JP5051727B2 - 耐熱性エタノール生産酵母及びこれを用いたエタノール生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、高温条件下においてエタノール生産が可能な新規微生物及びこれを用いたエタノール生産方法に関し、より詳しくは、３５℃以上の温度条件下において耐熱性エタノール発酵能を有する、Kluyveromyces marxianus種に属する株及びこれを用いたエタノール生産方法に関する。

食用・工業用を問わず、エタノールは多様な用途に利用される物質であり、工業用には化学合成したエタノールが、食用は酵母などを用いた醸造エタノールがそれぞれ利用されてきている。中でも近年、バイオテクノロジーの発展とバイオマス利用への意識が高まった事により、食用だけではなく工業用、特に燃料エタノールにも発酵生産技術を利用しようとする試みが広がり始めている。エタノール生産に酵母を用いる発酵生産技術は古くから用いられてきた技術であり、その主役を担う酵母の生産性向上を目指した改良も数多く開示されている。

微生物を用いた発酵生産を工業的に適用するための改良の一つに、好熱性微生物の利用があげられる。発酵過程に伴う発熱（発酵熱）は、熱耐性の無い微生物にとっては代謝など生命活動を低下させ、これらの微生物を死に至らしめることもあるため、特に大規模な発酵容器を用いた発酵では冷却装置を設置するなど対策が採られてきている。しかし冷却装置にはコスト面の問題等もあり、また酵素化学的には高温条件下での発酵が実現すればより効率的な発酵生産に結びつくことが期待されるため、自然界から耐熱性と発酵能を併せ持った微生物を単離するか、または遺伝子組換えによって発酵微生物に耐熱性を付与することが有効である。これらの観点から、種々の耐熱（好熱）性微生物やそれを用いた発酵生産技術、例えば好熱性メタン発酵細菌、好熱性バチルス属細菌、好熱性繊維分解細菌、好熱性サーモアクチネノミセス属放線菌や、超好熱始原菌の遺伝子を他種微生物に導入し、熱耐性を導入する方法、サッカロマイセス属酵母に好熱性細菌の熱耐性関連遺伝子を発現させる方法、高温発酵性酵母クリベロミセス・マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus）を用いたエタノールの製法などが開示されている（特許文献１−８）。しかしながらこれらの発明は、主に好熱性細菌を用いた物質生産に関するものであり、また耐熱性を改良した酵母にあってはエタノール生産性が低下するなどの問題点があった。今後需要の急増が見込まれるエタノール発酵生産技術において適用可能な、熱耐性を持った微生物の開発が待たれていた。

特表２００３−５２００４５ メタンを含有する生物ガスを生成するための方法 特表２００６−５１４８３１ ペントース含有基質からの乳酸の製造 特開平５−３３６９５１ 好熱性繊維素分解菌 特開平６−３０３９６８ 好熱性放線菌 特開２０００−０５０８９４ 発酵生産物の製造法及びストレス耐性微生物 特開２００１−０６９９７９ 発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造方法 特開２００６−２８０２５３ 耐熱性酵素を高生産できる酵母変異株 特開昭６３−４２６９０ 高温発酵性酵母によるエタノールの製造法 Kourkoutas Y.et al.2002.BioresourceTechnology82,177-181. Yarrow D.etal.1998.The Yeasts ,A TaxonomicStudy 4th edition.Elsevier,Amsterdam.pp.77-100. O’Donell K.1993.Fusarium and itsnearrelatives.CABInternational,Wallingford.pp.225-233. Bergmeyer H.U.1974.Methods of EnzymicAnalysis,Vol.1.Verlag Chemic Weinheim and Academic Press,NewYork-London. AdachiO.etal.1978.Agric.Biol.Chem.42,2045-2056.

上記の現状に鑑み、本発明は、３７℃以上の温度条件下、好ましくは４０−４５℃以上の温度条件下でも効率よくエタノール発酵生産が可能な新規酵母株及びこれを用いたエタノール生産方法を提供することを課題とする。

上記課題の解決のため、本発明者らは、熱帯地域に生息する発酵微生物に着目し、野外から本課題を解決可能な微生物株を単離する方法を試みた。すなわち高濃度の糖分とエタノールを含有した培地によるスクリーニングを用い、ここで得られた種々の微生物株のエタノール発酵生産能を検討した。この中から、酵母の一種Kluyveromyces marxianus種の幾つかの株が３７℃以上の温度条件でエタノール発酵生産能を有することを見いだした。従来、発酵生産に用いられているのはサッカロマイセス属の酵母（Saccharomyces cerevisiae）やザイモモナス属発酵細菌であり、Kluyveromyces属の酵母が産業上、エタノール発酵生産に利用できることはこれまでに知られていない。本発明者らは更に、それらの株の中に３５℃以上の温度条件下でもサッカロマイセス属酵母に匹敵するエタノール生産能を有するものがあることを確認し、特にこれらのKluyveromyces属酵母株の中から、４０℃以上という発酵環境としては極めて高い温度条件下においても、サッカロマイセス属酵母の至適条件下におけるエタノール生産に劣らない生産能を示す株であるＤＭＫＵ３−１０４２株（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−２８３）、ＤＭＫＵ３−１１８株（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−２８９）、ＤＭＫＵ３−ｐ１０６株（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−２９０）、及びＤＭＫＵ３−ｐ１０４２株（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−２９１）を見いだし、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、［１］３５℃以上の温度条件におけるエタノール発酵能力を有するKluyveromyces marxianus種の耐熱性エタノール生産酵母を、糖アルコールを含有する培養液で培養することを特徴とするエタノール生産方法や、［２］糖アルコールが、ソルビトールであることを特徴とする上記［１］記載のエタノール生産方法に関する。

また本発明は、［３］耐熱性エタノール生産酵母が、４０−４９℃の温度条件下におけるエタノール発酵能力を有することを特徴とする上記［１］又は［２］に記載のエタノール生産方法や、［４］耐熱性エタノール生産酵母が、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−２８３、ＮＩＴＥ ＢＰ−２８９、ＮＩＴＥ ＢＰ−２９０、又はＮＩＴＥ ＢＰ−２９１で表される酵母であることを特徴とする上記［３］記載のエタノール生産方法に関する。

