ES2713749T3 - Proceso para propagar una levadura capaz de fermentar glucosa y xilosa - Google Patents

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Abstract

Un proceso para producir un producto de fermentación a partir de una suspensión de hidrolizado de materia prima lignocelulósica que comprende agua, glucosa soluble en agua y xilosa soluble en agua y materia prima lignocelulósica pretratada insoluble en agua, comprendiendo dicho proceso las etapas de: crear un primer medio de conversión que comprende una primera porción de la suspensión de hidrolizado de materia prima lignocelulósica y una levadura capaz de convertir la glucosa y xilosa a una levadura de propagación y un producto de fermentación; permitir a la levadura convertir al menos el 50 % de la glucosa soluble en agua y menos del 20 % de la xilosa soluble en agua del primer medio de conversión a una primera levadura propagada y una primera porción del producto de fermentación en una primera etapa de conversión llevada a cabo durante un primer tiempo de conversión y que tiene una proporción de la primera conversión azúcar a células en un intervalo del 5 % al 25 %, en donde la proporción de la primera conversión azúcar a células es una proporción de porcentaje en peso de la glucosa y xilosa convertida a la levadura propagada en la primera etapa de conversión a la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas en el primer medio de conversión, sobre una base de carbono; crear un segundo medio de conversión que comprende al menos una porción de la primera levadura propagada y una segunda porción de la suspensión de hidrolizado de materia prima lignocelulósica; permitir a la levadura convertir al menos una porción de la glucosa y xilosa solubles en agua en el segundo medio de conversión a al menos una segunda levadura propagada y una segunda porción del producto de fermentación en una segunda etapa de conversión llevada a cabo durante un segundo tiempo que es mayor que el primer tiempo de conversión y que tiene una proporción de una segunda conversión azúcar a células que es menor que la proporción de la primera conversión de azúcar a células, en donde la proporción de la segunda conversión de azúcar a células es una proporción de porcentaje en peso de la glucosa y xilosa solubles en agua convertidas a la levadura propagada en la segunda etapa de conversión a la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas en el segundo medio de conversión, sobre una base de carbono.

Description

DESCRIPCION
Proceso para propagar una levadura capaz de fermentar glucosa y xilosa
Antecedentes
La fermentacion de azucares monomericos a alcohol por medio de levaduras es muy conocida desde hace miles de anos. A saber, la cerveza se ha producido por casi todas las culturas y poblaciones en la historia de la humanidad. En el campo de los biocombustibles, las materias primas de primera generacion que tienen un alto contenido en almidon, tal como el mafz, se han utilizado con exito a escala industrial para producir etanol. Los procesos fermentativos de tecnologfa de primera generacion aprovechan la facilidad para hidrolizar la materia prima para producir una mezcla hidrolizada que tiene una muy alta concentracion de azucares monomericos de C6, predominantemente glucosa, y muy pocos o ningun inhibidor de levadura, tal como el acido acetico, Ademas, azucares derivados de hemicelulosa, tales como xilosa, no estan presentes en la materia prima de primera generacion.
El uso de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica presenta una serie de problemas exigentes, la mayona de los cuales surgen al realizar el proceso a escala industrial. La mayona de los problemas estan relacionados con hacer que el proceso sea economicamente factible; otros estan relacionados con las caractensticas espedficas del hidrolizado de materia prima lignocelulosica que hace que el uso de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica sea mas diffcil que en el caso de un hidrolizado de primera generacion.
Un primer inconveniente en la fermentacion de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica es la presencia de azucares monomericos de C5, principalmente xilosa. Se sabe que la xilosa es diffcil o imposible de convertir mediante enzimas naturales y levaduras, y las mezclas de enzimas y levaduras modificadas geneticamente especiales se han disenado para convertir la porcion hemicelulosica. Incluso con las levaduras modificadas geneticamente para poder fermentar tanto la glucosa como la xilosa, la conversion de la xilosa es lenta.
Un segundo inconveniente en la fermentacion de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica es la baja concentracion de azucar de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica, que suele ser inferior a 100 g de azucar total por Kg de hidrolizado sobre una base humeda. A baja concentracion de azucar, la velocidad de absorcion de azucar por la levadura es lenta y, por lo tanto, se facilita la propagacion de contaminantes biologicos, tales como las bacterias, que consumen una parte relevante de los azucares disponibles para producir productos biologicos no deseados, tales como los acidos lacticos. El problema se ve reforzado por la lenta velocidad de conversion de xilosa por la levadura. De este modo, a menudo se practica la esterilizacion del hidrolizado de materia prima lignocelulosica por medio de agentes qmmicos o bioqmmicos, como los antibioticos, o por medio de agentes ffsicos, como el calor o la luz, lo que aumenta el costo total.
Un tercer inconveniente en la fermentacion de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica es la presencia de compuestos inhibidores en el hidrolizado. Los compuestos tales como el acido acetico, acido formico, furfural, que se producen ffpicamente en el pretratamiento o hidrolizacion de la materia prima lignocelulosica, reducen la capacidad de la levadura para absorber los azucares, o al menos la velocidad de absorcion. La eliminacion de compuestos inhibidores en varias etapas anteriores a la conversion de la levadura se practica a menudo aumentando nuevamente los costes totales.
Un problema importante en un proceso de fermentacion de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica es reducir la cantidad de levadura totalmente necesaria, lo que tiene un gran impacto en el coste del producto final. Para resolver el problema, generalmente se practica una etapa de propagacion, en la que la levadura se inserta en un medio de propagacion en condiciones que promueven el crecimiento de la levadura, permitiendo, por lo tanto, producir mas celulas de levadura para ser utilizadas en un proceso de fermentacion posterior. La propagacion se puede realizar en modo discontinuo, alimentado por lotes y continuo. Si bien la propagacion de una levadura en un medio de propagacion que comprende azucares sinteticos, tanto la xilosa como la glucosa, ha demostrado ser eficaz a escala de laboratorio, se han propuesto diferentes enfoques para propagar la levadura en un hidrolizado de materia prima lignocelulosica para reducir los costes del medio de propagacion.
Tfpicamente, todo el proceso para convertir un hidrolizado de materia prima lignocelulosica en un producto de fermentacion se separa en una o mas etapas de propagacion, seguido por una o mas etapas de fermentacion. Las etapas de propagacion y fermentacion estan especializadas para producir un producto espedfico. La etapa de propagacion se lleva a cabo para dedicar la cantidad maxima permitida de carbono en el medio de propagacion para producir celulas de levadura, minimizando la cantidad de carbono convertido a otros productos, tales como etanol, que se consideran subproductos en la etapa de propagacion. La etapa de fermentacion se realiza en cambio para maximizar la cantidad de carbono en el medio de fermentacion para producir etanol, que es el producto final de la fermentacion, por medio de la levadura propagada en la etapa de propagacion. La etapa de propagacion se lleva a cabo en condiciones aerobicas, por lo tanto, el aire a un alto flujo debe insertarse en el hidrolizado de materia prima lignocelulosica y el hidrolizado de materia prima lignocelulosica debe agitarse a alta intensidad para promover el contacto de la levadura con el aire. El hidrolizado de materia prima lignocelulosica se produce a menudo en forma de suspension, por lo tanto es diffcil y caro de agitar. La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se puede separar en un componente ffquido que comprende agua y glucosa y xilosa solubles en agua, y un componente solido que comprende materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua, que aumenta de nuevo los costes del proceso.
El documento de Patente WO2009155633A1 describe el uso de un sustrato que comprende material que contiene un compuesto de C5, en el crecimiento de la levadura Saccharomyces o la produccion de un producto de levadura Saccharomyces, en el que el material que contiene el compuesto de C5 es: (a) un material que contiene el compuesto de C5 obtenido a partir del hidrolizado lignocelulosico; (b) un material que contiene el compuesto de C5 obtenido a partir de la fermentacion del hidrolizado lignocelulosico; o (c) una mezcla de (a) y (b). La solicitud de Patente tambien describe un metodo para producir biomasa de levadura Saccharomyces o un producto de levadura Saccharomyces utilizando el sustrato, el metodo que comprende incubar un sustrato que comprende un material que contiene el compuesto de C5 con una levadura Saccharomyces en condiciones que causen el crecimiento de la levadura Saccharomyces o la produccion del producto. Por lo tanto, la solicitud de Patente no dice nada sobre los problemas espedficos y las soluciones relacionadas implicadas en la propagacion de la levadura en un hidrolizado lignocelulosico.
