BRPI0719317A2

BRPI0719317A2 - Levedura produzindo etanol termotolerante e método de produção de etanol utilizando a mesma

Info

Publication number: BRPI0719317A2
Application number: BRPI0719317-3A
Authority: BR
Inventors: Mamoru Yamada; Limtong Savitree
Original assignee: Univ Yamaguchi
Priority date: 2006-11-20
Filing date: 2007-11-20
Publication date: 2014-02-04
Also published as: JP5051727B2; US20100062506A1; JPWO2008062558A1; WO2008062558A1; US8334122B2

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LEVEDURA PRODUZINDO ETANOL TERMOTOLERANTE E MÉTODO DE PRODU- ÇÃO DE ETANOL UTILIZANDO A MESMA".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um novo micro-organismo ca-

paz de produzir etanol sob condição de temperatura elevada e a um método para produzir etanol usando o mesmo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma cepa pertencendo à espécie Kluyveromyces mar- xianus que tem uma capacidade de fermentação de etanol termotolerante 10 sob uma condição de temperatura de 35°C ou maior e um método para pro- duzir etanol utilizando a mesma.

Antecedente da Técnica

Sem levar em conta se ele se destina para uso em alimentos ou uso industrial, etanol é uma substância que pode ser usada para várias apli- 15 cações. O etanol quimicamente sintetizado e etanol fermentado por levedu- ra, etc, tem sido usados para uso industrial e para uso em alimentos, respec- tivamente. Especialmente, recentemente, devido ao desenvolvimento de bio- tecnologia e aumentada conscientização sobre a utilização de biomassa, tentativas para usar a produção fermentativa não somente para uso em ali- 20 mentos, mas também para uso industrial, em particular para etanol combus- tível está aumentando. A tecnologia de produção fermentativa usando leve- dura para produção de etanol tem sido usada através dos tempos, e várias melhorias visando melhorar a produtividade de levedura que tem um papel importante aqui descrito.

O uso de micro-organismos termofílicos pode ser exemplificado

como um aperfeiçoamento da produção fermentativa usando micro- organismo para aplicação industrial. Porque a geração de calor (calor de fermentação) associada ao processo de fermentação reduz as atividades vitais como metabolismo de micro-organismo não termotolerante e pode Ie- 30 var o micro-organismo à morte, soluções foram tomadas, por exemplo por instalação de um dispositivo de resfriamento, em particular, quando um grande vaso de fermentação é usado para fermentação. No entanto, os dis- positivos de resfriamento têm inconvenientes, como problemas de custo, etc, e em química de enzimas, se a fermentação sob uma condição em alta tem- peratura é realizada, uma produção fermentativa mais efetiva pode ser espe- rada. Assim, é efetivo isolar um micro-organismo tendo tanto termotolerância 5 como capacidade fermentativa a partir de natureza, ou conferir termotolerân- cia a um micro-organismo fermentativo por recombinação genética. A partir deste ponto de vista, vários micro-organismos termotolerantes (termofílicos) e tecnologia de produção fermentativa por utilização dos mesmos são des- critos, e exemplos incluem um método para conferir termotolerância por in- 10 tradução de um gene de bactéria de metano termofílico, bacilo termofílico, bactéria degradando fibra termofílica, termoactinomices termofílico, ou ar- quaea hipertermofílica, em um micro-organismo de outra espécie; um méto- do para expressar um gene relacionado com a termotolerância de bactéria termofílica em levedura Saccharomyces; e um método para produzir etanol 15 usando Kluyveromyces marxianus, uma levedura fermentável em alta tem- peratura etc. (Documentos de patente 1 a 8). No entanto, as invenções aci- ma referem-se à produção de uma substância tendo principalmente uma bactéria termofílica, e elas tem inconvenientes, por exemplo, em que a pro- dutividade de etanol é reduzida no caso de levedura cuja termotolerância é 20 melhorada. Assim, está sendo aguardado o desenvolvimento de um micro- organismo termotolerante aplicável à tecnologia de produção fermentativa de etanol em que demandas em explosão estão sendo previstas no futuro.

Documento de Patente 1: Tradução para o japonês publicada de publicação internacional PCT N0 2003-520045; "MEHTOD AND DEVICE FOR PRODUCING BIOGAS, WHICH CONTAINS METHANE, FROM OR- GANIC SUBSTANCES".

Documento de Patente 2: Tradução para o japonês publicada de publicação internacional PCT N0 2006-514831; "PREPARATION OF LACTIC ACID FROM A PENTOSE CONTAINING SUBSTRATE".

Documento de Patente 3: Pedido de patente japonesa acessível

ao público Pedido de patente japonesa acessível ao público N0 5-336951; "THERMOPHILIC CELLULOSE-DECOMPOSING BACTERIUM". Documento de Patente 4: Pedido de patente japonesa acessível ao público N0 6-303968; "THERMOPHILIC ACTINOMYCES".

Documento de Patente 5: Pedido de patente japonesa acessível ao público N0 2000-050894; "A METHOD FOR PRODUCING FERMENTATI- VE PRODUCTS AND STRESS-TORELANT MICROORGANISMS".

Documento de Patente 6: Pedido de patente japonesa acessível ao público N0 2001-069979; "A METHOD FOR PRODUCING L-GLUTAMINE THROUGH FERMENTATION PROCESS".

Documento de Patente 7: Pedido de patente japonesa acessível ao público N0 2006-280253; "A YEAST MUTANT STRAIN CAPABLE OF Hl- GHLY PRODUCING HEAT-RESISTANT ΕΝΖΥΜΕ".

Documento de Patente 8: Pedido de patente japonesa acessível ao público N0 63-42690; "A METHOD FOR PRODUCING ETHANOL USING AYEAST WHICH IS FERMENTATIVE AT HIGH TEMPERATURE".

Documento Diferente de Patente 1: Kourkoutas Y. et al. 2002.

Bioresource Technology 82, 177-181.

Documento Diferente de Patente 2: Yarrow D., et al. 1998. The Yeasts, ATaxonomic Study 4a. ed. Elsevier, Amsterdam. pp. 77-100.

Documento Diferente de Patente 3: 0’Donell K. 1993. Fusarium and its near relatives. CAB International, Wallingford. pp. 225-233.

Documento Diferente de Patente 4: Bergmeryer H. U. 1974. Me- thods of Enzymie Analysis, Vol. 1. Verlog Chemic Weinheim e Academic Press, New York-London.

Documento Diferente de Patente 5: Adachi et al. 1978. Agric Biol. Chem. 42, 2045-2056.

Descrição da Invenção

Objeto a ser resolvido pela presente invenção.

Em vista da situação acima mencionada, o objeto da presente invenção consiste em prover uma nova cepa de levedura capaz de produzir efetivamente etanol através da fermentação mesmo sob uma condição de temperatura de 37°C ou maior, preferivelmente uma condição de temperatu- ra de 40 a 45°C ou maior, e um método para produzir etanol por utilização da cepa de levedura.

Meios para Resolver o Obieto

A fim de alcançar os objetos acima, os presentes inventores fo- calizaram em um micro-organismo fermentativo vivendo em áreas tropicais, 5 e tentaram um método para isolar uma cepa de micro-organismo capaz de alcançar os objetos presentes do campo. Especificamente, os presentes in- ventores estudaram a capacidade de produzir etanol através da fermentação de vários micro-organismos por triagem usando um meio compreendendo açúcar em uma concentração elevada, e etanol. Dentre os mesmos, verifi- 10 cou-se que algumas cepas de uma espécie de levedura, Kluyveromyces marxianus, tem uma capacidade de produzir etanol através de fermentação sob uma condição de temperatura de 37°C ou maior. Convencionalmente, micro-organismos usados para produção através de fermentação são leve- dura pertencendo ao gênero Saccharomyces (Saccharomyees cerevisiae) ou 15 bactéria fermentativa do gênero Zymomonas. No entanto, até agora não se sabia que a levedura do gênero Kluyveromyces é industrialmente aplicável para produzir etanol através de fermentação. Além disso, os presentes in- ventores confirmaram que dentre as cepas acima, algumas tinham um capa- cidade de produzir etanol comparável à da levedura do gênero Saeeharomy- 20 ees, mesmo a uma condição de temperatura de 35°C ou maior. Particular- mente, dentre estas cepas de levedura do gênero Kluyveromyces, foram en- contradas as cepa DMKU 3-1042 (Depósito N0 NITE BP-283), cepa DMKU3- 118 (Depósito N0 NITE BP-289), cepa DMKU3-p106 (Depósito N0 NITE BP- 290), e cepa DMKU3-p1042 (Depósito N0 NITE BP-291) que são cepas de- 25 monstrando uma capacidade de produção igual à da produção de etanol da levedura de Saccharomyees sob condições ótimas, mesmo em uma condi- ção de temperatura muito elevada para fermentação como 40°C ou maior. A presente invenção foi assim completada.

