KR102090790B1

KR102090790B1 - 사카로마이콥시스 휘블리제라 유래의 신규 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈 및 이를 이용한 아세테이트 에스테르 생산방법

Info

Publication number: KR102090790B1
Application number: KR1020180107771A
Authority: KR
Inventors: 강현아; 문혜연; 유수진; 래쉬드 아진; 이동욱; 루반트린; 서정아
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 숭실대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2018-09-10
Publication date: 2020-03-18

Abstract

본 발명은 사카로마이콥시스 휘블리제라(Saccharomycopsis fibuligera) 유래의 신규 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈(alcohol acetyltransferase) 및 이를 이용한 아세테이트 에스테르 생산방법에 관한 것으로서, 확보된 S. fibuligera KJJ81 균주의 생물정보학 분석 결과, S. cerevisiae ATF (ScATF) 유전자와 유사한 AATase 단백질 도메인을 가지고 있는 효소 및 이를 발현시키는 유전자 후보가 총 13개나 존재하는 것으로 확인되었다. 본 발명자들이 이종 숙주인 사카로마이세스 세레비지애에서 과발현시켜 분석한 결과 향에 관련된 여러 아세테이트 에스테르 성분들의 생성이 현저하게 증가됨을 관찰함으로써 주류의 향을 증가시킬 수 있는 기능을 지닌 신규 유전자로서의 활용 가능성을 제시하게 되었다.

Description

사카로마이콥시스 휘블리제라 유래의 신규 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈 및 이를 이용한 아세테이트 에스테르 생산방법{Novel alcohol acetyltransferases from Saccharomycopsis fiburigera and method for producing acetate esterases using the same}

본 발명은 사카로마이콥시스 휘블리제라(Saccharomycopsis fiburigera) 유래의 신규 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈(alcohol acetyltransferase) 및 이를 이용한 아세테이트 에스테르 생산방법에 관한 것이다.

대표적인 한국 전통주인 막걸리는 발효주로써 곡물(쌀, 밀)의 전분을 포도당의 형태로 분해(당화)하는 효소를 가진 곰팡이, 분해된 포도당을 알코올로 전환시키는 효모, 다양한 대사산물로 향미를 더하는 세균 등이 포함된 ‘누룩’이라는 복합적인 미생물이 서식하고 있는 발효제를 활용함으로 만들어진다. 발효 초반에는 주로 곰팡이에 의한 당화가 이루어지고, 이후 효모의 증식이 크게 늘어나며 알코올 생성이 급격히 증가하고 말기에 이르면 pH는 감소 및 알코올 함량 상승으로 인해 일반 세균의 증식은 억제되고 유산균 및 내 산성을 가진 유익균의 증식이 증가하게 된다. 막걸리 발효 중에는 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 아시디아 이다호엔시스(Asidia idahoensis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 사카로마이콥시스 휘블리제라(Saccharomycopsis fibuligera), 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) 6종이 주요 발효 효모 종으로 알려져 있다. 최근에서는 막걸리에 대한 국제적인 인지도와 젊은 세대의 관심이 증가됨에 따라 막걸리 품질 향상에 중요한 역할을 하는 향기 성분에 관한 연구가 주목을 받고 있다. 막걸리 향기를 만들어주는 성분은 주 알코올인 에틸알코올(ethyl alcohol)과 바나나 향이 나는 이소아밀 알코올(isoamyl alcohol), 과일향이 나는 여러 가지 에스테르(ester), 맥주에 들어 있는 에틸아세테이트(ethyl acetate), 과일향이나 벌꿀향을 내는 베타-페닐 에틸아세테이트(beta-phenyl ethylacetate), 장미향이 나는 베타-페닐 에틸알코올(beta-phenyl ethyl alcohol), 녹색의 풀향이 나는 헥세닐 알코올(hexenyl alcohol) 등이 있다. 특히 일본의 대표 술인 사케의 향기 성분 중 가장 큰 부분을 차지하는 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate)는 과일 향과 달콤한 향을 내는 주요 성분이다. 이와 같이 술의 휘발성 향의 주요성분인 아세테이트 에스테르(acetate esters) 또는 퓨젤 에스테르(fusel esters)들은 루이신(leucine), 이소루이신(Isoleucine), 발린(valine), 페닐알라닌(phenylalanine) 등 아미노산들의 에를리히 경로(Ehrlich pathway)의 여러 효소 반응들의 작용으로 생성되며, 최종 산물인 아세테이트 에스테르는 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈(alcohol acetyltransferase, AATases; EC 2.3.1.84)에 의해 매개되는 아세틸-CoA와 알코올의 축합반응으로 생성된다고 알려져 있다(도 1).

전통 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈 효소에 대한 두 유전자 ATF1과 ATF2가 존재하며, Atf1p가 아세테이트 에스테르 생산에서 주 기능을 담당하는 반면 Atf2p는 스테롤 에스테르 생산에 주로 관여한다고 알려져 있다. 이 효소들의 기능이 강하거나 발현이 강할 때 생성된 배양액(주류)에서 맛과 향이 뛰어나다. 최근의 연구들을 통하여 S. cerevisiae 외의 다른 효모 종들, 비사카로마이세스 효모(non-Saccharomyces yeasts)들이 맥주, 와인 등 다양한 주류의 향미를 결정짓는 데에 중요한 역할을 하고 있다는 결과들이 제시되고 있다. 이들 비사카로마이세스 효모들 중 여러 효모들이 S. cerevisiae 보다 더 높은 수율로 향미 성분들을 생성해 내고 있으며, 유전체 분석 연구들은 이와 같은 차이는 유전체에 담겨있는 정보의 차이로부터 기인됨을 보고하고 있다. 예를 들면, 가장 대표적인 좋은 향 생산 효모인 위커하모마이세스 아노말러스의 유전체에는 6개의 ATF 유전자들이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 더 많은 비사카로마이세스 효모들에 대한 연구를 통해 향미 성분과 관련된 효소들을 밝혀낼 필요가 있다.

한국등록특허 제10-1651951호(2016.08.23 등록)

본 발명의 목적은 사카로마이콥시스 휘블리제라(Saccharomycopsis fiburigera) 유래 신규 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈(alcohol acetyltransferase)및 이를 암호화하는 유전자를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아세테이트 에스테르 생산방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfAtf(A)2 단백질, 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfAtf(B)2 단백질 및 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfAtf(B)6 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈(alcohol acetyltransferase)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈를 암호화하는, 서열번호 4로 표시된 염기서열로 이루어진 SfATF(A)2 유전자, 서열번호 5로 표시된 염기서열로 이루어진 SfATF(B)2 유전자 또는 서열번호 6으로 표시된 염기서열로 이루어진 SfATF(B)6 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 ATF1 유전자 및 ATF2 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 형질전환시킨 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아세테이트 에스테르 생산방법을 제공한다.

