ES2697757T3 - Uso de enzimas que catalizan la síntesis de piruvato a partir de formiato y acetil-CoA y bacterias que expresan la misma - Google Patents

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Abstract

Un microorganismo aislado que se modifica genéticamente para expresar piruvato formiato liasa (PFL) o 2- cetobutirato formiato liasa, en donde se elimina el gen que codifica para isocitrato liasa (aceA) y/o malato sintasa en el microorganismo, en donde acetil-CoA del microorganismo se convierte a piruvato en presencia de formiato en una reacción de una sola etapa, en donde el flujo neto de la reacción es en la dirección de la síntesis de piruvato.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de enzimas que catalizan la síntesis de piruvato a partir de formiato y acetil-CoA y bacterias que expresan la misma
La presente descripción, en algunos aspectos de la misma, se refiere a microorganismos que expresan enzimas que catalizan la conversión de formiato y acetil-Co-A a piruvato.
El concepto de biorrefinerías se ha convertido en un concepto muy difundido en la última década. Se basa en la premisa de que los organismos vivos pueden y deben utilizarse para satisfacer la creciente demanda de la humanidad de productos químicos especializados, incluyendo combustibles, disolventes, plásticos, productos farmacéuticos, etc. Hoy en día, la mayoría de estos productos químicos se derivan, directa o indirectamente, de carbonos fisionables. Sin embargo, con el inminente agotamiento de estos carbonos fósiles y el aumento del CO2 atmosférico se ha vuelto esencial encontrar fuentes alternativas para estos materiales importantes.
Las materias primas sugeridas para la mayoría de las biorrefinerías propuestas son azúcares simples, almidón, o biomasa lignocelulósica. Si bien la última alternativa tiene una ventaja aparente sobre la primera al no competir con las necesidades del consumo humano, todavía presenta numerosas dificultades, incluyendo una tecnología de fermentación problemática y la disponibilidad y transporte de las materias primas. Una materia prima alternativa fascinante sería la corriente eléctrica. Los electrones se pueden transportar desde un electrodo a las células vivas, proporcionando los equivalentes reductores y la energía necesarios para apoyar el crecimiento autotrófico y la electrosíntesis de los productos básicos deseados. Dado que la electricidad está ampliamente disponible, la electrosíntesis microbiana se puede desacoplar espacial y temporalmente de la producción de energía y puede tener lugar en cualquier lugar y momento convenientes.
La electrosíntesis microbiana puede ser especialmente útil para el mercado de energía renovable. Uno de los principales inconvenientes de la mayoría de las fuentes de energía renovable, incluyendo la energía solar, eólica, hidráulica y nuclear, es que son difíciles de almacenar de manera conveniente. La electrosíntesis microbiana de combustibles puede servir, en consecuencia, para abordar este problema de manera eficiente, convirtiendo la energía eléctrica en enlaces químicos estables cinéticamente.
El CO2 se puede reducir directamente en el cátodo (los electrones se derivan de la división del agua en el ánodo), proporcionando compuestos orgánicos que pueden ser utilizados por las células vivas como fuente de equivalentes reductores, energía e incluso carbono. De esta manera se puede producir un grupo diverso de compuestos. La producción de alcoholes simples, tales como metanol, etanol y propanol, hidrocarburos, tales como metano y etileno, o ácidos con más de un carbono, tales como ácido acético y ácido oxálico, tienen la ventaja de suministrar microbios con compuestos relativamente fáciles de metabolizar y/o ser ricos en equivalentes reductores. Sin embargo, la producción electrocatalítica de todos estos compuestos es generalmente ineficiente (no específica para un solo producto y/o requiere un alto sobrepotencial), requiriendo catalizadores costosos y/o manteniendo una baja densidad de corriente. En contraste, hay dos compuestos que pueden producirse por reducción directa de CO2 con una eficacia relativamente alta (aunque inferior a la del hidrógeno molecular) y una densidad de corriente aceptable: monóxido de carbono y ácido fórmico. Dado que el monóxido de carbono es un gas tóxico e inflamable con baja solubilidad, el ácido fórmico, que es fácilmente soluble y de baja toxicidad, es un mediador preferido de los electrones. De hecho, una economía basada en el formiato se propuso recientemente como una alternativa a los conceptos de la economía basada en hidrógeno o la economía basada en el metanol.