また本発明は、［５］培養液が、１５−２５％の糖分を含有する培養液であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれかに記載のエタノール生産方法や、［６］培養液が、主成分として１５−２５％の糖分を含有し、補助成分として０．０１−０．５％のアンモニウム塩、０．０１−０．５％のカリウム塩、０．０１−０．５％のマグネシウム塩のうち少なくとも１種類を含む培養液を用いることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれかに記載のエタノール生産方法や、［７］培養液が、主成分として１８−２４％の糖分を含有し、補助成分として０．０５−０．１％の硫酸アンモニウムと、０．０２５−０．１％のリン酸カリウムを含有し、ｐＨが４．８−５．２に調整された培養液を用い、３０−４０℃の温度条件下で酵母を培養することを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれかに記載のエタノール生産方法や、［８］培養液が、主成分として１６−２２％の糖分を含有し、補助成分として０．０５−０．１％の硫酸アンモニウムと、０．０５−０．１５％の硫酸マグネシウムを含有し、ｐＨが５．３−５．７に調整された培養液を用い、４０℃以上の温度条件下で酵母を培養することを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれかに記載のエタノール生産方法に関する。

また本発明は、［９］１５０−４５０ｒｐｍの振とうと、０．１−０．３ｖｖｍのエアレーションを行うことを特徴とする上記［１］〜［８］のいずれかに記載のエタノール生産方法に関する。

また本発明は、［１０］１０−１００ｍＭのソルビトールを含有する培養液を用いることを特徴とする上記［１］〜［９］のいずれかに記載のエタノール生産方法に関する。

また本発明は、［１１］サトウキビ搾り汁を原料とすることを特徴とする上記［１］〜［１０］のいずれかに記載のエタノール生産方法に関する。

本発明はまた、［１２］３５℃以上の温度条件におけるエタノール発酵能力を有することを特徴とするKluyveromyces marxianus種の耐熱性エタノール生産酵母や、［１３］４０−４９℃の温度条件下におけるエタノール発酵能力を有することを特徴とする上記［１２］に記載の耐熱性エタノール生産酵母や、［１４］寄託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−２８３で表されることを特徴とする上記［１３］に記載の耐熱性エタノール生産酵母や、［１５］寄託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−２８９で表されることを特徴とする上記［１３］に記載の耐熱性エタノール生産酵母や、［１６］寄託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−２９０で表されることを特徴とする上記［１３］に記載の耐熱性エタノール生産酵母や、［１７］寄託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−２９１で表されることを特徴とする上記［１３］に記載の耐熱性エタノール生産酵母に関する。

さらに本発明は、［１８］上記［１４］〜［１７］のいずれかに記載の耐熱性エタノール生産酵母において、１または複数個の遺伝子を改変または導入して得られる形質転換体に関する。

本発明の提供する耐熱性エタノール生産酵母を利用することにより、食品用・工業用を問わず効率的にエタノールを生産することが可能となる。特に本発明の提供する酵母は、４０℃から４５℃と高い温度条件においても効率よくエタノールを発酵生産する能力を有しており、従来の酵母を利用したエタノール発酵生産における発酵熱除去装置を小型化または不要とするため、発酵槽設備の簡素化や大型化が可能となり、設備コストの低減や生産の効率化を図ることができ、サトウキビなどバイオマスを原材料とした大規模な燃料用エタノールの発酵生産が容易に行えると期待される。

野外から単離された耐熱性エタノール生産酵母４株における、培養温度別の培養液中エタノール濃度（縦軸；％ ｗ／ｖ）の経時変化（横軸；培養開始からの時間）を示す。 ＤＭＫＵ３−１０４２株の、異なる温度条件下での培養過程におけるエタノール濃度と酵母の増殖の経時変化（横軸；時間）を示す。 ３−１０４２株と、Saccharomyces cerevisiaeの標準的な株（ＫＵ１株）の３０℃における増殖を比較して示す。縦軸はＯＤ６６０値を、横軸は培養開始からの時間（ｈｏｕｒ）を表す。 ３−１０４２株とＫＵ１株の４５℃における増殖を比較して示す。縦軸はＯＤ６６０値を、横軸は培養開示からの時間を表す。 ３−１０４２株とＫＵ１株の３０℃におけるエタノール生産能を比較して示す。縦軸は培養液中のエタノール濃度（％，ｖ／ｖ）を、横軸は培養開始からの時間を表す。 ３−１０４２株とＫＵ１株の４５℃におけるエタノール生産能を比較して示す。縦軸は培養液中のエタノール濃度（％，ｖ／ｖ）を、横軸は培養開始からの時間を表す。 ３０℃の培養条件下における、本発明の耐熱性エタノール生産酵母４株（３−ｐ１０４２，３−１０４２，３−１１８，３−ｐ１０６）とK.marxianus種酵母の標準的な株（ＮＢＲＣ１７７７）との増殖能を比較して示す。縦軸はＯＤ６６０値を、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を表す。 ３０℃の培養条件下における、本発明の耐熱性エタノール生産酵母４株と標準的な株とのエタノール生産能を比較して示す。縦軸はエタノール濃度（％，ｖ／ｖ）を、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を表す。 ４８℃の培養条件下における、本発明の耐熱性エタノール生産酵母４株と標準的な株とのエタノール生産能を比較して示す。 ４９℃の培養条件下における、本発明の耐熱性エタノール生産酵母４株と標準的な株とのエタノール生産能を比較して示す。 ４８℃の培養条件下における、本発明の耐熱性エタノール生産酵母４株と標準的な株とのエタノール生産能を比較して示す。 ４９℃の培養条件下における、本発明の耐熱性エタノール生産酵母４株と標準的な株とのエタノール生産能を比較して示す。 ４８℃の培養条件下における、ソルビトール添加の増殖への影響を表す。Ａ．はソルビトール有りを、Ｂ．はソルビトール無しの結果を示す。 ４９℃の培養条件下における、ソルビトール添加の増殖への影響を表す。Ａ．はソルビトール有りを、Ｂ．はソルビトール無しの結果を示す。 ４８℃の培養条件下における、ソルビトール添加のエタノール生産能への影響を表す。Ａ．はソルビトール有りを、Ｂ．はソルビトール無しの結果を示す。 ４９℃の培養条件下における、ソルビトール添加のエタノール生産能への影響を表す。Ａ．はソルビトール有りを、Ｂ．はソルビトール無しの結果を示す。