도 1은 에를리히 경로(Ehrlich pathway)에 의한 아미노산으로부터 휘발성 향기 성분 아세테이트 에스테르 생합성까지의 각 단계별 효소 반응을 나타낸다.
도 2는 S. fibuligera Atf 단백질들과 다른 효모 유래의 Atf 효소들과의 상동성 비교 결과(a), phylogenetic tree(b) 및 HXXXD 활성부위(activation domain) 분석 결과(c)를 나타낸다.
도 3은 RNA-Seq(A) 및 qRT-PCR(B)를 활용한 S. fibuligera ATF 유전자 발현양상 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 S. cerevisiae ATF1 및 ATF2 유전자 파쇄 균주 제작 모식도(A) 및 S. cerevisiae atf1Δatf2Δ 변이주 균주 확인 결과(B)를 나타낸다.
도 5는 SfATF 유전자 발현 재조합 S. cerevisiae 균주 제작 모식도(A), SfATF(B)6의 시퀀스 분석을 통해 밝혀낸 인트론 정보(B) 및 SfAtf 단백질 발현 확인을 위한 웨스턴 블롯 분석 결과(C)를 나타낸다.
도 6은 SPME-GC/MS를 이용한 SfATF/Scatf1Δatf2Δ 재조합 효모 균주의 향미 성분 프로파일 분석 결과를 나타낸다.

본 발명자들은 선행연구로 막걸리를 만드는 과정에 사용되는 국내 토종누룩에서 우점종으로 분리 동정되며, 다른 효모 균주들에 비해 상당히 좋은 향을 가지고 있는 효모 사카로마이콥시스 휘블리제라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주에 대한 전체 유전체 서열을 해독하였다. 확보된 S. fibulilgera KJJ81 생물정보학 분석 결과, S. cerevisiae ATF (ScATF) 유전자와 유사한 AATase 단백질 도메인을 가지고 있는 효소 및 이를 발현시키는 유전자 후보가 총 13개나 존재하는 것으로 확인되었다. 비록 S. fibuligera ATF 유전자들은 기존의 효모 유래의 ATF 유전자들과 상동성이 매우 낮지만, 본 발명자들이 이종 숙주인 사카로마이세스 세레비지애에서 과발현시켜 분석한 결과 향에 관련된 여러 아세테이트 에스테르 성분들의 생성이 현저하게 증가됨을 관찰함으로써 주류의 향을 증가시킬 수 있는 기능을 지닌 신규 유전자로서의 활용 가능성을 제시하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfAtf(A)2 단백질, 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfAtf(B)2 단백질 및 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfAtf(B)6 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈(alcohol acetyltransferase) 및 이의 기능적 동등물을 제공한다.

상세하게는 상기 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈는 사카로마이콥시스 휘블리제라(Saccharomycopsis fibuligera) 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 "기능적 동등물"에는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 상기 효소 기능을 유지하는 것 모두를 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 수산화효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

또한, 본 발명은 상기 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는 상기 유전자는 서열번호 4로 표시된 염기서열로 이루어진SfATF(A)2 유전자, 서열번호 5로 표시된 염기서열로 이루어진 SfATF(B)2 유전자 또는 서열번호 6으로 표시된 염기서열로 이루어진 SfATF(B)6 유전자일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 서열에 등가의 핵산서열들을 제공한다.

본 발명에 있어서, "등가의 핵산서열"에는 상기 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈 서열의 코돈 축퇴성 서열을 포함한다. "코돈 축퇴성 서열"이란 상기 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 재조합 미생물은 상기 재조합 발현벡터로 ATF1 유전자 및 ATF2 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 형질전환시킨 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 상기 ATF1 유전자 및 ATF2 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 ATF1 유전자는 NCBI accession no. 854559 일 수 있고, ATF2 유전자는 NCBI accession no. 853088 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 재조합 미생물은 아세테이트 에스테르를 생산할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 아세테이트 에스테르는 이소아밀 아세테이트, 2-페닐에틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.

본 발명에서 있어서,“발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 아프라마이신(apramycin)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

바람직하게는, 상기 아세테이트 에스테르는 이소아밀 아세테이트, 2-페닐에틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용한 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1,2,3, John Wiley & Sons, Inc.(1994)) 등을 참조할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 신규 향미 관련 효소 S. fibuligera ATF 유전자 발굴 및 도메인 분석

본 발명자들은 선행연구를 통해 전통누룩에 우점종으로 존재하며 좋은 향미를 내는 전분분해 효모로 발굴된 사카로마이콥시스 휘블리제라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주의 전체 유전체를 완전 해독하여 GenBank GCA_001936135.1로 등록하였다. S. fibuligera KJJ81는 38 Mb 크기의 유전체를 지닌 이배체 효모로서 약 88% 동일성을 보이는 서열을 지닌 각각 8개의 염색체 쌍을 지닌 두 개의 유전체(A subgenome, B subgenome)로 구성되어 있다(Choo et al. 2016). 확보한 S. fibuligera 유전체를 대상으로 단백질 패밀리(protein family) 도메인 비교 기반의 Pfam 데이터베이스를 활용한 생물정보학 분석을 수행하여 S. fibuligera KJJ81 두 개 유전체에서 AATase 단백질 도메인을 지닌 유전자를 각각 7개[SfATF(A)1N, SfATF(A)1C, SfATF(A)2, SfATF(A)3, SfATF(A)4, SfATF(A)5, SfATF(A)6]와 6개[SfATF(B)1, SfATF(B)2, SfATF(B)3, SfATF(B)4, SfATF(B)5, SfATF(B)]를 발굴하였다. 이들 S. fibuligera ATF 유전자들은 A genome 유래의 유전자의 경우 전통효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) ATF1 유전자와의 상동성을 기준으로 높은 순서대로 명명하였고, B genome 유래의 유전자의 경우는 상동유전자의 염색체 번호를 고려하여 명명하였다(표 1).