En la mayoría de los organismos, la glicolisis es la principal ruta por la que las células obtienen sus bloques de construcción de biomasa, así como la energía disponible (en la forma de ATP), a partir de los azúcares [1]. Existen varias variantes naturales de la ruta glicolítica, que difieren en su rendimiento de ATP, flujo metabólico y sensibilidad a las condiciones externas [2-4]. Sin embargo, todas estas alternativas comparten una característica en común: producen cantidades estequiométricas de moléculas de piruvato a partir de hexosas, pentosas y triosas. Por otro lado, la confianza en el piruvato cambia dependiendo del organismo y las condiciones. En condiciones aeróbicas o cuando otros aceptores de electrones están disponibles, el piruvato se descarboxila y oxida en su mayoría, ya sea a través de la piruvato deshidrogenasa o la piruvato oxidasa, para formar acetil-CoA, que alimenta el ciclo de TCA. Otras moléculas de piruvato se utilizan como bloques de construcción de biomasa, ya sea directamente (por ejemplo, biosíntesis de valina) o a través de reacciones anapleróticas (por ejemplo, biosíntesis de aspartato). Cuando los aceptores de electrones terminales están ausentes, lo que requiere una fermentación redox equilibrada, el piruvato se convierte generalmente en lactato o etanol, en un proceso que proporciona dos moléculas de ATP por hexosa fermentada.
La fermentación ácida mixta es una estrategia metabólica que permite a las células aumentar su producción de ATP de 2 a 3 moléculas por hexosa (por ejemplo, [5-9]). En este proceso redox equilibrado la enzima piruvato formiato liasa (PFL) escinde el piruvato a acetil-CoA y formiato. La mitad de las moléculas de acetil-CoA se reducen después a etanol, mientras que la otra mitad se secreta como acetato, proporcionando un ATP adicional. La PFL opera en numerosos organismos [10], procariotas [6, 7, 11-15] así como eucariotas [16-18]. La variante de PFL más estudiada proviene de la Y-proteobacteria Escherichia coli (por ejemplo, [19-22].
En E. coli, la PFL está codificada por el gen pflB y es activa como un homodímero de polipéptidos de 85 kDa [23]. La escisión del piruvato tiene lugar mediante un mecanismo radicálico, que implica un radical glicilo en G734 de PFL [24­ 26]. La enzima que activa la piruvato formiato liasa (PFL-AE) - codificada por el gen pflA en E. coli - genera el radical glicilo estable y catalíticamente esencial [27, 28]. PFL-AE realiza esta notable hazaña mediante el uso de un grupo de hierro-azufre y S-adenosilmetionina, colocándola así entre la superfamilia de enzimas radicales AdoMet [28].
El radical glicilo es susceptible de ser destruido por el oxígeno, lo que da como resultado una escisión irreversible del polipéptido y la inactivación de la PFL [29, 30]. Sin embargo, estudios previos han demostrado que las células de E. coli cultivadas bajo condiciones microaeróbicas producen una cantidad significativa de formiato, lo que indica que la PFL conserva su actividad en presencia de niveles bajos de oxígeno [21, 31, 32]. Se demostró que el producto del gen yfiD reactiva la PFL en presencia de oxígeno al reemplazar su parte fragmentada [32, 33].
Si bien se demostró que la reacción de la PFL es reversible in-vitro (ArG'° = -10 KJ/mol) a pH 7,5 y fuerza iónica de 0,2 M), catalizando la formación de piruvato a una velocidad no despreciable (Kcat > 4 s_1 [37]), el significado de esta reacción inversa nunca se exploró in-vivo.
El documento de la solicitud de Patente internacional PCT No. PCT/IL2013/050643 muestra bacterias formatotróficas que utilizan la ruta de la glicina reductora.
El documento de Patente WO 2013076144 se refiere a un microorganismo recombinante diseñado para la producción de 2,3-butanodiol (BDO), en el que dicho microorganismo sobreexpresa al menos un gen que codifica un polipéptido involucrado en la conversión del piruvato a 2,3-butanodiol. También se refiere a un método de producción de 2,3-butanodiol que comprende las siguientes etapas: - proporcionar un microorganismo recombinante - cultivar el microorganismo recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono, y - recuperar el 2,3-butanodiol.
El documento de Patente WO 2012138942 proporciona nuevas rutas metabólicas para reducir o eliminar la producción de glicerol y aumentar la formación de productos. Más específicamente, proporciona un microorganismo recombinante que comprende una eliminación de una o más enzimas nativas que funcionan para producir glicerol y/o regular la síntesis de glicerol y una o más enzimas nativas y/o heterólogas que funcionan en una o más rutas metabólicas diseñadas para convertir una fuente de carbohidratos, tal como lignocelulosa, a un producto, tal como etanol, en el que las una o más enzimas nativas y/o heterólogas se activan, antes de la regulación o después de la regulación. También proporcionan un microorganismo recombinante que comprende una o más enzimas heterólogas que funcionan para regular la síntesis de glicerol y una o más enzimas nativas y/o heterólogas que funcionan en una o más rutas metabólicas diseñadas para convertir una fuente de carbohidratos a etanol, en donde dichas una o más enzimas nativas y/o heterólogas se activan, antes de la regulación o después de la regulación. Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un microorganismo aislado que se modifica genéticamente para expresar la piruvato formiato liasa (PFL) o la 2-cetobutirato formiato liasa, en el que se elimina el gen que codifica la isocitrato liasa (aceA) y/o malato sintasa en el microorganismo, o la actividad de dicha isocitrato liasa o dicha malato sintasa se regula posteriormente, en el que la acetil-CoA del microorganismo se convierte a piruvato en presencia de formiato en una sola etapa de reacción, en el que el flujo neto de la reacción es en la dirección de la síntesis de piruvato.
