对照，未发现重组蛋白。

2、RT-qPCR检测嗜热毁丝霉重组菌株MhglaA基因表达情况

以重组菌株的基因组DNA为模板，所需的PCR引物对为actin-RT-F/actin-RT-R和MhglaA-RT-F/MhglaA-RT-R，进行RT-qPCR检测分析。所用RT-qPCR试剂为TOYOBO的

Green Realtime PCR Master Mix，20μL反应体系操作步骤如下：

Green RealtimePCR Master Mix 10μL，上游引物0.4μM，下游引物0.4μM，DNA样品为10-100ng，剩余体积用ddH₂O水补齐。RT-qPCR反应条件为：95℃ 30s，然后95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，40个循环；以actin基因(MYCTH_2314852)作为内参基因，计算得出糖化酶基因MhglaA的拷贝数。结果如图2B所示，糖化酶基因MhglaA在这8株过表达eGFP的重组菌株中拷贝数为～7-12，并且MhglaA基因拷贝数与GFP荧光强度情况是一致的，其中T12、T18和T20这3株重组菌株包含MhglaA基因的拷贝数均大于或等于10个，表明本发明构建的FMDV 2A肽介导的串联表达系统能够成功高水平转录2个目标基因。

3、重组菌株在水溶性淀粉培养基中生产糖化酶功能验证

(1)嗜热毁丝霉重组菌株在水溶性淀粉培养基中培养：

将这8株高表达融合蛋白的重组菌株OE-MhglaA-gfp(T2、T6、T9、T12、T14、T18、T20、T23)和野生型菌株WT分别在2％(2g/100mL)水溶性淀粉培养基(配方：50×Vogel’s盐2mL，水溶性淀粉2g，定容体积到100mL，高压灭菌)上45℃培养5d，样品离心取上清液，测定蛋白浓度和测定糖化酶活力。

(2)分泌蛋白的浓度测定：

使用伯乐Bradford蛋白快速测试试剂盒检测上清中的蛋白浓度，结果如图2C所示，与野生型相比，所有重组菌株的蛋白产量都有非常显著的提高，特别是T2、T18和T20重组菌株，在水溶性淀粉培养条件下，其蛋白产量比野生型高达3.7-4.3倍。

(3)糖化酶活力测定：

将粗酶液用0.05M pH 4.8醋酸钠缓冲液稀释适宜的倍数，终体积为0.25mL，放入50℃水浴锅内预热，取出，加入50℃水浴锅内预热后的0.25mL 1％可溶性淀粉(Difco)底物溶液，混匀，50℃反应10min，用0.5mL DNS溶液终止反应，煮沸10min，至冰上冷却，加蒸馈水定容至2.5mL，上下摇匀，释放的葡萄糖的量用DNS的方法测定，在波长540nm下，测定OD值，空白组使用灭活的酶液作对照。

糖化酶活力定义：1mL酶液在50℃、pH 4.8的条件下，每min水解可溶性淀粉产生1μmol葡萄糖的酶量，即为一个酶活力单位(U)。

根据蛋白浓度稀释上清进行糖化酶的酶活测定，结果如图2D所示，水溶性淀粉生长条件下，同野生型菌株对比，所有重组菌株的糖化酶活力都表现出极为显著的提高，其酶活力比野生型提高2.5-3.9倍。

实施例3、重组糖化酶rMhGlaA的制备及其酶学性质研究

1、发酵制备糖化酶rMhGlaA

将生产糖化酶水平最高的重组菌株T18在2％(2g/100mL)水溶性淀粉培养基(配方：50×Vogel’s盐2mL，水溶性淀粉2g，定容体积到100mL，高压灭菌)上45℃诱导培养，取培养5d的发酵液于4℃，12,000×g离心30min，收集上清进行50kD超滤浓缩，取蛋白浓缩液参照Qiagen公司的Ni-NTA Matric操作手册进行蛋白的纯化。

用buffer A(20mmol/L NaH₂PO₄，500mmol/L NaCl和20mmol/L imidazole，pH7.4)平衡柱子，样品以1mL/min的流速流穿Ni-NTA纯化柱，然后用buffer B(20mmol/L sodiumphosphate，500mmol/L NaCl和500mmol/L imidazole pH 7.4)进行梯度洗脱，紫外检测仪监控，收集各洗脱峰，SDS-PAGE进行检测，如图3A所示，将上述经Ni-NTA层析纯化后的样品用Sephadex G-10层析介质进行脱盐处理，用0.05mol/L的醋酸铵缓冲液洗脱Sephadex G-10层析柱，洗脱速度为2mL/min，收集洗脱峰。重组蛋白MhGlaA的诱导上清发酵液通过Ni-NTA亲和层析进行SDS-PAGE电泳鉴定后，如图3A所示，最终获得65kDa的MhGlaA纯化样品。