*S. fibuligera* ORF ID	Identity to *ScATF1 (%)*	*S. fibuligera* gene name
KJJ81A2G066500	14.7	ATF(A)6
KJJ81A2G089400	16.8	ATF(A)4
KJJ81A2G089500	18.1	ATF(A)2
KJJ81A3G017700	15.4	ATF(A)5
KJJ81A4G012700	21.2	ATF(A)1N
KJJ81A4G012800	27.0	ATF(A)1C
KJJ81A5G003500	17.1	ATF(A)3
KJJ81B2G064500	13.3	ATF(B)6
KJJ81B2G086900	15.5	ATF(B)4
KJJ81B2G087000	17.1	ATF(B)2
KJJ81B3G017600	18.4	ATF(B)5
KJJ81B4G012200	17.1	ATF(B)1
KJJ81B5G003500	14.9	ATF(B)3

전체적으로 S. fibuligera ATF 유전자들은 S. cerevisiae 뿐만 아니라 다른 비사카로마이세스 효모들의 ATF 유전자들과 25% 미만의 낮은 상동성을 보이고 있다(도 2a). S. fibuligera Atf 단백질들과 가장 높은 상동성은 Candida maltosa의 Atf와 SfAtf(B)4가, Wicherhamomyces ciferrii Atf6와 SfAtf(B)3로 각각 23%, 23.1% 상동성을 보인다. SfAtf(A)1C, SfAtf(A)4, SfAtf(B)4를 제외하고 모든 S. fibuligera Atf 단백질들은 AATase 단백질들에서 잘 보존되어 있는 H-X-X-X-D 추정 활성화 부위를 지니고 있다(도 2c).

< 실시예 2> RNA- Seq을 활용한 SfATF 유전자의 발현 양상 분석

실시예 1에서 발굴해낸 S. fibuligera ATF 유전자들의 발현 정도 및 배양 조건에 따른 발현 양상을 분석하기 위해 RNA-Seq 및 qRT-PCR 실험을 수행하였다. 기본 배양조건인 YPD(2% glucose), 37℃와 비교를 위해 YPD(0.1% low glucose), 37℃, YPD(2% glucose), 25℃ 그리고 황 결핍 B 배지(2% glucose), 37℃에서 OD 0.2에서 0.5 까지 배양한 후 효모 세포를 모은 뒤 상등액을 버리고 액체질소 상에서 막자사발을 이용해 갈아준 뒤 Qiagen의 RNeasy Mini Kit를 사용하여 얻은 총 RNA 샘플로 RNA-Seq 분석을 진행하였다. RNA-Seq 분석은 Illumina HiSeq 2500 기기를 이용해 100 bp read length로 paired-end 형태로 진행되었다. HiSeq 기반 생물정보적 분석을 거쳐 얻은 RNA-Seq 결과에서 SfATF(A)6을 제외한 나머지 유전자들의 발현이 확인되었다. 특이하게도 이들 SfATF 유전자들 중 SfATF(A)2, SfATF(B)2, SfATF(B)6 세 유전자가 모든 배양 조건에서 다른 ATF 유전자들에 비해 높은 발현 수준을 보이는 것을 확인하였다(도 3A).

또한, 13개 유전자들의 발현 수준을 정확하게 알아보기 위해 같은 조건에서 배양한 효모의 RNA를 RNA-Seq에서와 같은 방법으로 얻은 다음, DNaseI (Thermo scientific)을 처리하여 잔여 gDNA를 없앤 다음 RNaseOUT (Invitrogen) 첨가 하에, Reverse transcriptase (LeGene)을 이용해 mRNA를 cDNA로 전환한 뒤, 표 2에 기술된 각 SfATF 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 SYBR green (BioRad)와 반응시켜 BioRad 기기를 이용해 qRT-PCR을 수행하였다. qRT-PCR 조건은 BioRad사의 SYBR green에서 추천하는 방법대로, TDW 9.5 ul, cDNA(1ng/ul) 1 ul, primer forward 1 ul, reverse 1 ul, SYBR green master mix 12.5 ul를 섞은 뒤, 95℃에서 3분 pre-denaturation, 95℃에서 10초간 denaturation, 62℃에서 30초간 annealing을 39회 반복, 이후 95℃에서 10초, 65℃에서 5초를 진행한 뒤 종료하였다. qRT-PCR 결과, RNA-Seq에서 발현 수준이 낮아 확인되지 않았던 SfATF(A)7를 포함하여 모든 유전자에서 발현이 측정되었다. 대부분의 유전자들은 황 관련 영양소가 거의 존재하지 않는 조건인 B 배지에서 배양했을 때 발현 수준이 증가하는 현상을 나타내었다(도 3B).

유전자	Primer Name	sequence	PCR size	primer size	TM
SfATF(A)2	SfATF(A)2-FW-RT	tttgtggatttgatcgaccatgga	115	24	60
SfATF(A)2	SfATF(A)2-BW-RT	tggtgaggacagcagaatgagt	115	22	60
SfATF(A)3	SfATF(A)3-FW-RT	tgataccggcgccttatttgc	131	21	60.5
SfATF(A)3	SfATF(A)3-BW-RT	ctttctctattgaatctgtgcttgac	131	26	57.5
SfATF(A)4	SfATF(A)4-FW-RT	gtggataataaaatgggcagcca	137	23	58.5
SfATF(A)4	SfATF(A)4-BW-RT	tcacccgagattgcatctgga	137	21	60
SfATF(A)5	SfATF(A)5-FW-RT	cactctaccccaagtgacacg	127	21	59.5
SfATF(A)5	SfATF(A)5-BW-RT	atcccacaacagctccgga	127	19	60
SfATF(A)6	SfATF(A)6-FW-RT	cagcgatgataatgcttccaacc	156	23	59.3
SfATF(A)6	SfATF(A)6-BW-RT	gctttagtatcttcctcgctaacc	156	24	58
SfATF(B)5	SfATF(B)5-FW-RT	tcgagcagagattcagatgatga	138	23	58
SfATF(B)5	SfATF(B)5-BW-RT	cacagtaacaaattgcaagtttgcc	138	25	59.5
SfATF(B)2	SfATF(B)2-FW-RT	ggtttgtggatcttatcgactataag	123	26	56.5
SfATF(B)2	SfATF(B)2-BW-RT	tggtgctagtgaggacagc	123	19	58
SfATF(B)4	SfATF(B)4-FW-RT	tgtggataataaactaggcagccaa	132	25	59
SfATF(B)4	SfATF(B)4-BW-RT	gcgattggatcaggagctttcg	132	22	61
SfATF(B)3	SfATF(B)3-FW-RT	gagcaacagttgaacgggca	142	20	60.5
SfATF(B)3	SfATF(B)3-BW-RT	ctttgatctcgctgctcttaagc	142	23	59
SfATF(B)6	SfATF(B)6-FW-RT	cccaccaaaacgatattaaagatctc	139	26	57.5
SfATF(B)6	SfATF(B)6-BW-RT	tccttagtctcttcctcactaacc	139	24	58