Preferiblemente, dicha piruvato formiato liasa es codificada por un gen seleccionado del grupo que consiste en pflB, pflD y ybiW.
Preferiblemente, el microorganismo aislado expresa además un polipéptido que activa dicha enzima de piruvato formiato liasa.
Preferiblemente, el microorganismo es formatotrófico, autotrófico o metiltrófico.
Preferiblemente, el microorganismo es una bacteria, una levadura o un hongo.
Preferiblemente, el microorganismo se modifica genéticamente para expresar un polipéptido humano.
Preferiblemente, el microorganismo es capaz de producir un biocombustible.
La presente invención se refiere también a un cultivo celular que comprende el microorganismo aislado y un medio adecuado para la propagación del microorganismo.
Preferiblemente, el medio comprende una cantidad de acetato y/o formiato que favorece que el flujo neto de la reacción sea en la dirección de la síntesis de piruvato.
La presente invención también se refiere a un método de generar un biocombustible que comprende cultivar el microorganismo bajo condiciones que permitan la formación del biocombustible, generando así el biocombustible.
La presente invención también se refiere a un método para generar un polipéptido humano que comprende cultivar el microorganismo de la reivindicación 6 bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido humano, generando así el polipéptido humano.
La presente invención se refiere también a un método para eliminar el acetato de un medio que contiene acetato que comprende poner en contacto el microorganismo con dicho medio, eliminado así el acetato del medio que contiene acetato.
La presente invención se refiere también a un método para eliminar formiato de un medio que contiene formiato que comprende poner en contacto el microorganismo con dicho medio, eliminando así el formiato del medio que contiene formiato.
Breve descripción de los dibujos
Algunos aspectos de la descripción se describen aquí, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se subraya que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y para fines de discusión ilustrativa de los aspectos de la descripción. A este respecto, la descripción realizada con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica cómo se pueden practicar los aspectos de la descripción.
En los dibujos:
Las Figs. 1A-B muestran que la sobreexpresión de PFL salva el crecimiento en acetato de un mutante AaceA de E. coli (en el que aceA codifica la isocitrato liasa). (A) Esquemas del crecimiento dependiente de PFL de un mutante AaceA. Las eliminaciones de genes están marcadas con un signo 'X', las fuentes de carbono están marcadas como círculos azules, y las enzimas sobreexpresadas se muestran en rojo. (B) Ensayos de crecimiento para un mutante AaceA en el que PFL o mCherry (como un control) se sobreexpresaron. Hay que tener en cuenta que incluso en el caso de la sobreexpresión de mCherry, la PLF nativa está todavía presente, pero a un nivel subóptimo.
La Fig. 2 es un diagrama que ilustra esquemáticamente rutas alternativas de asimilación de formiato dependientes de PFL.
La Fig. 3 es un diagrama que ilustra la estructura de las rutas de asimilación de formiato dependientes de PFL anapleróticas.
La Fig. 4 es un diagrama que ilustra la estructura de las rutas de asimilación de formiato dependientes de PFL pentosa-fosfato-gluconeogénicos.
Descripción de aspectos específicos de la descripción
La presente descripción, en algunos aspectos de la misma, se refiere a microorganismos que expresan enzimas que catalizan la conversión de formiato y acetil-CoA a piruvato.
Antes de explicar al menos un aspecto de la descripción en detalle, debe entenderse que la descripción no se limita necesariamente en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificada por los Ejemplos. La descripción es capaz de otros aspectos o de ser practicada o llevada a cabo de varias maneras.
La electrosíntesis ha recibido recientemente mucha atención por ser un enfoque prometedor para el uso de una energía renovable para la producción de productos básicos por parte de las células vivas. Se propusieron varias técnicas para mediar la transferencia de electrones desde el cátodo a las células vivas. De estas, la electroproducción de formiato como mediador parece ser especialmente interesante: el formiato es fácilmente soluble, de baja toxicidad y se puede producir con alta eficiencia y con una densidad de corriente razonable.
Existen numerosas rutas metabólicas que, una vez expresadas en un microorganismo, pueden apoyar potencialmente el crecimiento formatotrófico. Los presentes inventores han descubierto ahora que los microorganismos pueden modificarse genéticamente de manera que puedan asimilar el formiato a través de un mecanismo dependiente de la piruvato formiato liasa (PFL).
