KR101651951B1 - 전분 분해 활성 및 알코올 생성능을 동시에 갖는 내열성 사카로마이콥시스 피불리게라 mby1320 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효주 - Google Patents

전분 분해 활성 및 알코올 생성능을 동시에 갖는 내열성 사카로마이콥시스 피불리게라 mby1320 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효주 Download PDF

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Abstract

본 발명의 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주는 전분을 분해하는 동시에 에탄올 발효가 가능하고, 내열성이 우수하기 때문에 발효주 제조시 공정이 단순화될 수 있고, 제조 시간이 단축될 수 있는 우수한 효과를 발휘한다.

Description

전분 분해 활성 및 알코올 생성능을 동시에 갖는 내열성 사카로마이콥시스 피불리게라 MBY1320 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효주{Thermostable Saccharomycopsis fibuligera MBY1320 with amylolysis and alcohol production ability and fermented liquor therefrom}
본 발명은 전분 분해 활성 및 알코올 생성능을 동시에 갖는 균주 및 이를 이용한 발효주의 제조에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 고온에서도 빠른 비성장속도 및 에탄올 생산 속도를 보이는 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera, S. fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주 및 이를 이용하는 발효주의 제조방법에 관한 것이다.
막걸리를 비롯한 우리나라 전통 발효주는 쌀을 주원료로 하기 때문에 병행복발효 방식으로 제조되고 있다. 병행복발효란 전분분해(당화)와 발효의 공정이 분명하게 구별되지 못하고 두 가지 작용이 병행해서 이루어지는 발효를 말하며, 막걸리와 같은 탁주, 청주 및 약주를 제조할 때 쓰이는 발효법이다.
알코올 발효능이 있는 효모는 단당류가 주요 에너지원으로 포함되어 있는 과일과 같은 소재를 이용할 경우, 알코올을 바로 생성할 수 있으나, 다당류 형태로 주요 에너지원을 저장하는 쌀과 같은 소재를 이용할 경우, 당화된 후에라야 비로소 알코올을 생성할 수 있다. 따라서, 전분질 소재로부터 발효주를 제조하기 위해서는 당화공정이 필수이고, 우리나라에서는 자연상태의 곰팡이, 효모 및 세균을 이용하여 제조된 누룩이 사용되고 있다.
막걸리 발효에 큰 영향을 끼치는 누룩은 밀이나 보리, 쌀 등 곡류에 물을 첨가한 후 반죽하고 성형하여 자연적으로 발효시켜서 제조된다고 알려져 있다. 따라서, 누룩 제조 과정 동안 주변환경으로부터 유래된 다양한 미생물이 자연적으로 생육되므로 생산된 지역의 기후나 풍토, 제조 환경 등에 따라 다른 누룩이 만들어 지게 된다. 이러한 누룩에 존재하는 다양한 미생물은 효소활성, 알코올 발효력, 유기산과 유리 아미노산 생성능 등에서 차이를 나타내게 되고, 결국 막걸리의 맛, 향기, 색 등의 품질 특성에 영향을 미치게 된다.
누룩의 다양한 미생물 중에서도 '효모'는 GRAS(generally recognized as safe) 균주로서 오래전부터 주류, 장류 등의 전통발효 식품 제조에 사용되고 있으며, 최근 건강기능성 식품 소비의 증가에 따라 효모에 의해서 생성되는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase) 저해물질, 항고혈압성 안지오텐신 전환효소(angiotensin-converting enzyme, ACE) 저해물질, 항통풍성 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해물질 및 항치매성 베타 세크레타아제(β-secretase) 저해물질과 같은 다양한 기능성 소재들이 보고된 바 있다.
이러한 효모 중 가장 많은 연구가 이루어진 것이 사카로미세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)인데, 이 균주는 발효 속도가 느린 편이며, 전분질을 분해할 수 없는 단점이 있다.