Especificamente, a presente invenção refere-se a (1) um método para produzir etanol compreendendo cultivar uma levedura produzindo eta- nol termotolerante de espécies Kluyveromyces marxianus tendo uma capa- cidade de fermentação de etanol a uma condição de temperatura de 35°C ou maior em uma solução de cultura contendo álcool de açúcar, e (2) um méto- do para produzir etanol de acordo com (1), em que o álcool de açúcar é sor- bitol.

Além disso, a presente invenção refere-se a (3) método para 5 produzir etanol de acordo com (1) ou (2), em que a levedura produzindo eta- nol termotolerante tem uma capacidade de fermentação de etanol sob uma condição de temperatura de 40 a 49°C, e (4) método para produzir etanol de acordo com (3), em que a levedura produzindo etanol termotolerante é re- presentada por Depósito No: NITE BP-283, NITE BP-289, NITE BP-290, ou 10 NITE BP-291.

Além disso, a presente invenção refere-se a (5) método para produzir etanol de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), em que a solu- ção de cultura contém 15 a 25% açúcar; (6) método para produzir etanol de acordo com qualquer um dentre (1) a (5), em que a solução de cultura com- 15 preende 15 a 25% açúcar como um componente principal, e compreende pelo menos um dentre componente selecionado de 0,01 a 0,5% sal de amô- nio, 0,01 a 0,5% sal de potássio, ou 0,01 a 0,5% sal de magnésio como um componente auxiliar; (7) método para produzir etanol de acordo com qual- quer um dentre (1) a (5), compreendendo cultivar levedura sob uma condi- 20 ção de temperatura de 30 a 40°C, em que a solução de cultura compreende 18 a 24% açúcar como um componente principal, e 0,05 a 0,1% sulfato de amônio e 0,025 a 0,1% fosfato de cálcio como um componente auxiliar, e cujo pH é ajustado de 4,8 a 5,2; e (8) método para produzir etanol de acordo com qualquer um dentre (1) a (5), compreendendo cultivar levedura sob uma 25 condição de temperatura de 40°C ou maior, em que a solução de cultura compreende 16 a 22% açúcar como um componente principal, e 0,05 a 0,1% sulfato de amônio e 0,05 a 0,15% sulfato de magnésio como um componen- te auxiliar, e cujo pH é ajustado de 5,3 a 5,7.

Além disso, a presente invenção refere-se a (9) método para produzir etanol de acordo com qualquer um dentre (1) a (8), compreendendo agitara 150 a 450 rpm e aerara 0,1 a 0,3 vvm.

Ademais, a presente invenção refere-se a (10) método para pro- duzir etanol de acordo com qualquer um dentre (1) a (9), compreendendo usar uma solução de cultura contendo 10 a 100 mM de sorbitol.

Além do mais, a presente invenção refere-se a (11) método para produzir etanol de acordo com qualquer um dentre (1) a (10), em que um suco de cana-de-açúcar esmagada é usado como matéria-prima.

Além disso, a presente invenção refere-se a (12) a uma levedura produzindo etanol termotolerante de espécies Kluyveromyces marxianus tendo uma capacidade de fermentação de etanol sob uma condição de tem- peratura de 35°C ou maior; (13) a levedura produzindo etanol termotolerante 10 de acordo com (12) tendo uma capacidade de fermentação de etanol sob uma condição de temperatura de 40 a 49°C; (14) a levedura produzindo eta- nol termotolerante de acordo com (13) representada por Depósito No: NITE BP-283, (15) a levedura produzindo etanol termotolerante de acordo com (13) representada por Depósito No: NITE BP-289; (16) a levedura produzin- 15 do etanol termotolerante de acordo com (13) representada por Depósito No: NITE BP-290; e (17) a levedura produzindo etanol termotolerante de acordo com (13) representada por Depósito No: NITE BP-291.

Além disso, a presente invenção refere-se a (18) a um transfor- mante obtido por modificação ou introdução de um ou mais genes em uma levedura produzindo etanol termotolerante de acordo com qualquer um den- tre (14) a (17).

Efeito da Presente Invenção

Ao utilizar uma levedura produzindo etanol termotolerante provi- da pela presente invenção, etanol pode ser produzido efetivamente sem Ie- 25 var em conta se ele é para aplicação em alimentos ou aplicação industrial. Em particular, porque a levedura provida pela presente invenção tem uma capacidade para produzir etanol através de fermentação efetivamente mes- mo sob uma condição de temperatura elevada de 40°C a 45°C, um dispositi- vo para a remoção do calor de fermentação usada na produção convencio- 30 nal de etanol através de fermentação usando levedura seria diminuído ou desnecessário, e as instalações do fermentador poderiam ser simplificadas e aumentadas. Assim, o custo das instalações pode ser reduzido e a eficácia de produção pode ser melhorada. Assim, espera-se que uma produção em larga escala de etanol através de fermentação para aplicação em combustí- vel usando biomassa, como cana-de-açúcar como uma matéria-prima pode ser prontamente conduzida.

Breve Descrição dos Desenhos Figura 1

A figura 1 mostra mudanças de uma concentração de etanol (ei- xo vertical: %, p/v) com passar do tempo (eixo horizontal ; tempo a partir do início da cultura) em uma solução de cultura em diferentes temperaturas de cultura para 4 cepas de levedura produzindo etanol termotolerante isolado do campo.

Figura 2

A figura 2 mostra mudanças com passar do tempo (eixo horizon- tal; time) de concentração de etanol e crescimento de levedura da cepa DM- KU 3-1042 durante a etapa de cultura sob diferentes condições de tempera- tura.

Figura 3

A figura 3 mostra o crescimento da cepa 3-1042 e uma cepa- padrão solução de Saccharomyces cerevisiae (cepa KU1) a 30°C por com- paração. O eixo vertical mostra um valor OD66O, e eixo horizontal mostra o tempo (hora) a partir do início da cultura.

Figura 4

A figura 4 mostra o crescimento da cepa 3-1042 e da cepa KU1 a 45°C por comparação. O eixo vertical mostra um valor OD66O, e eixo hori- zontal mostra o tempo a partir do início da cultura.

Figura 5

A figura 5 mostra a capacidade de produzir etanol da cepa 3- 1042 e da cepa KU1 a 30°C por comparação. O eixo vertical mostra concen- tração de etanol (%, v/v) em uma solução de cultura, e eixo horizontal mos- tra o tempo a partir do início da cultura.

Figura 6

A figura 6 mostra a capacidade de produzir etanol da cepa 3-1042 e da cepa KU1 a 45°C por comparação. O eixo vertical mostra a concentração de etanol (%, v/v) em uma solução de cultura, e eixo horizontal mostra o tempo a partir do início da cultura.

Figura 7

A figura 7 mostra a capacidade de crescimento das 4 cepas de

levedura produzindo etanol termotolerante da presente invenção (3-p1042, 3-1042, 3-118, 3-p106) e a cepa-padrão solução de levedura K. marxianus (NBRC1777) sob uma condição de cultura de 30°C por comparação. O eixo vertical mostra um valor OD66O, e eixo horizontal mostra o tempo (h) a partir do início da cultura.

Figura 8

Afigura 8 mostra a capacidade de produzir etanol das 4 cepas de le- vedura produzindo etanol termotolerante da presente invenção e uma cepa normal sob uma condição de cultura de 30°C por comparação. O eixo verti- cal mostra a concentração de etanol (%, v/v), e eixo horizontal mostra o tempo (h) a partir do início da cultura.

Figura 9

A figura 9 mostra a capacidade de produzir etanol das 4 cepas de levedura produzindo etanol termotolerante da presente invenção e a ce- pa-padrão solução sob uma condição de cultura de 48°C por comparação. Figura 10

Afigura 10 mostra a capacidade de produzir etanol das 4 cepas de levedura produzindo etanol termotolerante da presente invenção e a ce- pa-padrão solução sob uma condição de cultura de 49°C por comparação.

Figura 11

Afigura 11 mostra a capacidade de produzir etanol das 4 cepas de levedura produzindo etanol termotolerante da presente invenção e a ce- pa-padrão solução sob uma condição de cultura de 48°C por comparação. Figura 12

A figura 12 mostra a capacidade de produzir etanol das 4 cepas

de levedura produzindo etanol termotolerante da presente invenção e a ce- pa-padrão solução sob uma condição de cultura de 49°C por comparação. Figura 13

A figura 13 mostra a influência de adição de sorbitol no cresci- mento sob uma condição de cultura de 48°C. (A) mostra os resultados com sorbitol e (B) mostra os resultados sem sorbitol.