< 실시예 3> 신규 향미 관련 ATF 유전자 기능 분석을 위한 S. cerevisiae 시스템 구축

본 발명에서 발굴한 S. fibuligera ATF 유전자들이 실제로 아세테이트 에스테르 생합성 기능을 가진 효소인지 확인하고자, 우선 S. cerevisiae에서 ATF1와 ATF2 모두 결손된 Scatf1Δatf2Δ 파쇄 균주를 제작하고 이 균주에 SfATF 유전자들을 발현시켜 활성을 분석하고자 하였다. 우선 S. cerevisiae ATF1, ATF2 유전자가 파쇄된 변이주를 제작하기 위해, 표 3에 기술된 프라이머들을 사용하여 융합 중합효소 연쇄반응(fusion PCR)과 세포내 유전자 재조합(in vivo DNA recombination)이라는 두 가지 기술을 도입하여 S. cerevisiae BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)에서 ATF1, ATF2 유전자 파쇄를 시도하였다. 일차 PCR에서 S. cerevisiae ATF1 유전자(ScATF1 N-말단; ScATF1 dN fw, ScATF1 dN rv, ScATF1 C-말단; ScATF1 dC fw, ScATF1 dC rv)의 N-말단과 C-말단을 증폭한 후, 이차 융합 중합효소 연쇄반응에서 ScATF1 dN fw, ScATF1 dC rv 프라이머를 이용하여 ScATF1 유전자의 N-말단과 C-말단을 연결시켜 pT-Scatf1dNC 벡터를 제작한 후 pUG72 벡터(표 4)에 HindIII/SpeI를 처리하여 가져온 Kluyveromyces lactis URA3를 이 벡터에 도입하여 pT-Scatf1dNC-KlURA3 벡터를 제작하였다. 또한, 동일한 방식으로 제작한 pT-Scatf2dNC-KlLEU2 벡터 역시 일차 PCR에서 S. cerevisiae ATF2 유전자(ScATF2 N-말단; ScATF2 dN fw, ScATF2 dN rv, ScATF2 C-말단; ScATF2 dC fw, ScATF2 dC rv)의 N-말단과 C-말단을 증폭한 후, 이차 융합 중합효소 연쇄반응에서 ScATF2 dN fw, ScATF2 dC rv 프라이머를 이용하여 ScATF2 유전자의 N-말단과 C-말단을 연결시켜 pT-Scatf2dNC 벡터를 제작한 후 pUG73 벡터에서 HindIII, SpeI을 처리하여 가져온 K. lactis LEU2를 이 벡터에 도입하여 pT-Scatf2dNC-KlLEU2 벡터를 제작하였다. 각각 제작된 pT-Scatf1dNC-KlURA3, pT-Scatf2dNC-KlLEU2 벡터에 NcoI/MluI을 처리하여 ScATF1 및 ScATF2 파쇄 카세트 Scatf1dNC-KlURA3, Scatf2dNC-KlLEU2 각각을 준비한 후 BY4742 균주에 도입한 후 이중 상동 유전자 재조합에 의해서 ScATF1 및 ScATF2 유전자가 각각 파쇄된 형질 전환체인 Scatf1Δatf2Δ (MATα his3Δ1 lys2Δ0 Scatf1::URA3 Scatf2::LEU2)를 선별하였다(도 4A). PCR을 통해서 해당 유전자의 파쇄와 더불어 KlURA3 또는 KlLEU2 선별표지 유전자 도입을 확인하였고, 각 제작된 Scatf1Δatf2Δ 균주를 SC-LEU-URA 배지에 도말후 30℃ 배양하여 영양요구성(auxotrophic phenotype)을 추가적으로 확인하였다(도 4B).

유전자	프라이머	염기서열 (5'-3')
S. cerevisiae ATF1	ScATF1 dN fw	catg ccatgg gcgtgtgaggactactcattg
	ScATF1 dN rv	ctag actagt ggg aagctt cattctgaatcatctctttcag
	ScATF1 dC fw	ccc aagctt ccc actagt ctggcaccaagcattttccttg
	ScATF1 dC rv	cg acgcgt gcaatgttctgcacgttatttac
S. cerevisiae ATF2	ScATF2 dN fw	catg ccatgg gtaacagcaatgtcattcctaatg
	ScATF2 dN rv	ctag actagt ggg aagctt ccgcgtaaacagtaaaattc
	ScATF2 dC fw	ccc aagctt ccc actagt gcaggcgccttgagatttgc
	ScATF2 dC rv	cg acgcgt gcatcgactacgagcgtattg
S. fibuligera ATF(A)2	SfATF(A)2 fw	ctag actagt atgaccagtgaaactctacag
S. fibuligera ATF(A)2	SfATF(A)2 6His rv	ccc atcgat ttagtgatggtggtgatgatg aacgttgcctgattctgcaag
S. fibuligera ATF(B)2	SfATF(B)2 fw	ctag actagt atgaccagtgaaaattcacag
S. fibuligera ATF(B)2	SfATF(B)2 6His rv	cc atcgat ttagtgatggtggtgatgatg cttgcagaattaggcaacgtt
S. fibuligera ATF(B)6	SfATF(B)6 fw	ctag actagt atgagcgccactaccaacaatg
S. fibuligera ATF(B)6	SfATF(B)6 6His rv	cc atcgat ttagtgatggtggtgatgatg gttgatttcagaatccaagg

¹제한효소는 밑줄로 표시하였다.

²6His taq 는 기울여 표시하였다.

Strain	Description	Source
BY4742	Matα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0	Brachmann et al. (1998)
Scatf1Δ	Matα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 atf1 :: KlURA3	본 발명
Scatf2Δ	Matα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 atf2::KlLEU2	본 발명
Scatf1Δatf2Δ	Matα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 atf1::KlURA3 atf2::KlLEU2	본 발명
SfATF(A)2/Scatf1Δatf2Δ	Matα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 atf1::KlURA3 atf2::KlLEU2 [YCpH-SfATF(A)2]	본 발명
SfATF(B)2/Scatf1Δatf2Δ	Matα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 atf1::KlURA3 atf2::KlLEU2 [YCpH-SfATF(B)2]	본 발명
SfATF(B)6/Scatf1Δatf2Δ	Matα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 atf1::KlURA3 atf2::KlLEU2 [YCpH-SfATF(B)6]	본 발명