El documento de Patente WO2014072232A1 describe un proceso para la propagacion aerobica de levaduras en la que la levadura se cultiva en un reactor, que comprende las etapas de: a) llenar el reactor con una fuente de carbono y una poblacion de levadura inicial, b) opcionalmente hacer crecer la poblacion de levadura inicial en el reactor en el modo de lotes, c) medir el pH en el reactor, d) anadir el hidrolizado lignocelulosico al reactor en modo de alimentacion por lotes a una velocidad para establecer el pH en el reactor en un valor predeterminado, y e) despues de una propagacion suficiente, aislar la levadura del reactor. La fuente de carbono de la etapa a) puede ser hidrolizado lignocelulosico diluido, en donde la dilucion del hidrolizado lignocelulosico se proporciona para reducir los efectos de los compuestos inhibidores del hidrolizado lignocelulosico. Controlar un crecimiento en modo de alimentacion por lotes es diffcil a escala industrial y aumenta los costes, asf como mantener las condiciones aerobicas en un proceso de propagacion en un hidrolizado lignocelulosico, que requiere una fuerte agitacion y un alto flujo de aire. Ademas, la solicitud de Patente no reconoce la presencia de contaminantes biologicos como cnticos en la etapa de propagacion. Es decir, se afirma que la contaminacion por bacterias o levaduras nativas rara vez es un problema durante la propagacion porque los tanques de propagacion de levaduras son mas pequenos y se pueden limpiar mas facilmente que los tanques de fermentacion. Ademas de la limpieza, se pueden agregar productos antibacterianos para prevenir el crecimiento de microbios no deseados.
El documento de Patente US8450094 describe un metodo para propagar una levadura en un medio para la propagacion, en el que se suministra xilosa al medio como una fuente de carbono para el crecimiento de la masa celular. Una primera masa celular se propaga bajo condiciones aerobicas con un flujo de aire de al menos 1,0 volumenes de aire por volumen de medio por minuto en una segunda masa celular, que se propaga opcionalmente en una etapa posterior en una tercera masa celular. El metodo secuencial descrito en la patente para producir una cantidad razonable de levadura necesita largos tiempos de propagacion en condiciones favorables a los contaminantes biologicos, requiriendo por lo tanto la esterilizacion de la fuente de carbono.
Ella Tomas-Pejo y Lisbeth Olsson “Influence of propagation strategy for obtaining robust Saccharomyces cerevisiae cells that efficiently co-ferment xylose and glucosa in lignocellulosic biomass hydrolysates” Microbial Biotechnology vol. 82015 pages 999-1005 describe que la adicion del hidrolizado lignocelulosico durante la propagacion de las celulas las adapto a los inhibidores, dando como resultado celulas mas tolerantes con fases de retardo mas cortas y valores de crecimiento espedfico mas altos en un medio irnnimo que contiene acido acetico y vainillina que las celulas no adaptadas.
Por lo tanto, existe la necesidad de un proceso industrial para producir un producto de fermentacion a partir de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica en una forma de suspension, en el que al mismo tiempo se produce la mayona de la levadura necesaria. Se cree que el proceso descrito supera los inconvenientes mencionados anteriormente al utilizar una suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica, que proporciona una solucion rentable para producir un producto de fermentacion a partir de un hidrolizado de materia prima lignocelulosica a escala industrial.
Compendio
Esta especificacion describe un proceso para producir un producto de fermentacion a partir de una suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica que comprende agua, glucosa soluble en agua y xilosa soluble en agua y materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua, comprendiendo dicho proceso las etapas de: crear un primer medio de conversion que comprende una primera porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica y una levadura capaz de convertir glucosa y xilosa a una levadura de propagacion y un producto de fermentacion; permitir que la levadura convierta al menos el 50 % de la glucosa soluble en agua y menos del 20 % de la xilosa soluble en agua del primer medio de conversion a una primera levadura propagada y una primera porcion del producto de fermentacion en una primera etapa de conversion que tenga una primera proporcion de conversion de azucar a celulas en un intervalo de 5 % a 25 %, en el que la primera proporcion de conversion de azucar a celulas es una proporcion de porcentaje en peso de la glucosa y xilosa convertida a la levadura propagada en la primera etapa de conversion a la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas en el primer medio de conversion, sobre una base de carbono; crear un segundo medio de conversion que comprende al menos una porcion de la primera levadura propagada y una segunda porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica; permitir que la levadura convierta al menos una porcion de la glucosa y xilosa solubles en agua en el segundo medio de conversion a al menos una segunda levadura propagada y una segunda porcion del producto de fermentacion en una segunda etapa de conversion que tiene una proporcion de la segunda conversion de azucar a celulas que es menor que la proporcion de la primera conversion de azucar a celulas, en donde la proporcion de la segunda conversion de azucar a celulas es una proporcion de porcentaje en peso de la glucosa y xilosa solubles en agua convertidas a la levadura propagada en la segunda etapa de conversion a la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas en el segundo medio de conversion, sobre una base de carbono.
Tambien se describe que la primera etapa de conversion puede comprender al menos una primera fase que es una fase aerobica y una segunda fase que es una fase anaerobica, en donde la fase aerobica se lleva a cabo durante un tiempo en un intervalo de 3 horas a 12 horas.
Ademas se describe que la primera etapa de conversion se puede llevar a cabo durante un primer tiempo de conversion que es menor que el valor seleccionado del grupo que consiste en 30 horas, 20 horas, 15 horas, y 10 horas. Tambien se describe que la primera etapa de conversion se puede llevar a cabo insertando aire a un caudal que esta en el intervalo seleccionado del grupo que consiste en 0,1 vvh a 10 vvh, de 0,1 vvh a 5 vvh, y de 0,5 vvh a 3 vvh.
Ademas se describe que la primera etapa de conversion se puede llevar a cabo mezclando el primer medio de conversion a una densidad de potencia de peso de menos de 100W/ton del primer medio de conversion sobre una base humeda.
Tambien se describe que la proporcion de la primera conversion de azucar en celulas puede estar en un intervalo seleccionado del grupo que consiste en del 5 % al 20 %, y del 10 % al 20 %.
Ademas se describe que la segunda etapa de conversion se puede llevar a cabo en condiciones anaerobicas durante al menos el 80 % del segundo tiempo de conversion.
Tambien se describe que la segunda etapa de conversion se puede llevar a cabo durante un segundo tiempo de conversion que es mayor que el primer tiempo de conversion y menor que un valor seleccionado del grupo que consiste en 72 horas, 60 horas, y 50 horas.
Ademas se describe que al menos el 80 % de la glucosa soluble en agua y la xilosa soluble en agua se pueden convertir en la segunda etapa de conversion.
Tambien se describe que la proporcion de la segunda conversion de azucar en celulas puede ser mayor del 2 %. Ademas se describe que la materia seca del primer y segundo medio de conversion puede ser menor del 30 % y mayor que un valor porcentual seleccionado del grupo que consiste en 5 %, 10 %, 15 % y 20 %.
Tambien se describe que el primer medio de conversion y el segundo medio de conversion puede comprender ademas una fuente de nitrogeno.
Ademas se describe que no se pueden anadir vitaminas y/o oligoelementos al proceso.
Tambien se describe que la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica no puede ser sometida a ninguna esterilizacion.
Ademas se describe que la primera etapa de conversion puede tener una densidad de levadura inicial entre 1 x 106 y 1 x 108 celulas de levadura por miligramo del primer medio de conversion sobre una base humeda.
Tambien se describe que la primera etapa de conversion puede tener una densidad de levadura final que esta entre 1 x 107 y 1 x 109 celulas de levadura por miligramo del primer medio de conversion sobre una base humeda.
Ademas se describe que la segunda etapa de conversion puede tener una densidad de levadura inicial que es mayor que la densidad de levadura inicial en la primera etapa de conversion.
Tambien se describe que la primera etapa de conversion y la segunda etapa de conversion se pueden llevar a cabo en recipientes separados.
Ademas se describe que el producto de fermentacion puede ser etanol.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 es la curva de saturacion de oxfgeno en la primera etapa de conversion de dos ensayos experimentales a escala de laboratorio.
La Figura 2 es la curva de saturacion de oxfgeno en la segunda etapa de conversion de dos ensayos experimentales a escala de laboratorio.
Descripcion detallada
Esta memoria descriptiva describe un proceso que comprende al menos dos etapas de conversion secuenciales de una suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica a un producto de fermentacion por medio de una levadura, en donde al mismo tiempo en cada etapa una porcion de la cantidad total de glucosa y xilosa solubles en agua del hidrolizado de materia prima lignocelulosica se convierten a celulas de levadura utilizadas en el proceso descrito. Las celulas de levadura producidas en la primera etapa de conversion se denominan una primera levadura propagada y luego se utilizan en la segunda etapa de conversion. En cada etapa, el producto de fermentacion es, por lo tanto, el principal producto de conversion, pero la primera etapa de conversion se lleva a cabo en condiciones mas favorables para la propagacion de la levadura que en la segunda etapa de conversion. De este modo, en la primera etapa de conversion el porcentaje de la cantidad total de glucosa soluble en agua y xilosa soluble en agua convertidas a levadura es mayor que el porcentaje de la cantidad total de glucosa soluble en agua y xilosa soluble en agua convertidas a levadura en la segunda etapa de conversion. En cada etapa de conversion, existe una proporcion de conversion de azucar a celulas. La proporcion de conversion de azucar a celulas es la proporcion de porcentaje en peso de la cantidad de glucosa soluble en agua y xilosa soluble en agua convertidas a levadura a la cantidad de glucosa soluble en agua y xilosa soluble en agua que se convierten totalmente en esa etapa sobre una base de carbono y expresada como un porcentaje, y no a la cantidad de glucosa y xilosa solubles en agua totalmente disponibles en la etapa. Para mayor claridad, la proporcion de conversion de azucar a celulas de la cantidad de glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas en la primera etapa de conversion puede ser menor que en la segunda etapa de conversion. Esto puede ocurrir, por ejemplo, en el caso de que la primera etapa de conversion se lleve a cabo para un primer tiempo de conversion que es mas corto que el tiempo de conversion de la segunda etapa de conversion. Pero, en relacion a la respectiva fraccion convertida de glucosa y xilosa solubles en agua , la propagacion de levadura en la primera etapa de conversion es mas favorable que en la segunda etapa de conversion. La glucosa y xilosa solubles en agua que no se convierten en la primera etapa de conversion no se desperdician, ya que se introducen y se convierten preferiblemente en la segunda etapa de conversion.