2、重组糖化酶rMhGlaA的酶特性分析

最适反应pH：将纯化的MhGlaA酶液稀释适当倍数，在不同的pH缓冲液中，50℃下测定其酶活力，并采用最高酶活为100％，其他检测结果与之相比，即得到不同pH检测条件下的相对酶活，以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 3.0-6.0的50mM醋酸缓冲液，pH 6.0-7.0的磷酸缓冲液，pH 7.0-9.0的Tris-HCl缓冲液，pH 9.0-10.0的甘氨酸-NaOH缓冲液。最适反应pH曲线如图3B所示，表明MhGlaA的最适作用pH为5.5，在pH 4.0-6.0能保持70％以上的酶活。

最适反应温度：将纯化的MhGlaA酶液稀释适当倍数，在pH 5.5缓冲液中，在不同温度(30-90℃)下反应测定其酶活力，以最高酶活力为100％，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活，以测定其最适温度。最适反应温度曲线如图3C所示，表明MhGla的最适作用温度为70℃，在40℃至75℃之间，保持40％以上的酶活。

pH稳定性：将酶液分别在pH 3.0-10.0缓冲液中于25℃下处理60min后，然后在最适反应温度和最适pH下测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果如图3D，表明MhGlaA在pH范围为3.0-9.0间都很稳定，保持75％以上的酶活，pH 10.0缓冲液中仍保持50％以上的酶活。

耐热稳定性：将酶液分别在50、60、65和70℃条件下分别保温不同时间测定相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。结果如图3E所示，在50和60℃下，MhGlaA热稳定性很好，处理60min后仍能保留近80％的酶活；65℃下处理60min后仍能保留近70％的酶活；70℃下处理30min后保留近58％的酶活。

金属离子和不同底物对酶活力的影响：在最适pH与最适温度下，分别测定在5mmol/L不同金属离子溶液(NaCl、KCl、CaCl₂、CoCl₂、FeCl₂、Cu Cl₂、MgCl₂、ZnSO4)或金属螯合剂Na₂EDTA浓度下的酶活，计算相对酶活。底物分别以1mg/mL水溶性淀粉、支链淀粉、葡聚糖、糖原和麦芽糖作底物，在最适pH与最适温度下测定酶活，计算相对酶活。结果如图3E所示，钠离子、钾离子、钴离子和Na₂EDTA对该酶的活性没有显著影响，其中钙离子和锰离子对其酶活性则有显著激活作用，能提高酶活至125％和136％，而铜离子和铁离子对其酶活性则有显著抑制作用，铜离子对酶活抑制影响最大，5mmol/L铜离子浓度就能抑制MhGlaA酶活的60％以上。MhGlaA对可溶性淀粉具有最高的酶活性，以支链淀粉、葡聚糖和糖原为底物时相对酶活仍能保持65％以上，其中以麦芽糖为底物的相对酶活力最低，为37％。

重组糖化酶MhGlaA动力学常数：用不同浓度(0.1-1.0mg/mL)的水溶性淀粉为底物，在最适反应pH与最适反应温度下测定其酶活力，利用双倒数作图法求得其K_m值和V_max。经测定，MhGlaA在70℃下以水溶性淀粉为底物的K_m值为0.83mg/mL，最大反应速度V_max为76.9U/mg。

实施例4、嗜热毁丝霉高产糖化酶工程菌株的构建

1、通过基因工程的改造提高嗜热毁丝霉生产糖化酶

对上述获得的嗜热毁丝霉重组菌株OE-MhglaA-gfp T18进行基因工程的改造，利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除重组菌株T18基因组中的cre1、res1和alp1基因，同时过表达amyR基因，如图4A和图6A所示。将CRISPR-Cas9编辑元件(Liu Q,Gao RR,Li JG,Lin LC,Zhao JQ,Sun WL,Tian CG.Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system inthermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering.Biotechnology for Biofuels.2017,10:1.)和过表达载体pOE-Mycth_2301920(Xu GB,Li JG,Liu Q,Sun WL,Jiang M,TianCG.Transcriptional analysis of Myceliophthora thermophila on soluble starchand role of regulator AmyR on polysaccharide degradation.Bioresourcetechnology.2018,265:558-562.)共转化进入T18原生质体细胞后，原生质体转化步骤与上述实施例一相应方法一致。Cas9在sgRNA介导下，通过protospacer与宿主细胞基因组上的目标基因的DNA链配对来识别靶标位点进行切割，随后供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，通过在平板中加入G418和PPT筛选转化子。

嗜热毁丝霉转化子验证：

1)基因组提取方法与上述实施例一相应方法一致。

2)PCR验证嗜热毁丝霉cre1、res1、alp1和amyR突变转化子

以提取的基因组DNA为模版，用引物对cre1-out-F/in-R，res1-out-F/in-R，alp1-1-out-F/in-R1和PgpdA-SF/TtrpC-SR(表1)分别对转化子进行基因PCR验证。PCR反应体系为：5×phusion GC buffer 4μL，10mM dNTPs 0.2μL，引物各1μL，基因组1μL，DMSO 0.6μL，Phusion DNA polymerase 0.1μL，水12.1μL。PCR反应条件为：先98℃ 30s；然后98℃ 10s，63℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃ 10min，4℃ 10min。