Figura 14

Afigura 14 mostra a influência de adição de sorbitol no cresci- mento sob uma condição de cultura de 49°C. (A) mostra os resultados com sorbitol e (B) mostra os resultados sem sorbitol.

Figura 15

A figura 15 mostra a influência de adição de sorbitol em capaci-

dade de produzir etanol sob uma condição de cultura de 48°C. (A) mostra os resultados com sorbitol e (B) mostra os resultados sem sorbitol.

Figura 16

Afigura 16 mostra a influência de adição de sorbitol em capaci- dade de produzir etanol sob uma condição de cultura de 49°C. (A) mostra os resultados com sorbitol e (B) mostra os resultados sem sorbitol.

Melhor Modo para Realizar a Invenção

O melhor modo para realizar a presente invenção é abaixo des- crito. A primeira forma de realização da presente invenção consiste em pro- ver uma levedura produzindo etanol termotolerante de espécies Kluyve- romyces marxianus tendo uma capacidade de fermentação de etanol sob uma condição de temperatura de 35°C ou maior. Convencionalmente, a le- vedura do gênero Saccharomyces foi usada principalmente para produzir etanol através de fermentação, e tecnologias melhoradas usando procedi- mento de engenharia genética foram focalizados sobre estas levedura de Saccharomyees. Além disso, foi considerado que uma temperatura apropria- da para fermentação é de aproximadamente da temperatura ambiente a 30°C, um equipamento para resfriar para manter um fermentador em uma temperatura apropriada foi requerido com frequência na indústria de fermen- tação de etanol convencional. A levedura do gênero Kluyveromyces tem sido usada até agora na fermentação em alta temperatura usando materiais celu- lósicos de lignina, ou uma "levedura exterminadora" para inibir o crescimento de outras espécies de levedura, ou para fermentação de acido láctico etc. (Documento diferente de patente 1). A presente invenção recém provê uma cepa de levedura de espécies Kluyveromyces marxianus capaz de produzir etanol que é aplicável à aplicação em combustível etc. a partir de matéria- 5 primas como suco de cana-de-açúcar esmagada. A origem da cepa de leve- dura de espécies Kluyveromyces marxianus da presente invenção não é li- mitada desde que seja uma cepa tendo capacidade de fermentação de eta- nol sob uma condição de temperatura de 35°C ou maior, preferivelmente na faixa de 40 a 49°C. No entanto, uma cepa de levedura que foi triada através 10 de 2 etapas, incluindo (a) uma etapa de cultivar por uso de um meio conten- do 5 a 10% açúcar, 0,01 a 0,1% sulfato de amônio, e 2 a 5% etanol sob uma condição de temperatura de 30 a 37°C; (b) uma etapa de cultivar a cepa de levedura que tinha proliferado na etapa (a) usando um meio contendo 5 a 10% açúcar, 0,01 a 0,1% sulfato de amônio, e 2 a 5% etanol sob uma condi- 15 ção de temperatura de 40 a 45°C. A etapa de triagem acima compreende colocar em suspensão, por exemplo, uma amostra de solo em água, inocular a amostra em um meio, como um meio líquido ou meio de agar, contendo os componentes de (a) e cultivar os mesmos sob uma condição de temperatura de 35°C. Além disso, as cepas que foram proliferadas são inoculadas sobre 20 um meio, como um meio de agar, contendo os componentes de (b) e cultiva- dos sob uma condição de temperatura de 40 a 45°C para obter uma cepa desejada como uma colônia. Em etapa (a), tolerância a etanol é selecionada, e ma etapa (b), a termotolerância a uma temperatura de 40 a 45°C é sele- cionada. A cepa de levedura atendendo a todas as condições acima pode 25 ser preferivelmente exemplificada como a seguir: Kluyveromyces marxianus cepa DMKU 3-1042 (Depósito N0 NITE BP-283), cepa DMKU3-118 (Depósito N0 NITE BP-289), cepa DMKU3-p106 (Depósito N0 NITE BP-290), e cepa DMKU3-p1042 (Depósito N0 NITE BP-291). Estas cepas foram depositadas junto a Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology 30 and Evaluation (NITE), NITE Patent Microorganisms Depositary (2-5-8, Ka- zusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japão) sob o Tratado de Bu- dapeste. Cepas de Kluyveromyces marxianus (cepas DMKU 3-1042, 3- 118, 3-p106, e 3-p1042) providas pela presente invenção foram isoladas da natureza como uma cepa tendo uma capacidade de fermentação de etanol sob uma condição de temperatura elevada. No entanto, a modificação de 5 genes das presentes cepas relacionadas com, por exemplo fermentação de etanol ou termotolerância usando engenharia genética, ou melhora da raça, compreendendo introduzir genes derivados de outros micro-organismos na cepa presente a fim de ainda conferir propriedades utilizáveis, são também vantajosos. Como uma tecnologia para modificação ou introdução genética, 10 procedimentos normalmente usados no campo de engenharia genética u- sando micro-organismos podem ser aplicados de modo apropriado. Os e- xemplos incluem, sem limitar a presente invenção, modificação de genes genômicos por recombinação e introdução homólogas de um novo gene (ou grupo de genes) usando um vetor de plasmídeo.

Além disso, a presente invenção provê um método para produzir

etanol utilizando um levedura produzindo etanol termotolerante da presente invenção descrita acima na presença de álcool de açúcar. Mais especifica- mente, o método para produzir etanol da presente invenção não é particu- larmente limitado desde que seja um método compreendendo cultivar uma 20 levedura produzindo etanol termotolerante de espécies Kluyveromyces mar- xianus tendo uma capacidade de fermentação de etanol a uma condição de temperatura de 35°C ou maior em uma solução de cultura contendo álcool de açúcar. Porque o princípio fundamental de fermentação de etanol de gli- cólise anaeróbica permanece igual mesmo quando as cepas de levedura 25 provê pela presente invenção são utilizadas, na produção de etanol através de fermentação por utilização da levedura da presente invenção, é possível conduzir a fermentação por adição da levedura produzindo etanol da forma de realização acima em uma solução de carga contendo uma quantidade apropriada de açúcar (hidreto de carbono) como um componente principal, e 30 preferivelmente contendo uma fonte de nitrogênio, uma fonte de potássio, e metais de traço como magnésio como componentes auxiliares. Para um dis- positivo, um equipamento e uma composição do líquido de matéria-prima etc. usados para fermentação, os usados no campo da indústria de fermen- tação podem ser aplicados de modo apropriado. Um exemplo preferido inclui um método para produzir etanol usando uma solução de cultura contendo 15 a 20% açúcar como um componente principal e álcool de açúcar como um 5 componente essencial, e preferivelmente, ainda compreendendo pelo menos um componente selecionado dentre 0,01 a 0,5% sal de amônio, 0,01 a 0,5% sal de potássio, e 0,01 a 0,5% sal de magnésio como um componente auxili- ar além dos ingredientes acima, sem limitar a presente invenção.

Como descrito nos exemplos no seguinte, a levedura produzindo etanol termotolerante provida pela presente invenção tem um aspecto em que a composição preferida da solução de cultura varia dependendo das condições de temperatura. Assim, na produção de etanol sob uma condição de temperatura entre 30 a 40°C, em particular, sob uma condição de tempe- ratura de aproximadamente 37°C, é vantajoso usar uma solução de cultura contendo 20 a 24% de açúcar como um componente principal, 0,05 a 0,1% de sulfato de amônio e 0,025 a 0,1% de fosfato de cálcio como um compo- nente auxiliar, cujo pH é controlado de 4,8 a 5,2. Por outro lado, na produção de etanol sob uma condição de temperatura de 40°C ou maior, é vantajoso usar uma solução de cultura contendo 20 a 24% açúcar como um compo- nente principal, 0,05 a 0,1% sulfato de amônio e 0,05 a 0,2%, mais preferi- velmente 0,15% sulfato de magnésio como um componente auxiliar, cujo pH é controlado de 5,3 a 5,7.

Além disso, na fermentação de etanol usando uma levedura pro- duzindo etanol termotolerante provida pela presente invenção, é vantajoso 25 conduzir a fermentação por aplicação de agitação correspondendo a 150 a 450 rpm (rotações por minuto) preferivelmente 300 rpm, e aeração corres- pondendo a 0,1 a 0,3 vvm (volume do vaso por minuto), preferivelmente 0,2 vvm para aumentar a eficiência da fermentação. Em particular, aeração é extremamente efetiva para aumentar a densidade das células de levedura 30 em um sistema de cultura de massa como descrito nos seguintes exemplos.