Segun un aspecto, el proceso descrito proporciona una solucion que puede implementarse a escala industrial, superando los problemas que ocurren en una planta de conversion real.
Segun otro aspecto, el proceso descrito permite producir la levadura necesaria la levadura necesaria para producir el producto de fermentacion a partir de una pequena cantidad de levadura reduciendo, de este modo, sensiblemente los costes de fermentacion.
Segun un aspecto adicional, en el proceso descrito la propagacion de la levadura se produce sobre una suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica disponible ya en la planta de conversion, evitando asf o reduciendo en gran medida los costes asociados con las costosas fuentes de carbono.
Segun un aspecto adicional, el proceso descrito permite el uso de una suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica que puede contener contaminantes biologicos en un nivel no despreciable, sin el uso de ningun agente o procedimiento de esterilizacion.
Segun un aspecto adicional, el proceso descrito se puede llevar a cabo sin el uso de vitaminas u otros nutrientes costosos.
En el contexto de la presente descripcion, la expresion “convertir un azucar soluble en agua” se utiliza para indicar un proceso para producir un producto general a partir de azucar soluble en agua; el producto general comprende un producto de propagacion, que es una nueva biomasa de levadura, y un producto de fermentacion, tal como etanol. Por “propagacion de una levadura”, o “crecimiento de levadura”, o “produccion de una levadura”, “conversion a una levadura”, y “conversion a una levadura propagada” se entiende el proceso para aumentar la cantidad de levadura, o de biomasa de levadura, obtenida alimentando una cantidad de levadura inicial con una fuente de carbono y opcionalmente otros nutrientes en las condiciones adecuadas. El aumento de la cantidad de biomasa de levadura o de levadura se produce al aumentar el numero de celulas de levadura totalmente producidas, y puede verificarse determinando la densidad de las celulas al comienzo y al final de la etapa(s) de propagacion o etapa(s) de conversion, o durante la etapa o etapas de propagacion o conversion. La densidad celular se puede determinar contando las celulas de levadura presentes en muestras representativas del medio de conversion a diferentes tiempos de la etapa o etapas de propagacion.
La levadura del proceso descrito es capaz de fermentar no solo glucosa, sino tambien xilosa. Como una levadura natural no es capaz normalmente de captar xilosa, la levadura utilizada en el proceso descrito es preferiblemente una levadura no natural o derivada de una levadura no natural.
El termino levadura “no natural” significa que el organismo microbiano tiene al menos una alteracion genetica que no se encuentra normalmente en una cepa natural de las especies referenciadas, incluyendo cepas naturales de las especies referenciadas, para producir la levadura natural capaz de fermentar tanto glucosa como xilosa. Las alteraciones geneticas pueden incluir, por ejemplo, modificaciones que introducen acidos nucleicos expresables que codifican polipeptidos metabolicos, otras adiciones de acidos nucleicos, deleciones de acidos nucleicos y/o otras alteraciones funcionales del material genetico de levadura. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, regiones codificantes y fragmentos funcionales de las mismas, para polipeptidos heterologos, homologos o tanto heterologos como homologos para las especies referenciadas. Modificaciones adicionales pueden incluir, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresion de un gen o un operon.
La levadura no natural de la presente descripcion puede contener alteraciones geneticas estables, que se refiere a la levadura que puede propagarse durante mas de cinco generaciones sin perdida de la alteracion. En general, las alteraciones geneticas estables incluyen modificaciones que persisten por mas de 10 generaciones, las modificaciones particularmente estables persistiran por mas de 25 generaciones y, mas particularmente, las modificaciones geneticas estables estaran mas de 50 generaciones, incluyendo indefinidamente.
La levadura de la presente descripcion se puede seleccionar de cualquier genero y especie de levadura conocidos. Las levaduras se describen, por ejemplo, por N. J. W. Kreger-van Rij, “The Yeast,” Vol. 1 de Biology of Yeasts, Ch.
2, A. H. Rose y J. S. Harrison, Eds. Academic Press, London, 1987. En una realizacion la levadura se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, Phaffia, Rhodotorula, Yarrowia, y Schwanniomyces. Preferiblemente la levadura se selecciona de las cepas de Saccharomyces cerevisiae.
En el proceso descrito, la principal fuente de carbono utilizada es un hidrolizado en una forma de suspension derivada de la materia prima lignocelulosica. Una descripcion detallada de una materia prima lignocelulosica se puede encontrar en el documento de Patente WO2015028156A1, pag. 11-14. Una materia prima lignocelulosica preferida se selecciona del grupo de residuos agncolas, en particular pajas tales como paja de trigo, paja de arroz, o bagazo, tal como bagazo de cana de azucar. Las maderas duras y las maderas blandas tambien se benefician de este proceso. Opcionalmente, tambien se pueden utilizar otras fuentes de carbono tales como melaza o azucares sinteticos, pero los azucares monomericos del hidrolizado de materia prima lignocelulosica son preferiblemente al menos el 80 % en peso, mas preferiblemente al menos el 90 %, y lo mas preferiblemente al menos el 95 % de las fuentes de carbono total utilizadas en el proceso. En una realizacion aun mas preferida, el hidrolizado de materia prima lignocelulosica es la unica fuente de carbono utilizada en el proceso descrito para la propagacion de la levadura.
La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se deriva preferiblemente de la materia prima lignocelulosica por medio de un proceso de multiples etapas que comprende pretratar la materia prima lignocelulosica para producir una materia prima lignocelulosica pretratada y someter la materia prima lignocelulosica pretratada a una hidrolisis enzimatica. El pretratamiento aumenta la accesibilidad de los carbohidratos contenidos en ellos a la accion de las enzimas. Un pretratamiento preferido comprende tratar hidrotermicamente la materia prima lignocelulosica con agua en fase de vapor en un reactor presurizado, y explotar con vapor la materia prima tratada hidrotermicamente liberando rapidamente la presion aplicada a la materia prima. El tratamiento hidrotermico se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura en un intervalo de 130 °C a 230 °C durante un tiempo de 1 minuto a 180 minutos. El reactor se presuriza preferiblemente mediante vapor a una presion de al menos 10 bares para obtener una ruptura efectiva de la materia prima.
En una realizacion, la materia prima lignocelulosica se somete a un proceso o etapa de remojo para eliminar una porcion de compuestos no lignocelulosicos contenidos en el material de partida lignocelulosico sin procesar tal como sales inorganicas, ceras, y acidos organicos antes de tratarse hidrotermicamente en el reactor presurizado. En la etapa o proceso de remojo, los contaminantes externos, tales como tierra, piedras y los residuos de la cosecha tambien pueden separarse. El proceso de remojo comprende preferiblemente introducir la materia prima lignocelulosica en un lfquido de remojo que comprende agua a una temperatura de 20 °C a 100 °C, mas preferiblemente de 40 °C a 70 °C y para un tiempo de remojo que es de 30 segundos a 30 minutos, mas preferiblemente de 3 minutos a 15 minutos.
Opcionalmente, la materia prima lignocelulosica se somete a un tratamiento hidrotermico preliminar en agua o un lfquido que comprende agua para solubilizar una porcion de los carbohidratos insolubles en agua contenidos en la materia prima lignocelulosica antes de introducirse en el recipiente del reactor presurizado. El tratamiento hidrotermico preliminar se lleva a cabo en condiciones de presion en presencia de agua en una fase de vapor o lfquida, o una mezcla de las mismas, a una temperatura de 100 °C a 190 °C, preferiblemente de 130 °C a 180 °C, y lo mas preferiblemente de 140 °C a 170 °C. El tratamiento hidrotermico preliminar se lleva a cabo durante un tiempo en un intervalo de 10 minutos a 3 horas, preferiblemente de 15 minutos a 3 horas, y lo mas preferiblemente de 20 minutos a 60 minutos. El tratamiento hidrotermico preliminar solubiliza principalmente el componente hemicelulosico de la materia prima lignocelulosica, que puede someterse a la degradacion termica a una temperatura mas alta, y un lfquido que comprende agua y polfmeros y oligomeros de xilosa solubles en agua y opcionalmente otros azucares derivados de hemicelulosa se separa asf a partir de la materia prima lignocelulosica solida.