对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(120V电压，30分钟)，在凝胶成像系统下观察基因扩增条带，显示在上游引物cre1-out-F和下游引物cre1-in-R，上游引物res1-out-F和下游引物res1-in-R，上游引物alp1-out-F和下游引物alp1-in-R，上游引物PgpdA-SF和下游引物TtrpC-SR引导下经PCR扩增获得了分别为1900bp和2600bp目的条带，野生型菌株目的条带分别为1000bp和0bp，结果如图4B所示，表明供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，过表达了amyR基因，进而得到基因编辑组合突变菌株，其中包括三基因位点编辑突变株2OEΔa(OE-MhglaA-gfpOE-amyRΔalp-1)、四基因位点编辑突变株2OEΔaΔr(OE-MhglaA-gfpOE-amyRΔalp-1Δres-1)和2OEΔaΔc(OE-MhglaA-gfpOE-amyRΔalp-1Δcre-1)和五基因位点编辑突变株2OEΔaΔrΔc(OE-MhglaA-gfpOE-amyRΔalp-1Δres-1Δcre-1)。

3)RT-qPCR检测嗜热毁丝霉组合突变菌株amyR基因表达情况

以突变菌株的基因组DNA为模板，所需的PCR引物对为actin-RT-F/actin-RT-R和amyR-RT-F/amyR-RT-R，进行RT-qPCR检测分析。所用RT-qPCR试剂为TOYOBO的

GreenRealtime PCR Master Mix，20μL反应体系操作步骤如下：

Green Realtime PCRMaster Mix 10μL，上游引物0.4μM，下游引物0.4μM，DNA样品为10-100ng，剩余体积用ddH₂O水补齐。RT-qPCR反应条件为：95℃ 30s，然后95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，40个循环；以actin基因(MYCTH_2314852)作为内参基因，计算得出糖化酶基因amyR的拷贝数。结果如图4C所示，淀粉酶调控因子amyR在这7株组合突变菌株中拷贝数为～5-7，表明调控因子amyR在突变菌株中成功过表达。

2、在嗜热毁丝霉蛋白酶五突变菌株MtL51中重组表达糖化酶MhGlaA

将10μg由限制性内切酶Hind III线型化重组表达载体pAN52-MhGlaA转化导入嗜热毁丝霉蛋白酶五基因缺失突变菌株MtL51(Li XL,Liu Q,Sun WL,He Q,TianCG.Improving cellulases production by Myceliophthora thermophila throughdisruption of protease genes.Biotechnology Letters.2020,42:219-229.)原生质体细胞后中，原生质体转化步骤与上述实施例一相应方法一致，通过在平板中加入草丁膦(PPT)筛选出转化子，PCR、酶标仪、Western blot和RT-qPCR检测MtL51重组表达MhGlaA与上述实施例一和例二中相应方法一致。

绿色荧光蛋白检测结果如图5A所示，获得的20个重组菌株呈现出不同的eGFP荧光信号，其中3株重组菌株MtL51-OE-MhglaA-gfp(T4、T9、T13)表现出强烈的eGFP荧光信号，每10⁶个分子孢子产生的其荧光强度大于等于150。

MhglaA基因表达情况如图5B所示，在这3株强表达eGFP的重组菌株(T4、T9、T13)中MhglaA拷贝数为～11-14，表明糖化酶MhglaA基因在重组菌株中成功过表达。

Western blot检测结果如图5C所示，65kD大小的重组蛋白MhGlaA-9×His在蛋白酶五基因突变菌株MtL51中成功表达分泌。

以上所述结果表明MhGlaA表达盒片段成功导入嗜热毁丝霉蛋白酶突变菌株MtL51基因组中，进而得到3株高水平表达分泌MhGlaA的重组菌株MtL51-OE-MhglaA-gfp(T4、T9、T13)。

实施例5、嗜热毁丝霉高产糖化酶工程菌株的生物学表型分析

将上述所得重组菌株(OE-MhglaA-gfp和MtL51-OE-MhglaA-gfp)和基于基因工程改造获得的多基因突变菌株(2OEΔa、2OEΔaΔc、2OEΔaΔr和2OEΔaΔrΔc)及其宿主菌株(野生型菌株WT和蛋白酶五突变菌株MtL51)分别在2％(2g/100mL)水溶性淀粉培养基(配方：50×Vogel’s盐2mL，水溶性淀粉2g，定容体积到100mL，高压灭菌)上45℃培养5d，样品离心取上清液，SDS-PAGE电泳分析，测定蛋白浓度和测定糖化酶活力。

