CN108699574B - 生产发酵产物的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一种由木质纤维素原料水解产物浆料生产发酵产物的方法，该浆料包含水、水溶性葡萄糖和木糖以及水不溶性预处理的木质纤维素原料。该过程包括至少两个转换步骤。首先产生包含木质纤维素原料水解产物浆料的第一部分和能够发酵葡萄糖和木糖的酵母的第一转化介质，然后允许酵母在具有5％至25％范围内的第一糖‑细胞转化率的第一转化步骤中，将第一转化介质的至少50％的葡萄糖和小于20％的木糖转化为第一繁殖酵母和第一部分发酵产物。然后产生包含至少一部分第一繁殖酵母和第二部分木质纤维素原料水解产物浆料的第二转化介质，然后允许酵母在具有小于第一糖‑细胞转化率的第二糖‑细胞转化率的第二转化步骤中，将第二转化介质中的至少一部分水溶性葡萄糖和木糖转化成至少第二繁殖酵母和第二部分发酵产物。优选地，第一转化步骤包括至少第一相和第二相，第一相是好氧相，第二相是厌氧相。
Description
背景
数千年来，通过酵母将单糖发酵为醇是众所周知的。也就是说，啤酒几乎是人类历史上所有文化和人种的产物。在生物燃料领域，具有高淀粉含量的第一代原料，例如玉米，已经成功地以工业规模用于生产乙醇。第一代技术的发酵方法利用设施来水解原料以产生具有非常高浓度的单体C6糖(主要是葡萄糖)的水解醪，并且极少或没有酵母抑制剂，例如乙酸。此外，在第一代原料中不存在半纤维素衍生的糖，如木糖。
木质纤维素原料水解产物的使用存在一系列苛刻的问题，其中大多数是在工业规模上进行该过程时产生的。大多数问题涉及使该方法在经济上可行，其它问题与木质纤维素原料水解产物的特定特征相关，这使得木质纤维素原料水解产物的使用比第一代水解产物的情况更难。
发酵木质纤维素原料水解产物的第一个缺点是存在C5单糖，主要是木糖。已知木糖难以或不可能被天然酶和酵母转化，并且已经设计了特殊的基因修饰的酶合剂和酵母以转化半纤维素部分。即使经过基因修饰的酵母能够发酵葡萄糖和木糖，木糖转化也很慢。
发酵木质纤维素原料水解产物的第二个缺点是木质纤维素原料水解产物的低糖浓度，其按湿量计算通常小于100gr总糖/kg水解产物。在低糖浓度下，酵母的糖摄取速率缓慢，从而促进生物污染物(例如细菌)的繁殖，其消耗相关部分的可用糖以产生不需要的生物产物，例如乳酸。酵母的木糖转化率慢，进一步增强了这个问题。因此，通常通过化学或生物化学试剂(例如抗生素)或通过物理试剂(例如热或光)对木质纤维素原料水解产物进行灭菌，从而增加了整体成本。
发酵木质纤维素原料水解产物的第三个缺点是在水解产物中存在抑制性化合物。通常在预处理或水解木质纤维素原料中产生的化合物如乙酸、甲酸、糠醛降低酵母摄取糖的能力，或至少降低摄取速率。经常在酵母转化的上游的各个阶段去除抑制性化合物，再次增加了整体成本。
在木质纤维素原料水解产物的发酵过程中存在的一个主要问题是减少全部需要的酵母量，这对最终产品成本具有很大影响。为了解决该问题，通常实施繁殖步骤，其中在促进酵母生长的条件下将酵母插入繁殖介质中，从而允许产生更多酵母细胞以用于随后的发酵过程。繁殖可以分批、分批进料和连续模式进行。虽然已经证明酵母在包含合成糖(木糖和葡萄糖两者)的繁殖介质上的繁殖在实验室规模上是有效的，但已经提出了不同的方法来将酵母在木质纤维素原料水解产物上繁殖以降低繁殖介质的成本。
通常，将木质纤维素原料水解产物转化为发酵产物的整个过程分离成一个或多个繁殖步骤，然后进行一个或多个发酵步骤。繁殖和发酵步骤专门用于生产特定产品。进行繁殖步骤以在繁殖介质中投入最大允许量的碳以产生酵母细胞，从而最小化转化为在繁殖步骤中被认为是副产物的其他产物(例如乙醇)的碳的量。相反，进行发酵步骤以通过在繁殖步骤中繁殖的酵母使发酵介质中的碳的量最大化以产生作为最终发酵产物的乙醇。繁殖步骤在有氧条件下进行，因此必须将高流量的空气插入木质纤维素原料水解产物中，并且必须以高强度搅拌木质纤维素原料水解产物以促进酵母与空气的接触。木质纤维素原料水解产物通常以浆料形式生产，因此搅拌困难且昂贵。木质纤维素原料水解产物浆料可以分离成包含水和水溶性葡萄糖和木糖的液体组分以及包含水不溶性预处理的木质纤维素原料的固体组分，再次增加了工艺成本。
WO2009155633A1公开了包含含C5化合物的材料的底物在酵母属(saccharomyces)的酵母生长或酵母属的酵母产品的生产中的用途，其中含C5化合物的材料是：(a)从木质纤维素水解产物中获得的含有C5化合物的材料；(b)从木质纤维素水解产物的发酵中获得的含C5化合物的材料；或(c)(a)和(b)的混合物。该专利申请还公开了使用该底物生产酵母属的酵母生物质或酵母属的酵母产物的方法，该方法包括在引起酵母属的酵母生长或产物的生产的条件下，将包含含C5化合物的材料的底物与酵母属的酵母一起培育。因此，该专利申请没有提及涉及酵母在木质纤维素水解产物上繁殖的具体问题和相关解决方案。
WO2014072232A1公开了酵母的有氧繁殖方法，其中酵母在反应器中生长，包括以下步骤：a)用碳源和初始酵母群填充反应器，b)任选地以分批模式在反应器中生长初始酵母群，c)测量反应器中的pH值，d)以分批进料模式将木质纤维素水解产物以一定速率加入反应器中，以将反应器中的pH值设定在预定值，以及e)在充分繁殖后，从反应器中隔离酵母。步骤a)的碳源可以是稀释的木质纤维素水解产物，其中稀释木质纤维素水解产物以降低木质纤维素水解产物的抑制剂化合物的作用。在工业规模上控制分批进料模式的增长是困难的，并且增加了成本，并且在木质纤维素水解产物上的繁殖过程中维持有氧条件，这需要强烈的搅拌和高空气流动。此外，该专利申请没有认识到生物污染物的存在在繁殖步骤中是关键的。即，据说细菌或野生酵母污染在繁殖过程中很少成为问题，因为酵母繁殖罐比发酵罐更小并且更容易清洁。除清洁外，还可添加抗菌产品以防止不需要的微生物生长。