以下に本発明を実施するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、３５℃以上の温度条件下におけるエタノール発酵能力を有することを特徴とする、Kluyveromyces marxianus種の耐熱性エタノール生産酵母を提供する。従来、エタノールの発酵生産にはサッカロマイセス属の酵母が主に用いられてきており、遺伝子工学的手法を用いた改良技術もこれらサッカロマイセス属酵母に集中してきた。また、発酵に適した温度は室温〜３０℃付近であるとされてきており、従来のエタノール発酵産業ではしばしば発酵槽を適温に保つために冷却する設備が必要であった。Kluyveromyces属酵母については、リグニン−セルロース系の原料を用いた高温発酵や他種の酵母の生育を抑制する「キラー酵母」としての利用、乳酸発酵などにこれまで利用されてきたが（非特許文献１）、本発明は新たに、サトウキビ絞り汁などの原料から燃料用等に利用可能なエタノールを生産可能なKluyveromyces marxianus種の酵母株を提供するものである。本発明におけるKluyveromyces marxianus種の酵母株は、３５℃以上、好ましくは４０−４９℃の範囲の温度条件下でエタノール発酵能力を有する株であれば由来はどの様なものであっても良いが、好ましくは、（ａ）５−１０％の糖分と、０．０１−０．１％の硫酸アンモニウムと、２−５％のエタノールを含む培地を用い、３０−３７℃の温度条件下で培養する工程と、（ｂ）５−１０％の糖分と、０．０１−０．１％の硫酸アンモニウムと、２−５％のエタノールを含む培地を用い、４０−４５℃の温度条件下において、前記（ａ）工程で増殖した酵母株を培養する工程、の２工程を経てスクリーニングされる酵母株が適している。前記スクリーニング工程は、例えば土壌サンプルを水で懸濁し、それを（ａ）成分を含む培地、例えば液体培地や寒天培地上に蒔いて３５℃の温度条件下で培養を行い、ここで増殖したものについて更に（ｂ）成分を含む培地、例えば寒天培地上にまき、４０−４５℃の温度条件下で培養を行って目的の株をコロニーとして得るというものであり、（ａ）工程ではエタノール耐性を、（ｂ）工程では４０−４５℃における温度耐性（Thermotolerance）を選択している。前記条件を全て満たす酵母株の一例として、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にブタペスト条約に基づき寄託されているKluveromyces marxianus ＤＭＫＵ３−１０４２株（寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−２８３）、ＤＭＫＵ３−１１８株（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−２８９）、ＤＭＫＵ３−ｐ１０６株（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−２９０）、及びＤＭＫＵ３−ｐ１０４２株（寄託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−２９１）を好適に例示することができる。

本発明が提供するKluyveromyces marxianus株（ＤＭＫＵ３−１０４２株、３−１１８株、３−ｐ１０６株、３−ｐ１０４２株）は、高温条件下においてエタノール発酵能力を有する株として自然界から単離されてきた株であるが、遺伝子工学的な手法を用い、例えばエタノール発酵や温度耐性に係る本株の遺伝子を改変したり、または他種生物由来の遺伝子を本株に導入して更に有用な形質を付加したりするといった品種改良もまた有効である。遺伝子改変や導入に用いる技術としては、微生物を用いた遺伝子工学分野で通常用いられている手法を適宜応用すれば良く、本発明を限定するものではないが、例えば相同組み換えによるゲノム上の遺伝子の改変や、プラスミドベクターを用いた新規な遺伝子（群）の導入などの手法が考えられる。

本発明はまた、上記本発明の耐熱性エタノール生産酵母を用いた糖アルコール存在下でのエタノールの生産方法も提供する。すなわち、本発明のエタノール生産方法としては、３５℃以上の温度条件におけるエタノール発酵能力を有するKluyveromyces marxianus種の耐熱性エタノール生産酵母を、糖アルコールを含有する培養液で培養する方法であれば特に制限されない。嫌気的解糖というエタノール発酵の基本的な原理は本発明の提供する酵母株を利用した場合にも変わりはないため、本発明の酵母を用いたエタノールの発酵生産のためには、適当量の糖分（炭化水素）を主成分とし、好適には補助成分として窒素源とカリウム源とマグネシウムなどの微量金属を含んだ原料液に、上記態様のエタノール生産酵母を加えて発酵を行う事が可能である。発酵に用いる装置、機器、原料液の構成などは発酵産業分野において用いられているものを適宜利用すれば良く、本発明を限定するものではないが、例えば主成分として１５−２５％の糖分と必須成分としての糖アルコールとを含有する培養液、好ましくはこれら成分に加え補助成分として０．０１−０．５％のアンモニウム塩、０．０１−０．５％のカリウム塩、０．０１−０．５％のマグネシウム塩のうち少なくとも１種類を含む培養液を原料液に用いるエタノール生産方法が好適である。

下記実施例で述べる通り、本発明の提供する耐熱性エタノール生産酵母はその温度条件により好適な培養液の組成が異なるという特徴を有している。このため、３０−４０℃の温度条件下、特に３７℃付近の温度条件下におけるエタノール生産のためには、主成分として２０−２４％の糖分を含有し、補助成分として０．０５−０．１％の硫酸アンモニウムと、０．０２５−０．１％のリン酸カリウムを含有し、ｐＨが４．８−５．２に調整された培養液を用いることが有効であり、一方４０℃以上の温度条件下におけるエタノール生産のためには、主成分として２０−２４％の糖分を含有し、補助成分として０．０５−０．１％の硫酸アンモニウムと、０．０５−０．２％、より好ましくは０．１５％の硫酸マグネシウムを含有し、ｐＨが５．３−５．７に調整された培養液を用いることが有効である。

本発明の提供する耐熱性エタノール生産酵母を用いたエタノール発酵においては更に、発酵の効率を上げるために１５０−４５０ｒｐｍ（Round per minute）、好適には３００ｒｐｍに相当する振とうと、０．１−０．３ｖｖｍ（Vessel volume per minute）、好適には０．２ｖｖｍに相当するエアレーションをかけて発酵を行わせることが有効である。特にエアレーションは、下記実施例に述べるとおり大量培養系における酵母の細胞密度を上げるためにはきわめて効果的である。