分泌蛋白的浓度测定和糖化酶活力测定同与上述实施例二中相应方法一致。

结果如图6B-D所示，在水溶性淀粉培养条件下，SDS-PAGE电泳结果显示，与相比野生型菌株，所有突变菌株的蛋白对应条带都显著加深，尤其是糖化酶对应条带都极为显著加深。与野生型WT及其出发菌株相比，所有突变菌株的蛋白产量和糖化酶的酶活力都有非常显著的提高，其中多基因突变菌株生产蛋白能力和的糖化酶活力都表现出极为显著的提高，特别是五基因突变菌株2OEΔaΔrΔc，其蛋白产量比野生型高达～12.5倍，其糖化酶活力比野生型提高～8.5倍。

实施例6、糖化酶MhGlaA的应用

利用嗜热毁丝霉重组菌株OE-MhglaA-gfp T18重组表达的糖化酶rMhGlaA对Difco可溶性淀粉、支链淀粉、葡聚糖和糖原进行降解生产葡萄糖，并通过DNS法对其进行葡萄糖的含量进行检测，从而测定其水解淀粉的能力。结果如图7A所示，反应10min后，重组表达的糖化酶rMhGlaA(80μg/mL)能分别将2.5mg/mL Difco可溶性淀粉、支链淀粉、葡聚糖和糖原降解生成1.03mg/mL、0.69mg/mL、0.63mg/mL、0.64mg/mL葡萄糖，对淀粉的水解效果显著。

将嗜热毁丝霉野生型菌株和上述获得的高产糖化酶突变菌株在淀粉条件下诱导培养5d后，样品离心，收集其上清液，发酵液对Difco可溶性淀粉进行降解生产葡萄糖，并通过DNS法对其进行葡萄糖的含量进行检测，从而测定分析嗜热毁丝霉野生型和突变株重组表达糖化酶MhGlaA后其发酵液水解淀粉的能力。结果如图7B所示，反应10min后，野生型菌株粗酶液(50μg/mL)仅能够将2.5mg/mL Difco可溶性淀粉降解生成0.096mg/mL葡萄糖，但本发明获得的高产糖化酶突变菌株的粗酶液(50μg/mL)，包括OE-MhglaA-gfp T18、2OEΔa、2OEΔaΔc、2OEΔaΔr、2OEΔaΔrΔc、MtL51和MtL51-OE-MhglaA-gfp，能够显著提高淀粉的降解效率，能将2.5mg/mL Difco可溶性淀粉降解生成0.16-0.38mg/mL葡萄糖，尤其是五个基因突变菌株2OEΔaΔrΔc能产生0.38mg/mL葡萄糖，比野生型菌株的降解效果提高了4倍，其发酵液对淀粉的水解效果显著优于野生型发酵液。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 异宗毁丝霉糖化酶MhglaA及其编码基因和在葡萄糖生产中的应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 652

<212> PRT

<213> Myceliophthora heterothallica

<400> 1

Met Ala Gly Leu Val Ala Gln Leu Gln Asp His Leu Pro Ser Val Asn

1 5 10 15

Gly Ser Gly Leu Val Thr Pro Ala Met His Ala Leu Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Leu Gly Ala Phe Ala Val Gln Thr Val Leu Gly Arg Pro Ala Thr

35 40 45

Leu Ser Lys Arg Ala Thr Asp Ser Phe Ile Glu Thr Glu Thr Pro Ile

50 55 60

Ala Trp Glu Lys Leu Arg Cys Asn Ile Gly Ala Asn Gly Cys Ala Ala

65 70 75 80

Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp

85 90 95

Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ala Gly Leu Val Leu Thr

100 105 110

Gly Ile Val Asp Ala Leu Ser Gln Asn Tyr Ser Ala Ala Leu Gln Thr

115 120 125

Asn Ile Gln Asp Tyr Ile Ile Ala Gln Ala Lys Leu Gln Gly Val Ser

130 135 140

Asn Pro Ser Gly Ser Leu Ser Asp Gly Thr Gly Leu Gly Glu Pro Lys

145 150 155 160

Phe Asn Val Asp Leu Thr Gln Phe Thr Gly Asp Trp Gly Arg Pro Gln

165 170 175

Arg Asp Gly Pro Pro Leu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Arg Tyr Ala Lys

180 185 190

Trp Leu Ala Ser Asn Gly Tyr Lys Asp Thr Ala Asn Ser Val Val Trp

195 200 205

Pro Val Ile Lys Asn Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr Trp Asn Glu

210 215 220

Thr Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Pro Gly Ser Ser Phe Phe Thr

225 230 235 240

Ile Ala Ser Thr His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ala Ala Leu Ala Ala

245 250 255

Gln Leu Gly Thr Glu Cys Ser Ala Cys Ile Thr Val Ala Pro Gln Val

260 265 270

Leu Cys Phe Gln Gln Ser Phe Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Val Val