US8450094公开了一种在用于繁殖的介质上繁殖酵母的方法，其中将木糖作为用于细胞团生长的碳源提供给介质。第一细胞团在有氧条件下繁殖，其中第二细胞团中每体积介质每分钟至少1.0体积空气的气流，其任选地在随后的步骤中在第三细胞团中繁殖。该专利中公开的产生合理量酵母的顺序方法需要在有利于生物污染物的条件下的长繁殖时间，从而需要对碳源进行灭菌。
因此，需要一种工业方法，从浆料形式的木质纤维素原料水解产物中生产发酵产物，其中同时产生所需的大部分酵母。据信本公开方法克服了使用木质纤维素原料水解产物浆料的上述缺点，提供了以工业规模从木质纤维素原料水解产物生产发酵产物的成本有效的解决方案。
概述
本说明书公开了由木质纤维素原料水解产物浆料生产发酵产物的方法，所述浆料包含水、水溶性葡萄糖和水溶性木糖以及水不溶性预处理木质纤维素原料，所述方法包括以下步骤：产生第一转化介质，所述第一转化介质包含第一部分木质纤维素原料水解产物浆料和能够将葡萄糖和木糖转化为繁殖酵母和发酵产物的酵母；允许酵母在具有5％至25％范围的第一糖-细胞转化率的第一转化步骤中，将第一转化介质的至少50％的水溶性葡萄糖和小于20％的水溶性木糖转化为第一繁殖酵母和第一部分发酵产物，其中第一糖-细胞的转化率是以碳基计算的、在第一转化步骤中转化为繁殖酵母的葡萄糖和木糖与在第一转化介质中全部转化的水溶性葡萄糖和木糖的重量百分比；产生第二转化介质，所述第二转化介质包含至少一部分的第一繁殖酵母和第二部分木质纤维素原料水解产物浆料；允许酵母在具有小于第一糖-细胞转化率的第二糖-细胞转化率的第二转化步骤中，将所述第二转化介质中的至少一部分水溶性葡萄糖和木糖转化为至少第二繁殖酵母和第二部分发酵产物，其中第二糖-细胞转化率是以碳基计算的、在第二转化步骤中转化为繁殖酵母的水溶性葡萄糖和木糖与在第二转化介质中全部转化的水溶性葡萄糖和木糖的重量百分比。
还公开了，所述第一转化步骤可包括至少第一相和第二相，所述第一相为好氧相，所述第二相为厌氧相，其中所述好氧相进行3小时至12小时的时间。
还公开了，第一转化步骤可进行第一转化时间，所述第一转化时间小于选自由30小时、20小时、15小时和10小时组成的组的值。
还公开了，第一转化步骤可以是通过以选自从0.lvvh至10vvh、从0.1vvh至5vvh和从0.5vvh至3vvh构成的组的范围内的流速插入空气来进行的。
还公开了，所述第一转化步骤可以是通过在湿基基础上以小于所述第一转化介质的100W/ton的重量功率密度混合所述第一转化介质来进行。
还公开了，所述第一糖-细胞转化率可以在选自5％至20％和10％至20％组成的组的范围内。
还公开了，第二转化步骤可以在厌氧条件下进行至少80％的第二转化时间。
还公开了，所述第二转化步骤可以进行第二转化时间，所述第二转化时间大于第一转化时间并且小于选自72小时、60小时和50小时组成的组的值。
还公开了，至少80％的水溶性葡萄糖和水溶性木糖可以在第二转化步骤中被转化。
还公开了，所述第二糖-细胞的转化率可以大于2％。
还公开了，第一转化介质和第二转化介质的干物质可以是小于30％且大于选自由5％、10％、15％和20％组成的组的百分值。
还公开了，第一转化介质和第二转化介质还可以包含氮源。
还公开了，该方法中可以不加入维生素和/或微量元素。
还公开了，木质纤维素原料水解产物浆料可以不进行任何灭菌。
还公开了，第一转化步骤的起始酵母密度可以为以湿基计算每毫克第一转化介质中1×106至1×108个酵母细胞。
还公开了，所述第一转化步骤的最终酵母密度可以为以湿基计算每毫克第一转化介质1×107至1×109个酵母细胞。
还公开了，第二转化步骤的起始酵母密度可以大于第一转化步骤中的起始酵母密度。
还公开了，第一转化步骤和第二转化步骤可以在分开的容器中进行。
还公开了，发酵产物可以是乙醇。
附图简述
图1是实验室规模的两个实验测试的第一转化步骤中的氧气饱和度曲线。
图2是实验室规模的两个实验测试的第二转化步骤中的氧气饱和度曲线。
详述
本说明书公开了一种方法，该方法包括通过酵母将木质纤维素原料水解产物浆料转化为发酵产物的至少两个连续的转化步骤，其中在每个步骤中同时地，木质纤维素原料水解产物的水溶性葡萄糖和木糖总量的一部分转化为本公开的方法中使用的酵母细胞。在第一转化步骤中产生的酵母细胞称为第一繁殖酵母，然后用于第二转化步骤。在每个步骤中，发酵产物因此是主要转化产物，但相比于第二转化步骤，第一转化步骤是在对酵母繁殖更有利的条件下进行的。因此，在第一转化步骤中，转化为酵母的水溶性葡萄糖和水溶性木糖的总量的百分比大于在第二转化步骤中转化为酵母的水溶性葡萄糖和水溶性木糖的总量的百分比。在每个转化步骤中，存在糖-细胞的转化率。糖-细胞转化率是转化为酵母的水溶性葡萄糖和水溶性木糖的量与在该步骤中以碳基计全部转化的水溶性葡萄糖和木糖的量的重量百分比，并且表示为百分数，而不是与该步骤中完全可用的水溶性葡萄糖和木糖的量去比。为清楚起见，在第一转化步骤中全部转化的水溶性葡萄糖和木糖的量的糖-细胞转化率可小于第二转化步骤中的糖-细胞转化率。例如，在第一转换步骤进行的第一转换时间短于第二转换步骤的转换时间的情况下，这可能发生。但是，相对于水溶性葡萄糖和木糖的各自转化部分，第一转化步骤中的酵母繁殖比第二转化步骤中更有利。在第一转化步骤中未转化的水溶性葡萄糖和木糖不会被浪费，因为其优选在第二转化步骤中引入和转化。
根据一个方面，本公开方法提供了一种解决方案，该解决方案可以在工业规模上实施，克服在真实转换设备中发生的问题。
根据另一方面，本公开方法允许从少量酵母开始制备生产发酵产物所需的酵母，从而显著地降低发酵成本。
根据另一方面，在本公开方法中，酵母繁殖发生在转化装置中已经可用的木质纤维素原料水解产物浆料中，从而避免或大大降低与昂贵碳源相关的成本。
根据另一方面，本公开方法能够使用可含有不可忽略水平的生物污染物的木质纤维素原料水解产物浆料，而无需使用任何灭菌剂或程序。
根据另一方面，可以在不使用维生素和其他昂贵营养素的情况下进行本公开方法。
在本公开的上下文中，表述“转化水溶性糖”用于表示由水溶性糖生产一般产品的方法；一般产品包括作为新酵母生物质的繁殖产物和发酵产物，例如乙醇。