Los presentes inventores han demostrado la capacidad para producir dichas bacterias mediante ingeniería genética de una cepa de bacterias AaceA (una deleción en isocitrato liasa) para expresar PFL. Esta bacteria pudo crecer en una mezcla de acetato y formiato (Figura 1B).
Dichas rutas de asimilación de formiato pueden apoyar potencialmente la fijación de carbono y el crecimiento autótrofo en los microorganismos cuando se combinan con el CO2 reductor de la formiato deshidrogenasa y una fuente externa de poder reductor. Alternativamente, las rutas de asimilación de formiato pueden apoyar la asimilación de otros compuestos C1 reducidos (por ejemplo, metano, metanol, metilamina o formaldehído). Como estos compuestos se pueden convertir en los microorganismos a formiato, su asimilación se puede diseñar para que sea dependiente de PFL. Por lo tanto, las rutas de asimilación de formiato anteriores pueden sustituir las rutas nativas de ribulosa monofosfato, deshidroacetona y serina, que apoyan la asimilación de compuestos C1 reducidos en los organismos metiltróficos.
Además, los microorganismos que asimilan el acetil-CoA mediante un mecanismo dependiente de la piruvato formiato liasa (PFL) se pueden utilizar para apoyar la conversión de compuestos C2 a C3, evitando así el uso de rutas intrincadas tales como la derivación de glioxilato, la ruta de etilmalonil-CoA o el ciclo del metilaspartato.
Además, los microorganismos que se han modificado genéticamente para llevar a cabo la reacción inversa de la PFL pueden ser importantes para eliminar el acetato que se acumula en el medio de fermentación. La acumulación de acetato puede dificultar el proceso de fermentación, ya que inhibe muchos procesos metabólicos centrales. Para implementar esta estrategia eficazmente, los presentes inventores contemplan el diseño de una cepa de microorganismos dedicada en la que el transporte de azúcar y la utilización de genes de los mismos se eliminan o dejan de ser funcionales. Además, las enzimas isocitrato liasa y malato sinteasa endógenas pueden eliminarse y la enzima PFL se puede sobreexpresar. Esta cepa dependerá del acetato y del formiato para su crecimiento y no competirá con las cepas de fermentación primarias para los azúcares.
Al igual que en el caso del acetato, la acumulación de formiato en el medio de fermentación (por ejemplo, durante la fermentación ácida mixta) puede ser perjudicial para el crecimiento microbiano. En consecuencia, los presentes inventores contemplan microorganismos que se diseñan genéticamente para llevar a cabo la reacción inversa de la PFL y los utilizan para eliminar el formiato del medio cuando se proporciona acetato externa o internamente.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un microorganismo aislado que se modifica genéticamente para expresar una enzima que convierte el acetil-CoA del microorganismo a piruvato en presencia de formiato en una sola etapa, en el que el flujo neto de la reacción es en la dirección de la síntesis de piruvato.
Como se utiliza aquí, el término “microorganismo” se refiere a cualquier organismo de tamaño microscópico. Ejemplos no limitantes de microorganismos como se utiliza el término aquí incluyen tanto microorganismos procarióticos como eucarióticos, tales como bacterias, arqueas, protozoos, hongos, mohos, levaduras, algas, etc. El microorganismo puede ser aeróbico o anaeróbico.
Los organismos pueden ser organismos fermentativos. Ejemplos de microorganismos incluyen, por ejemplo, Clostridium (por ejemplo, C. acetobutylicum, C. Beijerinckii, C. saccharoperbutylacetonicum, C. saccharobutylicum, C. aurantibutyricum, C. tetanomorphum), Zymomonas, Escherichia (por ejemplo, E. coli), Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Zymomonas y Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces lactis.
Las bacterias pueden ser aquellas que son útiles en la industria alimentaria. Por ejemplo, la bacteria del ácido láctico (LAB) desempeña un papel esencial en la conservación, sabor y textura del queso, yogur, salchichas, chucrut y una gran variedad de alimentos fermentados autóctonos tradicionales.
Como se utiliza aquí, la expresión “bacteria del ácido láctico” se refiere a un grupo de bacterias gram positivas, microaerofílicas o anaeróbicas que tienen en común la capacidad para fermentar azúcares y citratos con la producción de ácidos incluyendo ácido láctico como el ácido producido predominantemente, ácido acético, ácido fórmico y ácido propiónico. Las bacterias del ácido láctico más útiles a nivel industrial se encuentran entre las especies Lactococcus, especies Streptococcus, especies Lactobacillus, especies Leuconostoc, especies Oenococcus y especies Pediococcus. En la industria láctea, los anaerobios estrictos que pertenecen al género Bifidobacterium se incluyen generalmente en el grupo de bacterias del ácido láctico, ya que estos organismos también producen ácido láctico y se utilizan como cultivos de inicio en la producción de productos lácteos.
Por lo tanto, la presente descripción contempla los productos alimenticios que comprenden dicha bacteria.