대한민국 공개특허 제10-2009-0089189호(발명의 명칭: 신규한 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모 및 이를 이용한 전통주의 제조방법)에는, 전분분해활성을 갖는 효모와 알코올 발효능을 갖는 효모를 융합하여 전분분해활성과 알코올 발효능을 갖는 새로운 효모융합체 개발에 대해 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-0462279호(발명의 명칭: 에탄올 내성 균주 사카로마이세스 세레비제 에스이 211 및 이를 이용한 청주의 제조방법)에는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) SE211를 이용한 청주의 제조방법에 대해 기재되어 있다.
상기 특허들에는 전분분해 활성 및 알코올 생성능을 동시에 갖고 우수한 발효능을 보이는 내열성 효모 균주에 대해서는 기재된 바가 없다. 따라서, 본 발명은 전분분해 활성 및 알코올 생성능을 동시에 갖고 우수한 발효능을 보이는 내열성 효모 균주를 개발하여 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전분분해 활성 및 알코올 생성능을 동시에 갖는 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주를 제공한다.
한편, 본 발명은 발효주를 제조하는 방법에 있어서, 발효 균주로 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는 발효주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주는 전분을 분해하는 동시에 에탄올 발효가 가능하고, 내열성이 우수하기 때문에 발효주 제조시 공정이 단순화될 수 있고, 제조 시간이 단축될 수 있다.
본 발명은 발효주를 제조함에 있어서, 발효 균주로 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주를 사용하는 것에 특징이 있는 것으로, 발효주 제조에 관한 그 외의 사항은 공지의 기술을 이용할 수 있다. 일 예로, (a) 수확된 벼를 쪄서 제조한 찐 쌀을 준비하고, 준비된 상기 찐 쌀을 1~5mm 이하의 입자를 갖도록 분쇄하여 찐쌀 가루를 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 단계와는 별도로, 통밀을 분쇄한 밀가루에 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) 속 MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주를 접종하고, 덩어리 내부에 지지체를 이용하여 공간부를 확보하거나 건조된 밀가루, 건조된 누룩 가루 또는 건조된 풀을 이용한 충진물을 충입하여 누룩 덩어리를 성형한 후, 성형된 누룩 덩어리를 발효시켜 누룩을 준비하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 찐 쌀 가루 20~50중량%와 상기 (b) 단계의 누룩 가루 50~80중량%의 비율로 혼합하고, 물을 첨가한 후, 발효시켜 원주를 제조하는 단계; (d) 상기 원주에 포함된 이물질을 제거하여 단계;로부터 발효주를 제조할 수 있는 것이다.
한편, 본 발명에 따른 발효주는 다양한 원료로부터 제조될 수 있는데, 일 예로는 쌀로부터 제조되는 막걸리가 있다.
본 발명의 사카로마이콥시스 피불리게라 (Saccharomycopsis fibuligera , S.fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주는 전분을 분해하는 동시에 에탄올 발효가 가능하고, 내열성이 우수하기 때문에 발효주 제조시 공정이 단순화될 수 있고, 제조 시간이 단축될 수 있는 우수한 효과를 발휘한다.
도 1은 누룩에서 분리한 7종 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera) 균주의 전분분해 활성을 요오드 염색법으로 조사한 사진이다.
도 2는 누룩에서 분리한 7종 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera) 균주의 비성장속도 (specific growth rate)를 나타낸 그래프이다 (■: 30℃, □: 37℃, ▧: 42℃).
도 3A는 누룩에서 분리한 7종 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera) 균주의 알파 아밀라아제(α-Amylase) 효소활성을 나타낸 그래프이다 (■: 30℃, □: 37℃, ▧: 42℃).
도 3B는 누룩에서 분리한 7종 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera) 균주의 글루코아밀라아제(glucoamylase) 효소활성을 나타낸 그래프이다 (■: 30℃, □: 37℃, ▧: 42℃).
도 4A는 대조구인 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera) KCTC7806 균주의 에탄올 생산량을 나타낸 그래프이다 (●: OD600, ○: ethanol).
도 4B는 본 발명의 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주의 에탄올 생산량을 나타낸 그래프이다 (●: OD600, ○: ethanol).