通过“繁殖酵母”或“酵母生长”或“制备酵母”、“转化为酵母”和“转化为繁殖酵母”，意味着增加酵母或酵母生物质的量的过程是通过在合适的条件下用碳源和任选的其他营养物饲喂初始酵母量而获得。酵母生物质或酵母量的增加通过增加全部生成的酵母细胞的数量而发生，并且可以通过确定在繁殖步骤或转化步骤的开始和结束时，或在繁殖或转化步骤期间的细胞密度来验证。细胞密度可以通过在一个或多个繁殖步骤的不同时间对转化介质的代表性样品中存在的酵母细胞进行计数来确定。
本公开方法的酵母不仅能够发酵C6单糖，优选葡萄糖，而且能够发酵C5单糖，优选木糖。由于天然存在的酵母通常不能摄取木糖，因此在本公开方法中使用的酵母优选是非天然存在的酵母或衍生自非天然存在的酵母。
术语“非天然存在的”酵母意指微生物具有至少一种基因突变以产生能够发酵葡萄糖和木糖的天然存在的酵母，该基因突变通常在参考物种的一个天然存在的菌株中不存在，包括参考物种的天然存在的多个菌株中也是不存在的。基因突变可包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其他核酸添加物、核酸缺失和/或酵母遗传物质的其他功能破坏。这些修饰可包括，例如，其编码区和功能片段，用于参考物种的异源、同源或异源和同源多肽。其他修饰可以包括，例如，非编码调节区，其中修饰改变基因或操纵子的表达。
本公开的非天然存在的酵母可以含有稳定的基因突变，其是指可以繁殖超过五代而不损失突变的酵母。通常，稳定的基因突变包括持续超过10代的修饰，特别地，稳定的修饰将持续超过约25代，更特别地，稳定的转基因将大于50代，包括无限期。
本公开的酵母可以选自任何已知的酵母属和种。酵母描述于例如N.J.W.Kreger-van Rij，“酵母”，酵母生物学第1卷，第2章，A.H.Rose和J.S.Harrison，Eds.学术出版社，伦敦，1987年。在一个实施方案中，酵母选自由酵母菌属、接合酵母属，假丝酵母属、汉森酵母属、克鲁维酵母属、德巴利酵母属、拿逊酵母属、油脂酵母属、球拟酵母属、克勒克酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属、三角酵母属、酒香酵母、隐球菌属、毛孢子菌属、短梗霉属、油脂酵母属、法夫酵母属、红酵母、耶氏酵母属和许旺酵母属组成的组。优选地，酵母选自酿酒酵母菌株。
在本公开方法中，使用的主要碳源是衍生自木质纤维素原料的浆料形式的水解产物。木质纤维素原料的详细描述可以在WO2015028156A1的第11-14页中找到，其通过引用的方式并入本文。优选的木质纤维素原料选自农业残余物的组，特别是秸秆，例如麦秆、稻草或蔗渣，例如甘蔗渣。硬木和软木也受益于这一过程。任选地，也可以使用其他碳源如磨拉石或合成糖，但木质纤维素原料水解产物的单糖优选为在该过程中使用的总碳源的重量的至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％。在最优选的实施方案中，木质纤维素原料水解产物是用于繁殖酵母的本公开方法中使用的独特碳源。
木质纤维素原料水解产物浆料优选通过多步骤方法源自木质纤维素原料，所述多步骤方法包括预处理木质纤维素原料以产生预处理的木质纤维素原料，并对预处理的木质纤维素原料进行酶水解。预处理增加了其中所含碳水化合物对酶的作用的可及性。优选的预处理包括在加压反应器中用蒸汽相的水对木质纤维素原料进行水热处理，并通过快速释放施加到原料上的压力使蒸汽爆炸所述水热处理的原料。水热处理优选在130℃至230℃的温度范围下进行1分钟至180分钟。优选通过蒸汽在至少10巴的压力下对反应器加压，以获得原料的有效分解。
在一个实施方案中，木质纤维素原料经受浸泡过程或步骤，以在加压反应器中进行水热处理之前除去原始木质纤维素原料中包含的一部分非木质纤维素化合物，例如无机盐、蜡和有机酸。在浸泡步骤或过程中，也可以分离外部污染物，例如地面、石头和收获残余物。浸泡方法优选包括将木质纤维素原料引入包含水的浸泡液体中，所述浸泡液体的温度为20℃至100℃，更优选为40℃至70℃，并且浸泡时间为30秒至30分钟，更优选3分钟至15分钟。
任选地，木质纤维素原料在水或含水的液体中进行初步水热处理，以在引入加压反应器容器之前溶解包含在木质纤维素原料中的一部分水不溶性碳水化合物。初步水热处理在加压条件下、在水以蒸汽或液相或其混合物存在时，在100℃至190℃，优选130℃至180℃，最优选从140℃到170℃的温度下进行。初步水热处理进行的时间范围为10分钟至3小时，优选15分钟至3小时，最优选20分钟至60分钟。初步的水热处理主要溶解了可以在较高温度下经受热降解的木质纤维素原料的半纤维素的成分，并且因此包含水和水溶性木糖聚合物和低聚物以及任选其他半纤维素衍生的糖的液体从固体木质纤维素原料中分离。
将预处理的木质纤维素原料进行酶水解以将聚合和低聚糖水解成单糖，包括葡萄糖和木糖。酶水解包括在促进酶活性的条件下使浆料形式的预处理的木质纤维素原料与酶或酶组合物接触。因此，通过将预处理的木质纤维素原料与包含水的液体混合以使干物质含量优选在10％至25％之间，来提供预处理的木质纤维素原料的浆料；任选地，当实施初步水热处理时，也可以使用至少一部分包含水和其中产生溶解的木糖聚合物和低聚物的液体。酶水解通常在4.5至5.0之间的pH值和45℃至55℃之间的温度下进行，并且在混合搅拌下水解时间为24小时至72小时。
酶水解可以在一个或多个步骤中进行。优选地，酶水解在分离的水解容器中分两步进行。在第一个容器中进行12小时至30小时时间的第一个水解步骤中，获得预处理的木质纤维素原料的部分水解，以获得预处理的木质纤维素原料的液化，从而获得粘度低于初始浆料的部分水解的混合物。然后将部分水解的混合物移动到第二水解容器中，其中第二水解步骤持续12小时至60小时的时间以获得木质纤维素原料水解产物浆料，其包含水、残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料以及水溶性葡萄糖和木糖，其中水溶性葡萄糖和木糖中包含葡萄糖和木糖。木质纤维素原料水解产物浆料可以进一步包含其他C6和C5水溶性单糖，其浓度通常分别低于葡萄糖和木糖。