本発明のエタノール生産方法においては、前記のように、耐熱性エタノール生産酵母の高温条件下における増殖能とエタノール生産能を向上させるための培養液の必須成分として、糖アルコールが必要とされる。かかる糖アルコールとしては、エリトリトール、グリセリン、ＨＳＨ、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、還元パラチノース、キシロビイトール、セロビトール等を挙げることができるが、特にソルビトールを好適に例示することができる。ソルビトールは林檎や梨などの果実に多く含まれる糖アルコールの一種で、他の糖類に比べて発酵しにくく、脂質の酸化を防ぎタンパク質を安定化させることが知られている。４０℃以上の高温条件は耐熱性エタノール生産酵母にとっても厳しい環境であり、ソルビトールの持つこれらの性質が酵母の増殖やエタノール生産の補助をすると考えられる。１０−１００ｍＭの範囲内の濃度のソルビトール、より好ましくは５０ｍＭ前後の濃度のソルビトールを含む培地など、１０−１００ｍＭの範囲内の濃度の糖アルコール、より好ましくは５０ｍＭ前後の濃度の糖アルコールを含む培地で培養することが有効である。下記実施例に示す通り、ソルビトール添加によって４８℃、４９℃という過酷な環境下でもエタノール生産を行わせることが可能になることが実証されており、特に４９℃では、標準的なK.marxianus種の酵母株に対しては効果が見られないのに対し、本発明の耐熱性エタノール生産酵母株では増殖能・エタノール生産能ともに格段に向上させる事が示され、本補助成分の添加はきわめて有効である。

本発明の提供する耐熱性エタノール生産酵母を用いたエタノール発酵生産において、原料液に含まれる主成分たる糖分については、グルコース、スクロース、フルクトースといった純粋な糖やそれらの混合物の他、酒類の原料として用いられている植物原料、例えば米類、麦類、芋類、サトウキビ、サトウカエデ、甜菜、トウモロコシなどバイオマスと総称される種々の原料が利用可能である。これらのうち単糖類、オリゴ糖類を含有するものは、その搾り汁などをそのまま用いることが可能であり、デンプンやセルロースなど多糖類を主として含有するものについては、これら多糖類を分解する酵素をあるいは分解能力を持つ微生物に多糖類の加水分解を行わせ、単糖類またはオリゴ糖類にまで分解して用いるのが好ましい。バイオマス原料から作られる「バイオエタノール」は、石油資源に代わる燃料として今後需要の増加が予想されており、本発明の提供する耐熱性エタノール生産酵母及びこの酵母が生産するエタノールを利用することによって、バイオエタノール関連産業に寄与することが期待される。上述の通りバイオエタノールの原料としては種々のバイオマスが利用可能であるが、これらの原料のうち、特にサトウキビの精糖後に残った「糖蜜（Sugar cane juice）」は、現状では飼料程度にしか利用されておらず、また高濃度の糖分を含有しているため、好適な原料である。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。

（野外からの耐熱性微生物の単離）土壌サンプル及び水サンプルはタイ王国の４つの地域、Phra NakhonSi
Ayutthaya，Ratchaburi，Suphanburi，Uthaithaniにあるサトウキビプランテーションや精糖工場から採集した。これらのサンプルを、０．０５％ 硫酸アンモニウム、４％ エタノール（ｖ／ｖ）を含むサトウキビ糖蜜培養液（５−８％ ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒｓ）に入れ、３５℃の温度条件下で、振とう機（Gallenkamp Orbital Incubator,Leicester,UK）にかけ、１７０ｒｐｍで３日間培養した。３日後、この培養液（微生物を含む）を一部取って同じ組成の寒天培地上にまき、３５℃で培養した。寒天培地上に現れた酵母のコロニー７２個をピックアップし、保存用としてＹＰＤ寒天培地（１％ イーストエクストラクト，２％ ペプトン，２％ グルコース，２％ 寒天）に移して８℃にて保存した。

（耐熱性酵母のスクリーニング）前述の７２株について、耐熱性エタノール生産株を次の方法でスクリーニングした。まずＹＰＤ寒天培地上にあるコロニーをピックアップし、三角フラスコ中の５０ｍｌサトウキビ糖蜜培養液（総糖濃度 ２％ ，０．０５％ 硫酸アンモニウム含有、１Ｎ塩酸でｐＨを４．５に調製）に植え、２５−２８℃の温度条件下で２４時間振とう培養した。ここで得られた培養液約５ｍｌを、三角フラスコ中の１００ｍｌスクリーニング用サトウキビ糖蜜培養液（スクロースを添加し、総糖濃度を１８％に調製。０．０５％ 硫酸アンモニウム含有、１Ｎ塩酸でｐＨを４．５に調製）に移し、４０℃または４５℃の温度条件下で振とう培養してその増殖を観察した。７２株のうち、５５株については４０℃での増殖が見られ、このうち３７株については４５℃でも増殖が確認された。これらの５５株のエタノール生産能を検討するため、３７℃と４０℃の温度条件下で７２時間培養を行い、培養液中に含まれるエタノール濃度を測定した結果、ＤＭＫＵ３−１０４２，ＤＭＫＵ３−１１８，ＤＭＫＵ３−ｐ１０６，ＤＭＫＵ３−ｐ１０４２の４つの株が、高いエタノール生産能を有することが明らかになった（以後株名については適宜ＤＭＫＵを省いた形で記載）。これら４株のそれぞれの温度におけるエタノール生産能は下記表１の通りであり、エタノール生産能は培養液中に含まれるエタノール濃度（％，ｗ／ｖ）で表した。他の５１株については、これら４株よりも遙かに低いエタノール生産能を示したため、以後の解析はこの４株について行った。