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 누룩으로부터 효모 분리 및 동정]
전국 각지에서 수집한 누룩으로 8개 지역(진주, 용인, 상주, 예산, 제주, 광주, 부산, 상주)의 재래시장에서 시판되는 누룩과, 농가에서 직접 제조한 누룩을 포함하여 총 11개 샘플을 수집하였다. 누룩을 수집한 후, 분쇄한 누룩 1 g을 펩톤수 9 ml에 현탁하였다. 현탁 후, 적정 희석배수로 희석하여 클로람페니콜(chloramphenicol) 100 mg/ℓ이 함유된 YEPD (효모 추출물 1 %(w/v), 펩톤 2 %(w/v), 글루코스 2 %(w/v)) 평판배지에 도말하였다. 도말한 배지는 30℃에서 48시간 동안 배양한 후, 현미경 관찰을 통하여 효모로 추정되는 집락을 분리하고, 집락에서 60종의 효모를 분리하여 평판배지에서 배양하였다.
상기 배양된 60종의 효모에 ITS(Internal transcribed spacer)영역을 증폭할 수 있는 프라이머인 ITS1(5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´)과 ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´)를 사용하여 18S rRNA 단편을 증폭하였고, NL1(5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´) 및 NL4(5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3´) 프라이머를 사용하여 26S rDNA 영역의 D1/D2 단편을 증폭 후, 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)의 블라스트(blast)를 사용하여 18S rRNA 및 26S rDNA 유전자 단편의 염기서열 상동성을 근거로 동정하였다.
동정결과, MBY1276 및 MBY1280로 명명된 균주는 기존에 보고된 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera)와 99%의 상동성을 나타내었으며, MBY1320 (수탁번호: KACC93213P), MBY1322, MBY1323, MBY1324 및 MBY1327로 명명된 균주는 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera)와 100%의 상동성을 나타내었다.
따라서, 하기 실험예에서는 MBY1276, MBY1280, MBY1320 (수탁번호: KACC93213P), MBY1322, MBY1323, MBY1324 및 MBY1327와 같은 7종의 효모를 사용하였으며, 대조구 균주로서 사카로마이콥시스 피불리게라(S. fibuligera) KCTC7806 균주를 미생물자원센터(KCTC, Korea)로부터 분양받아 사용하였다.
[실험예 1: 전분분해 활성 측정]
본 실험예에서는 1%의 가용성 전분을 함유한 YEPS(효모 추출물 1 %(w/v), 펩톤 2 % (w/v), 가용성 전분 1 % (w/v)) 고체배지를 사용하여 상기 실시예 1에서 동정한 효모 균주 7종의 전분분해 활성을 측정하고자 하였다.
효모 균주는 YEPS 액체배지에서 대수증식기로 성장할 때 회수하여 멸균수로 희석하고 동량을 고체배지에 분주한 후, 세포의 성장을 관찰하였다. YEPS 고체배지에서 효모에 의한 가용성 전분의 분해를 관찰하기 위하여 요오드-전분반응법을 사용하였다. 요오드용액(I2 2 %(w/v), KI 0.5 %(w/v), Simgma-Aldrich)을 평판배지에 분주한 후, 10분 동안 실온에서 반응하여 생성된 투명환의 크기를 관찰하였다.
관찰결과, 37℃에서 MBY1276, MBY1280, MBY1320 (수탁번호: KACC93213P), MBY1322 및 MBY1323 균주는 대조구인 KCTC7806 균주와 비슷한 크기의 전분 분해환을 나타내었으며, 예산지역의 누룩에서 분리된 MBY1327 균주는 전분 분해환 크기가 가장 작게 나타났다. 42℃에서는 MBY1280, MBY1320 (수탁번호: KACC93213P), MBY1322, MBY1323 및 MBY1327 균주는 전분 분해환을 나타내었으나, KCTC7806 균주와 MBY1324 균주는 전분분해환을 거의 나타내지 않았다 (도 1). 도 1은 누룩에서 분리한 7종 사카로마이콥시스 피불리게라 (S. fibuligera) 균주의 전분분해 활성을 요오드 염색법으로 조사한 사진이다.