La materia prima lignocelulosica pretratada se somete a hidrolisis enzimatica para hidrolizar los azucares polimericos y oligomericos a azucares monomericos, que comprenden glucosa y xilosa. La hidrolisis enzimatica comprende poner en contacto la materia prima lignocelulosica pretratada en forma de suspension con una enzima o composicion enzimatica en condiciones que promueven la actividad enzimatica. De este modo, se proporciona una suspension de la materia prima lignocelulosica pretratada mezclando la materia prima lignocelulosica pretratada con un lfquido que comprende agua para tener un contenido de materia seca preferiblemente entre el 10 % y el 25 %; opcionalmente, cuando se practica el tratamiento hidrotermico preliminar, tambien se puede utilizar al menos una porcion del Kquido que comprende agua y los polfmeros y oligomeros de xilosa solubilizados producidos en el mismo. La hidrolisis enzimatica se lleva a cabo tfpicamente a un pH entre 4,5 y 5,0 a una temperatura entre 45 °C y 55 °C, y durante un tiempo de hidrolisis de 24 horas a 72 horas, bajo agitacion de la mezcla.
La hidrolisis enzimatica se puede llevar a cabo en una o mas etapas. Preferiblemente, la hidrolisis enzimatica se lleva a cabo en dos etapas en recipientes de hidrolisis separados. En las primeras etapas de hidrolisis, que se realizan durante un tiempo entre 12 horas y 30 horas en un primer recipiente, se obtiene una hidrolisis parcial de la materia prima lignocelulosica pretratada para obtener la licuefaccion de la materia prima lignocelulosica pretratada, obteniendo asf una mezcla parcialmente hidrolizada que tiene una viscosidad inferior a la suspension inicial. La mezcla parcialmente hidrolizada se mueve despues a un segundo recipiente de hidrolisis, en donde una segunda etapa de hidrolisis se continua durante un tiempo entre 12 horas y 60 horas para obtener la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica, que comprende agua, materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual y glucosa y xilosa solubles en agua que comprende glucosa y xilosa. La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica puede comprender ademas otros azucares monomericos solubles en agua de C6 y C5, tfpicamente a concentracion menor que la glucosa y xilosa, respectivamente.
Aun mas preferiblemente, la hidrolisis enzimatica se lleva a cabo segun las ensenanzas del documento de Patente WO2010113130. Una porcion de la materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual se puede separar de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica. La separacion de la materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual se puede obtener, por ejemplo, por decantacion, centrifugacion, o prensado del hidrolizado de materia prima lignocelulosica, o una combinacion de las mismas. Sin embargo, incluso si la presencia de la materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual en el proceso de propagacion descrito puede dar lugar a problemas de mezcla, algunos de los azucares monomericos solubles en agua empapados en los solidos residuales pueden retirarse en la etapa de separacion, por lo que en una realizacion preferida no se practica la eliminacion de solidos.
El proceso o procesos descritos anteriormente para derivar la suspension del hidrolizado de materia prima lignocelulosica a partir de la materia prima lignocelulosica son realizaciones ejemplares y preferidas para proporcionar la suspension del hidrolizado de materia prima lignocelulosica utilizada como fuente principal de carbono para producir una producto de fermentacion segun el proceso descrito, y se entiende que no estan destinados a limitar de ninguna manera el alcance de la invencion.
La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica puede tener un contenido de materia seca entre el 5 % y 30 %, preferiblemente entre el 10 % y el 20 %.
La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica tiene una concentracion de glucosa que puede ser de 20 g/Kg a 100 g/Kg de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica sobre una base humeda, preferiblemente de 30 g/Kg a 70 g/Kg, y lo mas preferiblemente de 40 g/Kg a 50 g/Kg.
La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica tiene una concentracion de xilosa que puede ser de 10 g/Kg a 40 g/Kg de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica sobre una base humeda, preferiblemente de 15 g/Kg a 30 g/Kg, y lo mas preferiblemente de 20 g/Kg a 25 g/Kg.
La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica puede comprender ademas compuestos inhibidores seleccionados de la lista de acido acetico, acido formico, furfural e hidroximetil furfural (5-HMF), que se forman en las etapas o procesos de pretratamientos e hidrolisis previos, e inhiben el crecimiento de la levadura, causando al menos un retraso en la velocidad de crecimiento.
Particularmente, el acido acetico puede tener una concentracion que esta en el intervalo de 2 g/Kg a 7 g/Kg de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica sobre una base humeda.
La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica puede contener ademas contaminantes biologicos, como ocurre tfpicamente en operaciones a escala industrial. Los contaminantes biologicos son organismos microbianos diferentes de las levaduras que deben propagarse segun el proceso descrito, y cuya presencia es en general perjudicial para el rendimiento del proceso descrito, consumiendo una porcion de los azucares monomericos totalmente disponibles para el crecimiento de la levadura deseada. Los contaminantes biologicos pueden comprender bacterias y hongos, asf como levaduras diferentes de la levadura que se desea propagar, tal como levaduras de tipo nativo. La bacteria del acido Lactico, en particular las especies Lactobacillus, son los principales contaminantes bacterianos. Las concentraciones de acido lactico de las mezclas de fermentacion se toman generalmente como una medida del grado de contaminacion. La contaminacion biologica se ha controlado mediante la esterilizacion del hidrolizado de materia prima lignocelulosica, los medios de conversion y los equipos implicados en el proceso, que pueden obtenerse anadiendo agentes antibacterianos, tales como antibioticos u otros agentes asepticos, o mediante procedimientos de esterilizacion, tales como la pasteurizacion, mediante la aplicacion de agentes ffsicos, incluyendo entre otros, calor, luz y radiacion, antes, entre o durante el transcurso de las series de fermentacion/propagacion. Por “esterilizacion” se considera en la presente memoria la reduccion de la densidad de contaminantes biologicos por un factor de al menos 100. El uso de agentes antibacterianos y procedimientos de esterilizacion, que introducen costes adicionales, se evita preferiblemente en los procesos descritos, al mismo tiempo que se mantiene el crecimiento de contaminantes biologicos en un nivel bajo razonable.
Preferiblemente, el hidrolizado de materia prima lignocelulosica no se somete a ninguna etapa o procedimiento de esterilizacion, lo que sena diffcil y costoso de practicar a escala industrial.
Preferiblemente, no se utilizan agentes antibacterianos en el proceso descrito, ni se anaden al hidrolizado de materia prima lignocelulosica antes del proceso descrito.
El proceso descrito comprende al menos dos etapas de conversion, que se pueden llevar a cabo en un unico recipiente o en dos recipientes separados. Para minimizar los costes, el recipiente o recipientes, preferiblemente, no se someten a ninguna esterilizacion y/o limpieza entre y/o durante las etapas de conversion. Preferiblemente, cada etapa de conversion se lleva a cabo en modo de lotes, en donde la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se anade antes de comenzar la etapa de conversion, o al comienzo de la etapa de conversion.
Primero se crea un primer medio de conversion que comprende una primera porcion de hidrolizado de materia prima lignocelulosica y una cantidad inicial de levadura. Para limitar el efecto del crecimiento competitivo de los contaminantes biologicos, en una realizacion preferida la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se mantiene a una temperatura de 45 °C a 55 °C antes de utilizarse en el proceso descrito, y lo mas preferiblemente a la temperatura de la hidrolisis enzimatica o la etapa de hidrolisis enzimatica final. A esta temperatura, la actividad de los contaminantes biologicos se reduce significativamente. La temperatura de la porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica utilizada en la primera etapa de conversion se reduce a la temperatura de la primera etapa de conversion, que esta preferiblemente en el intervalo de 28 °C a 35 °C. Los intercambiadores de calor se pueden utilizar para enfriar la primera porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica a la temperatura de la primera etapa de conversion en el primer recipiente de conversion o antes de entrar al primer recipiente de conversion.
El agua o un lfquido que comprende agua, y cantidades limitadas opcionales de fuentes de carbono adicionales diferentes de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se pueden utilizar para alcanzar el contenido de materia seca deseado. Una de las ventajas ofrecidas por el proceso descrito es la posibilidad de ser conducido a una materia seca que es mayor que otros procesos conocidos que utilizan la suspension de hidrolizado lignocelulosico como la principal fuente de carbono. El contenido de materia seca en peso del primer medio de conversion es preferiblemente menor del 30 %, ya que sena diffcil de agitarse, y es preferiblemente mayor del 5 %, mas preferiblemente mayor del 10 %, incluso mas preferiblemente mayor del 15 %, lo mas preferiblemente mayor del 20 %. El agua o el ffquido que comprende agua se puede anadir a una temperatura que es menor que la temperatura de la primera conversion para enfriar la primera porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica.
Por consiguiente, la densidad de los contaminantes biologicos en el primer medio de conversion al comienzo de la primera etapa de conversion se puede mantener a un nivel razonable, que puede estar en el intervalo de 100CFU/ml a 106 CFU/ml, preferiblemente de 101CFU/ml a 105CFU/ml, y lo mas preferiblemente de 102CFU/ml a 103CFU/ml del primer medio de conversion.
El primer medio de conversion puede comprender ademas una fuente de nitrogeno, ffpicamente urea, que es una fuente de nutrientes barata para la levadura, pero preferiblemente no contiene vitaminas y/o oligoelementos anadidos, que son utilizados ffpicamente a escala de laboratorio como suplementos de crecimiento pero son extremadamente costosos. Dicho en otras palabras, preferiblemente no se anaden vitaminas y/o oligoelementos a la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica y al medio de conversion durante el proceso o en las etapas antes del proceso.