（酵母の同定）前述のスクリーニングで得られた４株の酵母については、その形態的、生理的、生化学的性質をＹａｒｒｏｗの方法により同定した（非特許文献２）。またこれらの酵母からゲノムＤＮＡを抽出し、O’Donnellの開発したプライマー（非特許文献３）を用いてLarge subunitｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域を増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００シークエンサー（Applied Biosystem,USA）を用いてその塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈを用いて酵母の既知種と比較した。これらの結果、特にＤ１／Ｄ２領域の塩基配列は酵母の一種Kluyveromyces marxianusのType strainの配列と一致したため、４つの酵母株はいずれもK.marxianusに分類された。

（エタノール生産能の検討−２００ｍｌスケール）５００ｍｌフラスコサイズにおける上記５５株のエタノール生産能について、２００ｍｌのサトウキビ糖蜜培養液（総糖濃度 ８％，硫酸アンモニウム濃度 ０．０５％，ｐＨ４．５）を用い、まず温度条件を検討した。この培養液に酵母株を植え、Reciprocating water bath shaker（ModelR76,New
Brunswick Scientific,USA）を用い、１１０ strokes／分で振とう培養を行った。

図１に、これら４株の各温度条件下におけるエタノール生産能を示す。グラフはそれぞれ３０，３７，４０，４５℃における各株（ＤＭＫＵ３−ｐ１０４２＝○；ＤＭＫＵ３−１０４２＝●；ＤＭＫＵ３−ｐ１０６＝□；ＤＭＫＵ３−１１８＝■）のエタノール生産能を、培養液中に含まれるエタノール濃度（縦軸；％ ｗ／ｖ）の経時変化（横軸；培養開始からの時間）として表したものであり、培養液としては総糖濃度が１８％、硫酸アンモニウム濃度が０．０５％、ｐＨが４．５の条件（リン酸一カリウムと硫酸マグネシウムは含まず）適用している。３０，３７℃における４株のエタノール濃度（グラフＡ，Ｂ）は最大で７．１３−７．６％（ｗ／ｖ）であり、このうち３−１１８株と３−１０４２株では３０℃と３７℃でエタノール濃度にほとんど差が無かったが、３−ｐ１０６株と３−ｐ１０４２株では３７℃の方が高いエタノール濃度を示した。
４０℃、４８時間後におけるエタノール濃度（グラフＣ）は、３−１０４２株が７．２３％と最も高い値を示し、しかもこの値は３７℃における７．４３％と比べても遜色のない数字であった。この値はまた、１時間・１ｌ（リットル）あたりのエタノール生産性（ｇ／ｌ・ｈで表される）にも反映されており、３７℃における生産性が１．０３ｇ／ｌ・ｈであるのに対して４０℃では１．５１ｇ／ｌ・ｈと高い値を示した。他の３株については、４８時間後におけるエタノール濃度は６．４３−６．８５％であった。
４５℃における各株のエタノール生産能（グラフＤ）は、４０℃に比べて低い傾向が見られた。４株で最も高い値を示したのは４０℃と同様３−１０４２株であり、エタノール濃度で４．９３％、生産性で１．１７ｇ／ｌ・ｈの値であった。また、４０℃、４５℃においては、３０℃、３７℃に比べて、エタノール濃度が最大値となる時間が早めにシフト（３６−４８時間）しているという特徴が見られた。以後の培養液組成の検討、ラージスケールでのエタノール生産性については、このＤＭＫＵ３−１０４２株を用いることとした。下記表２に、それぞれの温度条件下における４株のエタノール濃度と生産性をまとめた。

４０℃、４５℃で最もエタノール生産能の優れていた３−１０４２株を用い、サトウキビ糖蜜培養液の最適化を行うため、総糖濃度を１６，１８，２０，２２，２４％の５種類、硫酸アンモニウムの濃度を０，０．０５，０．０７，０．１％の４種類、リン酸一カリウムの濃度を０，０．０２５，０．０５，０．１％の４種類、硫酸マグネシウム７水和物の濃度を０，０．０５，０．１，０．１５，０．２，０．３％の６種類、ｐＨを４．０，４．５，５．０，５．５の４種類としたサトウキビ糖蜜培養液を用意し、３７℃、４０℃それぞれについてエタノール生産能とそれぞれの成分の効果を比較検討した。
総糖濃度については、３７℃、４０℃ともに糖濃度に比してエタノールの最終濃度が増加し、２２％で最大値となった。しかし２４％では下がったため、２２％付近が最適な糖濃度であると考えられた。糖濃度２２％，５４時間後におけるエタノール濃度は３７℃で８．２９％、エタノール生産性は１．５４ｇ／ｌ・ｈであり、収率（糖濃度から推計される理論値に対する割合）は７３．９％であった。４０℃においては、糖濃度２２％でエタノール濃度が最大（６．８８％）となり、最大値に到達するまでの時間も３７℃よりも短かったが、最大の生産性（１．４２ｇ／ｌ・ｈ）と収率（７２．６％）は糖濃度１６％で記録された。

エタノール生産に対する窒素源の影響を検討するため、総糖濃度２２％、ｐＨ４．５の糖蜜培養原液に０−０．１％の硫酸アンモニウムを含む４種類の培養液を用意し、３−１０４２株の培養を行った。３７℃においては、硫酸アンモニウム濃度が０．０７％のときにエタノール濃度の最大値７．８％を記録し、このときの生産性は１．０８ｇ／ｌ・ｈ、収率は６９．５％であった。しかし、生産性に関しては硫酸アンモニウム濃度が０．０５％のときの方が高く、１．３６ｇ／ｌ・ｈであった。このときの収率は６５．５％、またエタノール濃度は７．３５％であった。いずれの場合においても、硫酸アンモニウム無添加（０％）で記録されたエタノール濃度６．８５％、生産性０．９５ｇ／ｌ・ｈ、収率６１．０％に比べれば高い値であり、窒素源として硫酸アンモニウムを添加することが有効である事が明らかとなった。４０℃においても、エタノール濃度は無添加（６．２２％）に比べて添加の方が高く、特に０．０５％で良好であった。硫酸アンモニウム０．０５％添加時におけるエタノール濃度は６．６０％、生産性１．３７ｇ／ｌ・ｈ、収率５８．８％であり、無添加時における生産性１．１５ｇ／ｌ・ｈ、収率５５．４％よりも高い値であった。これらの結果から、４０℃においても適量の硫酸アンモニウム添加が有効である事が明らかとなった。

