KR100767383B1

KR100767383B1 - 신규한 전분자화성 효모와 그 용도

Info

Publication number: KR100767383B1
Application number: KR1020060110688A
Authority: KR
Inventors: 박환희; 홍주헌; 박치덕; 정희경
Original assignee: 박환희; 홍주헌
Priority date: 2006-11-09
Filing date: 2006-11-09
Publication date: 2007-10-17

Abstract

본 발명은 신규한 전분자화성 효모와 그 용도에 관한 것으로, 전통적인 방법으로 제조한 누룩으로부터 전분자화성 효모를 분리한 다음 에탄올 내성과 당내성이 우수한 특성을 가지는 균주를 최종 선발하여 상기 선발된 효모의 배양시간, 온도 및 pH에 따른 효모 생육 및 효소생산성을 조사하고 상기 효모가 생산하는 아밀라제의 활성에 미치는 온도 및 pH의 영향을 조사한 후 상기 선발된 효모가 생산하는 아밀라제의 pH 및 열안정성, 금속염 및 저해제에 대한 안정성을 조사하고 마지막으로 알코올 발효력을 측정함으로써 에탄올 내성과 당내성이 우수하고 전분자화성을 가지는 신규한 효모와 이의 알콜 발효 용도를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

사카로마이세스 세레비지아에, 전분자화성, 알코올 발효, 효모

Description

신규한 전분자화성 효모와 그 용도{New starch utilizing yeast and use thereof}

도 1은 전통적인 방법으로 제조한 누룩으로부터 전분분해능을 보이는 효모가 생성한 노란 환을 보여주는 사진도이다.

도 2는 ITS 4 프라이머를 이용한 HA27로부터 얻은 증폭된 ITS 염기서열의 블라스트 서칭 결과를 보여주는 것이다.

도 3은 배양시간에 따른 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 아밀라제 생산성을 보여주는 그래프이다. 여기에서 세포성장은 -●-이고, 아밀라제 활성은 -○-이다.

도 4는 온도에 따른 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 아밀라제 생산성을 보여주는 그래프이다. 여기에서 세포성장은 -●-이고, 아밀라제 활성은 -○-이다.

도 5는 pH에 따른 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 아밀라제 생산성을 보여주는 그래프이다. 여기에서 세포성장은 -●-이고, 아밀라제 활성은 -○-이다.

도 6은 온도에 따른 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 아밀라제 활성을 보여주는 그래프이다.

도 7은 pH에 따른 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 아밀라제 활성을 보여주는 그래프이다.

도 8은 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 아밀라제 활성에 대한 열안정성을 보여주는 그래프이다.

도 9는 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 아밀라제 활성에 대한 pH 안정성을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 신규한 전분자화성 효모와 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전통적인 방법으로 제조한 누룩으로부터 전분자화성 효모를 분리·선발하여 이를 동정함으로써 얻은 알콜 발효에 적합한 전분자화성의 신규한 효모와 이의 알콜 발효 효모로서의 용도에 관한 것이다.

술은 나라마다 많은 종류가 있으며, 술마다 독특한 맛과 향이 있다. 우리나라도 삼한시대 이래 지역 고유의 술들을 빚기 시작하였으며, 그 지역 자연환경에 따라 미생물, 양조용수, 원료곡물의 차이에 의해 지역 고유 특성을 지닌 술이 현재까지 전해 내려오고 있다. 현재, 우리나라의 전통주는 약주, 탁주, 증류식 소주, 민속주로 나눌 수 있으며, 이들 중 특히 민속주는 주세법상 주종구분에 의한 명칭이 아니고 명맥이 남아있는 전통적인 방법으로 빚은 전통술을 발굴 지원하기 위하여 제조면허를 부여한 술을 말한다.

전통 민속주는 양조방식에 있어서 주로 백미를 주원료로 고두밥, 죽, 떡 등으로 제조하며, 누룩을 발효제로 이용하여 밑술을 제조하고 덧술을 치는 병행복합발효 방식으로 제조되고 있다. 특히 담금에 있어서 현대적 양조과정과 같이 순수 배양한 효모를 사용하지 않으며, 자연적으로 곡물에 생육하는 곰팡이, 효모 및 세균에 의해 제조된 천연 발효제인 누룩을 사용하여 발효를 한다는 것이 민속주의 가장 큰 특징이다.