< 실시예 4> S. fibuligera ATF 유전자 발현 벡터 제작 및 재조합 효모에서 의 Sf ATf 단백질 발현 확인

본 발명에서 발굴된 13개의 SfATF 유전자들의 효소 활성 확인을 위해 이종 숙주인 S. cerevisiae에서 발현할 수 있는 벡터를 제작하였다. SfATF(A)2, SfATF(B)2, SfATF(B)6 유전자가 과발현된 변이주를 제작하기 위해 S. fibuligera KJJ81 gDNA를 주형으로 하고, 표 3에 기술된 프라이머 SfATF(A)2 fw, SfATF(A)2 6His rv, SfATF(B)2 fw, SfATF(B)2 6His rv, SfATF(B)6 fw, SfATF(B)6 6His rv을 사용하여 유전자 증폭한 후 SpeI/ClaI를 처리하고 YCpHT-UPC2-1 벡터(표 5)를 SpeI/ClaI을 처리한 후 연결하여 SfATF 유전자들이 TEF1 프로모터에 의해 발현되는 최종 발현벡터 YCpH-SfATF(A)2, YCpH-SfATF(B)2, YCpH-SfATF(B)6를 제작하였다(도 5A 및 표 5). 이중 SfATF(B)6 의 경우 155 bp의 인트론(intron)이 존재함을 시퀀스 결과 확인할 수 있었고, 이는 진핵 세포들에서 스프라이싱(splicing) 부위로 잘 보존된 5‘GU-AG3’시퀀스를 가지고 있어 S. cerevisiae 균주에서도 스프라이솜(spliceosome) 의해 스프라이싱이 될 것이라 추측하고 별도의 인트론 제거 없이 지놈 DNA 서열 그대로 벡터 제작을 수행하였다(도 5B). 제작된 벡터들을 실시예 3에서 제작한 Scatf1Δatf2Δ 균주에 도입하여 SfATF(A)2/Scatf1Δatf2Δ, SfATF(B)2/Scatf1Δatf2Δ, SfATF(B)6/Scatf1Δatf2Δ 재조합 균주를 제작하였다. 제작된 이들 재조합 균주에서 SfAtf 단백질 발현 확인을 위해 SC-HIS 배지에서 1일 배양 후 TNE 분해 버퍼(lysis buffer, 50 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH8.0))와 글라스 비드(glass bead)를 동량 추가 후 파쇄하여 효모 세포 파쇄액를 얻은 후 SDS-PAGE 전기영동한 후 His 항체를 이용한 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 통해 SfAtf 단백질의 예상되는 위치, 즉 SfAtf(A)2와 SfAtf(B)2의 경우 ~63.5 kDa, SfAtf(B)6의 경우 ~65 kDa에서 각각의 단백질 밴드를 확인하였다(도 5C).

Plasmid	Relevant characteristics	Source
pT-Scatf1dNC	pGEM-T-based vector containing N and C fragment of ScATF1 for the deletion	본 발명
pT-Scatf2dNC	pGEM-T-based vector containing N and C fragment of ScATF2 for the deletion	본 발명
pT-Scatf1dNC-KlURA3	pGEM-T-based vector containing the Scatf1::KlURA3 disruption cassette	본 발명
pT-Scatf2dNC-KlLEU2	pGEM-T-based vector containing the Scatf2::KlLEU2 disruption cassette	본 발명
pUG72	pGEM-T-based vector containing KlURA3	Guldener U et. al (2002)
pUG73	pGEM-T-based vector containing KlLEU2	Guldener U et. al (2002)
YCpH-Tp-UPC2-1	YCpH-Tp containing a single amino acid variant UPC2_G888D fused to the TEF1 promoter	한국특허출원 제10-2017-0182422호
YCpH-SfATF(A)2	YCpH containing 6His-tagged SfATF(A)2 under the control TEF1 promoter	본 발명
YCpH-SfATF(B)2	YCpH containing 6His-tagged SfATF(B)2 under the control TEF1 promoter	본 발명
YCpH-SfATF(B)6	YCpH containing 6His-tagged SfATF(B)6 under the control TEF1 promoter	본 발명

< 실시예 5> GC /MS 분석 기반 S. fibuligera ATF 기능 검증

대조구로 사용된 S. cerevisiae BY4742 야생형 균주, Scatf1Δatf2Δ 결손균주 및 실시예 4에서 제작된 SfATF(A)2/Scatf1Δatf2Δ, SfATF(B)2/Scatf1Δatf2Δ, SfATF(B)6/Scatf1Δatf2Δ 재조합 균주들을 YPD 배지에서 24시간 배양한 5 ml 배양액을 샘플로 하여 SPME headspace로 향미 성분 샘플을 회수하여 Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC/MS, CAR-PDMS fibre) 분석을 수행하였다. SPME-GC/MS 분석 방법은 다음과 같다. Equilibrium을 위해 샘플을 50℃에서 5분간 반응시킨다. SPME 장치(a 50/30 μm divinylbenzene/carboxen/ polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) fiber)를 이용하여 휘발성 화합물을 30분간 흡착시킨 후, 250℃에서 2분간 용출시킨다. 용출된 화합물은 250℃로 설정된 이동선을 따라 GC-MS 기기(7820A series gas chromatograph-5977E quadrupole mass selective detector, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)로 주입되었다. HP-INNOWax GC column (30 m length × 250 μm i.d. × 0.25 μm film thickness) (19091N-133, Agilent Technologies)을 이용하여 분리를 진행하였고, GC 조건은 다음과 같다: Oven 온도 40℃로 시작, 5분 유지, 5 ℃/min의 속도로 150 ℃ 까지 온도 증가 후 10분 유지, 10℃/min의 속도로 220℃ 까지 온도 증가 후 5분 유지; 운반 기체(He) 유속 1.0 mL/min; 이온화 에너지 70 eV; 스캔 범위 33-200 m/z. 보존 지수(retention indices)와 mass spectrum data를 이용하여 각 화합물을 동정하였고, mass spectrum data는 the National Institute of Standards and Technology에서 제공하는 mass spectral libraries와 비교하여 이용하였다.