La bacteria puede ser gram positiva o gram negativa. Ejemplos de bacterias que se contemplan en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus, y Zymomonas.
Ejemplos de hongos contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a Aspergillus, Candida, Chlamydomonas, Chrysosporium, Cryotococcus, Fusarium, Kluyveromyces, Neotyphodium, Neurospora, Penicillium (por ejemplo P. chrysogenum), Pichia, Saccharomyces, Trichoderma y Xanthophyllomyces.
Ejemplos de algas contempladas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a un diatom o una cyanobacterirum.
El diatom puede ser una microalga de la clase Coscinodiscophyceae, Fragilariophyceae o Bacillariophyceae.
La cyanobacterium puede incluir, por ejemplo, Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Gracilaria, Pleurochrysis carterae, Sargassum o Ulva.
El microorganismo puede ser metilotrófico - es decir, es capaz de crecer en compuestos orgánicos de C1 como su único carbono, reduciendo el poder y la fuente de energía. Ejemplos de dichos compuestos incluyen metano, metanol, metilalamina y monóxido de carbono.
De acuerdo con un aspecto particular, el microorganismo metilotrófico es formatotrófico - es decir, utiliza formiato como fuente de carbono, reduciendo el poder y la fuente de energía. Se apreciará que los organismos formatotróficos de la presente descripción pueden ser también capaces de crecer en fuentes de carbono adicionales -ta les como glucosa, glicerol, celulosa, acetato, butirato, lactato, propionato, o valerato.
De acuerdo con otro aspecto, el microorganismo es autótrofo. Un tipo de microorganismo autótrofo es un organismo fototrófico (uno que requiere luz para conseguir el poder reductor y la energía para la fijación del dióxido de carbono). La fuente de electrones para la fotosíntesis puede ser por ejemplo, agua, sulfuro de hidrógeno, azufre elemental o ion ferroso (Fe2+).
Otro tipo de microrganismo autótrofo es un microorganismo quimiotrófico (uno que requiere una fuente de electrones externa [por ejemplo, hidrógeno molecular, monóxido de carbono (CO), sulfuro de hidrógeno (H2S), azufre elemental (S), sulfito (SO32-), fosfito (PO32-), amonio (NH4+), nitrito (NO22-), hidróxido de amonio (NH2OH), ion ferroso (Fe2+), ion Mn2+] para conseguir el poder reductor y la energía para la fijación del dióxido de carbono). Posibles aceptores de electrones terminales incluyen oxígeno molecular, dióxido de carbono (CO2), sulfato (SO42-), azufre elemental (S), nitrato (NO32-), ion férrico (Fe3+).
Los microorganismos de la presente descripción se expresan, ya sea de forma natural o mediante diseño genético, para expresar una enzima que convierte el acetil CoA del microorganismo a piruvato en presencia de formiato en una sola etapa, en la que el flujo neto de la reacción es en la dirección de la síntesis de piruvato.
El término “enzima” como se utiliza aquí se refiere a una “biomolécula catalíticamente funcional” que incluye tanto moléculas enteras nativas (o de tamaño nativo) como derivados (por ejemplo, modificaciones genéticas) de los mismas.
La frase “en una sola etapa” como se utiliza aquí, se refiere a la capacidad de la enzima para catalizar la reacción sin la formación de un producto intermedio.
Ejemplos de dichas enzimas incluyen, pero no se limitan a piruvato formiato liasa (PFL; número EC 2.3.1.54, codificado en E. coli por el gen pflB, por ejemplo, Números de Acceso: EG10701 (EcoCyc), b0903, ECK0894); 2-cetobutirato formiato liasa (codificado por el gen tdcE, Números de Acceso: G7627 (EcoCyc), b3114, ECK3103) y las proteínas codificadas por los genes pflD y ybiW (véase por ejemplo Zhu y colaboradores, (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64: 367-375).
Por lo tanto, una enzima de la presente descripción se refiere también a homólogos y otras modificaciones que incluyen adiciones y deleciones de aminoácidos específicos a la secuencia (por ejemplo, polipéptidos que son al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 87%, al menos el 89%, al menos el 91%, al menos el 93%, al menos el 95% o a más decir el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1, como se determinó utilizando el sofware BlastP del Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) utilizando parámetros predeterminados). El homólogo puede referirse también a un ortólogo, una variante de deleción, inserción, o sustitución, que incluye una sustitución de aminoácidos, y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos de los mismos.
Dado que la enzima PFL es típicamente inactiva y requiere un radical glicilo estable y catalíticamente esencial en G734, la presente descripción contempla además la expresión de una enzima que activa la piruvato formiato liasa (PFL-AE; número EC 1.97.1.4) en el microorganismo. Ejemplos de PFL-AEs son aquellos codificados por el gen pflA o el gen pflC o el gen YjjW.