275 280 285

Ser Asn Ile Asn Gly Gly Asn Asn Arg Ser Gly Lys Asp Leu Asn Ser

290 295 300

Val Leu Ala Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Val Gly Cys Asp Ser

305 310 315 320

Val Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn His Lys Ala

325 330 335

Tyr Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile Ala

340 345 350

Gln Gly Lys Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Ser Glu Asp Val Tyr Tyr

355 360 365

Asn Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Asn Phe Ala Ala Ala Glu Gln Leu

370 375 380

Tyr Asp Ala Ile Phe Val Trp Lys Thr Gln Gln Ser Ile Glu Val Thr

385 390 395 400

Gln Leu Ser Leu Pro Phe Phe Lys Asp Leu Leu Pro Ser Ile Ser Thr

405 410 415

Gly Thr Tyr Thr Pro Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Gln Ile Leu Asp Ala

420 425 430

Val Ser Ala Tyr Ala Asp Gly Phe Ile Asp Val Ala Ala Lys Tyr Thr

435 440 445

Pro Ser Asp Gly Ser Leu Ala Glu Gln Tyr Thr Arg Asp Ser Gly Arg

450 455 460

Pro Ile Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Phe Leu Ser

465 470 475 480

Ala Ala Asp Arg Arg Ala Gly Ile Val Pro Ala Gly Trp Ser Ala Glu

485 490 495

Asn Gly Lys Thr Leu Pro Gly Ser Cys Ser Ala Val Gln Val Ala Gly

500 505 510

Thr Tyr Thr Arg Ala Thr Ala Thr Ser Phe Pro Pro Gly Gln Thr Pro

515 520 525

Asn Pro Thr Ser Asp Thr Pro Ala Pro Phe Pro Thr Ala Cys Ala Asp

530 535 540

Pro Thr Gln Val Phe Val Thr Phe Arg Ala Glu Val Thr Thr Gln Trp

545 550 555 560

Gly Gln Ser Val Lys Val Val Gly Ser Ser Ser Glu Leu Gly Asn Trp

565 570 575

Asp Val Ser Lys Ala Pro Arg Leu Ser Ala Ser Gly Tyr Thr Ala Ser

580 585 590

Asp Pro Leu Trp Ala Ile Thr Val Pro Met Lys Ala Gly Gln Ser Val

595 600 605

Gln Tyr Lys Phe Val Lys Val Asn Gly Asp Gly Ser Ile Gln Trp Glu

610 615 620

Ser Asp Pro Asn Arg Gln Phe Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser

625 630 635 640

Gly Cys Ala Ser Gln Ser Ile Glu Ala Thr Trp Arg

645 650

<210> 2

<211> 1959

<212> DNA

<213> Myceliophthora heterothallica

<400> 2

atggcaggcc tcgttgccca gctccaggac cacctcccat ccgtcaacgg atctggcctc 60

gtcacgcccg ccatgcacgc tctctcgtcg ctcgctgtcc tcggcgcctt cgccgtccag 120

acggtcttgg gccgtccggc caccctctcc aagcgggcca ccgactcctt catcgagacc 180

gagacgccta tcgcatggga aaagctgcgg tgcaacatcg gcgctaacgg ctgtgcggct 240

tccggagccg ctgccggggt ggtcattgcc agcccgtcca agtcggatcc agactacttc 300

tacacctgga ctcgagatgc cggcctggtc ctgacgggta tcgtggacgc cctgtcccaa 360

aactactcgg cggccctgca gaccaacatt caggactaca tcatcgccca ggccaagctc 420

cagggtgttt cgaacccctc cggtagcctc tcggacggca ccggtcttgg cgagcccaag 480

ttcaatgtcg acctcaccca gttcacgggc gactggggcc ggccgcagcg cgacggtccg 540

cctctccggg ccatcgccct catccgctac gccaagtggc tggcttccaa cgggtacaag 600

gacacggcca acagcgtcgt ctggcccgtc atcaagaacg acctggccta tgccgctcag 660

tattggaacg agactggttt cgacctgtgg gaggaggttc ccggcagctc gttcttcacc 720

attgccagca cgcaccgagc cttggtcgag ggagctgccc tcgctgccca gctcggcacc 780

gaatgcagcg cctgcatcac cgtcgcgccc caagtcctct gcttccagca gagcttctgg 840

aacccgtcgg gcggttacgt tgtctcgaac atcaacggcg ggaacaaccg gtccggcaag 900

gatctcaact cggtcctggc ctccatccac accttcgacc cggcggtcgg ctgcgactcg 960

gtcaccttcc agccctgcag cgacaaggcg ctctccaacc acaaggccta tgtcgactcc 1020

ttccgcagcg tctacgccat caactcgggc attgcccagg gcaaggccgt cgccgtgggc 1080

cgctactcgg aggacgtcta ctacaacggc aacccgtggt acctggccaa cttcgcggcc 1140

gccgagcagc tctacgacgc catcttcgtc tggaagacgc agcagtccat cgaggtcacc 1200

cagctgtccc tccccttctt caaggacctg ctccccagca tctccaccgg cacctacacc 1260

ccgtcgtcgt cgacgtacca gcagatcctc gacgccgtct cggcctacgc cgacggcttc 1320

atcgacgtcg cggccaagta caccccctcg gacggctccc tggccgagca gtacacgcgc 1380

gactcgggcc ggccgatctc ggccagggac ctgacctggt cctacgccgc cttcctctcg 1440

gccgccgacc gccgcgcggg catcgtcccg gccggctggt ccgccgagaa cggcaagacg 1500

ctgcccggct cgtgctcggc cgtccaggtc gccggcacct acactcgggc caccgccacc 1560

tccttcccgc ccggccagac gcccaacccg accagcgaca ccccggcccc gttccccacg 1620

gcctgcgccg accccaccca ggtcttcgtc accttccgcg ccgaggtgac cacccagtgg 1680

ggccagtcgg tcaaggtcgt cggcagctcg tccgagctcg gcaactggga cgtctccaag 1740

gccccgcgcc tgtccgcgtc gggctacacg gcgtcggacc cgctctgggc catcacggtg 1800

cccatgaagg ccggccagtc ggtgcagtac aagttcgtca aggtgaacgg ggacgggtcg 1860

atccagtggg agtcggaccc gaaccgccag ttcacggtca gctcttcctc cacggtcagc 1920

ggctgtgcct cgcagagcat cgaggcgacc tggcggtag 1959

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> 手足口病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)

<400> 3

gtcaagcaga ccctgaactt cgacctgctc aagttggccg gagacgtcga gtccaaccct 60

ggaccc 66

<210> 4

<211> 4992

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tctggccatg ttccgcatct atctacatca gttcagtctt tgccctgttg gtcttgctag 60