Em método para produzir etanol de acordo com a presente in- venção, como descrito acima, álcool de açúcar é requerido como um com- ponente essencial de uma solução de cultura para melhorar a capacidade de crescimento e capacidade de produzir etanol de uma levedura produzindo etanol termotolerante sob uma condição de temperatura elevada. Exemplos de álcool de açúcar incluem: eritritol, glicerina, HSH, isomalte, lactitol, malti- 5 tol, mannitol, sorbitol, xilitol, palatinose reduzida, xilobiitol, e celobitol. Parti- cularmente, sorbitol pode ser preferivelmente exemplificado. Sorbitol é um tipo de álcool de açúcar altamente contido em frutas com maçã e perda, e se sabe que sorbitol não fermenta facilmente comparado a outros açúcares, e evita que a gordura oxida, e estabiliza proteína. As condições de temperatu- 10 ra elevada de 40°C ou maior é também um ambiente severo para uma leve- dura produzindo etanol termotolerante, e sendo considerado que estas pro- priedades de sorbitol auxiliam o crescimento da levedura e a produção de etanol. É eficiente cultivar um meio contendo álcool de açúcar a uma con- centração dentro da faixa de 10 a 100 mM, mais preferivelmente álcool de 15 açúcar a uma concentração na proximidade de 50 mM, por exemplo em um meio contendo sorbitol a uma concentração dentro da faixa de 10 a 100 mM, mais preferivelmente sorbitol a uma concentração na proximidade de 50 mM. Como descrito no seguinte Exemplo, foi demonstrado que a produção de etanol pode ser conduzida mesmo sob um ambiente severo de 48°C e 49°C 20 por adição de sorbitol. Em particular, a uma temperatura de 49°C, não foi observado efeito em uma cepa-padrão solução de levedura de espécies K. marxianus, enquanto que foi mostrado que a capacidade de crescimento e capacidade de produzir etanol foram ambas melhoradas de modo significan- te nas cepas de levedura produzindo etanol termotolerante da presente in- 25 venção. Assim, a adição do presente componente auxiliar é altamente efeti- va.

Na produção de fermentação de etanol usando uma levedura produzindo etanol termotolerante provida pela presente invenção, como o açúcar que é um componente principal contido na solução de carga, o se- 30 guinte pode ser usado: açúcar puro como glicose, sacarose, e frutose, e uma mistura dos mesmos, um material de planta que é usado como um material para álcoois, por exemplo várias matérias-primas que são genericamente chamadas de biomassa como tipos de arroz, aveia, batatas, cana-de-açúcar, xarope de açúcar, beterraba de açúcar, e milho. Dentre estes, os contendo monossacarídeo e oligossacarídeo, suco espremido etc. dos mesmos po- dem ser usados por si e os principalmente contendo polissacarídeo como 5 amido e celulose, prefere-se que a hidrólise do polissacarídeo seja conduzi- da por um micro-organismo tendo uma enzima que pode degradar estes po- lissacarídeos ou tendo uma capacidade de degradação destes polissacarí- deos para degradar em monossacarídeo ou oligossacarídeo para uso. Esti- ma-se que as demandas de "bioetanol" produzido a partir de matérias- 10 primas de biomassa estarão depois aumentadas como um combustível al- ternativo às fontes de petróleo. Assim, espera-se que o uso de uma levedura produzindo etanol termotolerante provida pela presente invenção e etanol produzido pela levedura irão contribuir para as indústrias relacionadas com bioetanol. Como descrito acima, várias biomassas podem ser usadas como 15 matérias-primas de bioetanol, e dentre estes materiais, em particular, "suco de cana-de-açúcar" que é um resíduo após o refino de açúcar da cana-de- açúcar é uma matéria-prima preferida porque o suco de cana-de-açúcar é somente usado para carga de reação animal atualmente e contém açúcar altamente concentrado. Exemplos da presente invenção são descritos no 20 seguinte, apesar da presente invenção não ser limitada a estes exemplos. Exemplo 1

(Isolamento de um micro-organismo termotolerante do campo)

Amostras de solo e amostra de água foram coletadas de planta- ções de cana-de-açúcar e fábricas de refino de açúcar em 4 regiões do 25 Kingdom of Thailand, isto é, Phra NakhonSi Ayutthaya, Ratchaburi, Suphan- buri, e Uthaithani. Estas amostras foram adicionadas em uma solução de cultura de suco de cana-de-açúcar (5 a 8% açúcares totais) contendo 0,05% sulfato de amônio e 4% etanol (v/v), e a mistura foi cultivada em um aparelho de agitação (Gallenkamp Orbital lncubator, Leicester, UK) a 170 rpm sob 30 uma condição de temperatura de 35°C, durante 3 dias. 3 dias depois, uma porção da solução de cultura (incluindo micro-organismos) foi inoculada so- bre um meio de agar tendo a mesma composição e cultivada a 35°C. 72 co- lônias de levedura que apareceram no meio de agar foram tomadas e trans- feridas para um meio de agar YPD (1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicose, 2% agar), e armazenadas a 8°C.

(Triagem de leveduras termotolerantes)

Cepas produzindo etanol termotolerantes foram triadas pelo se-

guinte método a partir das 72 cepas acima. Primeiro as colônias no meio de agar YPD foram tomadas e inoculadas em 50 ml de uma solução de cultura de suco de cana-de-açúcar (concentração de açúcar total 2%; contendo 0,05% sulfato de amônio; pH ajustado a 4,5 com 1 N ácido clorídrico) em um frasco cônico, e cultivadas por agitação durante 24 horas sob uma condição de temperatura de 25 a 28°C. Aproximadamente 5 ml de uma solução de cultura obtida aqui foram transferidos em 100 ml de solução de cultura de suco de cana-de-açúcar para triagem (sacarose foi adicionada a 18%; con- tendo 0,05% sulfato de amônio; pH ajustado a 4,5 com 1N ácido clorídrico) em um frasco cônico, e cultivado por agitação sob uma condição de tempe- ratura de 40°C ou 45°C e o crescimento foi observado. Dentre as 72 cepas, crescimento foi observado em 55 cepas a 40°C, e 37 cepas dentre estas, crescimento foi observado mesmo a 45°C. A fim de examinar a capacidade de produzir etanol destas 55 cepas, cultura foi conduzida durante 72 horas sob uma condição de temperatura de 37°C e 40°C para medir a concentra- ção de etanol contido na solução de cultura. Como um resultado, verificou-se que as 4 cepas, DMKU3-1042, DMKU3-118, DMKU3-p106, e DMKU3- p1042, têm um nível elevado de capacidade de produzir etanol (abaixo, o nome das cepas será descrito por omissão de DMKU consequentemente). A capacidade de produzir etanol destas 4 cepas em cada temperatura é mos- trada na tabela 1 abaixo, e a capacidade de produzir etanol é representada pela concentração de etanol (%, p/v) contido em uma solução de cultura. Porque as 51 cepas restantes mostram um nível bem menor de capacidade de produzir etanol comparado com estas 4 cepas, a análise abaixo foi con- duzida para estas 4 cepas. Tabela 1 : Capacidade de produzir etanol de 4 cepas de K. marxianus

Concentração de etanol em uma solução de cultura(%, p/v) 37°C 40°C DMKU3-1042 6,78 6,17 DMKU3-118 6,57 5,58 DMKU3-p106 6,50 5,14 DMKU3-p1042 6,38 6,33 (Identificação de levedura)

As propriedades morfológicas, fisiológicas e bioquímicas das 4 cepas obtidas através da triagem acima foram identificadas pelo método de 5 Yarrow (Documento Diferente de Patente 2). Além disso, DNAs genômicos foram extraídos destas leveduras, região D1/D2 de rDNAde unidade grande foi amplificada usando o iniciador desenvolvido por 0’Donnell (Documento Diferente de Patente 3), seqüências de nucleotídeos dos mesmos (base) foram determinadas por um sequenciador ABI PRISM 3100 (Applied Biosys- 10 tem, USA), e comparadas com espécie conhecida de levedura usando busca de homologia BLAST. Como um resultado do acima, especificamente, por- que a seqüência de nucleotídeos de região D1/D2 foram idênticas à seqüên- cia de um tipo de levedura Kluyveromyces marxianus, todas as 4 cepas de levedura foram classificadas como K marxianus.

Exemplo 2

(Exame da capacidade de produzir etanol - escala de 200 ml)

A capacidade de produzir etanol das 55 cepas acima foi investi- gada em um frasco de 500 ml, primeiramente, para a condição de tempera- tura usando 200 ml de solução de cultura de suco de cana-de-açúcar (con- 20 centração de açúcar total 8%; concentração de sulfato de amônio 0,05%; pH 4,5). As cepas de levedura foram inoculadas em uma solução de cultura e cultivadas por agitação a 110 batidas/min usando um agitador de banho d'á- gua reciprocante (Modelo R76, New Brunswick Scientific, USA).