甚至更优选地，酶水解根据WO2010113130的教导进行，其通过引用的方式并入本文。
可以从木质纤维素原料水解产物浆料中除去一部分残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料。残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料的分离可以通过例如倾析、离心或挤压木质纤维素原料水解产物浆料或其组合来获得。然而，即使在所公开的繁殖过程中残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料的存在可能引起混合问题，浸泡在残留固体中的一些水溶性单糖可能在分离步骤中损失，从而在优选实施方案中没有实施固体去除。
从木质纤维素原料得到木质纤维素原料水解产物浆料的上述一个或多个方法是示例性和优选的实施方案，以提供用作生产根据本公开方法的发酵产物的主要碳源的木质纤维素原料水解产物浆料，并且应理解，它们不旨在以任何方式限制本发明的范围。
木质纤维素原料水解产物浆料可具有5％至30％，优选10％至20％的干物质含量。
木质纤维素原料水解产物浆料的葡萄糖浓度可以为按湿量计算20g/Kg至100g/Kg木质纤维素原料水解产物浆料，优选为30g/Kg至70g/Kg，最优选为40g/Kg至50g/Kg。
木质纤维素原料水解产物浆料的木糖浓度可以为按湿量计算10g/Kg至40g/Kg木质纤维素原料水解产物浆料，优选15g/Kg至30g/Kg，最优选20g/Kg至25g/Kg。
木质纤维素原料水解产物浆料可进一步包含选自乙酸、甲酸、糠醛和羟甲基糠醛(5-HMF)的抑制剂化合物，其在先前的预处理和水解步骤或过程中形成，并抑制酵母生长，至少导致增长率的延迟。
特别地，乙酸以湿基计算的浓度可以为2g/Kg至7g/Kg范围内的木质纤维素原料水解产物浆料。
如通常在工业规模操作中发生的，木质纤维素原料水解产物浆料可进一步含有生物污染物。生物污染物是与根据本公开方法繁殖的酵母不同的微生物，并且其存在通常对本公开方法的产量有害，消耗一部分完全可用于所需酵母生长的单糖。生物污染物可包括细菌和真菌，以及与待繁殖的所需酵母不同的酵母，例如野生型酵母。细菌乳酸菌，特别是乳杆菌属，是主要的细菌污染物。通常将发酵混合物的乳酸浓度作为污染程度的量度。通过对木质纤维素原料水解产物、转化介质和该过程中涉及的设备进行灭菌来控制生物污染，其可以通过添加抗菌剂(例如抗生素或其他无菌剂)或通过灭菌程序获得，灭菌程序可以是例如巴氏消毒，通过在发酵/繁殖过程之前、之间或期间施加物理试剂，包括其中的热、光和辐射。“灭菌”在本文中被认为是生物污染物的密度降低至少100倍。在本公开方法中优选避免使用引入额外成本的抗菌剂和灭菌方法，同时将生物污染物的生长保持在合理的低水平。
优选地，木质纤维素原料水解产物不经受任何灭菌步骤或程序，这在工业规模上实施是困难和昂贵的。
优选地，在本公开方法中没有使用抗菌剂，它们也未在本公开方法之前添加到木质纤维素原料水解产物中。
本公开方法包括至少两个转化步骤，其可以在独特的容器中或在两个单独的容器中进行。为了使成本最小化，优选在转化步骤之间和/或期间不对容器进行任何灭菌和/或清洁。优选地，每个转化步骤以分批模式进行，其中在开始转化步骤之前或在转化步骤开始时，加入木质纤维素原料水解产物浆料。
首先产生包含第一部分木质纤维素原料水解产物和起始量的酵母的第一转化介质。为了限制生物污染物的竞争性生长的影响，在优选的实施方案中，木质纤维素原料水解产物浆料在用于本公开方法之前保持在45℃至55℃的温度，并且最优选是在酶水解或最终酶水解步骤的温度。在此温度下，生物污染物的活性显着降低。在第一转化步骤中使用的部分木质纤维素原料水解产物浆料的温度降低至第一转化步骤的温度，该温度优选在28℃至35℃的范围内。热交换器可用于在第一转化容器中或在进入第一转化容器之前，将第一部分木质纤维素原料水解产物浆料冷却至第一转化步骤的温度。
可以使用水或包含水的液体，以及与木质纤维素原料水解产物浆料不同的任选的有限量的额外碳源来达到所需的干物质含量。本公开方法提供的优点之一是在干物质下进行的可能性高于使用木质纤维素水解产物浆料作为主要碳源的其它已知方法。因为难以搅拌，第一转化介质的干物质重量含量优选小于30％，并且优选大于5％，更优选大于10％，甚至更优选大于15％，最优选大于20％。可以在低于第一转化温度的温度下加入水或包含水的液体，以冷却第一部分木质纤维素原料水解产物浆料。
因此，在第一转化步骤开始时，第一转化介质中的生物污染物的密度可以保持在合理水平，其可以在第一转化介质的100CFU/ml至106CFU/ml的范围内，优选从101CFU/ml到105CFU/ml，最优选从102CFU/ml到103CFU/ml。
第一转化介质可以进一步包含氮源，通常是尿素，其是酵母的廉价营养源，但优选不含添加的维生素和/或微量元素，其通常在实验室规模上用作生长补充剂，但非常昂贵。换句话说，优选地，在该过程期间或在该过程之前的步骤中，不向木质纤维素原料水解产物浆料和转化介质中添加维生素和/或微量元素。
优选地，将第一转化介质的pH值调节至5.0-5.5的值，例如通过添加例如适量的碱(NaOH溶液)。如果需要将pH值保持在所需范围内，可在第一转化步骤中加入另外的等分的碱。
酵母可以添加到第一转化介质中，或添加到用于形成第一转化介质的组分中。在一个实施方案中，将酵母添加到用于形成第一转化介质的第一部分木质纤维素原料水解产物浆料中。与第一转化介质接触的酵母的量将根据第一转化介质的总体积而变化。酵母可以是新鲜酵母，或者可以是在先前的繁殖或转化步骤中产生的酵母。优选地，在第一转化步骤中，加入一定量的酵母，使起始酵母密度为按湿量计算的每毫克第一转化介质中有1×106至1×108个酵母细胞。