GC/MS 분석 결과, S. cerevisiae 야생형 균주의 경우 이소아밀 아세테이트, 2-페닐에틸 아세테이트, 페닐에틸 알코올과 같은 향미 성분 외에도 에탄올(ethanol), 부탄올(butanol), 이소아밀 알코올(isoamyl alcohol)과 같은 비 향미 성분들이 분석되었다. 이에 반해 Scatf1Δatf2Δ 결손 균주의 경우, 이소아밀 아세테이트, 2-페닐에틸 아세테이트 같은 향미 성분의 생산능력이 사라짐을 확인하였다(도 6A). 이에 반하여 재조합 SfATF(A)2/Scatf1Δatf2Δ, SfATF(B)2/Scatf1Δatf2Δ, SfATF(B)6/Scatf1Δatf2Δ 균주들의 경우 Scatf1Δatf2Δ 결손 균주에 비해서 이소아밀 아세테이트, 2-페닐에틸 아세테이트를 높은 수율로 생산할 뿐만 아니라 에틸 아세테이트와 부틸 아세테이트 같은 야생형 균주에서는 감지되지 않았던 향미 성분도 생산하였다(도 6B). 따라서 이는 AATase 단백질 도메인을 지닌 SfATF 유전자들이 효모에서 향미 성분 대량 생산을 위한 유용한 유전자원으로 활용될 수 있는 큰 가능성을 시사한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation Foundation of Soongsil University-Industry Cooperation <120> Novel alcohol acetyltransferases from Saccharomycopsis fiburigera and method for producing acetate esterases using the same <130> ADP-2018-0263 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 554 <212> PRT <213> Saccharomycopsis fibuligera <400> 1 Met Thr Ser Glu Thr Leu Gln Thr Ser Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ser Gln Lys Asp Ser Thr Pro Ala Gln Thr Thr Gln Thr Ala 20 25 30 Gln Lys Gln Gly Pro Val Lys Ser Lys Asp Asp Leu Thr Tyr Lys Ala 35 40 45 Pro Phe Leu Glu Arg Asn Phe Tyr Phe Ser Ser Lys His Glu Leu Phe 50 55 60 Asn Cys Phe Gly Val Ser Ile Val Val Asn Lys Pro Ile Ser Arg Glu 65 70 75 80 Gln Phe Tyr Val Ala Leu Arg Lys Ile Ile Leu Lys Tyr Pro Lys Ser 85 90 95 Ile Thr Ser Val Tyr Asp Glu Phe Asp Arg Glu His His Leu Arg Phe 100 105 110 Ile Pro Lys Thr Lys Ile Ile Phe Asp Asp Asn Ala Val Glu Phe Asn 115 120 125 Glu Lys Phe Asp Gln Tyr Pro Tyr Gln Asn Lys Glu Leu Ser Ala Leu 130 135 140 Leu Thr Ser Tyr Arg Phe Asp Ala Asp Pro Asn Asn Gly Lys Pro Ser 145 150 155 160 Trp Lys Ile Val Tyr Phe Pro Lys Ile Lys Met Leu Ser Trp Leu Phe 165 170 175 Asp His Pro Ile Ser Asp Gly Ala Ser Gly Ala Ala Phe Cys Lys Glu 180 185 190 Leu Val Glu Ser Leu Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Glu Leu Asp Glu Ala 195 200 205 Lys Asp Leu Phe Glu Ser Ser Ala Ala Asn Lys Lys Ala Val Glu Leu 210 215 220 Phe Asn Leu Glu Lys Asp Ile Ser Lys Phe Glu Asn Pro Ile Thr Pro 225 230 235 240 Asp Ser Phe Lys Ile Ala Gly Tyr Lys Pro Ser Leu Ala Glu Lys Ile 245 250 255 Gly Thr Pro Ile Leu Arg Phe Phe Leu Asp Lys Phe Pro Lys Leu Phe 260 265 270 Pro Leu Val Ile Glu Gly Glu Met His Lys Gln Gln Phe Val Asp Thr 275 280 285 Lys Pro Ile Lys Phe Asp Asn Lys Lys Phe Phe Val Arg Glu Gln Asp 290 295 300 Val Ile Ser Lys Asp Ser Pro Leu Cys Gly Gln Ala Leu Thr Tyr Ile 305 310 315 320 Arg Ile Asp Pro Glu Thr Thr Ala Lys Ile Leu Gln Gln Cys Arg Asn 325 330 335 Asn Asn Thr Lys Phe Gln Thr Thr Phe Met Met Val Phe Leu Ser Thr 340 345 350 Ile His Glu Ile Ala Pro Glu Ala Tyr Thr Asn Lys Tyr Leu Lys Ile 355 360 365 Val Thr Ala Ala Asn Phe Arg His Ile Phe Pro Asn Tyr Lys Tyr Gly 370 375 380 His Ser Lys Phe Leu Ser Lys Pro Asp Ser Tyr Thr Lys Glu Thr Gly 385 390 395 400 Gln Phe Lys Asp Gly Phe His Asp His Ala Val Val Phe Tyr Val Glu 405 410 415 Pro Phe Lys Lys Phe Asn Trp Asn Leu Val Gln Lys Tyr His Asn Phe 420 425 430 Leu His Lys Leu Ile Arg Ser Lys Gln Trp Phe Ser Gly Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ala Ser Glu Ala Val Ser Ala Lys Thr Phe Phe Asp Gln Lys Ile Gly 450 455 460 Thr His Asp Asp Thr Tyr Phe Ala Leu Thr Asn Leu Gly Phe Val Asp 465 470 475 480 Leu Ile Asp His Gly Glu Glu Ala Ser Asn Lys Tyr Gln Ile Glu Asp 485 490 495 Leu Ile Phe Thr Ala Ser Pro Gly Pro Met Thr Gly Thr His Ser Ala 500 505 510 Val Leu Thr Ser Thr Lys Asn Gly Ile Asn Ile Cys Val Ala Asp Gln 515 520 525 Asp Pro Ala Ile Asn Ser Glu Glu Phe Arg Ala Arg Leu Thr Glu Asn 530 535 540 Leu Arg Lys Leu Ala Glu Ser Gly Asn Val 545 550 <210> 2 <211> 554 <212> PRT <213> Saccharomycopsis fibuligera <400> 2 Met Thr Ser Glu Asn Ser Gln Thr Ser Pro Ser Ser Ser Pro Ala Ser 1 5 10 15 Glu Thr Ser Gln Lys Ser Ser Thr Leu Ala Gln Thr Lys Gln Thr Val 20 25 30 Gln Lys Gln Gly Pro Val Thr Ser Lys Asp Asp Leu Ser Tyr Lys Ala 35 40 45 Pro Phe Leu Glu Arg Asn Phe Tyr Phe Ser Ser Lys His Gly Leu Phe 50 55 60 Asn Cys Phe Gly Val Ser Val Val Val Asn Lys Pro Ile Ser Arg Glu 65 70 75 80 Gln Phe Tyr Val Ala Leu Arg Lys Ile Val Leu Lys Tyr Pro Lys Ser 85 90 95 Ile Thr Ser Val Tyr Asp Glu Phe Asp Arg Glu His His Leu Arg Phe 100 105 110 Ile Pro Lys Thr Lys Ile Ile Phe Asp Asp Asn Val Val Glu Phe Asn 115 120 125 Glu Lys Phe Asp Gln Tyr Pro Tyr Glu Asn Lys Glu Leu Ser Ala Leu 130 135 140 Leu Thr Ser Tyr Arg Phe Asp Ala Asp Pro Asn Asn Gly Lys Pro Ser 145 150 155 160 Trp Lys Ile Val Tyr Phe Pro Lys Ile Lys Met Leu Ser Trp