エタノール生産に対するカリウム源の影響を検討するため、総糖濃度２２％、硫酸アンモニウム濃度０．０５％、ｐＨ４．５の糖蜜培養原液に０−０．１％のリン酸一カリウムを含む４種類の培養液を用意し、３−１０４２株の培養を行った。３７℃においては、リン酸一カリウム無添加（エタノール濃度６．９２％、生産性０．９６ｇ／ｌ・ｈ、収率６１．７％）に比べて添加した方が値が高く、特に０．０５％のときに最大値（エタノール濃度７．６５％、生産性１．０６ｇ／ｌ・ｈ、収率６８．１％）を記録した。反対に、４０℃においては、リン酸一カリウム添加による向上は見られなかった。この結果から、本発明の提供する酵母を用いた３７℃以下におけるエタノール生産において、適量のカリウム源（リン酸一カリウム）の添加が有効である事が示された。

エタノール生産に対するマグネシウム源の影響を検討するため、総糖濃度２２％、硫酸アンモニウム濃度０．０５％、リン酸一カリウム濃度０．０５％、ｐＨ４．５の糖蜜培養原液に０−０．３％の硫酸マグネシウム７水和物を含む６種類の培養液を用意し、３−１０４２株の培養を行った。カリウム源とは異なり、３７℃ではマグネシウム添加の影響はほとんど見られず、反対に４０℃において無添加と比べ添加時の方が高い値を示した。特に、硫酸マグネシウム７水和物の濃度が０．１５％のときに最大値（エタノール濃度６．２８％、生産性１．０５ｇ／ｌ・ｈ、収率５５．９８）を記録し、この値は無添加時の値（エタノール濃度６．０８％、生産性０．８４ｇ／ｌ・ｈ、収率５４．２２％）と比べいずれも高い値であった。硫酸マグネシウム濃度に関しては、０．１５％添加を境にそれより高くても低くてもエタノール濃度、生産性、収率とも低くなる傾向が見られ、０．１５％内外が最適な濃度である事が示された。すなわち、本発明の提供する酵母を用いた４０℃以上におけるエタノール生産において、適量（好ましくは０．１５％）のマグネシウム源（硫酸マグネシウム）の添加が有効である事が示された。

エタノール生産に対するｐＨの影響を検討するため、総糖濃度２２％、硫酸アンモニウム濃度０．０５％、リン酸一カリウム濃度０．０５％の糖蜜培養液原液について、そのｐＨを４．０−５．５に調整した４種類の培養液を用意し、３−１０４２株を培養した。３７℃においてはｐＨ５．０でエタノール濃度（８．７０％）、生産性（１．４５ｇ／ｌ・ｈ）、収率（７７．５％）ともに最大値を記録した。一方、４０℃においては、ｐＨ５．０よりもｐＨ５．５の方が良好であり、エタノール濃度（６．７８％）、生産性（１．１３ｇ／ｌ・ｈ）、収率（６０．４％）が４条件のうちで最大値を示した。以上、００２５−００２９までの結果を、下記表３にまとめた。

表３の結果より、３７℃、４０℃それぞれの温度条件における本発明の３−１０４２株を用いたエタノール生産のための好適な培地の組成を下記表４に示した。

表３，４に基づき、３−１０４２株を用いたエタノール生産用培養液として、サトウキビ糖蜜培養液原液を基に３７℃培養用（総糖濃度 スクロースを加え２２％；硫酸アンモニウム濃度０．０５％；リン酸一カリウム濃度 ０．０５％；硫酸マグネシウム７水和物濃度 ０．１５％；ｐＨ５．０）、及び４０℃培養用（総糖濃度 スクロースを加え２２％；硫酸アンモニウム濃度０．０５％；リン酸一カリウム濃度 ０．０５％；硫酸マグネシウム７水和物濃度 ０．１５％；ｐＨ５．５）の各培養液を調製し、それぞれの温度条件下で振とう培養（１１０ ｓｔｒｏｋｅ／分）を行った。図２に、それぞれの培養液の培養過程におけるエタノール濃度（○＝３７℃，□＝４０℃，グラフ左縦軸；％ ｗ／ｖ）と酵母の成長（●＝３７℃，■＝４０℃，右縦軸；６６０ｎｍのＯＤで表す）の経時変化（横軸；時間）を示した。３７℃の培養においては、エタノール濃度が６０時間後に最大８．７％まで上昇し、このときの生産性と収率はそれぞれ１．４５ｇ／ｌ・ｈと７７．５％であった。酵母細胞数を反映する６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）は、２４時間後に第１次のピークを迎え、その後も徐々に増加し続け、５４時間後に１１．４２、７２時間後には１４．３３であった。一方、４０℃における培養では、４２時間後にエタノール濃度はほぼ平衡に達し、最大値は６．７８％であった。このときの生産性と収率はそれぞれ１．１３ｇ／ｌ・ｈと６０．４％であった。６６０ｎｍにおける吸光度については、１８時間後でほぼ平衡に達するも、その後も徐々に増加し、最終的に７２時間後には１３．５５を示した。