在第一转化步骤中，酵母维持在促进第一转化介质的水溶性葡萄糖和木糖转化为第一繁殖酵母和第一部分发酵产物的条件下，其中一定百分比量的全部转化的水溶性葡萄糖和木糖用于酵母生物质的生长。因此，第一转化步骤的特征在于第一糖-细胞转化率，其是以碳基计，转化为第一繁殖酵母的水溶性葡萄糖和水溶性木糖的重量与在第一转化介质中全部转化的水溶性葡萄糖和木糖的总量的重量百分比，并且因为是重量百分比，所以以百分数表示。第一糖-细胞转化率范围为5％至25％，优选5％至20％，最优选10％至20％。
为了计算转化步骤的糖-细胞转化率，可以通过将在转化步骤结束时转化介质中存在的水溶性葡萄糖和木糖的浓度从转化步骤开始时转化介质中存在的水溶性葡萄糖和木糖的浓度中减去，来计算全部转化的水溶性葡萄糖和木糖的量。糖浓度可通过标准HPLC分析确定。显然，如果在转化步骤期间将一些组分添加到转化介质中或从转化介质中除去，则必须在密度测定中考虑，这在分析领域是众所周知的。例如，可以在特定时间添加水以稀释转化介质，或者需要pH值校正，或者添加额外的糖。在一个优选的实施方案中，木质纤维素原料水解产物浆料还包含来自一个或多个水解步骤的残余酶，其中一部分仍具有活性。即使转化条件对于酶活性不是最佳的，但残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料中的一部分水不溶性碳水化合物可以水解成另外的水溶性葡萄糖和木糖，因此其对酵母可能是有用的。同样在这种情况下，由酵母转化的葡萄糖和木糖的总量将考虑额外的水溶性葡萄糖和木糖，其可以通过在转化步骤结束时和开始时，测量残余水不溶性预处理木质纤维素原料中水不溶性糖的量来计算。全部转化的水溶性葡萄糖和木糖还考虑了生物污染物对糖的摄取。
按照每单位体积的酵母细胞数计算的酵母细胞密度可通过细胞计数确定，或者可选择地通过光学透射率测量来确定。一旦已知酵母密度，通过测量具有参考酵母密度的参考样品中的酵母细胞的重量，可以容易地计算酵母细胞的平均重量。
转化步骤的糖-细胞转化率以碳基计表示，即在转化步骤结束时以干基计算的酵母生物质中所含的碳与以干基计算包含在全部转化的水溶性葡萄糖和木糖中的碳之间的比率。
如通过标准元素分析所测量的，全部转化的水溶性葡萄糖和木糖中含有的碳可以通过在转化步骤结束时和转化步骤开始时存在于转化介质中的水溶性葡萄糖和木糖中的碳含量得到。或者，考虑到水溶性葡萄糖和木糖的化学计量式，它可以源自在转化步骤结束和开始时存在于转化介质中的、由酵母转化的水溶性葡萄糖和木糖的浓度。
酵母中的碳含量可以通过干酵母的标准元素分析来测量。或者，可以考虑本领域常用的参考糖-细胞比率转换[参见例如酒精教材，第五版，W.M.Ingledew等，诺丁汉大学出版社，乙醇技术研究所，2009，第133页)，每克糖干基0.50克酵母。因此，如果2克葡萄糖仅转化为酵母，则以干基计产生1gr的酵母。例如，如果产生1gr的酵母并且10gr的葡萄糖全部转化，则糖-细胞的转化率为：
糖-细胞的转化率＝(1gr酵母×2gr葡萄糖/克酵母)/10gr葡萄糖＝20％
每克糖中以干基计算0.50g酵母的相同参考转化率，在木糖的情况下也是有效的。因此，足以测量以干基计生产的酵母的重量和包括葡萄糖和木糖的总糖量，以容易地计算每个转化步骤的糖-细胞转化率。
如本领域所知，有氧条件增强了产生的繁殖酵母的量。有氧条件的特征在于转化介质中的平均氧气饱和度大于10％。氧气饱和度是在稳定平衡状态的温度和压力下，转化介质中溶解氧(O2)浓度与转化介质中溶解的最大氧气量之比。因此，通常将包含1vvm或更高流速氧气的氧气流、空气流或其他气体混合物气流插入转化介质中。为了促进转化介质中的氧扩散，通常还提供转化介质的搅拌或混合，由于转化介质的高粘度，这在高干物质下是困难的或昂贵的。
在本公开方法中，优选通过仅在第一转化步骤的一部分中保持有氧条件来获得第一转化步骤结束时的第一糖-细胞转化率。换句话说，相对于转化介质中的平均氧气饱和度，第一转化步骤包括至少两个阶段，第一阶段是好氧阶段，然后是第二阶段，其是厌氧阶段。在一个优选的实施方案中，好氧阶段是在第一转化步骤开始时，并且通过以中等的流速插入空气达到，该流速为0.1vvh至10vvh范围内，优选为0.1vvh至5vvh，最优选0.5vvh至3vvh。第一部分木质纤维素原料水解产物浆料通过重力从入口引入第一转化容器中，该入口位于足以在已经存在于第一转化容器中的木质纤维素原料水解产物浆料或转化介质中产生鼓泡的高度。可以引入第一部分木质纤维素原料水解产物浆料以形成级联，以利用在第一转化容器中转移期间发生的木质纤维素原料水解产物浆料的天然氧合。由于中等的空气流速，氧气饱和度的初始水平处于高值，优选大于40％，最优选大于80％，并且在第一转化步骤期间降低。中等的空气流速用于减缓氧气饱和度初始水平的自然降低，以获得好氧相，优选3小时至12小时，更优选5小时至10小时，最优选从7小时到8小时。在第一转化步骤期间，将第一转化介质在适度搅拌下保持第一转化时间的至少一部分，以改善氧扩散。可以通过机械混合装置实现搅拌。提供混合以减慢和均化氧气饱和度的初始水平的自然降低，并且即使在高干物质浆料的情况下，中等功率也足以在期望范围内获得一段时间的有氧条件。用于搅拌第一转化介质的功率可以根据用于按湿量计算搅拌一吨第一转化介质的电功率来测量，其是重量功率密度，并且在本公开方法中优选使用按湿量计算的低于100W/吨第一转化介质的平均重量功率密度。