Preferiblemente, el pH del primer medio de conversion se ajusta a un valor de 5,0 a 5,5, por ejemplo, mediante la adicion por ejemplo de una cantidad adecuada de base (solucion de NaOH). Si es necesario para mantener el pH en el intervalo deseado, se pueden anadir alfcuotas adicionales de base durante la primera etapa de conversion.
La levadura se anade al primer medio de conversion, o a los componentes utilizados para formar el primer medio de conversion. En una realizacion, la levadura se anade a la primera porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica utilizada para formar el primer medio de conversion. La cantidad de levadura que se ponen en contacto con el primer medio de conversion variara segun el volumen total del primer medio de conversion. La levadura puede ser una levadura fresca o puede ser una levadura producida en una etapa de propagacion o conversion previa. Preferiblemente, en la primera etapa de conversion se anade una cantidad de levadura para tener una densidad de levadura inicial que este entre 1 x 106 y 1 x 108 celulas de levadura por miligramo del primer medio de conversion sobre una base humeda.
En la primera etapa de conversion, la levadura se mantiene en condiciones que promueven la conversion de la glucosa y xilosa solubles en agua del primer medio de conversion a una primera levadura propagada y una primera porcion del producto de fermentacion, en donde un cierto porcentaje de la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas se dedica al crecimiento de la biomasa de levadura. De este modo, la primera etapa de conversion se caracteriza por una proporcion de la primera conversion azucar a celulas, que es la proporcion de porcentaje en peso para el peso de glucosa soluble en agua y xilosa soluble en agua convertidas a la primera levadura propagada a la cantidad total de glucosa y xilosa solubles en agua convertidas totalmente en el primer medio de conversion, sobre una base de carbono y dado que es una relacion de porcentaje en peso, se expresa como un porcentaje. La proporcion de la primera conversion de azucar a celulas esta en un intervalo de 5 % a 25 %, preferiblemente de 5 % a 20 %, y los mas preferiblemente de 10 % a 20 %.
Para calcular la proporcion de conversion de azucar a celulas de una etapa de conversion, la cantidad de glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas se puede calcular restando la concentracion de glucosa y xilosa solubles en agua presentes en el medio de conversion al final de la etapa de conversion a la concentracion de glucosa y xilosa solubles en agua presentes en el medio de conversion al principio de la etapa de conversion. La concentracion de azucar se puede determinar por analisis de HPLC estandar. Sin duda, si algun componente se anade a o se elimina del medio de conversion durante la etapa de conversion, debe tenerse en cuenta en la determinacion de la densidad como es bien conocido en las tecnicas analfticas. Por ejemplo, se puede anadir agua en un momento determinado para diluir el medio de conversion, o se necesita una correccion del pH, o se anade azucar adicional. En una realizacion preferida, la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica comprende ademas enzimas residuales de la etapa o etapas de hidrolisis, una parte de las cuales esta todavfa activa. Incluso si las condiciones de conversion no son las optimas para la actividad enzimatica, una porcion de los carbohidratos insolubles en agua en la materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual se puede hidrolizar a glucosa y xilosa solubles en agua adicionales que, por lo tanto, estan disponibles para la levadura. Tambien en este caso, la cantidad total de glucosa y xilosa convertidas por la levadura tendran en cuenta la glucosa y xilosa solubles en agua adicionales, que se puede calcular a partir de la medida de la cantidad de azucares insolubles en agua en la materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual al final y al comienzo de la etapa de conversion. La glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas tendran en cuenta tambien la absorcion de azucar por los contaminantes biologicos.
La densidad celular de levaduras en terminos del numero de celulas de levadura por unidad de volumen se puede determinar por recuento de celulas o, alternativamente, por medio de la medicion de la transmitancia optica. Una vez que se conoce la densidad de levadura, el peso medio de las celulas de levadura se puede calcular facilmente midiendo el peso de las celulas de levadura en una muestra de referencia que tiene una densidad de levadura de referencia.
La proporcion de conversion azucar a celulas de una etapa de conversion se expresa sobre una base de carbono, que es como la proporcion entre el carbono contenido en la biomasa de levadura sobre una base seca al final de la etapa de conversion al carbono contenido en la glucosa y xilosa soluble en agua totalmente convertidas sobre una base seca.
El carbono contenido en la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas se puede derivar por el contenido de carbono en la glucosa y xilosa solubles en agua presentes en el medio de conversion al final y al comienzo de la etapa de conversion, medido mediante un analisis elemental estandar. Alternativamente, puede derivarse de la concentracion de glucosa y xilosa solubles en agua convertidas por la levadura que estan presentes en el medio de conversion al final y al comienzo de la etapa de conversion, considerando las formulas estequiometricas de la glucosa y xilosa solubles en agua.
El contenido de carbono en la levadura se puede medir mediante analisis elementar estandar de la levadura seca. Alternativamente, se puede considerar la conversion de la proporcion azucar a celula de referencia que se utiliza comunmente en la tecnica [vease, por ejemplo, The Alcohol Textbook, Fifth Edition, W. M. Ingledew et al., Nottingham University Press, Ethanol Technology Institute, 2009, p.133), que es 0,50 g de levadura sobre una base seca por gramo de azucar. Por lo tanto, si 2 g de glucosa se convierten solo a levadura, se produce 1 g de levadura sobre una base seca. Por ejemplo, si 1 g de levadura se produce y 10 g de glucosa se convierten totalmente, la proporcion de conversion azucar a celulas es:
Proporcion de conversion azucar a celulas = (1 g de levadura x 2 g de glucosa por gramo de levadura)/10 g de glucosa = 20 %.
La misma proporcion de conversion de referencia de 0,50 g de levadura sobre una base seca por gramo de azucar es valida tambien en el caso de la xilosa. Por lo tanto, es suficiente medir el peso de levadura producida, sobre una base seca, y la cantidad de azucares totales, incluyendo glucosa y xilosa, para calcular facilmente la proporcion de conversion de azucar a celulas de cada etapa de conversion.
Como se sabe en la tecnica, las condiciones aerobicas mejoran la cantidad de levadura propagada producida. Las condiciones aerobicas se caracterizan por una saturacion de oxfgeno media en el medio de conversion que es mayor del 10 %. La saturacion de oxfgeno es la proporcion de la concentracion de oxfgeno disuelto (O2) en el medio de conversion a la cantidad maxima de oxfgeno que se disolvera en el medio de conversion a esa temperatura y presion bajo equilibrio estable. Por lo tanto, un flujo de oxfgeno, aire u otra mezcla de gases que comprende oxfgeno a un caudal de 1 vvm o mayor se inserta tfpicamente en el medio de conversion. Para promover la difusion de oxfgeno en el medio de conversion, se proporciona tambien tfpicamente la agitacion o mezclado del medio de conversion, que es diffcil o costoso en materia seca alta, debido a la alta viscosidad del medio de conversion.
En el proceso descrito, la proporcion de la primera conversion azucar a celulas al final de la primera etapa de conversion se obtiene preferiblemente manteniendo las condiciones aerobicas solo durante una parte de la primera etapa de conversion. Dicho en otras palabras, en relacion a la saturacion media de oxfgeno en el medio de conversion, la primera etapa de conversion comprende al menos dos fases, una primera fase que es una fase aerobica, seguida por una segunda fase que es una fase anaerobica. En una realizacion preferida, la fase aerobica es al comienzo de la primera etapa de conversion, y se alcanza insertando aire a un caudal moderado que esta en un intervalo de 0,1 vvh a 10 vvh, preferiblemente de 0,1 vvh a 5 vvh, y lo mas preferiblemente de 0,5 vvh a 3 vvh. La primera porcion de suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se introduce en el primer recipiente de conversion por gravedad desde una entrada localizada a una altura suficiente para crear burbujas en la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica o en el medio de conversion ya presente en el primer recipiente de conversion. La primera parte de suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se puede introducir para formar una cascada para aprovechar la oxigenacion natural de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica que tiene lugar durante la transferencia en el primer recipiente de conversion. El nivel inicial de saturacion de oxfgeno es alto, siendo preferiblemente superior al 40 %, y lo mas preferiblemente superior al 80 %, y disminuye durante la primera etapa de conversion, debido al caudal de aire moderado. El caudal de aire moderado se utiliza para frenar la disminucion natural del nivel inicial de saturacion de oxfgeno, para obtener una fase aerobica que es preferiblemente de 3 horas a 12 horas, mas preferiblemente de 5 horas a l0 horas, y lo mas preferiblemente de 7 horas a 8 horas. Durante la primera etapa de conversion, el primer medio de conversion se mantiene bajo agitacion moderada durante al menos una parte del primer tiempo de conversion para mejorar la difusion de oxfgeno. La agitacion puede alcanzarse mediante medios de mezcla mecanicos. La mezcla se proporciona para frenar y homogeneizar la disminucion natural del nivel inicial de saturacion de oxfgeno, y una potencia moderada es suficiente para obtener las condiciones aerobicas durante un tiempo en los intervalos deseados, incluso en el caso de una suspension de materia seca alta. La potencia utilizada para agitar el primer medio de conversion se puede medir en terminos de la potencia electrica utilizada para agitar una tonelada del primer medio de conversion sobre una base humeda, que es una densidad de potencia de peso, y se utiliza preferiblemente en el proceso descrito una densidad de potencia de peso media de menos de 100 W/ton del primer medio de conversion sobre una base humeda.