cggcgatgct atgaaaatct atcaattaat ggtgtccttt ttcgatgcga gtacactact 120

catttcgttt ccgaatcgcc atctcttcga ccattgctga actaattcaa tcttaggtag 180

tctgctgttc cttgttttcc atttccttgt cttaagtaaa accaactggc acacctcgaa 240

acacgcttga cggatggaca gtagaattga ccgtgtacgt acatgtacct tgacgtcctc 300

cgaggttcga catcagggtt cgtcataggg agtgaaacac ccgccatgat tccgtagccg 360

cgcgcgaaga tacgaagcag atatttcacg gacatggcgg agatacttgt ttcccgtact 420

aaggtagtca tgtcggagac atctgaacga cagagctggc caagagaacc gaccagttgc 480

cccaggacga tctagacaaa aaaaaagaga gatgagtggg ccacttttgc cacaacatcg 540

acggccctgc gaccgccccc aggcaaacaa acaaaccgcc gaacaataat acttttgtca 600

ttttaggagg agcgttgtat ggataaaaac aacatctcgt tgctgcagaa tgtggacttc 660

aaacttgcag aaaatgggag gcggatttgc atgatcggag ggtagttgac tcacgccgca 720

ggctgcaaat ccgtcctcca ttattccatg aacaacttcg taaggttggg ctgagcgcca 780

atgcctaacg gaccgggggc cacagcgcaa cgtcccactt aaaggccagc gtgacatgcc 840

agttccatac caagtagtgg caccagaggc ggccaatgct cagtaagggc agggagggag 900

gctcaaacga ttggcaaaaa gaggggcttg ccagttcagt tccctgtgcg agcgcgagag 960

gggcagtttc aaatctggag gggtgtgttg cgctggtctg aagagaaaga gaagactgta 1020

cttaataatt gttcaaagag tccatcatcg cgttgcggac tcctctagct gtatttagag 1080

ccctatcatt acttgtcggg tgcgaatcaa aataccggga tgcagccctc tggcgatttg 1140

catgcggttg tggaggaagt gaagcctgaa tcgcggggct gggcggcaaa gcacgacgtg 1200

aaattcctgg cgaaattcga gggcttgccc caccgtggtt gaagtttttg tgctgcgtaa 1260

ccccaccaac ccgccttgcc cctcccgcct gcccataaaa acttcgaccc ctcctcaaat 1320

cttcttcgat tcttcctctt cacttccttc gtcggcatac ctgattcaag caatcacctg 1380

ccactttcaa gtgcgtatac catcatcgat acactggttc ttgacaagta catcgtctct 1440

aactttcctt tttgcagttt tcattaagcg caagtcgcca gtttcgttct tcagaactag 1500

tatggcaggc ctcgttgccc agctccagga ccacctccca tccgtcaacg gatctggcct 1560

cgtcacgccc gccatgcacg ctctctcgtc gctcgctgtc ctcggcgcct tcgccgtcca 1620

gacggtcttg ggccgtccgg ccaccctctc caagcgggcc accgactcct tcatcgagac 1680

cgagacgcct atcgcatggg aaaagctgcg gtgcaacatc ggcgctaacg gctgtgcggc 1740

ttccggagcc gctgccgggg tggtcattgc cagcccgtcc aagtcggatc cagactactt 1800

ctacacctgg actcgagatg ccggcctggt cctgacgggt atcgtggacg ccctgtccca 1860

aaactactcg gcggccctgc agaccaacat tcaggactac atcatcgccc aggccaagct 1920

ccagggtgtt tcgaacccct ccggtagcct ctcggacggc accggtcttg gcgagcccaa 1980

gttcaatgtc gacctcaccc agttcacggg cgactggggc cggccgcagc gcgacggtcc 2040

gcctctccgg gccatcgccc tcatccgcta cgccaagtgg ctggcttcca acgggtacaa 2100

ggacacggcc aacagcgtcg tctggcccgt catcaagaac gacctggcct atgccgctca 2160

gtattggaac gagactggtt tcgacctgtg ggaggaggtt cccggcagct cgttcttcac 2220

cattgccagc acgcaccgag ccttggtcga gggagctgcc ctcgctgccc agctcggcac 2280

cgaatgcagc gcctgcatca ccgtcgcgcc ccaagtcctc tgcttccagc agagcttctg 2340

gaacccgtcg ggcggttacg ttgtctcgaa catcaacggc gggaacaacc ggtccggcaa 2400

ggatctcaac tcggtcctgg cctccatcca caccttcgac ccggcggtcg gctgcgactc 2460

ggtcaccttc cagccctgca gcgacaaggc gctctccaac cacaaggcct atgtcgactc 2520

cttccgcagc gtctacgcca tcaactcggg cattgcccag ggcaaggccg tcgccgtggg 2580

ccgctactcg gaggacgtct actacaacgg caacccgtgg tacctggcca acttcgcggc 2640

cgccgagcag ctctacgacg ccatcttcgt ctggaagacg cagcagtcca tcgaggtcac 2700

ccagctgtcc ctccccttct tcaaggacct gctccccagc atctccaccg gcacctacac 2760

cccgtcgtcg tcgacgtacc agcagatcct cgacgccgtc tcggcctacg ccgacggctt 2820

catcgacgtc gcggccaagt acaccccctc ggacggctcc ctggccgagc agtacacgcg 2880

cgactcgggc cggccgatct cggccaggga cctgacctgg tcctacgccg ccttcctctc 2940

ggccgccgac cgccgcgcgg gcatcgtccc ggccggctgg tccgccgaga acggcaagac 3000

gctgcccggc tcgtgctcgg ccgtccaggt cgccggcacc tacactcggg ccaccgccac 3060

ctccttcccg cccggccaga cgcccaaccc gaccagcgac accccggccc cgttccccac 3120

ggcctgcgcc gaccccaccc aggtcttcgt caccttccgc gccgaggtga ccacccagtg 3180

gggccagtcg gtcaaggtcg tcggcagctc gtccgagctc ggcaactggg acgtctccaa 3240

ggccccgcgc ctgtccgcgt cgggctacac ggcgtcggac ccgctctggg ccatcacggt 3300

gcccatgaag gccggccagt cggtgcagta caagttcgtc aaggtgaacg gggacgggtc 3360

gatccagtgg gagtcggacc cgaaccgcca gttcacggtc agctcttcct ccacggtcag 3420

cggctgtgcc tcgcagagca tcgaggcgac ctggcggcac caccaccacc accaccacca 3480

ccacgtcaag cagaccctga acttcgacct gctcaagttg gccggagacg tcgagtccaa 3540

ccctggaccc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt 3600

cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga 3660

tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc 3720

ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga 3780

ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg 3840

caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg 3900

cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat 3960

cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa 4020

gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt 4080

gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc 4140

cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga 4200

tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct 4260

gtacaagtaa tagggatcca cttaacgtta ctgaaatcat caaacagctt gacgaatctg 4320

gatataagat cgttggtgtc gatgtcagct ccggagttga gacaaatggt gttcaggatc 4380

tcgataagat acgttcattt gtccaagcag caaagagtgc cttctagtga tttaatagct 4440

ccatgtcaac aagaataaaa cgcgttttcg ggtttacctc ttccagatac agctcatctg 4500

caatgcatta atgcattgac tgcaacctag taacgccttt caggctccgg cgaagagaag 4560

aatagcttag cagagctatt ttcattttcg ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt 4620