[실험예 2: 비성장속도 측정]
본 실험예에서는 배양온도에 따른 효모균주의 비성장속도(specific growth rate)를 측정하기 위하여 YEPS 액체배지에 초기 세포 흡광도(OD600)가 0.1이 되도록 상기 실시예 1의 효모 균주 7종을 각각 접종한 후 30, 37, 42℃의 진탕배양기를 이용하여 배양하면서 각 균주의 대수증식기에서 비성장속도를 측정하고자 하였다.
측정결과, 대조구인 KCTC7806 균주의 비성장속도는 37℃에서 0.25 h-1로 측정되었으며, 42℃에서는 93.7% 감소한 수준인 0.02 h-1로 나타났다. 누룩에서 분리한 사카로마이콥시스 피불리게라 균주 중에서 MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주는 37℃에서 비성장속도가 0.31 h-1로 대조구보다 높은 비성장속도를 나타냈으며 42℃에서 비성장속도가 0.28 h-1로 대조구인 KCTC7806 균주의 비성장속도보다 높은 수치를 나타내었다.
이상의 결과로부터 MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주가 대조구보다 내열성이 우수한 것을 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 누룩에서 분리한 7종 사카로마이콥시스 피불리게라 (S. fibuligera) 균주의 비성장속도를 나타낸 그래프이다 (■: 30℃, □: 37℃, ▧: 42℃).
[실험예 3: 효소 활성 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 수득한 효모균주 7종의 알파 아밀라아제(α-Amylase) 효소활성 및 글루코아밀라아제(glucoamylase) 효소활성을 측정하고자 하였다.
알파 아밀라아제(α-Amylase) 효소활성은 선행문헌(Park JW, Kim BJ, Lee JW, and Kim YB. 2002. Purification and characterization of a 238 maltopentaose-producing amylase from bacillus megaterium KSM B-404. Kor. J. 239 Microbiol . Biotechnol . 30: 352-358)의 방법을 일부수정하여 측정하였다.
YEPS 액체배지에 흡광도(OD600)가 0.1이 되도록 사카로마이콥시스 피불리게라 균주 7종을 각각 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하고 균체를 제거한 상등액으로 효소활성을 측정하였다.
효소반응은 인산 완충액(50 mM, pH 6)에 조효소액 0.2 ml와 기질용액인 가용성 전분(1% w/v) 1 ml를 첨가하고, 30, 37, 42℃의 반응온도에서 30분 동안 각각 반응하였다. 반응액 0.1 ml를 취하여 1 ml의 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS) 용액과 100℃에서 10분간 반응 시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 브래드퍼드 염색 시약(Bradford Dye Reagent, Bio-Rad, USA)을 이용하여 제조사가 제시한 조건에서 단백질 농도를 측정하였으며, 적정 농도로 희석된 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, Biosesang, Korea)을 이용하여 검량선을 작성하였다. '균체농도'는 흡광광도계(GE healthcare, Sweden)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 1 unit(U)의 효소활성은 1분 동안 1 μmole의 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
한편, 글루코아밀라아제(glucoamylase) 효소활성은 선행문헌(Liu GL, Wang DS, Wang LF, Zhao SF, and Chi ZM. 2011. Mig1 is involved in 220 mycelial formation and expression of the genes encoding extracellular enzymes in 221 Saccharomycopsis fibuligera A11. Fungal. Genet. Biol. 48: 904-913.)의 방법을 수정하여 측정하였다.
YEPS 액체배지에서 흡광도가 0.1이 되도록 사카로마이콥시스 피불리게라 균주 7종을 각각 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 상등액으로 효소활성을 측정하였다.