Las velocidades de absorcion de glucosa y xilosa son un importante parametro del proceso descrito, especialmente en el caso de que el hidrolizado de materia prima lignocelulosica comprenda algunos contaminantes biologicos y no se utilicen esterilizacion y agentes antibacterianos, ya que en estas condiciones se potencia el crecimiento de contaminantes biologicos. La absorcion de glucosa por la levadura es favorita con respecto a la absorcion de xilosa, por lo tanto la concentracion de glucosa en el medio de conversion empezara a disminuir, mientras que la absorcion de xilosa no procedera significativamente hasta que la concentracion de glucosa disminuya por debajo de cierto valor cntico. A medida que disminuye la afinidad de la levadura a los azucares restantes (glucosa y xilosa) en el medio de conversion, la velocidad de absorcion total de glucosa y xilosa combinadas por la levadura disminuira con el tiempo, lo que hara que el crecimiento competitivo de contaminantes biologicos sea favorable. Por lo tanto, en el proceso descrito, la primera etapa de conversion se prolonga durante un tiempo suficiente para consumir al menos el 50 % de la glucosa contenida en el medio de conversion inicial, y menos del 20 % de la xilosa contenida en el medio de conversion inicial. Se pretende que el consumo de glucosa y xilosa sea el consumo total que tiene lugar durante la etapa de conversion, y se pueda verificar midiendo la correspondiente concentracion de azucar en el medio de conversion. Por lo tanto, el consumo de glucosa y xilosa combinadas total que tiene lugar en la primera etapa de conversion incluye tambien la glucosa y xilosa combinadas absorbidas por los contaminantes biologicos, que se pretenden minimizar en el proceso descrito, y el azucar finalmente convertido al producto de fermentacion. Para mejorar el rendimiento del proceso en terminos de biomasa de levadura producida, preferiblemente la primera etapa de conversion se lleva a cabo durante un primer tiempo de conversion suficiente para consumir al menos el 70 % de la glucosa del medio de conversion inicial, y lo mas preferiblemente al menos el 80 %. Al mismo tiempo, para evitar que la velocidad de absorcion de azucar total alcance un valor cntico para el crecimiento competitivo de los contaminantes biologicos, preferiblemente la primera etapa de conversion se prolonga durante un primer tiempo de conversion suficiente para consumir menos del 10 % de la xilosa en el medio de conversion inicial, lo mas preferiblemente menos del 5 %. Tambien se observa que, mientras la cantidad total de xilosa consumida en la primera etapa de conversion es preferiblemente mayor de 0, en algunos casos la xilosa no se puede consumir apreciablemente al menos en la primera etapa de conversion. La primera etapa de conversion se puede llevar a cabo durante un tiempo de conversion de menos de 30 horas, pero preferiblemente menos de 20 horas, mas preferiblemente menos de 15 horas, y lo mas preferiblemente menos de 10 horas.
Al final de la primera etapa de conversion, se obtiene un primer caldo de conversion que comprende agua, una primera levadura propagada y una primera porcion del producto de fermentacion. La cantidad de la primera levadura propagada puede ser de 5 a 15 veces la cantidad inicial correspondiente de levadura, como resultado de las condiciones aerobicas impuestas durante una parte del primer tiempo de conversion. Los mismos intervalos preferidos se aplican a la densidad celular de levaduras. Preferiblemente, en la primera etapa de conversion la densidad de levadura final esta entre 1 x 107 y 1 x 109 celulas de levadura por miligramo del primer medio de conversion sobre una base humeda. El primer caldo de conversion comprende ademas glucosa y xilosa solubles en agua no consumidas por la levadura y materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual.
La primera levadura propagada se utiliza despues en una segunda etapa de conversion para convertir una segunda porcion de suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica. En comparacion con la primera etapa de conversion, la segunda etapa de conversion se centra en la produccion del producto de fermentacion, pero al mismo tiempo convierte una pequena cantidad de glucosa y xilosa solubles en agua a una segunda biomasa de levadura. Al contrario de la primera etapa de conversion, la segunda etapa de conversion convierte la mayona de la glucosa y xilosa solubles en agua disponibles, y posiblemente toda la glucosa y xilosa solubles en agua, por lo tanto se necesita un segundo tiempo de conversion mas largo que el primer tiempo de conversion. La segunda etapa de conversion se realiza para alcanzar un mayor rendimiento de conversion de azucar que en la primera etapa de conversion y la segunda biomasa de levadura se produce, por lo tanto, para mantener el segundo tiempo de conversion tan bajo como sea posible, limitando el crecimiento de los contaminantes biologicos. La segunda etapa de conversion se realiza para tener una proporcion de la segunda conversion azucar a celulas que sea menor que la proporcion de la primera conversion de azucar a celulas. La proporcion de la segunda conversion de azucar a celulas es preferiblemente mayor del 2 %. Incluso si se puede anadir una cantidad limitada de levadura externa al proceso descrito en la segunda etapa de conversion, se prefiere que solo la primera levadura propagada, o al menos una porcion de la misma, sea utilizada. El segundo tiempo de conversion es mayor que el primer tiempo de conversion y preferiblemente menos de 72 horas, mas preferiblemente menos de 60 horas, y lo mas preferiblemente menos de 50 horas. En cualquier caso, se desea que al menos el 80 % de la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente disponibles en el segundo medio de conversion se conviertan en la segunda etapa de conversion.
Un segundo medio de conversion se crea a partir de al menos una porcion de la primera levadura propagada y una segunda porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica. El procedimiento utilizado para formar el segundo medio de conversion es similar al procedimiento para formar el primer medio de conversion, y las mismas realizaciones preferidas se aplican a mutatis mutandis para la creacion el segundo medio de conversion. En una realizacion preferida, la primera levadura propagada no se separa del primer caldo de conversion antes de utilizarse para crear el segundo medio de conversion, y al menos una parte del primer caldo poblado y la segunda porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se mezclan juntas en un segundo recipiente de conversion para formar el segundo medio de conversion. La glucosa y xilosa solubles en agua remanentes que no se han convertido en la primera etapa de conversion estan, por lo tanto, disponibles para ser convertidas en la segunda etapa de conversion y no se desperdician. En esta realizacion, el segundo medio de conversion al comienzo de la segunda etapa de conversion comprendera ademas la primera porcion del producto de fermentacion producido en la primera etapa de conversion. Preferiblemente, la cantidad del primer caldo de conversion y la segunda porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se seleccionan para tener una densidad de levadura inicial en la segunda etapa de conversion que es mayor que la densidad de levadura inicial en la primera etapa de conversion. Se prefiere una densidad de levadura inicial alta para reducir el segundo tiempo de conversion. La densidad de levadura inicial en la segunda etapa de conversion puede estar entre 1 x 106 y 1 x 108 celulas de levadura por miligramo del segundo medio de conversion sobre una base humeda. El primer caldo de conversion y la segunda porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica estan preferiblemente en una relacion en peso sobre una base humeda que es de 1:2 a 1:10, y lo mas preferiblemente de 1:3 a 1:8.
Como en la primera etapa de conversion, tambien en la segunda etapa de conversion la segunda porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se mantiene preferiblemente a una temperatura de 45 °C a 55 °C antes de ser usada para crear el segundo medio de conversion, para limitar el efecto del crecimiento competitivo de los contaminantes biologicos.
Por lo tanto, la densidad de los contaminantes biologicos en el segundo medio de conversion al comienzo de la segunda etapa de conversion se puede mantener a un nivel razonable, que puede estar en el intervalo de 100CFU/ml a 106CFU/ml, preferiblemente de 101CFU/ml a 105CFU/ml, y lo mas preferiblemente de 102CFU/ml a 103CFU/ml del segundo medio de conversion.
Para mantener la proporcion de la segunda conversion de azucar a celulas baja, la segunda etapa de conversion se lleva a cabo en condiciones anaerobicas, o predominantemente en condiciones anaerobicas, es decir, las condiciones anaerobicas se mantienen durante al menos el 80 % del segundo tiempo de conversion. Si esta presente, una fase aerobica puede estar presente preferiblemente al comienzo de la segunda etapa de conversion. Es decir, similarmente a la primera etapa de conversion, la segunda porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica y/o el primer caldo poblado se introducen preferiblemente en el primer recipiente de conversion por gravedad desde una entrada localizada a una altura suficiente para crear burbujas en la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica y/o el medio de conversion ya presente en el segundo recipiente de conversion. La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se puede introducir para formar una cascada para aprovechar la oxigenacion natural de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica que tiene lugar durante la transferencia en el segundo recipiente de conversion. Preferiblemente, no se introduce aire en la segunda etapa de conversion.
Durante la segunda etapa de conversion, el segundo medio de conversion se puede mantener bajo agitacion moderada durante al menos una parte del segundo tiempo de conversion para mejorar la homogeneidad de la suspension. La agitacion se puede lograr mediante medios de mezcla mecanicos. La mezcla se proporciona para frenar y homogeneizar la disminucion natural del nivel inicial de saturacion de oxfgeno. La potencia utilizada para agitar el segundo medio de conversion. Se utiliza preferiblemente una densidad de potencia de peso media de menos de 100W/ton del segundo medio de conversion sobre una base humeda.