일반적으로 술의 발효는 α-아밀라제(α-amylase)에 의해 전분이 용액화 되고 글루코아밀라제(glucoamylase)에 의하여 용액화 된 전분이 당화되어 효모가 당화된 기질을 이용하여 에탄올이 생산되는 3단계의 과정을 거쳐서 이루어진다. 알콜 발효를 일으키는 효모는 일반적으로 전분 분해력이 결여되어 있기 때문에 당화용 효소를 얻기 위해 전통적인 양조법을 고수한 민속주에서는 누룩 중의 곰팡이에 의해 당화가 이루어지며, 현대적 양조 과정에서는 α-아밀라제와 글루코아밀라제 등의 공업적으로 생산된 효소를 당화 공정에 이용한다. 그러나 현대적 양조에 있어서도 당화를 위한 비용과 에너지, 시간, 시설, 노동 등의 전처리 공정비용은 상당 부분을 차지하고 있다. 따라서 술의 생산 비용 절감 위해서는 아밀라제 생성력이 우수한 균주를 확보하여 전분 발효성 효모 개발이 필수적이다.

국내에서는 1단계로 직접 알콜을 발효하고자 고구마, 옥수수 등을 분리원으로 자연계로부터 전분 이용성 효모를 분리하였으며, 이를 이용하여 당화공정을 거치지 않고 직접 균체 생산하고 전분자화특성에 대하여 보고 하였다. 또한 전통 누룩으로부터 분리된 전분 자화성 효모는 한세눌라 아노마라(Hansenula anomala), 한 세눌라 시도위오룸(Hansenula sydowiorum), 사카로마이코프시스 피부리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 쉬와니오마이세스 오키덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 칸디다 파비아니(Candida fabianii), 칸디다 파마타(Candida famata), 칸디다 트로피칼리스(Candidia tropicalis) 등이 있다. 이뿐만 아니라 최근 유전자 재조합과 세포 융합 기술의 발달로 전분으로부터 알콜의 단일발효를 위하여 이를 이용한 전분 분해성 알코올 발효효모 개발을 하고자 글루코아밀라제의 분비력이 있는 효모 균주 사카로마이세스 디아스티아티커스(Saccharomyces diastiaticus)와 사카로마이세스 세레비지아에(S. cereivisiae)를 융합하여 아밀라제 분비효모와 알코올 발효효모를 세포 융합한 배수합 재조합 균주를 개발하고, 전분으로부터 에탄올을 생산하는 효율을 증진시키기 위하여 재조합된 융합체들을 이용하여 에탄올을 생산하고 최적발효 조건을 규명하였다. 또한 아밀라제 인테그레이팅 벡터(amylase integrating vector)를 이용하여 α-아밀라제와 글루코아밀라제를 동시에 분비하는 단수체 효모 균주를 개발 및 아밀라제 활성을 증가시키고자 사카로마이세스 디아스타티커스(S. diastaticus)와 칸디다 트로피칼리스(C. tropicalis)간의 세포융합에 관한 연구도 있다.

그러나 전분을 기질로 한 알코올 발효성 효모의 산업적 이용을 위해서는 융합된 세포들은 유전 안정성 검증이 필수적이며, 이에 대한 연구는 드문 실정이다. 또한 현재 효모는 알콜 발효를 위한 적합한 균주로 에탄올 내성이 높거나 고온과 고농도의 당에서 생육을 충분히 할 수 있어야 하나 여기에 대한 조사는 없다.

따라서 본 발명자는 상기와 같은 점을 고려하여 대구 달성군 유가면에서 전 통적 방법으로 제조한 누룩으로부터 유래되는 알콜발효에 적합한 전분자화성 효모를 분리하고 상기 효모의 알콜 발효 효모로의 이용가능성을 조사함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 전분자화성 효모와 그 용도를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 전통적인 방법으로 제조한 누룩으로부터 전분자화성 효모를 분리·선발하여 이를 동정하고 상기 효모의 알콜 발효에 대한 적합성을 조사함으로써 달성하였다.