Leu Phe 165 170 175 Asp His Pro Ile Ser Asp Gly Ala Ser Gly Ala Val Phe Cys Lys Glu 180 185 190 Leu Val Glu Ser Leu Asn Tyr Thr Thr Gln Lys Glu Leu Asp Glu Ala 195 200 205 Lys Asp Leu Phe Glu Lys Ser Ala Ala Asn Lys Lys Ala Val Glu Leu 210 215 220 Phe Asn Leu Glu Lys Asp Ile Ser Lys Phe Glu Asn Pro Ile Thr Pro 225 230 235 240 Asp Ser Phe Lys Ile Ala Gly Tyr Lys Pro Ser Leu Ala Glu Lys Ile 245 250 255 Gly Ala Pro Ile Leu Arg Phe Phe Leu Asn Lys Phe Pro Lys Leu Phe 260 265 270 Pro Leu Val Ile Glu Gly Glu Met His Lys Gln Gln Phe Val Asp Thr 275 280 285 Lys Pro Ile Lys Phe Asp Asn Lys Lys Phe Phe Val Arg Glu Gln Asp 290 295 300 Val Ile Ser Lys Asp Ser Pro Leu Cys Gly Gln Val Leu Ser Tyr Ile 305 310 315 320 Arg Ile Asp Pro Glu Thr Thr Ala Lys Ile Leu Gln Gln Cys Arg Asn 325 330 335 Asn Asn Thr Lys Phe Gln Thr Thr Phe Met Met Val Phe Leu Ser Thr 340 345 350 Ile His Glu Ile Ala Pro Glu Ala Tyr Thr Asn Lys Tyr Leu Lys Thr 355 360 365 Val Thr Ala Ala Asn Phe Arg His Ile Phe Pro Asn Phe Lys Tyr Gly 370 375 380 His Ser Asn Phe Leu Ser Lys Pro Asp Leu Tyr Thr Lys Glu Thr Gly 385 390 395 400 Gln Phe Lys Asp Gly Phe His Asp His Ala Val Val Phe Tyr Val Glu 405 410 415 Pro Phe Lys Asn Phe Ser Trp Asn Leu Val Gln Lys Tyr His Asn Phe 420 425 430 Leu His Lys Leu Ile Arg Ser Arg Gln Trp Phe Ser Gly Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ala Ser Glu Ala Val Ser Ala Lys Thr Phe Phe Asp Gln Lys Ile Gly 450 455 460 Thr His Asp Asp Thr Tyr Phe Ala Leu Thr Asn Leu Gly Phe Val Asp 465 470 475 480 Leu Ile Asp Tyr Lys Glu Asp Ala Ser Asn Lys Tyr Gln Ile Glu Asp 485 490 495 Leu Ile Phe Thr Ala Ser Pro Gly Pro Met Thr Gly Thr His Ser Ala 500 505 510 Val Leu Thr Ser Thr Lys Asn Gly Ile Asn Ile Cys Val Ala Asp Gln 515 520 525 Asp Pro Ala Ile Asn Ser Glu Glu Phe Arg Ala Arg Leu Thr Glu Asn 530 535 540 Leu Arg Lys Leu Ala Glu Leu Gly Asn Val 545 550 <210> 3 <211> 557 <212> PRT <213> Saccharomycopsis fibuligera <400> 3 Met Ser Ala Thr Thr Asn Asn Ala Ser Ala Asp Ala Ile Leu Lys Pro 1 5 10 15 Glu Thr Ile Gln Lys Cys Gln Ser Pro Pro Pro Ser Val Ser Lys Asp 20 25 30 Ala Tyr Cys Phe Asp Leu Lys Phe Pro Gly Asp Ile Phe Tyr Tyr Ala 35 40 45 Asn Lys Met Asp Leu Phe Glu Asn Phe Gln Ile Ala Val Lys Leu Ala 50 55 60 Lys Pro Val Ser Lys Ser Glu Leu Phe Thr Ala Leu Gln Lys Leu Leu 65 70 75 80 Phe Lys Phe Pro Leu Leu Ala Ser Thr Val Tyr Asn Gly Glu Asp Glu 85 90 95 Thr Val Lys Pro Arg Thr Ile Gly Pro Arg Ser Val Ile Tyr Phe Glu 100 105 110 Asn Val Tyr Glu His Arg Lys Glu Ser Phe Gly Thr Asn Pro Phe Phe 115 120 125 Asp Arg Gly Leu Leu Lys Glu Leu Gly Ala Arg Thr Phe Ser Phe Asp 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Asn Ala Leu Phe Lys Val Phe Tyr Phe Glu Glu Ala 145 150 155 160 Gln Tyr Leu Ser Leu Met Val Asp His Thr Leu Phe Asp Ala Gly Thr 165 170 175 Val Leu Ile Tyr Val Lys Gln Leu Ile Glu Asn Ile Asn Tyr Val Thr 180 185 190 Pro Asp Glu Ile Ala Leu Thr Asp Ser Leu Phe Lys Asp Ala Glu Lys 195 200 205 Asp Asn Ser Lys Leu Lys Leu Phe Asp Phe Asp Arg Asp Thr Lys Ser 210 215 220 Leu Glu Val Arg Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Phe Phe Asp Ile Ala 225 230 235 240 Pro Lys Glu Ser Ser Thr Ala Thr Val Leu Gly Val Val Lys Phe Leu 245 250 255 Leu Gly Val Pro Ile Ile Gly Ser Gly Leu Lys Leu Leu Val Ser Lys 260 265 270 Lys Ala Glu Lys Glu Met Phe Ala Asp Pro Ser Leu Val Thr Phe Asp 275 280 285 Gln Ser Lys Lys Trp Ile Ser Arg Lys Thr Val Gly Lys His Ser Gly 290 295 300 Thr Ala Ala Tyr Asp Leu Ala Leu Ile Asn Ile Pro Thr Glu Thr Leu 305 310 315 320 Asn Lys Val Leu Phe Phe Cys Arg Glu His Lys Thr Thr Leu Asn Thr 325 330 335 Leu Leu Lys Phe Leu Tyr Val Met Ser Ile Asn Lys Val Ala Pro His 340 345 350 Val Cys Ala Lys Lys Phe Val Lys Val Asn Thr Ile Val Asp Leu Arg 355 360 365 Arg Leu Ala Gly Asp Ala Val Leu Tyr Ser Thr Tyr Leu Thr Asp Lys 370 375 380 Ala Lys Ala Asn Glu Thr Lys Ile Tyr Glu Gly Ile Asn Val Ile Phe 385 390 395 400 Thr Ser Tyr Tyr Ile Glu Pro Leu Arg Lys Phe Ser Trp Asp Leu Ile 405 410 415 Lys Lys Tyr Lys Asp Tyr Phe His Lys Ser Ile Gln Gly Ser Ala Leu 420 425 430 Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Met Tyr Thr Phe Val Asp Gly Ile Lys Leu 435 440 445 Ile Asn Leu Leu Tyr Gly Leu Lys Arg Gln Thr Phe Leu Leu Ser Ser 450 455 460 Asn Leu Gly Phe Val His Val Lys Lys Tyr Ser Asp Asp Asn Ala Ser 465 470 475 480 His Gln Asn Asp Ile Lys Asp Leu Ile Phe Met Ser Val Pro Gly Ala 485 490 495 Val Tyr Gly Glu Cys Gly Leu Thr Ser Val Ser Thr Thr Glu Gly Gly 500 505 510 Leu Asn Leu Phe Val Met Val Ser Glu Glu Glu Thr Lys Glu Asn Phe 