葡萄糖和木糖摄取速率是本公开方法的重要参数，尤其是在木质纤维素原料水解产物包含一些生物污染物且不使用灭菌和抗菌剂的情况下，因为在这些条件下，生物污染物的竞争性生长增强。酵母的葡萄糖摄取相对于木糖摄取来说是更有利的，因此转化介质中的葡萄糖浓度将开始降低，而木糖摄取将不会显著进行直至葡萄糖浓度降低至某一临界值以下。随着酵母对转化介质中剩余糖(葡萄糖和木糖)的亲和力降低，由酵母组合的葡萄糖和木糖的总摄取速率将随时间降低，使得生物污染物的竞争性生长有利。因此，在本公开方法中，第一转化步骤延长足以消耗起始转化介质中所含葡萄糖的至少50％并且小于起始转化介质中所含木糖的20％的时间。意图是葡萄糖和木糖消耗量是转化步骤期间发生的总消耗量，并且可以通过测量转化介质中相应的糖浓度来验证。因此，在第一转化步骤中发生的葡萄糖和木糖组合的总消耗还包括生物污染物对葡萄糖和木糖组合的摄取，其意图在本公开方法中最小化，并且糖最终转化为发酵产物。为了在产生的酵母生物质方面提高方法的产率，优选第一转化步骤进行第一转化时间，其足以消耗起始转化介质的至少70％葡萄糖，最优选至少80％。同时，为了避免总糖摄取率达到生物污染物竞争性生长的临界值，优选第一转化步骤延长第一转化时间，足以在起始转化介质中消耗少于10％的木糖，最优选小于5％。还应注意，尽管在第一转化步骤中消耗的木糖总量优选大于0，但在某些情况下，至少在第一转化步骤中木糖可能不会明显消耗。第一转化步骤可进行小于30小时的第一转化时间，但优选小于20小时，更优选小于15小时，最优选小于10小时。
在第一转化步骤结束时，获得第一转化培养液，其包含水、第一繁殖酵母和第一部分发酵产物。由于在第一转化时间的一部分期间施加的有氧条件，第一繁殖酵母的量可以是相应的酵母起始量的5至15倍。相同的优选范围适用于酵母细胞密度。优选地，在第一转化步骤中，最终酵母密度按湿量计算为每毫克第一转化介质中有1×107至1×109个酵母细胞。第一转化培养液还包含水溶性葡萄糖和未被酵母消耗的木糖以及残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料。
然后将第一繁殖酵母用于第二转化步骤以转化第二部分木质纤维素原料水解产物浆料。与第一转化步骤相比，第二转化步骤集中于发酵产物的产生，但同时将少量水溶性葡萄糖和木糖转化为第二酵母生物质。与第一转化步骤相反，第二转化步骤转化大部分可用的水溶性葡萄糖和木糖，并且可能转化所有水溶性葡萄糖和木糖，从而需要比第一转化时间长的第二转化时间。进行第二转化步骤以达到比第一转化步骤更高的糖转化产量，因此产生第二酵母生物质以保持第二转化时间尽可能低，限制生物污染物的生长。进行第二转化步骤以具有小于第一糖-细胞转化率的第二糖-细胞转化率。第二糖-细胞转化率优选大于2％。即使在第二转化步骤中可以加入本公开方法以外的一些限量的酵母，优选仅使用第一繁殖酵母或其至少一部分。第二转化时间大于第一转化时间，优选小于72小时，更优选小于60小时，最优选小于50小时。在任何情况下，希望在第二转化步骤中，至少80％的、在第二转化介质中完全可用的水溶性葡萄糖和木糖被转化。
从第一繁殖酵母的至少一部分和第二部分木质纤维素原料水解产物浆料产生第二转化介质。用于形成第二转化介质的程序类似于形成第一转化介质的程序，并且相同的优选实施方案经必要的修正适用于第二转化介质的产生。在一个优选的实施方案中，在用于产生第二转化介质之前，第一繁殖酵母不与第一转化培养液分离，并且至少一部分第一填充培养液和第二部分木质纤维素原料水解产物浆料是在第二转化容器中混合在一起以形成第二转化介质。因此，在第一转化步骤中未转化的残余水溶性葡萄糖和木糖可在第二转化步骤中转化并且不浪费。在该实施方案中，第二转化步骤开始时的第二转化介质还包含在第一转化步骤中产生的第一部分发酵产物。优选地，选择第一转化培养液和第二部分木质纤维素原料水解产物浆料的量以在第二转化步骤中具有大于第一转化步骤中的起始酵母密度的起始酵母密度。优选，高的起始酵母密度以减少第二转化时间。第二转化步骤中的起始酵母密度可以是按湿量计算每毫克第二转化介质中有1×106至1×108个酵母细胞。第一转化培养液和第二部分木质纤维素原料水解产物浆料优选按湿量计算的重量比为1：2至1:10，最优选1：3至1：8。
如在第一转化步骤中那样，同样在第二转化步骤中，在用于产生第二转化介质之前，第二部分木质纤维素原料水解产物浆料优选保持在45℃至55℃的温度，以限制生物污染物的竞争性增长的影响。
因此，在第二转化步骤开始时，第二转化介质中的生物污染物的密度可以保持在合理水平，其可以在第二转化介质的100CFU/ml至106CFU/ml的范围内，优选从101CFU/ml至105CFU/ml，且最优选从102CFU/ml至103CFU/ml。
为了保持第二糖-细胞转化率低，第二转化步骤在厌氧条件下进行，或者普遍在厌氧条件下进行，即厌氧条件保持第二转化时间的至少80％。如果存在，优选在第二转化步骤开始时可以存在好氧相。即，类似于第一转化步骤，第二部分木质纤维素原料水解产物浆料和/或第一填充培养液优选通过重力从入口引入第一转化容器中，该入口位于足以在已经存在于第二转化容器中的木质纤维素原料水解产物浆料和/或转化介质中产生鼓泡的高度。可以引入木质纤维素原料水解产物浆料以形成级联，以利用在第二转化容器中转移期间发生的木质纤维素原料水解产物浆料的天然氧合。优选地，在第二转化步骤中不引入空气。
在第二转化步骤期间，第二转化介质可以在适度搅拌下保持第二转化时间的至少一部分，以改善浆料的均匀性。可以通过机械混合装置进行搅拌。提供混合以减缓和均匀化氧气饱和度的初始水平的自然降低。该功率用于搅拌第二转换介质。优选使用按湿量计算小于100W/吨第二转化介质的平均重量功率密度。
第二转化步骤产生浆料形式的第二发酵液，其包含水、发酵产物和残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料。可以从第二发酵液中分离和回收的发酵产物。
试验
木质纤维素原料水解产物的制备
选择小麦秸秆用于证明本公开方法。
首先，通过在158℃的温度下进行初步水热处理65分钟，同时对原料进行第一溶解，对原料进行预处理。该方法产生预处理的原料浆料，其通过挤压分离成液体部分和固体部分，液体部分主要包含低聚物。将固体部分用蒸汽在204℃下进行水热处理4分钟，然后蒸汽爆破，以产生固体的预处理木质纤维素原料。
将固体的预处理木质纤维素原料和包含低聚物的液体部分在生物反应器中混合，并加入水以获得干物质含量为15％重量的预处理的木质纤维素原料浆料，通过添加NaOH，调节pH值至5.0±0.2，然后将经预处理的木质纤维素原料浆料进行酶水解。