본 발명은 신규한 전분자화성 효모와 그 용도를 제공한다.

본 발명의 신규한 전분자화성 효모는 전통적인 방법으로 제조한 누룩으로부터 분리동정되었으며 에탄올 내성이 높고 고온과 고농도의 당에 대해서도 내성을 가진다.

상기 본 발명의 균주는 동정 결과 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) 균주에 속했으며 본 발명에서는 이를 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiase) HA27이라 명명하고 2006년 11월 6일자로 농업생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호를 KACC 93045P로 부여받았다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 누룩으로부터 전분 자화성 효모의 분리 및 선발

대구 달성군 유가지역에서 제조된 누룩으로부터 전분자화성 효모를 분리하고자 분쇄한 누룩 1 g에 멸균증류수 10 mL를 첨가하고 충분히 혼합한 후 10배 희석한 희석액 100 μL를 효모 맥아 추출 한천 배지(Yeast malt extract agar)(한천 2%, 글루코즈 1%, 펩톤 0.5%, 효모 추출물 3%, 맥아 추출물 3%, pH 6.0)에 도말하고 24시간 동안 28℃에서 배양시킨 후 생성된 집락을 분리하였다. 분리된 효모는 4℃에서 사면 배양하여 보관하면서 실험에 이용하였다.

전분자화성 효모의 선발은 전분 한천 배지(strach agar){한천 1.5%, 옥수수 전분 1%, 펩토너(peptoner) 1%, 0.12% 브로모크레졸 퍼플 용액(bromocresol purple solution)}에 분리된 균을 이쑤시개를 이용하여 접종하고 30℃에서 5일간 배양한 후 전분 가수분해에 의해 주변에 노란환이 생성되는 균주를 선발하였다.

그 결과, 육안 관찰시 노란 환을 생성하여 전분 분해능을 보이는 전분자화성 효모를 3균주 HA27, HA28, HA29를 분리할 수 있었다(도 1). 이들의 에탄올 및 당에 대한 내성을 측정한 결과, 하기 표 1을 통해 알 수 있듯이 HA27 균주의 경우 50% 글루코즈에서도 충분한 생육을 나타내었으며, 15% 에탄올 농도에서 HA28, HA29보다 양호한 생육을 나타내어 전분을 이용한 에탄올 발효를 위한 효모로 HA27를 최종 선발하였다.

이때 분리된 효모를 대상으로 당에 대한 내성 측정은 글루코즈를 40%, 50% 첨가한 효모 맥아 추출 배지(Yeast malt extract broth)(글루코즈 1%, 펩톤 0.5%, 효모 추출물 3%, 맥아 추출물 3%, pH 6.0)에 분리된 효모를 l 루프(loop) 접종하고 28℃에서 180rpm으로 24시간 동안 진탕배양 시킨 후 2% 글루코즈를 첨가한 효모 맥아 추출 배지(Yeast malt extract broth)(YM 배지)에서 분리된 효모균주에 관한 성장을 대조구로 하여 비교하였다.

또한 분리된 효모의 고농도 에탄올 내성에 관한 측정은 에탄올이 각각 5%, 10%, 15%의 농도로 함유된 YM 배지 10mL에 전 배양한 효모의 배양액을 0.1% 농도로 접종하고 5일간 배양 후 에탄올을 첨가하지 않은 YM 배지에 접종된 균주의 생육을 대조구로 하여 비교하였다. 이때 균주의 생육은 분광광도계(spectrophotometer)(Ultraspec 2100, Amersham Biosciences Co., Sweden)를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 조사하였다.