515 520 525 Val Ala Phe Leu Asn Thr Phe Glu Lys Ser Ile Tyr Glu Val Ala Glu 530 535 540 Thr Gly Lys Phe Glu Tyr Ser Leu Asp Ser Glu Ile Asn 545 550 555 <210> 4 <211> 1665 <212> DNA <213> Saccharomycopsis fibuligera <400> 4 atgaccagtg aaactctaca gacgtcttca tccagctttc cagcttctga agcaagccag 60 aaggattcta cccctgctca aactacacaa acagcccaaa agcaaggacc agtgaaatct 120 aaagatgatt tgacttacaa agctccgttt ttggaaagaa atttctactt tagtagtaag 180 cacgagcttt ttaactgttt cggtgtgtcc atcgtcgtta acaaaccaat atctagagag 240 cagttttacg tggcattgag aaaaattata ctcaagtatc caaaatctat taccagcgtt 300 tacgatgagt ttgatagaga gcaccactta aggttcatcc caaaaactaa aatcatattt 360 gatgacaatg ccgttgagtt caacgaaaaa tttgaccaat atccttacca aaacaaagaa 420 ctttctgctt tgttaaccag ctatcgtttc gacgcagacc cgaacaatgg gaagccaagt 480 tggaaaattg tttattttcc taaaattaag atgctttcat ggctatttga ccacccaatc 540 agtgatggtg catcaggagc tgctttttgc aaagaattgg tagaatcttt gaactatatt 600 actcaaaaag agcttgatga agctaaagat ttgtttgaaa gttcagccgc taataaaaaa 660 gcggtggaat tgtttaattt ggaaaaagat atatccaagt ttgaaaatcc catcactcca 720 gattcattca aaattgccgg ctacaagcca agcttagctg aaaaaatagg tacaccaatt 780 ttgagatttt ttttggacaa atttccaaaa ctttttccat tggtgatcga aggcgaaatg 840 cacaagcagc agtttgttga tacaaaacct ataaaatttg ataacaaaaa gttttttgta 900 agggagcagg atgtcattag caaagacagt ccattgtgtg gtcaagcatt gacctacatt 960 cgtattgatc cagaaaccac tgccaaaatt cttcagcaat gtcgtaacaa taacaccaag 1020 ttccaaacca ctttcatgat ggtttttctt tctactattc acgaaattgc tcctgaagca 1080 tacactaaca aatacttgaa aattgtgact gccgccaact tcagacacat tttcccaaac 1140 tataaatatg gtcacagcaa atttttatcc aagccggatt cgtacaccaa agaaacaggt 1200 caatttaaag atgggttcca tgaccacgca gtggtatttt atgttgagcc attcaagaag 1260 tttaattgga 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atgttgagcc attcaagaat 1260 tttagttgga atcttgtcca gaagtaccac aacttcttac acaaattgat tcgatcaaga 1320 cagtggtttt ctggttatta cttggcatct gaagcagttt ctgcaaagac attctttgat 1380 caaaaaatcg gtacccacga cgacacctat tttgccctta ctaaccttgg gtttgtggat 1440 cttatcgact ataaggaaga tgccagcaat aagtaccaga ttgaagatct tatctttact 1500 gcgtctcctg gtccaatgac cggtactcat tccgctgtcc tcactagcac caaaaacgga 1560 atcaatatct gtgttgctga tcaagatccg gccataaatt ccgaggagtt cagagctcgg 1620 cttacagaaa acttgcgtaa gcttgcagaa ttaggcaacg tttaa 1665 <210> 6 <211> 1674 <212> DNA <213> Saccharomycopsis fibuligera <400> 6 atgagcgcca ctaccaacaa tgcttcagct gatgccatcc tgaagcctga aacaattcaa 60 aaatgccaaa gcccaccacc tagtgtttcc aaagatgctt attgttttga tttaaaattt 120 cctggagata tattttacta cgcaaacaaa atggaccttt ttgagaattt tcaaattgcc 180 gtcaaacttg caaagccagt atcaaaatct gaattgttta ctgcacttca aaaacttttg 240 tttaaattcc cgttattggc atccactgtg tacaatggtg aagatgagac tgttaagcca 300 cgcacgatcg gtccaagatc agtaatctat ttcgaaaatg tttatgaaca tagaaaagaa 360 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atatcgagcc acttagaaag ttttcttggg atcttatcaa aaaatacaaa 1260 gactactttc ataaatcaat tcaaggtagc gctttggcag ctgctgccta taaaatgtat 1320 acatttgtgg atggtatcaa gcttattaat ttactttatg gtctcaaaag acaaacattt 1380 ttactaagtt ctaatttggg attcgttcat gtcaaaaagt acagcgatga taatgcttcc 1440 caccaaaacg atattaaaga tctcatcttt atgtctgttc caggagctgt ttatggtgag 1500 tgtggcttga catcagtgag tactactgaa ggtggcctta acttgtttgt aatggttagt 1560 gaggaagaga ctaaggaaaa ttttgttgcc tttttaaaca cttttgagaa gtccatttat 1620 gaagttgctg aaactgggaa atttgaatac tccttggatt ctgaaatcaa ctaa 1674

Claims

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서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfATF(A)2 단백질, 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfATF(B)2 단백질 및 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 SfATF(B)6 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈(alcohol acetyltransferase)를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로, ATF1 유전자 및 ATF2 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 형질전환시킨 아세테이트 에스테르 향미 성분 생산능이 증진된 재조합 미생물.
제7항에 있어서, 상기 알코올 아세틸트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자는 서열번호 4로 표시된 염기서열로 이루어진 SfATF(A)2 유전자, 서열번호 5로 표시된 염기서열로 이루어진 SfATF(B)2 유전자 또는 서열번호 6으로 표시된 염기서열로 이루어진 SfATF(B)6 유전자인 것을 특징으로 하는 아세테이트 에스테르 향미 성분 생산능이 증진된 재조합 미생물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 아세테이트 에스테르는 이소아밀 아세테이트, 2-페닐에틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트인 것을 특징으로 하는 아세테이트 에스테르 향미 성분 생산능이 증진된 재조합 미생물.
제7항의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아세테이트 에스테르 향미 성분 생산방법.
제10항에 있어서, 상기 아세테이트 에스테르는 이소아밀 아세테이트, 2-페닐에틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트인 것을 특징으로 아세테이트 에스테르 향미 성분 생산방법.