La PFL-AE de la presente descripción se refiere también a homólogos y otras modificaciones que incluyen adiciones o deleciones de aminoácidos específicos a la secuencia (por ejemplo, polipéptidos que son al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 87%, al menos el 89%, al menos el 91%, al menos el 93%, al menos el 95% o a más decir el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 2, como se determinó utilizando el software BlastP del Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) utilizando parámetros predeterminados). El homólogo puede referirse también a un ortólogo, una variante de deleción, inserción, o sustitución, que incluye una sustitución de aminoácidos, y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos de los mismos.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las enzimas y las proteínas que activan enzimas de algunos aspectos de la descripción se pueden optimizar para la expresión de un microorganismo particular. Ejemplos de tales modificaciones de secuencia incluyen, pero no se limitan a, un contenido de G/C alterado para acercarse más a lo que normalmente se encuentra en las especies de microorganismos de interés, y la eliminación de los codones encontrados atípicamente en las especies de microorganismos comúnmente referidos como optimización de codones.
La frase “optimización de codones” se refiere a la selección de nucleótidos de DNA apropiados para su uso dentro de un gen estructural o un fragmento del mismo que se aproxima al uso de codones dentro del microorganismo de interés. Por lo tanto, un gen o secuencia de ácidos nucleicos optimizado se refiere a un gen en el que la secuencia de nucleótidos de un gen nativo o natural se ha modificado para utilizar codones estadísticamente preferidos o estadísticamente favorecidos dentro del microorganismo. La secuencia de nucleótidos se examina típicamente a nivel de DNA y la región de codificación se optimizó para la expresión en las especies de microorganismos determinada utilizando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, como se describe en Sardana y colaboradores (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). En este método, la desviación estándar del uso de codón, una medida del sesgo del uso del codón, se puede calcular al encontrar primero la desviación proporcional al cuadrado del uso de cada codón del gen nativo en relación con la de los genes altamente expresados, seguido de un cálculo de la desviación media al cuadrado. La fórmula utilizada es: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, donde Xn se refiere a la frecuencia de uso del codón n en genes altamente expresado, donde Yn se refiere a la frecuencia de uso del codón n en el gen de interés y N se refiere al número total de codones en el gen de interés.
Un método para optimizar la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con el uso de codones preferidos para un tipo de célula particular se basa en el uso directo, sin realizar ningún cálculo estadístico adicional, de tablas de optimización de codones tales como las que se proporcionan en línea en la Base de Datos de Uso de Codones a través del banco de DNA NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) en Japón (www.dotkazusadotordotjp/codon/). La Base de Datos de Uso de Codones contiene tablas de uso de codones para varias especies diferentes, y cada tabla de uso de codones se ha determinado estadísticamente en función de los datos presentes en el Genbank.
Al utilizar las tablas anteriores para determinar los codones más preferidos o más favorecidos para cada aminoácido en especies particulares (por ejemplo, E. coli), una secuencia de nucleótidos que se produce de forma natural que codifica una proteína de interés puede optimizarse con codones para especies particulares. Esto se realiza al reemplazar los codones que pueden tener una baja incidencia estadística en el genoma de la especie en particular con los codones correspondientes, en relación con un aminoácido, que son estadísticamente más favorecidos. Sin embargo, se pueden seleccionar uno o más codones menos favorecidos para eliminar sitios de restricción existentes, para crear nuevos en uniones potencialmente útiles (extremos 5' y 3' para añadir péptidos señal o casetes de terminación, sitios internos que podrían utilizarse para cortar y empalmar segmentos juntos para producir una secuencia de longitud completa correcta), o para eliminar secuencias de nucleótidos que pueden afectar negativamente a la estabilidad o expresión del mRNA.
La secuencia de nucleótidos codificante que se produce de forma natural puede ya, antes de cualquier modificación, contener una serie de codones que corresponden a un codón estadísticamente favorecido en unas especies particulares. Por lo tanto, la optimización del codón de la secuencia de nucleótidos nativa puede comprender determinar qué codones, dentro de la secuencia de nucleótidos nativos, no están estadísticamente favorecidos con respecto a una planta particular, y modificar estos codones de acuerdo con la tabla de usos del codón de las especies particulares para producir un derivado del codón optimizado. Una secuencia de nucleótidos modificada puede optimizarse total o parcialmente para el uso de codones de microorganismos siempre que la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos modificada se produzca a un nivel más alto que la proteína codificada por el gen natural o nativo correspondiente. La construcción de genes sintéticos mediante la alteración del uso del codón se describe por ejemplo en la solicitud de Patente PCT Patent Application No. 93/07278.
Para expresar las enzimas de la presente descripción utilizando la tecnología recombinante, los polinucleótidos que codifican las enzimas pueden estar unidos a un vector de expresión de ácidos nucleicos, bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora en cis (por ejemplo, una secuencia promotora) adecuada para dirigir la transcripción constitutiva o inducible de las enzimas en el microorganismo.