누룩으로부터 분리한 효모 성장에 대한 당 및 알코올 내성 조사

균주 번호	세포 성장(Cell growth)¹ ⁾							효소 활성 (unit/mL)²⁾
	당 농도(%)			에탄올 농도(%)
	2	40	50	0	5	10	15
HA27	2.537	1.847	0.775	1.98	1.905	0.843	0.059	200.1
HA28	2.474	1.415	0.742	1.936	1.878	0.779	0.048	183.2
HA29	2.398	1.365	0.783	1.931	1.854	0.634	0.029	112.1
[주] 1) 세포 성장은 600 nm에서 분광광도계로 측정함. 2) 아밀라제 활성 1 unit은 40℃에서 용해성 전분으로부터 1μg의 글루코즈를 생성시키는 아밀라제의 양으로 결정함.

실시예 2: 선발된 효모 균주의 동정

전통 누룩으로부터 분리된 효모의 동정은 현미경상 형태적 특성 및 바이오로그(Biolog)사의 동정시스템(Microlog TM4.0)을 이용하였으며, 효모의 아이티에스 시퀀스(ITS sequence)의 상동성을 조사하였다. 즉 분리된 효모 배양액으로부터 DNA를 정제하고 rDNA의 유니버셜 프라이머(universal primer)인 ITS 1(forward) ITS 4(reverse)를 이용하여 PCR 증폭하고 증폭된 PCR 결과물(product)을 솔젠트사에 의뢰하여 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)사의 3730엑스엘 케필러리 DNA 시퀀서(3730XL Capillary DNA Sequencer)를 이용하여 DNA 염기서열을 분석하였으며, 분석된 염기서열은 NCBI의 블라스트 서치(blast search) 후 상동성을 조사하고 선발된 효모를 동정하였다.

하향주 제조를 위하여 선발된 주모용 효모인 HA27의 동정을 위하여 Biolog사의 동정시스템(MicrologTM4.0)으로 1차 동정 후 ITS 1 프라이머(5'-TCCGT AGG TGAACCTGCGG-3'), ITS 4 프라이머(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')를 이용하여 PCR 증폭 후 partial 18Sr DNA sequence를 이용하여 NCBI의 블라스트 서치를 수행한 결과, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에 98% 상동성을 나타내어 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) HA27로 명명하고 이를 2006년 11월 6일자로 농업생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호를 KACC 93045P로 부여받았다(도 2).

실시예 3: 배양시간, 온도 및 pH에 따른 효모 생육 및 효소 생산 조사

배양시간에 따른 효모의 생육 및 아밀라제 생산성을 조사하기 위해 1L 삼각플라스크에 효소 생산을 위한 배지로 전분 배지(strach broth)(옥수수 전분 1%, 펩톤 1%)에 선발된 효모 전배양액을 1%(v/v)농도로 접종하고 2일 간격으로 배양액을 회수하고 효모 생육은 분광광도계(spectrophotemeter)를 이용하여 600nm에서 측정하였고 효소 활성은 상기의 방법으로 DNS 법으로 측정하였다.

또한 배양 온도에 따른 효소와 균주의 생육은 전분 배지(starch broth)에 선발 효모 전배양액을 접종하고 10℃, 20℃, 30℃, 40℃에서 4일간 진탕배양하여 균주 생육과 효소활성을 조사하였다.

선발균주의 효소생산에 미치는 pH의 영향을 조사하기 위하여 1N HCl 및 1N NaOH로 pH 3.0에서 11.0까지 조정한 전분 한천(strach agar) 배지에 선발균주의 전배양액을 접종한 후 균주의 생육과 효소활성을 조사하였다.

배양시간에 따른 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae ) HA27의 생육과 효소 활성을 조사 한 결과, 균주의 생육과 효소활성이 배양시간이 지남에 따라 지속적으로 증가하여 배양 9일째 효소생산과 균주의 생육이 최고였으며, 그 이후로 차츰 감소하였다(도 3).