Figura 1 mostra a capacidade de produzir etanol destas 4 cepas sob respectivas condições de temperatura. Cada gráfico mostra a capacida- de de produzir etanol de cada cepa (DMKU3-p1042 = o; DMKU3-1042 = ·; DMKU3-p106 = □; DMKU3-118 = ■) a 30°C, 37°C, 40°C, e 45°C, respecti- vamente, e a mudança de concentração de etanol (eixo vertical; %, p/v) em uma solução de cultura com o passar do tempo é mostrada (eixo horizontal ; tempo a partir do início da cultura). A condição de uma solução de cultura foi 5 como a seguir: concentração de açúcar total 18%, concentração de sulfato de amônio 0,05%, e pH 4,5 (não contendo ácido fosfórico-potássio e sulfato de magnésio). A concentração máxima de etanol de 4 cepas a 30°C e 37°C (gráfico AeB) foi 7,13 a 7,6% (p/v), dentre o que a concentração de etanol da cepa 3-118 e cepa 3-1042 foi quase igual a 30°C e 37°C. No entanto, a 10 concentração de etanol da cepa 3-p106 e cepa 3-p1042 foi maior a 37°C.

Para uma concentração de etanol após 48 horas a 40°C (gráfico C), a cepa 3-1042 mostrou o maior valor de 7,23%, e além disso, este valor não foi de nenhum modo inferior ao de 7,43% a 37°C. Além disso, este valor foi refletido em uma produtividade de etanol em 1 I (litro) por hora (expressa- 15 do por g/l-h), e a produtividade a 37°C foi 1,03 g/l-h, enquanto a produtivida- de a 40°C indicou um valor elevado de 1,51 g/l-h. A concentração de etanol das outras 3 cepas após 48 horas foi 6,43 a 6,85%.

Notou uma tendência de que a capacidade de produzir etanol de cada cepa a 45°C (gráfico D) foi menor comparada a uma capacidade de 20 produzir etanol a 40°C. A cepa 3-1042 mostrou o maior valor dentre as 4 ce- pas similarmente como a 40°C, e a concentração de etanol foi 4,93%, e a produtividade foi 1,17 g/l-h. Além disso, verificou-se que, a 40°C e 45°C, o tempo quando a concentração de etanol se tornou máxima foi trocado para o anterior (36 a 48 horas) comparado a 30°C e 37°C. Isto foi decidido de que 25 esta cepa DMKU 3-1042 pudesse ser usada no seguinte exame para uma composição de uma solução de cultura e produtividade de etanol em larga escala. Tabela 2 abaixo mostra a concentração de etanol e a produtividade das 4 cepas sob respectivas condições de temperatura. Tabela 2: Comparação da capacidade de produzir etanol de cada cepa sob cada condição de temperatura

30°C 37°C 40°C 45°C Etanol Produ¬ Etanol Pro¬ Etanol Pro¬ Etanol Produ¬ %(p/v) to*1 %(p/v) duto* %(p/v) duto* %(p/v) to* g/l.h g/l.h g/l.h g/l.h 3-p106 7,60 1,06 7,56 1,57 6,43 1,51 4,74 0,99 (72 h*2) (48 h) (42 h) (48 h) 3-118 7,48 1,04 7,42 1,03 6,78 1,41 4,78 1,33 (72 h) (72 h) (48 h) (36 h) 3-1042 7,21 1,00 7,43 1,03 7,23 1,51 4,93 1,17 (72 h) (72 h) (48 h) (42 h) 3-p1042 7,13 0,99 7,39 1,54 6,84 1,43 4,59 0,96 (72 h) (48 h) (48 h) (48 h) *1 Produtividade, *2 Tempo registrado para o valor máximo (linha superior) da concentração de etanol

A fim de otimizar a solução de cultura de suco de cana-de-

açúcar usando a cepa 3-1042 que foi a mais superior na capacidade de pro- duzir etanol a 40°C e 45°C, as seguintes soluções de cultura de suco de ca- na-de-açúcar foram preparadas: 5 variações de concentração de açúcar total : 16%, 18%, 20%, 22% e 24%; 4 variações de concentração de sulfato de 10 amônio: 0%, 0,05%, 0,07%, e 0,1%; 4 variações de concentração de ácido fosfórico-potássio: 0%, 0,025%, 0,05% e 0,1%; 6 variações de concentração de sulfato de magnésio hepta-hidratado: 0%, 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2% e 0,3%; 4 variações de pH: 4,0, 4,5, 5,0 e 5,5. E então, a capacidade de pro- duzir etanol e o efeito de cada componente a 37°C e 40°C foram compara- 15 dos e examinados.

Com relação à concentração de açúcar total, a concentração final de etanol foi aumentada comparada à concentração de concentração de açúcar em ambos 37°C e 40°C, e alcançou o nível máximo a 22%. No entanto, porque a concentração de etanol final foi declinada a 24%, ela foi 20 considerada como a concentração ótima de açúcar em torno de 22%. Com uma concentração de açúcar de 22%, a concentração de etanol após 54 ho- ras foi 8,29%, a produtividade de etanol foi 1,54 g/l-h, e o rendimento (taxa para um valor teórico estimado a partir da concentração de açúcar ) foi 73,9% a 37°C. Com uma concentração de açúcar de 22%, a concentração de etanol alcançou um nível máximo (6,88%) a 40°C, e tempo para alcançar um nível máximo foi mais curto do que o a 37°C, no entanto, uma produtivi- 5 dade máxima (1,42%/l h) e rendimento (72,6%) foram registrados com a concentração de açúcar de 16%.

A fim de examinar a influência da fonte de nitrogênio sobre pro- dução de etanol, 4 tipos de soluções de cultura contendo O a 0,1% sulfato de amônio em uma solução de carga de cultura de xarope com a concentração 10 de açúcar total de 22%, pH 4,5, foram preparados em que a cepa 3-1042 foi cultivada. A 37°C, o nível máximo de concentração de etanol que foi 7,8% foi registrado com uma concentração de sulfato de amônio de 0,07%, a produti- vidade aqui foi 1,08g/l h, e o rendimento foi 69,5%. No entanto, a produtivi- dade foi maior com uma sulfato de amônio concentração de 0,05%, cujo ní- 15 vel foi de 1,36 g/l-h. O rendimento aqui foi 65,5% e a concentração de etanol foi 7,35%. Em ambos os casos, os níveis foram maiores comparados a quando não se adiciona sulfato de amônio (0%), onde uma concentração de etanol foi 6,85%, e a produtividade foi 0,95 g/l-h, e o rendimento foi 61,0%. Assim foi revelado que foi efetivo adicionar sulfato de amônio como uma fon- 20 te de nitrogênio. A 40°C, a concentração de etanol quando sulfato de amônio é adicionado foi maior comparada a uma concentração de etanol (6,22%) quando sulfato de amônio não é adicionado, e em particular, o nível foi exce- lente quando adicionando 0,05% de sulfato de amônio. Quando 0,05% de sulfato de amônio foi adicionado, a concentração de etanol foi 6,60%, a pro- 25 dutividade foi 1,37g/l-h, e o rendimento foi 58,8%, e os níveis foram maiores comparados a quando não se adicionou sulfato de amônio, onde a produtivi- dade foi 1,15g/l h e o rendimento foi 55,4%. A partir destes resultados, foi revelado que também foi efetivo adicionar uma quantidade apropriada de sulfato de amônio a 40°C.

A fim de examinar a influência de uma fonte de potássio sobre a

produção de etanol, 4 tipos de soluções de cultura contendo 0 a 0,1% de ácido fosfórico-potássio em uma solução de carga de cultura de xarope com a concentração de açúcar total de 22%, uma concentração de sulfato de amônio de 0,05%, pH 4,5, em que a cepa 3-1042 foi cultivada. A 37°C, os níveis foram maiores quando ácido fosfórico-potássio foi adicionado compa- rado quando não foi adicionado ácido fosfórico-potássio (concentração de 5 etanol 6,92%; produtividade 0,96g/l-h; e rendimento 61,7%). Em particular, quando 0,05% foi adicionado, o nível máximo foi registrado (concentração de etanol 7,65 %; produtividade 1,06 g/l-h; rendimento 68,1%). Ao contrário, a 40°C, não foi observada nenhuma melhora por adição de ácido fosfórico- potássio. A partir destes resultados, revelou-se que foi efetivo adicionar uma 10 quantidade apropriada de fonte de potássio (ácido fosfórico-potássio) na produção de etanol usando as leveduras providas pela presente invenção a 37°C ou menos.