（サッカロマイセス属酵母とのエタノール生産能比較）ＤＭＫＵ３−１０４２株のエタノール生産能の標準化を行うため、３０℃、４５℃におけるエタノール生産能と細胞の増殖を、エタノール生産に通常用いられる酵母Saccharomyces cerevisiaeの標準的な株であるＫＵ１株と同条件下で比較した。酵母の標準的な培養液であるＹＰＤ培地（１％ Yeast extract、２％ ペプトン、２％ グルコース）に３−１０４２株とＫＵ１株を植え、３０℃と４５℃で振とう培養（１６０ｒｐｍ）を行い、６時間ごとに培養液をサンプリングしてそのＯＤ６６０値（増殖の指標）と培養液中のエタノール濃度を測定した。エタノール濃度の測定は酢酸菌（Gluconobacter suboxydans ＩＦＯ１２５２８）から単離精製されたアルコール脱水素酵素による測定法（非特許文献４，５）を用いて行った。これらの結果を図３−図６に示す。
図３、図４はそれぞれ３０℃と４５℃における３−１０４２株（▲）とＫＵ１株（■）の増殖曲線を示し、縦軸はＯＤ６６０値を、横軸は培養開始からの時間経過（ｈｏｕｒ）を表す。図３から明らかなように、３０℃では両株の増殖はほとんど同じ推移を示した。一方４５℃ではＫＵ１株はほとんど増殖が見られず、これに対して３−１０４２株では３０℃と同じかやや早い増殖が見られた。
図５、図６はそれぞれ３０℃と４５℃における３−１０４２株（△）とＫＵ１株（□）のエタノール生産をグラフ化したもので、縦軸は培養液中のエタノール濃度（％ ｖ／ｖ；１％がｗ／ｖ換算では０．８％に相当）を、横軸は培養開始からの時間経過を表す。図５に示されるように、３０℃における３−１０４２株のエタノール生産能は、６時間までの最初期の立ち上がりこそ若干遅れるものの、１２時間後にはＫＵ１株と同じ水準まで上昇し、その後の推移もＫＵ１株と同様であった。すなわち、エタノール生産という基本的な性質については、３−１０４２株はSaccharomyces cerevisiaeの標準的な株と比べても遜色ないという事が示された。４５℃においては、ＫＵ１株では増殖の悪さを反映して培養液中に少量（０．４％程度）のエタノールしか含まれないのに対して、３−１０４２株では６時間後以降、３０℃と同等またはそれ以上のエタノール（１％以上）が含まれており、この温度における３−１０４２株のエタノール生産能はS.cerevisiaeの標準的な株の２倍以上であって、高い温度条件下における３−１０４２株の有用性が示された。

（エタノール生産能の検討−３ｌスケール）５ｌ培養器サイズ，３７℃におけるＤＭＫＵ３−１０４２株のエタノール生産能を検討するため、３ｌのサトウキビ糖蜜培養液（総糖濃度 スクロースを加え２２％；硫酸アンモニウム濃度 ０．０５％；リン酸一カリウム濃度 ０．０５％；硫酸マグネシウム７水和物濃度 ０．１５％；ｐＨ５．０）を調整し、更に大量培養における振とうとエアレーションの効果を検討するため、次の４条件、すなわち（１）３００ｒｐｍ（Round per minute）振とうのみ、（２）３００ｒｐｍ振とう＋０．２ｖｖｍ（Vesselvolume per
minute）でエアレーション、（３）３００ｒｐｍで振とう＋最初の１２時間だけ０．２ｖｖｍでエアレーション、（４）最初の１２時間は３００ｒｐｍで振とう＋０．２ｖｖｍでエアレーション、以降は１５０ｒｐｍで振とうのみ、で培養を行った。
下記表５にこれらの各条件におけるエタノール生産能を比較して示す。最も低い値を示したのは振とうのみの（１）で、エタノール濃度、生産性、収率ともに４条件中最低であった。反対に最も高かったのは振とう＋継続的エアレーションの（２）で、エタノール濃度４．９６％、生産性１．３ｇ／ｌ・ｈ、収率５７．１％をそれぞれ示した。また培養液中の細胞密度の指標であるＯＤ６６０の値を見ると、（１）は５．８３と最も低く、大量培養系においては、振とうのみでは十分な酵母の増殖が見られず、その結果としてエタノールの濃度も上昇しないという事を示した。この事は、連続的なエアレーションを行った（２）が最も高いＯＤ６６０値（１２．７３）を示した事でも裏付けられ、本発明の提供する耐熱性エタノール生産酵母を用いたエタノール発酵においては、振とうに加えて適度なエアレーションが有効である事を示している。

（K.marxianus標準株とのエタノール生産性比較） 本発明で見出された耐熱性エタノール生産酵母株について、K.marxianusの標準的な株との比較を行った。標準株としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より提供を受けたＮＢＲＣ１７７７株（以下１７７７株、または標準株という）を用いた。上述したサッカロマイセス属酵母との比較と同じ培養系、すなわち酵母の標準的な培養液であるＹＰＤ培地（１％ Yeast extract、２％ ペプトン、２％ グルコース）に３−１０４２、３−１１８，３−ｐ１０６，３−ｐ１０４２株とＮＢＲＣ１７７７株を植え、３０℃と４７，４８，４９℃で振とう培養（１６０ｒｐｍ）を行い、６時間ごとに培養液をサンプリングしてそのＯＤ６６０値（増殖の指標）と培養液中のエタノール濃度を測定した。エタノール濃度の測定は酢酸菌（Gluconobacter suboxydans ＩＦＯ１２５２８）から単離精製されたアルコール脱水素酵素による測定法（非特許文献４，５）を用いて行った。

図７に、３０℃における本発明の各株と標準株１７７７株の増殖曲線を示す。グラフ縦軸はＯＤ６６０を、横軸は培養開始からの時間経過を示し、本発明の各株（３−１０４２＝○、３−ｐ１０４２＝●、３−１１８＝■、３−ｐ１０６＝□）及び１７７７株（×）の増殖を可視化した。また図８は、３０℃における本発明の各株と１７７７株のエタノール生産能を比較したものであり、縦軸はエタノール濃度（％，ｖ／ｖ）を、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示している。５本の各棒グラフ（左から３−ｐ１０４２，３−１０４２，３−１１８，３−ｐ１０６，ＮＢＲＣ１７７７）は時間ごとの各株のエタノール生産を表している。図７，図８から明らかなように、３０℃においては、本発明の提供する各株とK.marxianus標準株との間には増殖、エタノール生産能とも明瞭な差は無いことが示された。

一方、図９、図１０には、４８℃及び４９℃における本発明の各株と１７７７株の増殖曲線を示した。両グラフとも縦軸はＯＤ６６０を、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示した。グラフのシンボルは図７と共通（３−１０４２＝○、３−ｐ１０４２＝●、３−１１８＝■、３−ｐ１０６＝□、１７７７株＝×）である。両グラフで示された様に、４８℃においては標準株１７７７株ではほとんど増殖が見られないのに対して、本発明の各株はＯＤ６６０値で９前後と一定の増殖を示し、また４９℃においても１７７７株がまったく増殖しないのに対して本発明の各株はＯＤ６６０値で３前後の増殖を示しており、本発明の提供する耐熱性エタノール生産酵母がK.marxianus種酵母の標準的な株と比較してもはるかに高い熱耐性を有していることが明らかとなった。