아세트산 완충액(10 mM, pH 5)에 조효소액 0.7 ml과 기질용액인 가용성 전분(1%, w/v) 0.2 ml를 첨가하여 30, 37, 42℃에서 30분 동안 각각 반응시킨 후, 100℃에서 10분 동안 가열하여 반응을 종결시켰다. 효소반응이 종결된 반응액은 포도당 정량키트(YD Diagnostic, Korea)를 사용하여 생성된 포도당의 양을 측정하였다. 브래드퍼드 염색 시약(Bradford Dye Reagent, Bio-Rad, USA)을 이용하여 제조사가 제시한 조건에서 단백질 농도를 측정하였으며, 적정 농도로 희석된 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, Biosesang, Korea)을 이용하여 검량선을 작성하였다. '균체농도'는 흡광광도계(GE healthcare, Sweden)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 1 unit(U)의 글루코아밀라아제(glucoamylase) 효소활성은 1분 동안 1 μmole의 포도당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
실험결과, 대조구인 KCTC7806 균주는 37℃에서 가장 우수한 알파 아밀라아제(α-amylase) 효소활성을 나타냈지만, 반응온도의 증가에 따라 효소활성이 급격히 감소하였다. MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주는 대조구인 KCTC7806 균주보다 낮은 수준의 알파 아밀라아제(α-amylase) 효소활성을 나타내었지만 반응온도가 증가함에 따라 알파 아밀라아제(α-amylase) 효소활성이 유의적으로 증가하는 경향을 나타냈다 (도 3A).
한편, 대조구인 KCTC7806 균주의 글루코아밀라아제(glucoamylase) 효소활성은 30℃에서 상대적으로 높은 효소활성을 보이지만, 반응온도가 증가할수록 효소활성이 유의적으로 감소하여 42℃에서는 효소활성이 거의 나타나지 않았다. MBY1280, 1322, 1323 및 MBY1324 균주는 글루코아밀라아제(glucoamylase) 효소활성이 KCTC7806 균주에 비해 상대적으로 낮았다. MBY1276 균주는 30℃에서 583.0 U으로 높은 효소활성을 나타냈으나, 37℃이상으로 반응온도가 상승하면서 활성이 급격히 감소하였다. 다만, MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주는 반응온도가 증가할수록 글루코아밀라아제(glucoamylase) 효소활성이 증가하였으며, 42℃에서 1,006.9 U로 가장 우수한 효소활성을 나타내었다 (도 3B).
상기와 같은 결과는, MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주가 대조구인 KCTC7806 균주를 비롯한 다른 사카로마이콥시스 피불리게라 균주에 비해 내열성이 있다는 것을 의미한다.
[실험예 4: 균체 성장속도와 에탄올 생산속도 비교]
본 실험예에서는 가용성 전분을 탄소원으로 사용하여 42℃의 온도에서 대조구인 사카로마이콥시스 피불리게라 KCTC7806 및 본 발명 MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주의 성장속도와 에탄올 생산속도를 비교하고자 하였다.
'에탄올 농도'는 Rezex ROA-90 Oranic Acid H+ (Phenomenex, USA) 컬럼이 장착된 고속액체크로마토그래피(HPLC, Shimadzu, Japan)로 측정하였으며, 0.005 N 황산용액을 이동상(0.6 ml/min)으로 사용하였다. Analytic Profile Index 20 C AUX kit (bioMerieux, France)를 제조사의 사용방법에 따라 사용하여 효모균주의 탄소원 대사특성을 조사하였다. 모든 측정은 3회 수행하였으며, 평균값과 표준오차는 시그마플롯(SigmaPlot, SPSS Software Inc., USA)을 사용하여 분석하였다.
실험결과, 대조구인 KCTC7806 균주는 42℃에서 에탄올 생산량이 배양 36시간 경과 후 약 0.25 g/l 이었으나 (도 4A), MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주는 0.32 g/l로 상대적으로 우수한 에탄올 생산성을 나타내었다 (도 4B).
또한, 가용성 전분을 탄소원으로 이용하여 성장할 때, MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주의 비성장속도가 KCTC7806 균주보다 유의적으로 높은 수준을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 사카로마이콥시스 피불리게라 MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주가 비교적 높은 온도에서 알코올 생성능이 우수한 것으로 판단할 수 있었다.
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC93213P 20140925

Claims (3)

  1. 전분분해 활성 및 알코올 생성능을 동시에 갖는 내열성 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주.
  2. 발효주를 제조하는 방법에 있어서,
    발효 균주로, 내열성 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) MBY1320 (수탁번호: KACC93213P) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는 발효주의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 발효주는,
    막걸리인 것을 특징으로 하는 발효주의 제조방법.




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