Por lo tanto, la presente descripción contempla polinucleótidos aislados que codifican las enzimas de la presente descripción.
La frase “un polinucleótido aislado” se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios que se aísla y proporciona en la forma de una secuencia de RNA, una secuencia de polinucleótidos complementaria (cDNA), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o una secuencia de polinucleótidos compuesta (por ejemplo, una combinación de las anteriores).
Como se utiliza aquí, la frase “secuencia de polinucleótidos complementaria” se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa del RNA mensajero utilizando una transcriptasa inversa o cualquier otra DNA polimerasa dependiente de RNA. Dicha secuencia se puede amplificar posteriormente in vivo o in vitro utilizando una DNA polimerasa dependiente de DNA.
Como se utiliza aquí, la frase “secuencia de polinucleótidos genómicos” se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y, por lo tanto, representa una parte contigua de un cromosoma.
Como se utiliza aquí, la frase “secuencia de polinucleótidos compuesta” se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias de exones requeridas para codificar los polipéptidos de la presente descripción, así como algunas secuencias intrónicas que se interponen entre ellas. Las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo de otros genes, y típicamente incluirán secuencias de señal de empalme conservadas. Dichas secuencias intrónicas pueden incluir además elementos reguladores de expresión que actúan en cis.
El vector de expresión de la presente descripción incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas, eucariotas, o preferiblemente ambos (por ejemplo, vectores lanzadera). Los vectores de clonación típicos contienen secuencias de inicio de transcripción y traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de transcripción y traducción (por ejemplo, señales de poliadenilación).
Se puede utilizar varios métodos para introducir el vector de expresión de la presente descripción en el sistema de células huésped. Dichos métodos se describen generalmente en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), en Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang y colaboradores, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega y colaboradores, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa y colaboradores [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Véase, además, los documentos de Patentes U.S. Nos. 5,464,764 y 5,487,992 para métodos de selección positivos-negativos.
Ejemplos de sistemas de expresión basados en bacterias se describen en Baneyx y colaboradores, Current Opinion in Biotechnology, 1999; 10, 411-421 y Macrides y colaboradores, Microbiol Rev 1996, 60: 512-538.
Los microorganismos se pueden transformar de manera estable o transitoria con las construcciones de ácidos nucleicos de la presente descripción. En la transformación estable, la molécula de ácido nucleico de la presente descripción se integra en el genoma del microorganismo y, como tal, representa un rasgo estable y heredado. En la transformación transitoria, la molécula de ácido nucleico se expresa por la célula transformada pero no está integrada en el genoma y, como tal, representa un rasgo transitorio.
Como se mencionó, el flujo neto de la reacción en el microorganismo es en la dirección de la síntesis de piruvato. Se apreciará que las enzimas tales como piruvato formiato liasa catalizan la reacción del acetil-CoA y formiato para generar piruvato y la reacción inversa de la degradación de piruvato en acetil-CoA y formiato. Las condiciones de la reacción son tales que el flujo neto de la reacción es en la dirección de la síntesis de piruvato. Una forma de manipular las condiciones es aumentando la concentración de formiato en el medio. Otra forma de manipular las condiciones para favorecer la síntesis de piruvato es aumentando la cantidad de acetil-CoA disponible para el organismo. Otra alternativa más es proporcionar un sumidero fuerte para el piruvato, es decir, el piruvato se consume a un ritmo elevado por otras reacciones celulares.
La fuente de acetil-CoA que requiere el microorganismo puede ser el acetato presente en el medio (por ejemplo, 0,01% - 10% de acetato de sodio, o más preferiblemente 0,1% - 5%). Alternativamente, el microorganismo puede ser capaz de generar acetil-CoA sin una fuente de acetato externa.
Para generar una fuente interna de acetil-CoA existen dos tipos de estructuras generales que pueden adoptar una ruta de asimilación de formiato dependiente de PFL. La estructura “anaplerótica” (mostrada en púrpura en la Figura 2) implica la carboxilación del piruvato derivado de PFL a oxaloacetato (mediante piruvato carboxilasa o alternativamente PEP carboxilasa) y su reducción adicional a malato. El malato se liga después con coenzima A para formar malil-CoA que se escinde para reciclar el acetil-CoA y producir glioxilato en el que puede crecer la célula. En la estructura “pentosa-fosfato-gluconeogénica” (mostrada en naranja en la Figura 2) el piruvato derivado de PFL se reduce a gliceraldehído 3-fosfato mediante la ruta gluconeogénica nativa. La ruta nativa de pentosa fosfato convierte después el gliceraldehído 3-fosfato a xilulosa 5-fosfato, que se escinde por la enzima fosfocetolasa (marcada como 'PKT' en la Figura 2) a gliceraldehído 3-fosfato y fosfato de acetilo. El fosfato de acetilo se convierte a acetil-CoA mediante la enzima fosfato acetiltransferasa endógena, completando así el ciclo. Alternativamente, la fosfocetolasa se puede utilizar para escindir la fructosa 6-fosfato (en vez de xilulosa 5-fosfato).