更に、図１１、図１２には、４８℃及び４９℃における本発明の各株と１７７７株のエタノール生産能を比較して表した。両グラフとも縦軸はエタノール濃度（％，ｖ／ｖ）を、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示している。グラフのシンボルは図８と共通である。両グラフが示す通り、１７７７株のエタノール生産能に比べて本発明の提供する各株のエタノール生産能は４８℃、４９℃でともに優れており、特に４８℃においては標準株の２倍以上のエタノール生産能を示した。

（ソルビトール添加の影響） ４８℃、４９℃という過酷な温度条件下における増殖能及びエタノール生産能の向上を目的として、ソルビトール添加の影響を検討した。培養液等の条件は上述の培養系、すなわち酵母の標準的な培養液であるＹＰＤ培地（１％ Yeast extract、２％ ペプトン、２％ グルコース）に終濃度５０ｍＭのソルビトールを添加し、３−１０４２、３−１１８，３−ｐ１０６，３−ｐ１０４２株とＮＢＲＣ１７７７株を植え、３０℃と４７，４８，４９℃で振とう培養（１６０ｒｐｍ）を行い、６時間ごとに培養液をサンプリングしてそのＯＤ６６０値（増殖の指標）と培養液中のエタノール濃度を測定した。

図１３に、４８℃の培養条件下におけるソルビトールの増殖への影響を示す。両グラフとも縦軸はＯＤ６６０を、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を表し、Ａ．がソルビトール有り、Ｂ．がソルビトール無添加での結果を示している。グラフのシンボルは図７と共通（３−１０４２＝○、３−ｐ１０４２＝●、３−１１８＝■、３−ｐ１０６＝□、１７７７株＝×）である。ソルビトール無添加に比べ、ソルビトール添加培養では全ての株でＯＤ６６０で表される増殖能が向上しており、ソルビトールの添加が有効である事を示した。図１４は４９℃における結果であり、Ａ．がソルビトール有り、Ｂ．がソルビトール無添加の結果である。４９℃において、ソルビトールの添加により本発明の４株では増殖能が向上し、ＯＤ６６０の値で２倍以上の差が見られたが、標準株ではこの効果が見られなかった。ソルビトールの添加は、標準株では効果の見られない４９℃という非常な高温において、本発明の耐熱性エタノール生産酵母株の増殖能を高めることが確認された。

図１５、図１６には、４８℃、４９℃の培養条件下におけるソルビトールのエタノール生産への影響を示す。各グラフとも縦軸はエタノール濃度（％，ｖ／ｖ）を、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示し、Ａ．がソルビトール有り、Ｂ．がソルビトール無添加での結果を示している。グラフのシンボルは図８と共通である。図１５が示す４８℃においては、１７７７株のエタノール生産能を向上させたが、本発明の各株に対してはわずかに向上させるにとどまった。これに対して、図１６で示した４９℃の条件下においては、ソルビトール無添加に比べて添加したものでは３倍以上ものエタノール生産能を示し、この値は４８℃における値にも劣らない値であった。一方１７７７株ではこの効果は見られなかった。ソルビトール添加培地では培養開始から３時間後に急激にエタノール濃度が上昇しており、ソルビトール添加の効果は３時間以上の培養で発揮されることが示された。

本発明の提供する耐熱性エタノール生産酵母は、エタノール生産、特にバイオマスを用いたエタノール生産に係る産業において利用可能である。特に、４０℃以上という酵母にとっては過酷な温度条件下でもエタノール生産能を有するという性質は、エタノール生産のコストダウンや発酵効率の向上に大きく道を拓くものである。

Claims (15)

1. ４０℃以上の温度条件におけるエタノール発酵能力を有するＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ種の耐熱性エタノール生産酵母を、１０〜１００ｍＭの糖アルコールを含有する培養液で培養することを特徴とするエタノール生産方法。
2. 糖アルコールが、ソルビトールであることを特徴とする請求項１記載のエタノール生産方法。
3. 耐熱性エタノール生産酵母が、４０−４９℃の温度条件下におけるエタノール発酵能力を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のエタノール生産方法。
4. 耐熱性エタノール生産酵母が、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−２８３、ＮＩＴＥ ＢＰ−２８９、ＮＩＴＥ ＢＰ−２９０、又はＮＩＴＥ ＢＰ−２９１で表される酵母であることを特徴とする請求項３に記載のエタノール生産方法。
5. 培養液が、１５−２５％の糖分を含有する培養液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のエタノール生産方法。
6. 培養液が、主成分として１５−２５％の糖分を含有し、補助成分として０．０１−０．５％のアンモニウム塩、０．０１−０．５％のカリウム塩、０．０１−０．５％のマグネシウム塩のうち少なくとも１種類を含む培養液を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のエタノール生産方法。
7. 培養液が、主成分として１８−２４％の糖分を含有し、補助成分として０．０５−０．１％の硫酸アンモニウムと、０．０２５−０．１％のリン酸カリウムを含有し、ｐＨが４．８−５．２に調整された培養液を用い、３０−４０℃の温度条件下で酵母を培養することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のエタノール生産方法。
8. 培養液が、主成分として１６−２２％の糖分を含有し、補助成分として０．０５−０．１％の硫酸アンモニウムと、０．０５−０．１５％の硫酸マグネシウムを含有し、ｐＨが５．３−５．７に調整された培養液を用い、４０℃以上の温度条件下で酵母を培養することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のエタノール生産方法。
9. １５０−４５０ｒｐｍの振とうと、０．１−０．３ｖｖｍのエアレーションを行うことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のエタノール生産方法。
10. サトウキビ搾り汁を原料とすることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のエタノール生産方法。
11. 寄託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−２８３で表されることを特徴とする耐熱性エタノール生産酵母。
12. 寄託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−２８９で表されることを特徴とする耐熱性エタノール生産酵母。
13. 寄託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−２９０で表されることを特徴とする耐熱性エタノール生産酵母。
14. 寄託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−２９１で表されることを特徴とする耐熱性エタノール生産酵母。
15. 請求項１４〜１７のいずれかに記載の耐熱性エタノール生産酵母において、１または複数個の遺伝子を改変または導入して得られる形質転換体。