caagagacct acgagactga ggaatccgct cttggctcca cgcgactata tatttgtctc 4680

taattgtact ttgacatgct cctcttcttt actctgatag cttgactatg aaaattccgt 4740

caccagctcc tgggttcgca aagataattg catgtttctt ccttgaactc tcaagcctac 4800

aggacacaca ttcatcgtag gtataaacct cgaaatcaat tcctactaag atggtataca 4860

atagtaacca tgcatggttg cctagtgaat gctccgtaac acccaatacg ccggccgaaa 4920

cttttttaca actctcctat gagtcgttta cccagaatgc acaggtacac ttgtttagag 4980

gtaatccttc tt 4992

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tgaagtaatc tctgcagatc tttaattaac tcgagtctgg ccatgttccg catctatcta 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

agtggatccg aattcgatat cgtttaaaca ctagttctga agaacgaaac tggcgacttg 60

<210> 7

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

agcgcaagtc gccagtttcg ttcttcagaa ctagtatggc aggcctcgtt gcccagctcc 60

a 61

<210> 8

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gaagttcagg gtctgcttga cgtggtggtg gtggtggtgg tggtggtgcc gccaggtcgc 60

ctcgatgctc tgc 73

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

caccaccacc accaccacca ccaccacgtc aagcagaccc tgaacttcga cct 53

<210> 10

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gctgtttgat gatttcagta acgttaagtg gatccctatt acttgtacag ctcgtccatg 60

ccgaga 66

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

cttcgacccc tcctcaaatc ttctt 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gagctattaa atcactagaa ggcac 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ctcccacggt gtcaactctg tccta 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gagctattaa atcactagaa ggcac 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

atacagtacc tctgcacaac catcc 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

agttgggatt gttgtgtatc ctcga 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

aaccccaggc atcgtagatc agggc 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

gcatatgagc cttgaggtcc ttgaa 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ttctggcctg cccttttctt tcaac 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

gccccttctt ccgaaagggg aggta 25

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

aacgctcctg ccttctac 18

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

gtaacaccat caccagagtc 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

cgagaccgag acgcctatc 19

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

cgagtccagg tgtagaagta 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

caccgttgcg tcgtatcttc 20

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

gtagtcacca ccaccagagg 23

Claims (24)

1.一种来源于异宗毁丝霉的糖化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述的糖化酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种包含如权利要求2或3所述的基因的表达盒。

5.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，表达盒的启动子是嗜热毁丝霉翻译延伸因子TEF1A的启动子Ptef1，所述表达盒的终止子是构巢曲霉trpC基因的终止子TtrpC。

6.如权利要求5所述的表达盒，其特征在于，表达盒还包括绿色荧光蛋白基因GFP构成串联表达。

7.如权利要求6所述的表达盒，其特征在于，通过来源于手足口病毒的2A肽编码序列介导的所述绿色荧光蛋白基因GFP的表达。

8.如权利要求7所述的表达盒，其特征在于，所述2A肽编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

9.如权利要求6至8任一项所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒依次含有嗜热毁丝霉翻译延伸因子TEF1A的启动子Ptef1、所述糖化酶的基因、组氨酸标签序列、2A 肽编码序列、绿色荧光蛋白基因GFP、构巢曲霉trpC基因的终止子TtrpC。

10.如权利要求9所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

11.含有如权利要求 4至10任一项所述的表达盒的重组表达载体。

12.如权利要求11所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架质粒为pAN52-bar。

13.含有如权利要求11或12所述重组表达载体的重组菌株。

14.如权利要求13所述的重组菌株，其特征在于，选自丝状真菌、酵母、芽孢杆菌或大肠杆菌。

15.一种提高嗜热毁丝霉生产糖化酶的方法，其特征在于，包括用如权利要求11或12所述的重组表达载体转化宿主菌株嗜热毁丝霉，得到嗜热毁丝霉异源表达糖化酶的重组菌株。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在所述重组菌株中，碳分解代谢物阻遏效应转录因子Cre1、内质网压力响应的调控因子Res1和蛋白酶Alp1中的一个或多个被敲除，和/或淀粉酶转录因子AmyR被过表达。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述敲除是通过基因编辑技术实现。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述敲除是通过CRISPR-Cas9编辑技术实现。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在所述重组菌株中，碳分解代谢物阻遏效应转录因子Cre1、内质网压力响应的调控因子Res1和蛋白酶Alp1中均被敲除，同时过表达淀粉酶转录因子AmyR。

20.一种利用如权利要求15至19任一项所述方法获得的重组菌株制备糖化酶的方法，其在40-50°C的发酵温度下培养所述重组菌株，收集所述糖化酶。

21.一种用于将淀粉类底物转化为葡萄糖的方法，其特征在于，所说的方法包括在根据权利要求1所述的糖化酶，或者包括由权利要求20所述方法获得的糖化酶的存在下糖化淀粉类底物的步骤。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述淀粉类底物是可溶性淀粉、支链淀粉、葡聚糖或糖原。

23.如权利要求 22所述的方法，其特征在于，其中在5至6的pH以及在60-80℃的反应温度下、以50-80 μg/mL所述重组菌株的粗酶液对可溶性淀粉进行所述的糖化。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述反应温度为63-75℃，所述pH为5.5。

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