A fim de examinar a influência de uma fonte de magnésio sobre a produção de etanol, 6 tipos de solução de culturas contendo 0 a 0,3% de sulfato de magnésio hepta-hidratado em uma solução de carga de cultura de xarope com uma concentração de açúcar total de 22%, concentração de sul- fato de amônio de 0,05%, concentração de ácido fosfórico-potássio de 0,05%, pH 4,5, em que a cepa 3-1042 foi cultivada. Diferente de fonte de potássio, quase nenhuma influência de adição de magnésio foi mostrada a 37°C, enquanto ao contrário, a 40°C, os níveis foram maiores quando mag- nésio foi adicionado comparado a quando não foi adicionado. Em particular, o valor máximo foi registrado com uma concentração de sulfato de magnésio hepta-hid ratado de 0,15% (concentração de etanol 6,28%; produtividade 1,05 g/l-h; rendimento 55,98%). Cada valor foi maior comparado a quando não se adicionou sulfato de magnésio hepta-hidratado (concentração de e- tanol 6,08%; produtividade 0,84g/l h; rendimento 54,22%). Com relação à concentração de sulfato de magnésio, notou-se uma tendência de que a concentração de etanol, a produtividade, e o rendimento foram todos reduzi- dos quando a adição foi maior ou menor do que 0,15%, e foi mostrado que a concentração ótima estava em torno de 0,15%. Especificamente, revelou-se que foi efetivo adicionar uma quantidade apropriada (preferivelmente 0,15%) de fonte de magnésio (sulfato de magnésio) na produção de etanol usando as leveduras providas pela presente invenção a 40°C ou maior.

A fim de examinar a influência de pH sobre a produção de eta- nol, 4 tipos de solução de cultura cujo pH foi ajustado de 4,0 a 5,5, a partir da solução de carga de cultura de xarope com uma concentração de açúcar 5 total de 22%, uma concentração de sulfato de amônio de 0,05%, e concen- tração de ácido fosfórico-potássio de 0,05%, em que a cepa 3-1042 foi culti- vada. A 37°C, os níveis máximos foram obtidos para concentração de etanol (8,70%), produtividade (1,45 g/l-h), e rendimento (77,5 %) com pH 5,0. Por outro lado, a 40°C, ela foi superior com um pH 5,5 comparado a pH 5,0, on- 10 de o nível máximo nas 4 condições foi observado para concentração de eta- nol (6,78%), produtividade (1,13 g/l-h), e rendimento (60,4 %). Os resultados de 0025 a 0029 são mostrados na seguinte tabela 3.

Tabela 3

Influência de várias fontes de nutrientes sobre a produção de etanol a 37°C e 40°C para a cepa DMKU3-1942

A 37°C A 40°C Etanol % Produ¬ % de Etanol % Produ¬ % de (p/v) to.*1 rendimen¬ (p/v) to. rendi¬ (g/l-h) to teórico (g/l-h) mento teórico Total açúca¬ res (%) 16 6, 26 (42)*2 1, 49 76, 7 5, 95 (48) 1, 42 72. 6 18 6, 92 (54) 1, 28 75, 4 6, 03 (48) 1, 26 65, 7 20 7, 77 (54) 1, 44 76. 2 6, 79 (48) 1, 42 66, 5 22 8. 29 Í54)*3 1. 54 73, 9 6. 88 (54) 1, 27 61, 3 24 7, 51 (60) 1, 25 61, 4 6, 54 (48) 1, 36 53, 4 (NH4)2S04( %) 0 6,85 (72) 0,95 61,0 6,22 (54) 1,15 55,4 0,05 7,35 (54) 1.36 65,5 6.60 (481 1.37 58.8 0,07 7.80 (72} 1,08 69.5 6,27 (60) 1,05 55,9 A 37°C A 40°C Etanol % Produ¬ % de Etanol % Produ¬ % de (p/v) to.*1 rendimen¬ (P/v) to. rendi¬ (g/l-h) to teórico (g/l-h) mento teórico 0,10 7,46 (72) 1,04 66,5 6,41 (60) 1,07 57,2 KH2P04 (%) 0 6,92 (72) 0,96 61,7 6.45 (60) 1,07 57.5 0,025 7,12(72) 0,99 63,5 6,02 (60) 1,00 53,7 0,05 7.65 (72) 1.06 68.1 6,33 (72) 0,88 56,4 0,10 7,55 (72) 1,05 67,3 6,12(54) 1,13 54,6 Mg- S047H20( %) 0 7,31 (72) 1,02 65,2 6,08 (72) 0,84 54,22 0,05 7,25 (72) 1,01 64,6 6,11 (54) 1,13 54,50 0,10 7,24 (72) 1,00 64,5 6,11 (60) 1,02 54,43 0,15 7,39 (72) 1.03 65.9 6.28 (60) 1.05 55.98 0,20 7,12(72) 0,99 63,4 6,08 (60) 1,01 54,22 0,30 6,94 (72) 0,96 61,9 6,04 (72) 0,84 53,87 PH pH 4,0 7,26 (96) 0,76 64,7 5,94 (84) 0,71 52,9 pH 4,5 7,68 (96) 0,80 68,5 5,78 (96) 0,60 51,5 pH 5,0 8.70 (60) 1.45 77.5 6,57 (60) 1,09 58,5 pH 5,5 8,50 (60) 1,42 75,8 6.78 (60) 1.13 60.4 *1 produtividade *2: número em parêntese é o tempo de cultura

*3 números sublinhados são o nível máximo sob a condição

A partir dos resultados da tabela 3, a composição preferida do meio para a produção de etanol usando a cepa 3-1042 da presente invenção a uma condição de temperatura de 37°C e 40°C, respectivamente, é mos- trada na seguinte Tabela 4. Tabela 4

Condição de temperatura 37°C 40° C Total açúcares totais 22% (20-24%) 22% (20-24%) (faixa possível) (NH4)2S04 0,07% (0,05-0,10%) 0,05% (-0,10%) (faixa possível) KH2P04 0,05% (0,025-0,10%) Não necessário (faixa possível) (possível -0,10%) MgS04,7H20 Não necessário 0,15% (0,05-0,15%) (faixa possível) (possível -0,15%) PH 5,0 (4,5-5,5) 5,5 (5,0-5,5) (faixa possível) De acordo com as Tabelas 3 e 4, a solução de cultura para uma cultura a 37°C (concentração de açúcar total 22% por adição de sacarose; concentração de sulfato de amônio 0,05%; concentração de ácido fosfórico- potássio 0,05%; concentração de sulfato de magnésio hepta-hid ratado

0,15%; pH 5,0); e a solução de cultura para uma cultura a 40°C (concentra- ção de açúcar total 22% por adição de sacarose; concentração de sulfato de amônio 0,05%; concentração de ácido fosfórico-potássio 0,05%; concentra- ção sulfato de magnésio hepta-hid ratado 0,15%; pH 5,5) foram preparados a 10 partir de uma solução de carga de cultura de suco de cana-de-açúcar como uma solução de cultura para produzir etanol usando a cepa 3-1042, e agi- tando a cultura (110 batidas/min) foi conduzida durante cada condição de temperatura. Na figura 2, a mudança com o passar do tempo (eixo horizontal ; horas) para concentração de etanol (o = 37°C, □ = 40°C, gráfico eixo verti- 15 cal a esquerda; % p/v) e crescimento de levedura (· = 37°C, □ = 40°C, gráfi- co eixo vertical à direita; mostrado por OD a 660 nm) em uma etapa de cultu- ra para cada solução de cultura são mostrados. Em uma cultura a 37°C, a concentração de etanol aumentou ao máximo de 8,7% 60 horas depois. O rendimento e produtividade aqui, foram 1,45 g/l-h e 77,5%, respectivamente. 20 A absorbância (OD) a 660 nm refletindo o número de células de levedura, alcançou o primeiro pico 24 horas depois. O nível lentamente aumentou de- pois, e foi 11,42 54 horas depois, e de 14,33 72 horas depois. Por outro lado em uma cultura a 40°C, a concentração de etanol quase chegou a equilíbrio 42 horas depois, e o nível máximo foi 67,8%. O rendimento e produtividade aqui, foi de 1,13 g/l-h e 60,4%, respectivamente. A absorbância a 660 nm 5 quase chegou a equilíbrio 18 horas depois, enquanto aumentou lentamente depois, e alcançou finalmente 13,55 72 horas depois.