전분 배지(Starch broth)를 이용하여 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 생육 및 효소생산에 대한 배양 온도에 대한 영향을 검토한 결과 도 4와 같이 20℃에서 균체의 생육 및 효소 활성이 최고였으며, 균주 생육의 경우 40℃에서 급격히 저하되었으나 효소 활성은 큰 차이가 없었다.

pH 3에서 11까지의 범위에서 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 생육과 효소의 생산을 조사하였다. 그 결과 효모의 최적 pH 생육범위와 동일하게 pH 5-6에서 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA 27의 생육은 최고를 나타내었으며, pH 7 이하에서는 균주의 생육은 급격히 감소하였다. 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 아밀라제 생산은 균주의 생육과 유사한 경향을 나타내었으며, pH 6.0에서 아밀라제 생산은 최대였다. 그러나 pH가 7.0 이상 상승됨에 따라 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA 27의 효소 생산은 감소하여 pH 11.0에서는 생산성이 pH 6.0과 비교시 80% 감소하였다(도 5).

실시예 4: 선발된 효모가 생산하는 아밀라제의 활성에 미치는 온도 및 pH 영향 조사

선발균주가 생산하는 아밀라제의 활성에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위하여 기질인 1% 용해성 전분(soluble starch) 0.5mL와 아세테이트 완충액(acetate buffer)(pH 5.0) 2mL 반응구에 0.5mL의 HA27 배양상등액을 첨가하여 이 혼합액을 10℃에서 70℃까지 60분간 반응시킨 후 효소활성을 분석하였고 최적 pH는 pH 4.0에서 11.0까지 조정된 완충액을 첨가하여 DNS법으로 활성을 측정하였다.

선발균주가 생산하는 아밀라제 활성에 미치는 pH 영향을 조사하기 위하여 pH 4.0-6.0은 50mM 구연산염-인산염 완충액(citrate-phosphate buffer)을, pH 6.0-8.0은 50mM Na-인산염 완충액(Na-phosphate buffer)을, pH 8.0-9.0은 50mM 트리스-HCl 완충액(Tris-HCl buffer)을 그리고 pH 9.0-11.0은 1/20M 글리신-NaOH 완충액(Glycine-NaOH buffer)을 효소반응을 위한 완충액으로 이용하여 기질과 효소액을 첨가한 후 40℃에서 60분간 반응 후 효소활성을 측정하였다.

이때 아밀라제의 활성 측정의 상세한 방법은 기질용액{50mM 아세트산 완충액에 녹인 1% 용해성 전분(1% soluble starch in 50mM acetate buffer), pH 5.0} 0.5mL와 50mM 아세트산 나트륨 완충액(sodium acetate buffer)(pH 5.0)에 균주의 배양 상등액 0.1mL를 첨가하고 40℃, 60분간 반응시킨 후 3,5-디니트로알리시클릭산(3,5-dinitroalicylic acid; DNS) 용액 0.5mL를 첨가하여 반응을 정지시키고 100℃에서 10분간 중탕시킨 후 충분히 냉각시킨 다음 반응액을 3,000rpm에서 10분간 원심분리하고 잔존 전분을 제거한 후 540nm에서 활성을 측정하는 것이다. 효소 활성 1 unit는 시간당 전분으로부터 1μg의 글루코즈를 생성시키는 양을 1 unit으로 환산하였다.

사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase)가 생산하는 아밀라제의 반응 최적 온도를 20℃에서 80℃까지 10℃간격으로 조사한 결과, 도 5와 같이 온도가 50℃까지 상승함에 따라 효소 활성도 증가하였고 그 이상의 온도에서는 큰 변화가 없었다. 60-80℃사이의 고온에서도 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase)가 생산하는 아밀라제는 50℃와 큰 차이가 없이 고온에서도 충분히 활성을 나타내어 열에 상당히 안정한 효소임을 확인할 수 있었다(도 6).

30℃에서 배양하여 얻은 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) 배양 상등액을 조효소액으로 하여 pH 4.0에서 11.0까지 범위에서 아밀라제 활성을 측정한 결과, 도 6과 같이 pH 6.0에서 50mM 구연산염 인산염 완충액(citrate phosphate buffer)을 사용시 최대 활성을 나타내었으며, pH 7.0 이하에서 급격히 저하되기 시작하여 pH 상승에 따라 효소활성은 저하되었다. 그러나 pH 11.0에서도 pH 6.0 활성의 80%이상이 잔존하였으며, pH 4.0에서도 pH 6.0 활성의 90% 이상의 활성이 여전히 유지하는 것으로 보아 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27이 생산하는 아밀라제는 광범위한 pH에서 반응을 하는 효소임을 알 수 있었다(도 7).