加入能够水解C6和C5糖的诺维信(Novozymes)的商业酶合剂CTec3，相当于预处理的木质纤维素原料中每克葡聚糖中7％蛋白质的mg剂量，并且浆料在连续搅拌72小时下在50℃水解。
得到的木质纤维素原料水解产物是浆料，其干物质为15％重量，包含液体馏分和残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料。
将木质纤维素原料水解产物浆料保持在50℃的温度直至其用于随后的繁殖实验。没有引入抗生素。
转换实验
本公开方法在实验室规模和工业规模上都得到了证实。在转化步骤之间和实验之间进行实验而没有任何灭菌。
实验室规模
第一实验室实验
在第一转化步骤中，在第一生物反应器中插入1.2L体积的热木质纤维素原料水解产物浆料，并以1.5g/L补充尿素溶液，形成第一转化介质。通过NaOH控制，将pH值设定为5.2±0.1。没有使用维生素和其他营养素。在插入酵母之前将转化介质冷却至32℃。干物质约为15％。表1中报告了第一转化介质的按湿量计算的成分，其大致对应于木质纤维素原料水解产物浆料的成分。这些成分是根据与该方法有关的水溶性组分给出的，并且残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料的主要成分分离(不溶性葡聚糖、不溶性木聚糖和木质素及其他不溶物)。乙酸、甲酸、糠醛、羟甲基糠醛是酵母繁殖的抑制性化合物。
乳酸是由细菌污染产生的，因此被认为是细菌存在的标志。因此，木质纤维素原料水解产物中存在某种生物污染。
第一转化步骤在搅拌状态下进行，通过以分批配置使用300rpm的叶轮混合培养介质，插入1VVh的空气流进行。VVh对应于每小时每转换介质体积流动的气体体积。
通过细胞计数(Neubauer细胞计数室)测定酵母细胞密度，并通过HPLC分析第一转化介质的组成，以确定残留葡萄糖和木糖以及酵母繁殖的关键化合物的浓度。两个测量都在转换步骤的开始和结束时进行。
由Leaf Technologies提供的、能够发酵葡萄糖和木糖的商业转基因酵母CelluXTM2，以每毫克第一转化介质中1.3×107个酵母细胞的起始酵母密度插入第一转化介质中，相当于每克第一转化介质中以干基计算0.2g酵母。
考虑到让酵母适应转化介质所需的初始滞后期，第一转化步骤进行14小时的第一转化时间。在转化步骤期间，通过在校准后插入转化介质中的pO2探头Mettler ToledoInProbe 6820测量氧气饱和度pO2，并报告在图1中。pO2在接近约70％的几乎稳定水平下保持约3小时，表明酵母在滞后期如预期的那样几乎无活性，然后在约6.5小时内逐渐降低至10％。
在第一转化培养液中实现酵母细胞浓度为1.5×108酵母细胞/毫克。通过计算生长因子来评估生长性能，所述生长因子是转化结束时和转化开始时酵母细胞浓度之间的比率。在第一转化步骤中获得约11.5的生长因子，对应于每千克第一转化介质中以干基计约2g酵母。
第一转化培养液的组成报告于表1中。尽管存在来自先前水解步骤的残余酶，转化培养液中的高糖浓度抑制了低聚糖以及不溶性葡聚糖和木聚糖的进一步水解。
转化约33.9g/Kg葡萄糖(相当于约76％的初始葡萄糖)，并且在第一转化步骤中消耗约1.3g/Kg木糖(相当于约7％的初始木糖)。考虑到每克糖0.50g酵母的参考转化率，因此每kg培养介质将约第一转化介质的4.2gr的糖转化为酵母，糖-细胞的转化率约为11％。
乳酸浓度没有显着增加，表明细菌污染物的繁殖处于合理水平。还产生了一定量的乙醇。
表1在实验室规模上实验的起始转化介质(t＝0h)和转化培养液(t＝14h，t＝6h)的成分
在第二转化步骤中，将等分试样的960ml热木质纤维素原料水解产物引入第二生物反应器中，与第一生物反应器相同，冷却至约32℃，然后添加体积为240ml的第一转化培养液以形成第二转化介质。通过NaOH溶液将pH值设定为5±0.1，并补充1.0g/L的尿素溶液。因此，在第二转化步骤中，第一转化培养液的体积约为第二转化介质总体积的1：5。表1中报告了第二种转化介质的组成。注意，第二转化介质含有来自用新鲜木质纤维素原料水解产物浆料稀释的第一转化培养液中的一些乙醇；乙醇浓度足够低，不会对第二转化步骤产生问题。起始葡萄糖和木糖浓度低于第一转化步骤中的浓度，因为一些糖被消耗。
起始酵母密度为每毫克第二转化介质约3.2×107个酵母细胞，相当于每克第二转化介质以干基计约0.5g酵母。图1中报告的第二转化步骤的PO2浓度在约2小时内从50％降至10％。
在没有气流的情况下，以分批配置进行48小时第二次转化，在300rpm的搅拌下保持32℃的温度。在第二转化步骤中，通过木质纤维素原料水解产物中包含的酶继续酶水解残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料，并且一些额外的糖可用于酵母。
在第二转化培养液中实现酵母细胞浓度为1.6×108酵母细胞/毫克，从而获得约5的生长因子，相当于每千克第二转化介质以干基计约2.5g酵母。
第二转化培养液的成分显示，第二转化介质中的几乎所有单糖都被繁殖的酵母消耗，以及在第二转化步骤中水解的其他单糖也是一样，其保持其发酵葡萄糖和木糖的能力。由此将约55gr糖/Kg第一转化介质转化为酵母，糖-细胞的转化率为约9％。
细菌污染非常低或可以忽略不计，正如稳定的乳酸浓度所证实的。
整个转化过程的效率通常通过基于碳的糖-乙醇转化因子来描述。如本领域所知，理想的糖-乙醇转化因子为0.51。如化学计量配方所描述的，在没有酵母繁殖的情况下，这对应于糖向乙醇的最大转化。总的糖-乙醇的转化因子为约0.43，表明本公开方法通过该方法以外非常少量的酵母，实现了高的乙醇产率。
第二实验室实验