(Comparação de capacidade de produzir etanol com levedura do gênero Saccharomyces)

A fim de padronizar a capacidade de produzir etanol de cepa DMKU 3-1042, a capacidade de produzir etanol e crescimento de células a 30°C e 45°C foram comparadas com as da cepa KU1, a cepa-padrão solu- ção de levedura Saccharomyees eerevisiae que é comumente usada na pro- dução de etanol, sob as mesmas condições. Cepa 3-1042 e cepa KU1 foram inoculadas em meio YPD (1% de extrato de levedura, peptona 2%, glicose 2%), uma solução padrão de cultura de levedura. A agitação da cultura (160 rpm) foi conduzida a 30°C e 45°C, uma amostragem foi conduzida em uma solução de cultura a cada 6 horas, e o valor OD66O (índice de crescimento) e concentração de etanol em uma solução de cultura foram medidos. A me- dida da concentração de etanol foi conduzida com um método de medição com um álcool desidrogenase que foi isolada e purificada a partir de bactéria de ácido acético (Glueonobaeter suboxydans IF012528) (Documentos dife- rente de patente 4, 5). Estes resultados são mostrado em figuras 3 a 6.

Figuras 3 e 4 mostram a curva de crescimento de cepa 3-1042 (Δ) e cepa KU1 (□) a 30°C e 45°C, respectivamente. O eixo vertical mostra 25 o valor OD66O, e o eixo horizontal mostra o curso do tempo (hora) a partir do início da cultura. Como é evidente da figura 3, o crescimento mostrou uma transição similar para ambas as cepas 30°C. Por outro lado, a 45°C, quase nenhum crescimento foi observado para cepa KU1, enquanto um crescimen- to igual ou mais rápido como em 30°C foi mostrado para cepa 3-1042.

Figuras 5 e 6 mostram a produção de etanol de cepa 3-1042 (Δ)

e cepa KU1 (□) a 45°C e 45°C, respectivamente, em um gráfico. O eixo ver- tical mostra a concentração de etanol em uma solução de cultura (% v/v; 1 % corresponde a 0,8% em termos de p/v), e o eixo vertical mostra o curso do tempo a partir do início da cultura. Como mostrado na figura 5, a capacidade de produzir etanol de cepa 3-1042 a 30°C mostrou uma elevação lenta sua- ve até 6 horas, enquanto atingiu o mesmo nível como a cepa KU1 12 horas 5 depois. A transição a seguir foi similar à da cepa KU1. Especificamente, com relação à característica básica de produção de etanol, foi mostrado que a cepa 3-1042 foi comparável à cepa-padrão solução de Saccharomyces cere- visiae. A 45°C, enquanto somente uma quantidade pequena (cerca de 0,4%) de etanol estava contida em uma solução de cultura para cepa KU1, refletin- 10 do um crescimento ruim, uma quantidade igual ou maior de etanol (1% ou mais) como em 30°C estava contida para cepa 3-1042, a partir de 6 horas e depois. Foi mostrado que a capacidade de produzir etanol de cepa 3-1042 nesta temperatura é maior do que 2 vezes a de uma cepa-padrão solução de

S. cerevisiae, sugerindo a eficácia da cepa 3-1042 sob uma condição de temperatura elevada.

Exemplo 3

(Exame da capacidade de produzir etanol - escala de 3 I)

A fim de investigar a capacidade de produzir etanol de cepa DMKU 3-1042 a 37°C em um vaso de cultura de tamanho de 5 I, 3 I de solu- 20 ção de cultura de suco de cana-de-açúcar (concentração de açúcar total 22% por adição de sacarose; concentração de sulfato de amônio 0,05%; concentração de ácido fosfórico-potássio 0,05%; concentração de sulfato de magnésio hepta-hidratado 0,15%; pH 5,0) foram preparados. Além disso, a fim de examinar o efeito da agitação e da aeração em uma cultura em larga 25 escala, a cultura foi realizada com as seguintes 4 condições:

(1) agitar a 300 rpm (rotações por minuto) apenas

(2) agitar a 300 rpm e aeração a 0,2 vvm (volume do vaso por

minuto)

(3) agitar a 300 rpm, e aeração a 0,2 vvm para as primeiras 12

horas

(4) agitar a 300 rpm e aeração a 0,2 wm para as primeiras 12 horas, e agitar a 150 rpm somente depois A capacidade de produzir etanol para cada uma destas condi- ções são comparadas e mostradas na seguinte Tabela 5. O menor nível foi observado para uma condição (1) de agitação apenas, enquanto a concen- tração de etanol, produtividade, e rendimento foram o mínimo nas 4 condi- 5 ções. Ao contrário, os níveis maiores foram observados com a condição (2) de agitação e aeração contínua, onde uma concentração de etanol foi 4,96%, produtividade 1,3 g/l h, e rendimento 57,1%. Como para o valor OD66O, índice de densidade celular em uma solução de cultura, ele foi me- nor (1) com 5,83, mostrando que, em um sistema de cultura em larga escala, 10 não foi observado suficiente crescimento da levedura com apenas agitação e que, como um resultado, a concentração de etanol não aumentou. Este re- sultado foi suportado a partir do fato de que o valor OD66O maior (12,73) foi observado em (2), onde a aeração contínua foi realizada, mostrando que conduzir uma aeração adequada além da agitação é efetivo na fermentação 15 de etanol usando uma levedura produzindo etanol termotolerante provida pela presente invenção.

Tabela 5

Efeito de agitação e aeração sobre a cultura em uma escala de 3 Efeito de agitação e aeração sobre a cultura em uma escala de 3 I

Concentra¬ Produtivida¬ Rendi¬ Nível máximo de ção de etanol de de Etanol mento OD66O (tempo (%, P/v) (g/l.h) (%) registrado) (1) agitara 300 rpm 4,96 0,81 44 5,83 apenas (2) agitar a 300 rpm 6,43 1,3 57,1 12,73 + aeração a 0,2 vvm (24 h) (3) agitar a 300 rpm 6,17 Levemente Leve¬ 8,92 + aeração a 0,2 wm maior do mente (36 h) (somente para as que (1) maior do primeiras 12 horas) que (1) Concentra¬ Produtivida¬ Rendi¬ Nível máximo de ção de etanol de de Etanol mento OD66O (tempo (%, P/v) (g/l.h) (%) registrado) (4) agitar a 300 rpm 6,03 Levemente Leve¬ 8,10 + aeração a 0,2 wm maior do mente (44 h) (para as primeiras 12 que (1) maior do horas) ---> agitar a que (1) 150 rpm somente depois Exemplo 4

(Comparação de capacidade de produzir etanol com a cepa-padrão solução de K. marxianus)

A cepa de levedura produzindo etanol termotolerante encontrada na presente invenção foi comparada com a cepa-padrão solução de K. mar- xianus. Como uma cepa-padrão solução, cepa NRBC 1777 (abaixo referida como a cepa 1777, ou como uma cepa-padrão solução) que foi fornecida a partir do Incorporated AdministrativeAgency, National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Biological Ressource Center (NBRC) foi usada. O mesmo sistema usado para a comparação acima com levedura do gênero Saccharomyces foi usado, especificamente, cepa 3-1042, cepa 3-118, cepa 3-p106, cepa 3-p1042 e cepa NBRC 1777 foram inoculadas em meio YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose), uma solução- padrão de cultura de levedura. A agitação da cultura (160 rpm) foi conduzida a 30°C e 47°C, 48°C, e 49°C, uma amostragem foi conduzida em uma solu- ção de cultura a cada 6 horas, e o valor de OD66O (índice de crescimento) e concentração de etanol em uma solução de cultura foram medidos. A medida da concentração de etanol foi conduzida com um método de medição com um álcool desidrogenase que foi isolado e purificado a partir da bactéria de ácido acético Gluconobacter suboxydans IF012528) (Documentos diferente de patente 4, 5).

Na figura 7, a curva de crescimento de cada cepa da presente invenção e a cepa-padrão solução cepa 1777 a 30°C são mostradas. O eixo vertical do gráfico mostra o valor OD66O, e o eixo horizontal mostra o curso de tempo a partir do início da cultura. O crescimento de cada cepa da pre- sente invenção (3-1042 = o, 3-p1042 = ·, 3-118 = ■, 3-p106 = □) e o da cepa 1777 (x) foram visualizados. Além disso, figura 8 mostra a comparação da 5 capacidade de produzir etanol de cada cepa da presente invenção e a cepa 1777 a 30°C. O eixo vertical mostra a concentração de etanol (%, v/v), e eixo horizontal mostra o tempo (h) a partir do início da cultura. Os gráficos de 5 barras (do lado à esquerda: 3-1042, 3-p1042, 3-118, 3-p106, NBRC 1777) mostram a produção de etanol de cada cepa por vez. Como é evidente das 10 figuras 7 e 8, foi mostrado que não se tem uma diferença óbvia tanto para o crescimento como para a capacidade de produzir etanol entre cada cepa provida pela presente invenção e a cepa-padrão solução de K. marxianus a 30°C.