실시예 5: 선발된 효모가 생산하는 아밀라제의 pH 및 열안정성 조사

열에 대한 안정성은 HA27의 배양상등액을 조효소액로 하여 10℃에서 70℃까지 각각의 온도에서 30분간 열처리 후 활성을 측정하였다. 또한 pH에 대한 안정성은 선발된 효모가 생산하는 아밀라제의 배양액 3mL을 조효소액으로 하여 동결건조 후 pH 4.0-6.0은 50mM 구연산염-인산염 완충액, pH 6.0-8.0은 50mM Na-인산염 완충액, pH 8.0-9.0은 50mM 트리스-HCl 완충액 그리고 pH 9.0-11.0은 1/20M 글리신-NaOH 완충액을 각각 3mL 첨가하여 pH 4.0에서 11.0까지 4℃에서 12시간 전처리 후 위와 동일한 방법으로 활성을 측정하였다.

사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27이 생산하는 아밀라제의 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 20℃에서 70℃까지 온도에서 반응 후 기질과 반응시켜 잔존하는 효소활성을 측정한 결과, 온도 상승에 따라 다소 효소 활성이 감소하였으나 70℃에서도 잔존 활성이 95% 이상 유지하는 것으로 보아 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27가 생산하는 아밀라제는 상당이 열에 안정함을 알수 있었다(도 8).

사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27이 생산하는 아밀라제의 pH 안정성을 조사한 결과, 도 9와 보는 바와 같이 pH가 상승함에 따라 아밀라제의 활성은 다소 감소하였으나 pH 11에서도 pH 5에서 나타나는 활성의 90% 이상을 잔존하고 있어 광범위한 pH에 안정성을 나타내었다. 술의 발효에서는 젖산균의 생육에 의해 pH가 낮아져 발효액이 산성화 되는 경향이 있다.

사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27이 생산하는 아밀라제는 특히 낮은 pH에서 안정성이 높으므로 술의 발효시 pH가 낮아지더라도 충분히 그 활성을 유지하여 지속적인 알콜 발효를 일으켜 높은 에탄올 생산량을 나타낼 것으로 사료되었다.

실시예 6: 선발된 효모가 생산하는 아밀라제의 금속염 및 저해제에 대한 안정성 조사

선발균주가 생산하는 아밀라제가 금속염과 저해제에 어떠한 영향을 받는지 확인하기위해 선발균주의 배양상등액을 조효소액으로 하여 최종농도를 2×10^-3M로 용해시킨 MgSO₄·7H₂O, CaCl₂ 등의 각종 금속염과 EDTA, SDS 등 화학 저해제에 조효소액과 동량으로 첨가하여 금속염은 4℃에서 12시간, 저해제는 40℃에서 1시간 전처리 시킨 후 이를 효소액으로 하여 잔존 활성을 측정하였다.

금속이온에 대한 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27이 생산하는 아밀라제에 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 표 2와 같이 CaCl₂, FeCl₃, FeSO₄, CoCl₂. AgNO₃은 효소 활성을 다소 증가시켰으나 HgCl₂은 18.9%로 현저하게 효소 활성을 감소시켰다(표 2).

사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27의 활성에 대한 다양한 금속 이온의 영향

금속 이온들(Metal ions)¹ ⁾	상대적 활성(Relative activity)(%)
None	100
AgNO₃	201.1
Na₂MoO₄	98.9
ZnSO₄	92.2
Na₂SO₄	95.6
FeCl₃	113.3
MgSO₄·7H₂0	97.8
HgCl₂	18.9
KCl	96.7
BaCl₂·2H₂O	101.1
CaCl₂	110.0
CoCl₂	166.7
CuSO₄	81.1
LiCl	92.2
MnSO₄	104.4
ZnCl₂	92.2
FeSO₄	133.3
[주] 1) 최종 농도: 10^-3M

또한 SDS, EDTA 등 각종 화학저해제를 처리하여 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27이 생산하는 아밀라제에 미치는 영향을 조사한 결과, 표 3과 같이 SDS, 소듐 우레아(sodium urea), 소듐 아자이드(sodium azide), L-시스테인(L-cystein), CDTA, EDTA, ρ-CMB, PMSF 모두 85%이상 잔존 활성을 유지하여 화학저해제에 상당히 안정하였다. 특히 히드록시 우레아(hydroxy urea)는 무처리와 비교시 효소활성을 103.3%로 증가시켰다(표 3).