La segunda etapa de conversion produce un segundo caldo de fermentacion en una forma de suspension, que comprende agua, el producto de fermentacion y la materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual. El producto de fermentacion se puede separary recuperar del segundo caldo de fermentacion.
Experimental
Preparacion de hidrolizado de materia prima lignocelulosica
Se selecciono paja de trigo para probar el proceso descrito.
Primero, la materia prima se sometio a un proceso de pretratamiento, aplicando un tratamiento hidrotermico preliminar a una temperatura de 158 °C durante 65 minutos, con una primera solubilizacion del material de partida. El proceso genero una suspension de materia prima pretratada, que se separo en una porcion lfquida, que comprende principalmente xilooligomeros, y una porcion solida por medio de una prensa. La porcion solida se sometio a un tratamiento hidrotermico con vapor a 204 °C durante 4 minutos, seguido por una explosion de vapor, para generar una materia prima lignocelulosica pretratada solida.
La materia prima lignocelulosica pretratada solida y la porcion lfquida que comprende xilooligomeros se mezclaron en un biorreactor, y se agua par aañ oabdtieóner una suspension de materia prima lignocelulosica pretratada que tiene un contenido de materia seca del 15 % en peso, el pH se ajusto a 5,0±0,2 mediante la adicion de NaOH, despues la suspension de materia prima lignocelulosica pretratada se sometio a hidrolisis enzimatica.
Se añadió una mezcla enzimatica comercial CTec3 de Novozymes, capaz de hidrolizar azucares tanto de C6 como de C5, correspondiente a una dosis de 7 % mg de protema por gramos de glucanos en la materia prima lignocelulosica pretratada y la suspension se hidrolizo a 50 °C bajo agitacion continua durante 72 horas.
El hidrolizado de materia prima lignocelulosica resultante fue una suspension, que tiene una materia seca del 15 % en peso, que comprende una fraccion lfquida y una materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual. La suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica se mantuvo a la temperatura de 50 °C hasta su uso en los siguientes experimentos de propagacion. No se introdujeron antibioticos.
Experimentos de conversion
El proceso descrito se probo tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. Los experimentos se llevaron a cabo sin ninguna esterilizacion entre las etapas de conversion, y entre experimentos.
Escala de laboratorio
Primer experimento de laboratorio
En la primera etapa de conversion, el primer medio de conversion se formo insertando un volumen de 1,2l de suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica caliente en un primer biorreactor y suplementando con una disolucion de urea a 1,5 g/l. El pH se fijo a 5,2±0,1 mediante control con NaOH. No se utilizaron vitaminas ni otros nutrientes. El medio de conversion se enfrio a 32 °C antes de insertar la levadura. La materia seca fue aproximadamente del 15 %. La composicion sobre una base humeda del primer medio de conversion, que corresponde aproximadamente a la composicion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica, se recoge en la Tabla 1. Las composiciones se dan en terminos de los componentes solubles en agua que son relevantes para el proceso y la materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual se separa en sus principales componentes (glucanos insolubles, xilanos insolubles y lignina y otros insolubles). Acido acetico, acido formico, furfural, hidroximetil furfural son compuestos inhibidores de la propagacion de la levadura.
El acido lactico se produce por contaminacion bacteriana y, por lo tanto, se considera como un marcador de la presencia bacteriana. Por lo tanto, una cierta contaminacion biologica estaba presente en el hidrolizado de materia prima lignocelulosica.
La primera etapa de conversion se realizo bajo agitacion para mezclar el medio de cultivo con un impulsor a 300 rpm en configuracion continua, insertando un flujo de aire de 1VVh. VVh corresponde al volumen de gas que fluye por volumen de medio de conversion por hora.
La densidad celular de levaduras se determino por recuento celular (camara de recuento celular de Neubauer) y la composicion del primer medio de conversion se analizo por HPLC para determinar la concentracion de glucosa y xilosa residuales y los compuestos cnticos para la propagacion de levadura. Ambas medidas se realizaron al comienzo y al final de la etapa de conversion.
Una levadura modificada geneticamente comercial ClluXTM2 distribuida por Leaj Technologies, capaz de fermentar glucosa y xilosa, se inserto en el primer medio de conversion a una densidad de levadura inicial de 1,3 x 107 celulas de levadura por miligramo del primer medio de conversion, que corresponden a 0,2 g de levadura sobre una base seca por gramo del primer medio de conversion.
La primera etapa de conversion se realizo para un primer tiempo de conversion de 14 horas para tener en cuenta la fase de retardo inicial necesaria para permitir que la levadura se adapte al medio de conversion. La saturacion de ox^geno, pO2, se midio durante la etapa de conversion mediante una sonda de pO2 Mettler Toledo InProbe 6820 insertada en el medio de conversion despues de la calibracion y se recoge en la Figura 1. La pO2 se mantuvo en un nivel casi estable proximo a aproximadamente el 70 % durante aproximadamente 3 horas, lo que indica que la levadura estuvo casi inactiva como se esperaba durante la fase de retardo, despues disminuye progresivamente al 10 % en aproximadamente 6,5 horas.
Una concentracion celular de levaduras de 1,5 x 108 celulas de levadura por miligramo se logro en el primer caldo de conversion. Los resultados del crecimiento se evaluaron calculando un factor de crecimiento, que es la proporcion entre la concentracion de celulas de levadura al final y al comienzo de la conversion. Un factor de crecimiento de aproximadamente 11,5 se obtuvo en la primera etapa de conversion, que corresponde a aproximadamente 2 g de levadura sobre una base seca por Kg del primer medio de conversion.
La composicion del primer caldo de conversion se recoge en la Tabla 1. A pesar de la presencia de enzimas remanentes de la etapa de hidrolisis previa, la alta concentracion de azucar en el caldo de conversion inhibe la hidrolisis adicional de los azucares oligomericos y los glucanos y xilanos insolubles.
Aproximadamente 33,9 g/Kg de glucosa se convirtieron (que corresponden a aproximadamente 76 % de la glucosa inicial) y aproximadamente 1,3 g/Kg de xilosa (que corresponden a aproximadamente 7 % de la xilosa inicial) se consumieron en la primera etapa de conversion. Teniendo en cuenta la proporcion de conversion de referencia de 0,50 g de levadura por gramo de azucar, aproximadamente 4,2 gramos de azucar del primer medio de conversion se convirtieron de esta manera a levadura, por Kg de medio de cultivo, con una proporcion de conversion azucar a celula de aproximadamente el 11 %.
La concentracion de acido lactico no se incremento significativamente, lo que indica que la propagacion de los contaminantes bacterianos estaba en niveles razonables. Se produjo tambien una cierta cantidad de etanol.
Tabla 1. Composicion del medio de conversion inicial (t = 0) y los caldos de conversion (t = 14 h, t = 6 h) de los experimentos a escala de laboratorio.
Figure imgf000013_0001
En la segunda etapa de conversion, una aKcuota de 960 ml de hidrolizado de materia prima lignocelulosica caliente se introdujo en un segundo biorreactor, identico al primer biorreactor, se enfrio a aproximadamente 32 °C, despues un volumen de 240 ml del primer caldo de conversion se para formar el segundo medio d aeña cdoiónversion. El pH se fijo a 5±0,1 mediante una disolucion de NaOH y se suplemento con una disolucion de urea a 1,0 g/l. De este modo, en la segunda etapa de conversion, el volumen del primer caldo de conversion fue aproximadamente de 1:5 el volumen total del segundo medio de conversion. La composicion del segundo medio de conversion se recoge en la Tabla 1. Se observa que el segundo medio de conversion contiene algo de etanol del primer caldo de conversion diluido con suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica fresca; la concentracion de etanol fue lo suficientemente baja para no crear problemas a la segunda etapa de conversion. La concentracion de glucosa y xilosa iniciales fueron mas bajas que en la primera etapa de conversion, ya que se consumieron algunos azucares. La densidad de levadura inicial fue de aproximadamente 3,2 x 107 celulas de levadura por miligramo del segundo medio de conversion, que corresponde a aproximadamente 0,5 g de levadura sobre una base seca por gramo del segundo medio de conversion. La concentracion de PO2 de la segunda etapa de conversion, recogida en la Figura 1, disminuye del 50 % al 10 % en aproximadamente 2 horas.
La segunda conversion se llevo a cabo durante 48 horas en ausencia de flujo de aire, en una configuracion continua, manteniendo una temperatura de 32 °C bajo agitacion a 300 rpm. En la segunda etapa de conversion, la hidrolisis enzimatica de la materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua residual se continuo mediante las enzimas contenidas en el hidrolizado de materia prima lignocelulosica y algunos azucares adicionales se pusieron a disposicion de la levadura.
Una concentracion celular de levadura de 1,6 x 108 celulas de levadura por miligramo se alcanzo en el segundo caldo de conversion, se obtuvo de este modo un factor de crecimiento de aproximadamente 5, que corresponde a aproximadamente 2,5 g de levadura sobre una base seca por Kg del segundo medio de conversion.