Por outro lado, figuras 9 e 10 mostram a curva de crescimento de cada cepa da presente invenção e a da cepa 1777 a 48°C e 49°C. Em ambos os gráficos, eixo vertical mostra o valor OD66O, e eixo horizontal mostra o tempo (h) a partir do início da cultura. Os símbolos no gráfico são iguais como na figura 7 (3-1042 = o, 3-pl042 = *, 3-118 = a, 3-p106 = □. cepa 1777 = *). Como mostrado em ambos os gráficos, quase nenhum crescimento é observado para a cepa-padrão solução cepa 1777 a 48°C, enquanto um certo crescimento de aproximadamente 9 por valor OD66O foi observado para cada cepa da presente invenção. Além disso, a 49°C, ne- nhum crescimento de todo foi observado para cepa 1777, enquanto um crescimento de aproximadamente 3 por valor OD66O foi observado para ca- da cepa da presente invenção. Foi revelado que a levedura produzindo eta- nol termotolerante provida pela presente invenção tem uma termotolerância extremamente superior comparada com a cepa-padrão solução de espécies K. marxianus.

Além disso, em figuras 11 e 12, a capacidade de produzir etanol de cada cepa da presente invenção e a da cepa 1777 a 48°C e 49°C são mostradas por comparação. Em ambos os gráficos, o eixo vertical mostra a concentração de etanol (%, v/v), e o eixo horizontal mostra o tempo (h) a partir do início da cultura. Os símbolos no gráfico são iguais como na figura

8. Como mostrado em ambos os gráficos, as capacidades de produzir etanol de cada cepa da presente invenção são ambas superiores a 48°C e 49°C comparadas com a da cepa 1777. Particularmente, a capacidade de produzir etanol foi mostrada como sendo maior do que 2 vezes a da cepa-padrão so- lução a 48°C.

(Influência de adição de sorbitol)

A fim de melhorar a capacidade de crescimento e a capacidade de produzir etanol sob uma condição severa de temperatura de 48°C e 49°C, 10 a influência da adição de sorbitol foi investigada. As condições de solução de cultura são iguais que o sistema de cultura acima, e especificamente, sorbi- tol com uma concentração final de 50 mM foi adicionado ao meio YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose, 2% de agar) em que a cepa 3-1042, cepa 3-118, cepa 3-p106, cepa 3-p1042 e cepa NBRC 1777 15 foram inoculadas e cultivadas por agitação a 30°C, e 47°C, 48°C, e 49°C. Uma amostragem foi conduzida a uma solução de cultura a cada 6 horas, e o valor de OD66O (índice de crescimento) e concentração de etanol em uma solução de cultura foram medidos.

Figura 13 mostra a influência de sorbitol sobre o crescimento sob uma condição de cultura de 48°C. Em ambos os gráficos, o eixo vertical mostra o valor OD66O, e o eixo horizontal mostra o tempo (h) a partir do iní- cio da cultura. "A" mostra os resultados com sorbitol, e "B" os resultados sem adição de sorbitol. Os símbolos no gráfico são iguais como na figura 7 (3- 1042 = o, 3-p1042 = ·, 3-118 = ■, 3-p106 = □, cepa 1777 = *). Comparado a quando sorbitol não é adicionado, com a cultura por adição de sorbitol, todas as cepas mostraram uma capacidade aumentada de crescimento como mos- trado por OD66O, sugerindo que a adição de sorbitol foi efetiva, figura 14 mostra os resultados a 49°C, e "A" mostra os resultados com sorbitol, e "B" os resultados sem adição de sorbitol. A capacidade de crescimento das 4 cepas da presente invenção aumentou com a adição de sorbitol a 49°C, e uma diferença de 2 vezes ou mais foi observada para o valor OD66O. No entanto, este efeito não foi observado em uma cepa-padrão solução. Confir- mou-se que a adição de sorbitol aumenta a capacidade de crescimento de uma cepa de levedura produzindo etanol termotolerante da presente inven- ção, a uma temperatura extremamente elevada de 49°C onde nenhum efeito é observado em uma cepa-padrão solução.

As figuras 15 e 16 mostram os efeitos de sorbitol sobre a capa-

cidade de produzir etanol sob uma condição de cultura de 48°C e 49°C. Em ambos os gráficos, eixo vertical mostra a concentração de etanol (%, v/v), e eixo horizontal mostra o tempo (h) a partir do início da cultura. "A" mostra os resultados com sorbitol, e "B" os resultados sem adição de sorbitol. Os sím- bolos no gráfico são iguais como na figura 8. A 48°C mostrado na figura 15, a capacidade de produzir etanol de cepa 1777 foi aumentada, enquanto que ela foi somente levemente aumentada para cada cepa da presente invenção. Ao contrário, sob a condição of 49°C mostrada na figura 16, a capacidade de produzir etanol foi de 3 vezes ou mais quando sorbitol foi adicionado, com- parado a quando não foi adicionado. Este nível não foi menor do que o nível a 48°C. Por outro lado, este efeito não foi observado para cepa 1777. Em um meio com adição de sorbitol, concentração de etanol foi dramaticamente aumentada 3 horas depois a partir do início da cultura, e foi mostrado que o efeito de adição de sorbitol foi mostrado em uma cultura de 3 horas ou mais. Aplicabilidade Industrial

A levedura produzindo etanol termotolerante provida pela pre- sente invenção pode ser usada em uma indústria relacionada com a produ- ção de etanol, particularmente a produção de etanol usando biomassa. Par- ticularmente, a propriedade de ter uma capacidade de produzir etanol mes- 25 mo sob uma condição de temperatura severa de 40°C ou mais, leva a uma diminuição do custo na produção de etanol, e aumento da eficiência da fer- mentação.

Claims

1. Método para produzir etanol compreendendo cultivar uma le- vedura produzindo etanol termotolerante de espécie Kluyveromyces marxia- nus tendo uma capacidade de fermentação de etanol sob uma condição de temperatura de 40°C ou maior em uma solução de cultura contendo 10 a 100 mM de álcool de açúcar.

2. Método para produzir etanol de acordo com a reivindicação 1, em que o álcool de açúcar é sorbitol.

3. Método para produzir etanol de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a levedura produzindo etanol termotolerante tem uma capaci- dade de fermentação de etanol sob uma condição de temperatura de 40 a 49°C.

4. Método para produzir etanol de acordo com a reivindicação 3, em que a levedura produzindo etanol termotolerante é representada por De- pósito N0 NITE BP-283, NITE BP-289, NITE BP-290, ou NITE BP-291.

5. Método para produzir etanol de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a solução de cultura contém 15 a 25% açúcar.

6. Método para produzir etanol de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a solução de cultura compreende 15a 25% de açúcar como um componente principal, e compreende pelo menos um com- ponente selecionado dentre 0,01 a 0,5% de sal de amônio, 0,01 a 0,5% de sal de potássio, e 0,01 a 0,5% de sal de magnésio como um componente auxiliar.

7. Método para produzir etanol de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo cultivar levedura sob uma condição de temperatura de 30 a 40°C, em que a solução de cultura compreende 18 a 24% de açúcar como um componente principal, e 0,05 a 0,1% de sulfato de amônio e 0,025 a 0,1% de fosfato de cálcio como um componente auxiliar, e cujo pH é ajustado de 4,8 a 5,2.

8. Método para produzir etanol de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo cultivar levedura sob uma condição de temperatura de 40°C ou maior, em que a solução de cultura compreende 16 a 22% de açúcar como um componente principal, e 0,05 a 0,1% de sulfato de amônio e 0,05 a 0,15% de sulfato de magnésio como um componente auxiliar, e cujo pH é ajustado de 5,3 a 5,7.

9. Método para produzir etanol de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, compreendendo agitar a 150 a 450 rpm e aerar a 0,1 a 0,3 wm.

10. Método para produzir etanol de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que um suco de cana-de-açúcar esmagada é usado como matéria-prima.

11. Levedura produzindo etanol termotolerante de acordo com a reivindicação 13, representada por Depósito N0: NITE BP-283.

12. Levedura produzindo etanol termotolerante de acordo com a reivindicação 13, representada por Depósito N0: NITE BP-289.

13. Levedura produzindo etanol termotolerante de acordo com a reivindicação 13, representada por Depósito N0: NITE BP-290.

14. Levedura produzindo etanol termotolerante de acordo com a reivindicação 13, representada por Depósito N0 NITE BP-291.

15. Transformante obtido por modificação ou introdução de um ou mais genes em uma levedura produzindo etanol termotolerante como de- finida em qualquer uma das reivindicações 11 a 14.