사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27의 활성에 대한 다양한 화학저해제의 영향

화학저해제(Chemicals) ¹ ⁾	상대적 활성(Relative activity)(%)
무첨가구(None)	100
SDS	93.3
히드록시 우레아(Hydroxy urea)	103.3
소듐 아자이드(Sodium azide)	94.4
L시스테인(L-cystein)	92.2
CDTA(pH 7.0)	88.9
EDTA(pH 7.0)	90.0
ρ-CMB	96.7
PMSF	93.3
[주] 1) 최종 농도: 10^-3M EDTA: 에틸렌 디아민테트라아세트산, SDS: 소듐 도데실 설페이트, CDTA: 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산, ρ-CMB: ρ-클로머큐리벤조산, AHA: 아세토하이드록사믹산

실시예 7: 알코올 발효력 조사

글루코즈 및 전분으로부터의 알코올 발효력을 조사하기 위하여 250mL 삼각플라스크에 아미노산과 암모늄 설페이트가 없는 니트로겐 베이스(nitogen base without amino acid and ammonium sulfate)(Difco, 291940)에 탄소원으로 2% 농도의 글루코즈 또는 전분을 첨가한 발효 배지 선발된 효모를 1%(v/v)로 접종하여 7일간 배양한 다음 각각의 알코올 발효능을 조사하였다. 이때 에탄올 함량은 비중법을 이용하여 국세청 기술연구소 주류분석 규정에 따라 배양상등액 100 mL를 증류한 다음 70%(v/v)를 메스실린더에 회수하고 다시 증류수를 이용하여 100 mL로 정용한 다음 주정계를 이용하여 측정하였다.

2% 글루코즈에 대한 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase)의 알콜올 발효능을 조사한 결과, 7일 뒤 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27은 최대 2.5% 알콜발효능을 나타내었으며, 같은 농도에서 전분을 이용한 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiase) HA27의 알콜 발효능은 6.2%의 알콜 생성을 보였다. 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27은 전분을 이용하여 충분히 알콜 발효를 할 수 있었으며, 지속적인 당의 생성으로 같은 농도에서 글루코즈보다 높은 알콜 발효능을 보였다(표 4).

글루코즈와 전분을 이용한 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae) HA27의 알코올 발효력

	세포 성장(Cell growth)(CFU/mL)	알코올 발효력(%)
글루코즈	1.04×10⁷	2.5
전분	3.9×10⁵	6.2

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 전통적인 방법으로 제조한 누룩으로부터 전분자화성 효모를 분리한 다음 에탄올 내성과 당내성이 우수한 특성을 가지는 균주를 최종 선발하여 상기 선발된 효모의 배양시간, 온도 및 pH에 따른 효모 생육 및 효소생산성을 조사하고 상기 효모가 생산하는 아밀라제의 활성에 미치는 온도 및 pH의 영향을 조사한 후 상기 선발된 효모가 생산하는 아밀라제의 pH 및 열안정성, 금속염 및 저해제에 대한 안정성을 조사하고 마지막으로 알코올 발효력을 측정 함으로써 에탄올 내성과 당내성이 우수하고 전분자화성을 가지는 신규한 효모와 이의 알콜 발효 용도를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업상 획기적이고 유용한 발명인 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

에탄올 내성 및 당내성을 가지는 누룩 유래의 전분자화성 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) HA27(기탁번호: KACC 93045P).
술의 제조방법에 있어서, 효모로서 제 1항 기재의 균주를 첨가하여 알코올 발효시키는 것을 특징으로 하는 술의 제조방법.