第二个实验如第一个实验中那样进行，但第一个实验中第一转化培养液的残余等分试样用作接种物，而不是新鲜的干酵母。此外，第一转化步骤进行6小时，因为酵母已经适应转化介质。转化介质和培养液的组成列于表1中。第一个转化介质中的葡萄糖含量略低于第一个实验中的葡萄糖含量，因为来自第一个实验的残留等分试样中的一些葡萄糖被转化。此外，即使没有问题，也存在一些乙醇。在图1中报告了第一转化步骤的pO2。第二转化步骤的pO2与第一实验的相应步骤几乎相同。
第一转换步骤的主要参数和结果：
起始酵母密度：每毫克5.3×107个酵母细胞
最终酵母细胞密度：每毫克1.7×108个酵母细胞
生长因子：约3.2
产生的酵母的重量：每千克干基1.8克酵母
转化的总糖：26克/千克
糖-细胞的转化率：13.4％。
第二转换步骤的主要参数和结果：
起始酵母密度：每毫克3.4×107个酵母细胞
最终酵母细胞密度：每毫克1.5×108个酵母细胞
生长因子：约4.4
产生的酵母的重量：每千克干基1.8克酵母
总糖转化率：59g/Kg
糖-细胞的转化率：8％。
整个过程的总糖/乙醇转化因子：0.43
工业规模验证
转换过程在工业规模设备上进行测试。使用的程序转换自实验室规模的实验。
第一转化步骤在第一个圆柱形容器中进行。通过与容器轴线同轴的、以38rpm旋转的叶轮提供搅拌。
第二转化步骤在第二个圆柱形容器中进行。通过与容器轴线同轴的、以20rpm旋转的叶轮提供搅拌。
通过设置在转化介质内的不同位置的一组探针测量pO2。
pO2曲线显示与实验室规模实验类似的轮廓。
第一转化容器装有350立方米的第一培养介质，第一转化步骤进行18小时。第二转化步骤在1200立方米的全部第二培养介质上进行60小时，其按照新鲜水解产物：第一转化培养液为4：1的比例形成。
两个实验室规模的实验都按工业规模进行了扩大。
第一个转换步骤的主要参数和结果：
第二次转化步骤的主要参数和结果：
糖-细胞转化率： 12％ 15％
在整个过程中，按湿基计算的平均电功率消耗约为90W/吨第一转化介质。
进行不同的运行，平均电功率消耗小于100W/吨第一转化介质。在某些情况下，获得了小于80W/吨的平均电功率消耗。
工业规模验证表明，本公开方法可以通过该方法以外的少量酵母达到高乙醇产率，低细菌污染和非常低的功耗。
Claims (13)
1.一种由木质纤维素原料水解产物浆料生产发酵产物的方法，所述水解产物浆料包括水、水溶性葡萄糖和水溶性木糖以及水不溶性预处理木质纤维素原料，所述木质纤维素原料水解产物浆料不进行任何灭菌，所述方法包括以下步骤：
产生第一转化介质，所述第一转化介质的干物质含量小于30％且大于10％的百分比值，所述第一转化介质包含第一部分木质纤维素原料水解产物浆料和能够将葡萄糖和木糖转化为繁殖酵母和发酵产物的酵母；
允许酵母在具有10％至20％范围的第一糖-细胞转化率的第一转化步骤中执行第一转化时间，将第一转化介质的至少50％的水溶性葡萄糖和小于20％的水溶性木糖转化为第一繁殖酵母和第一部分发酵产物，其中第一糖-细胞的转化率是以碳基计算的、在第一个转化步骤中转化为繁殖酵母的葡萄糖和木糖与在第一转化介质中全部转化的水溶性葡萄糖和木糖的重量百分比，
所述第一转化步骤的起始酵母密度为以湿基计算每毫克第一转化介质中1×106至1×108个酵母细胞；
产生第二转化介质，所述第二转化介质的干物质含量小于30％且大于10％的百分比值，所述第二转化介质包含至少一部分的第一繁殖酵母和第二部分木质纤维素原料水解产物浆料；
允许酵母在具有小于第一糖-细胞转化率的第二糖-细胞转化率的第二转化步骤中执行比所述第一转化时间长的第二转化时间，将所述第二转化介质中的至少一部分水溶性葡萄糖和木糖转化为至少第二繁殖酵母和第二部分发酵产物，其中第二糖-细胞转化率是以碳基计算的、在第二转化步骤中转化为繁殖酵母的水溶性葡萄糖和木糖与在第二转化介质中全部转化的水溶性葡萄糖和木糖的重量百分比，
所述第二转化步骤的起始酵母密度大于所述第一转化步骤中的起始酵母密度；
所述发酵产物是乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一转化步骤包括至少第一相和第二相，所述第一相为好氧相，所述第二相为厌氧相，其中所述好氧相进行3小时至12小时范围的时间。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中第一转化步骤进行第一转化时间，所述第一转化时间小于30小时的值。
4.根据权利要求1所述的方法，其中第一转化步骤是通过以从0.lvvh至10vvh的范围内的流速插入空气来进行的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一转化步骤通过以以湿基计算小于100W/吨所述第一转化介质的重量功率密度混合所述第一转化介质来进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二转化步骤进行第二转化时间，所述第二转化时间大于第一转化时间并且小于72小时的值。
7.根据权利要求1所述的方法，其中第二转化步骤在厌氧条件下进行至少80％的第二转化时间。
8.根据权利要求7所述的方法，其中至少80％的水溶性葡萄糖和木糖在第二转化步骤中被转化。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二糖-细胞的转化率大于2％。
10.根据权利要求1所述的方法，其中第一转化介质和第二转化介质还包含氮源。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该方法中不加入维生素和/或微量元素。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一转化步骤的最终酵母密度为以湿基计算每毫克第一转化介质1×107至1×109个酵母细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中第一转化步骤和第二转化步骤在分开的容器中进行。
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