Las composiciones del segundo caldo de conversion muestran que casi todos los azucares monomericos en el segundo medio de conversion se consumieron por la levadura propagada, asf como azucares monomericos adicionales hidrolizados en la segunda etapa de conversion, que mantuvieron su capacidad de fermentacion tanto de glucosa como de xilosa. Aproximadamente 55 g de azucares/Kg del primer medio de conversion fueron, por lo tanto, convertidos a levadura, con una proporcion de conversion de azucar a celula de aproximadamente del 9 %. La contaminacion bacteriana fue muy baja o insignificante, como lo demuestra la concentracion de acido lactico que fue estable.
La eficiencia de todo el proceso de conversion se describe tipicamente por medio del factor de conversion de azucar a etanol sobre una base de carbono. Como se sabe en la tecnica, el factor de conversion azucar a etanol ideal es 0,51. Esto corresponde a la conversion maxima de azucares a etanol, sin propagacion de levadura, como se describe mediante las formulaciones estequiometricas. El factor de conversion de azucar a etanol total es aproximadamente 0,43, lo que muestra que el proceso descrito alcanza un rendimiento de etanol alto con una cantidad muy baja de levadura externa al proceso.
Segundo experimento de laboratorio
El segundo experimento se realizo como en el primer experimento, pero la alfcuota remanente del primer caldo de conversion en el primer experimento se utilizo como inoculo en vez de levadura seca fresca. Ademas, la primera etapa de conversion se llevo a cabo durante 6 horas, ya que la levadura ya estaba adaptada al medio de conversion. La composicion del medio y los caldos de conversion se recogen en la Tabla 1. El contenido de glucosa en el primer medio de conversion fue ligeramente menor que en el primer experimento, ya que se convirtio algo de glucosa en la alfcuota residual del primer experimento. Ademas, algo de etanol estuvo presente incluso a nivel no problematico. La pO2 de la primera etapa de conversion se recoge en la Figura 1. La pO2 de la segunda etapa de conversion fue casi identica a la etapa correspondiente del primer experimento.
Principales parametros y resultados de la primera etapa de conversion:
Densidad de levadura inicial: 5,3 x 107 celulas de levadura por miligramo
Densidad celular de levadura final: 1,7 x 108 celulas de levadura por miligramo
Factor de crecimiento: aproximadamente 3,2
Peso de levadura producida: 1,8 g de levadura sobre una base seca por Kg
Azucar total convertida: 26 g/Kg
Proporcion de conversion azucar a celula: 13,4 %
Principales parametros y resultados de la segunda etapa de conversion:
Densidad de levadura inicial: 3,4 x 107 celulas de levadura por miligramo
Densidad celular de levadura final: 1,5 x 108 celulas de levadura por miligramo
Factor de crecimiento: aproximadamente 4,4
Peso de levadura producido: 1,8 g de levadura sobre una base seca por Kg
Azucar total convertida: 59 g/Kg
Proporcion de conversion azucar a celula: 8 %
Factor de conversion de azucar a etanol total del proceso completo: 0,43
Validacion a escala industrial
El proceso de conversion se probo en un equipo a escala industrial. El procedimiento utilizado fue transpuesto de experimented a escala de laboratorio.
La primera etapa de conversion se llevo a cabo en un recipiente cilmdrico. La agitacion se proporciono mediante un impulsor coaxial a los ejes del recipiente, girados a 38 rpm.
La segunda etapa de conversion se llevo a cabo en un segundo recipiente cilmdrico. La agitacion se proporciono mediante un impulsor coaxial a los ejes del recipiente, girados a 20 rpm.
La pO2 se midio por medio de un conjunto de sondas dispuestas en diferentes posiciones dentro del medio de conversion.
Las curvas de pO2 muestran perfiles similares a los experimentos a escala de laboratorio.
El primer recipiente de conversion se lleno con 350 m3 del primer medio de cultivo y la primera etapa de conversion se llevo a cabo en 18 horas. La segunda etapa de conversion se llevo a cabo durante 60 horas en 1200 m3 del segundo medio de cultivo total, que se formo segun la proporcion 4:1 (hidrolizado fresco:primer caldo convertido). Ambos experimentos a escala de laboratorio se escalaron a escala industrial.
Principales parametros y resultados de la primera etapa de conversion:
Condiciones del primer experimento Condiciones del segundo experimento a escala de laboratorio a escala de laboratorio Conversion de glucosa 84 % 97 %
Conversion de xilosa 15 % 13 %
Proporcion de conversion
azucar a celula: 17 % 20 %
Principales parametros y resultados de la segunda etapa de conversion:
Proporcion de conversion
azucar a celula: 12 % 15 %
El consumo medio de energfa electrica fue aproximadamente de 90 W/ton del primer medio de conversion sobre una base humeda sobre el proceso completo.
Se llevaron a cabo diferentes series, con un consumo medio de energfa electrica de menos de 100 W/ton del primer medio de conversion. En algunos casos se alcanzo un consumo medio de energfa electrica de menos de 80 W/ton. La validacion a escala industrial muestra que el proceso descrito puede alcanzar un alto rendimiento de etanol con una minima cantidad de levadura externa al proceso, baja contaminacion bacteriana y muy bajo consumo de energfa.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para producir un producto de fermentacion a partir de una suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica que comprende agua, glucosa soluble en agua y xilosa soluble en agua y materia prima lignocelulosica pretratada insoluble en agua, comprendiendo dicho proceso las etapas de:
crear un primer medio de conversion que comprende una primera porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica y una levadura capaz de convertir la glucosa y xilosa a una levadura de propagacion y un producto de fermentacion;
permitir a la levadura convertir al menos el 50 % de la glucosa soluble en agua y menos del 20 % de la xilosa soluble en agua del primer medio de conversion a una primera levadura propagada y una primera porcion del producto de fermentacion en una primera etapa de conversion llevada a cabo durante un primer tiempo de conversion y que tiene una proporcion de la primera conversion azucar a celulas en un intervalo del 5 % al 25 %, en donde la proporcion de la primera conversion azucar a celulas es una proporcion de porcentaje en peso de la glucosa y xilosa convertida a la levadura propagada en la primera etapa de conversion a la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas en el primer medio de conversion, sobre una base de carbono;
crear un segundo medio de conversion que comprende al menos una porcion de la primera levadura propagada y una segunda porcion de la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica;
permitir a la levadura convertir al menos una porcion de la glucosa y xilosa solubles en agua en el segundo medio de conversion a al menos una segunda levadura propagada y una segunda porcion del producto de fermentacion en una segunda etapa de conversion llevada a cabo durante un segundo tiempo que es mayor que el primer tiempo de conversion y que tiene una proporcion de una segunda conversion azucar a celulas que es menor que la proporcion de la primera conversion de azucar a celulas, en donde la proporcion de la segunda conversion de azucar a celulas es una proporcion de porcentaje en peso de la glucosa y xilosa solubles en agua convertidas a la levadura propagada en la segunda etapa de conversion a la glucosa y xilosa solubles en agua totalmente convertidas en el segundo medio de conversion, sobre una base de carbono.
2. El proceso de la reivindicacion 1, en donde la primera etapa de conversion comprende al menos una primera fase que es una fase aerobica y una segunda fase que es una fase anaerobica, en donde la fase aerobica se realiza durante un tiempo en un intervalo de 3 horas a 12 horas.
3. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la primera etapa de conversion se realiza durante un primer tiempo de conversion que es menor de 30 horas.
4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la primera etapa de conversion se realiza insertando aire a un caudal que esta en el intervalo seleccionado de 0,1 vvh a 10 vvh.
5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la primera etapa de conversion se realiza mezclando el primer medio de conversion a una densidad de potencia de peso de menos de 100W/ton del primer medio de conversion sobre una base humeda.
6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde la proporcion de la primera conversion azucar a celulas esta en el intervalo de 5 % a 20 %.
7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la segunda etapa de conversion se lleva a cabo durante un segundo tiempo de conversion que es menor de 72 horas.
8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la segunda etapa de conversion se lleva a cabo en condiciones anaerobicas durante al menos el 80 % del segundo tiempo de conversion.
9. El proceso de la reivindicacion 8, en donde al menos el 80 % de la glucosa y xilosa solubles en agua se convierten en la segunda etapa de conversion.
10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en donde la proporcion de la segunda conversion azucar a celulas es mayor del 2 %.
11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el primer medio de conversion y el segundo medio de conversion tienen un contenido en materia seca que es menor del 30 % y mayor del 5 %.
12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el primer medio de conversion y el segundo medio de conversion comprenden ademas una fuente de nitrogeno.
13. El proceso de la reivindicacion 12, en donde no se anaden al proceso vitaminas y/o oligoelementos.
14. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en donde la suspension de hidrolizado de materia prima lignocelulosica no se somete a ninguna esterilizacion.
15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la primera etapa de conversion tiene una densidad de levadura inicial entre 1 x 106 y 1 x 108 celulas de levadura por miligramo del primer medio de conversion sobre una base humeda.
16. El proceso de la reivindicacion 15, en donde la primera etapa de conversion tiene una densidad de levadura final que esta entre 1 x 107 y 1 x 109 celulas por miligramo del primer medio de conversion sobre una base humeda.
17. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en donde la segunda etapa de conversion tiene una densidad de levadura inicial que es mayor que la densidad de levadura inicial en la primera etapa de conversion.
18. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la primera etapa de conversion y la segunda etapa de conversion se llevan a cabo en recipientes separados.
19. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde el producto de fermentacion es etanol.
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