Existen varias variantes de la estructura “anaplerótica” descrita aquí anteriormente como se muestra en la Figura 3. Estas rutas pueden denominarse rutas de p FL-APOG, donde APOG representa Acetil-CoA-Piruvato-Oxaloacetato-Glioxilato/Glicina, los metabolitos más comunes en casi todas estas rutas.
Para que un microorganismo utilice la estructura anaplerótica de la ruta de asimilación de formiato dependiente de PFL, tiene que expresar las siguientes enzimas:
piruvato-formiato-liasa (número EC 2.3.1.51), enzima activante de piruvato formiato liasa (número EC 1.97.1.4), piruvato carboxilasa (número EC 6.4.1.1), malato deshidrogenasa (número EC 1.1.1.37), malato-CoA ligasa (número EC 6.2.1.9) y malil-CoA liasa (número EC 4.1.3.24).
Se apreciará que si el microorganismo no expresa endógenamente una o una combinación de las enzimas anteriormente indicadas, la presente descripción contempla la modificación genética del microorganismo de manera que exprese cada una de las enzimas mencionadas anteriormente (o alternativas de las mismas) de manera que sea capaz de utilizar la ruta (es decir, la expresión recombinante). Se pueden utilizar los ortólogos y parálogos de las enzimas anteriores, así como las enzimas que catalizan la misma actividad que las enzimas anteriores, en lugar de las enzimas anteriormente mencionadas. Específicamente, se puede utilizar cualquier enzima que muestre la actividad de piruvato formiato liasa en lugar de pflB y se puede utilizar cualquier enzima que pueda activar la piruvato formiato liasa en lugar de pflA.
Existen varias variantes de la estructura “pentosa fosfato gluconeogénica” como se muestra en la Figura 4. Estas variantes se denominan aquí como rutas PFL-PKT, enfatizando las enzimas comunes en todas estas rutas (PKT representa fosfocetolasa). Se pueden imaginar otras rutas de asimilación de formiato que utilizan las rutas de PFL y PKT, además de las que se muestran en la Figura 4, que incluyen diferentes cableados de la ruta de pentosa fosfato y la escisión de otros azúcares por PKT.
Para que un microorganismo utilice la estructura pentosa fosfato gluconeogénica de la ruta de asimilación de formiato dependiente de PFL, tiene que expresar las siguientes enzimas:
piruvato formiato liasa (número EC 2.3.1.51), enzimas activantes de piruvato formiato liasa (número EC 1.97.1.4), PEP sintetasa (número EC 2.7.92), fosfopiruvato hidratasa (número Ec 4.2.1.11), fosfogliceromutasa (número EC 5.4.2.11) , 3-fosfoglicerato quinasa (número EC 2.7.2.3), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (número EC 1.2.1.12) , triosa fosfato isomerasa (número EC 5.3.1.1), fructosa bisfosfato aldolasa (número EC 4.1.2.13), fructosa bisfosfatasa (número EC 3.1.3.11), transcetolasa (número EC 2.2.1.1), transaldolasa (número EC 2.2.1.2), ribulosa fosfato 3-epimerasa (número EC 5.1.3.1), ribosa 5-fosfato isomerasa A (número EC 5.3.1.6), fosfocetolasa (número EC 4.1.2.9) y fosfato acetiltransferasa (número EC 2.3.1.8).
Se apreciará que si el microorganismo no expresa de manera endógena una o una combinación de las enzimas anteriormente indicadas, la presente descripción contempla la modificación genética de los microorganismos de manera que exprese cada una de las enzimas mencionadas anteriormente (o alternativas a las mismas) de manera que sea capaz de utilizar la ruta. Se pueden utilizar ortólogos y parálogos de las enzimas anteriores, así como enzimas que catalizan la misma actividad que las enzimas anteriores, en lugar de las enzimas mencionadas anteriormente. Específicamente, se pueden utilizar cualquier enzima que muestre la actividad de piruvato formiato liasa en lugar de pflB y se puede utilizar cualquier enzima que pueda activar la piruvato formiato liasa en lugar de pflA.
Con el fin de asegurar que el microorganismo utiliza la enzima PFL para la síntesis de piruvato, y no se basa en la derivación del glioxilato endógeno, la presente descripción contempla cepas de microorganismos en la que se elimina el gen que codifica para la isocitrato liasa (aceA) y/o malato sintasa, o se regula después la actividad de la isocitrato liasa o malato sintasa.
Los métodos para eliminar los genes de los cromosomas de los microorganismos son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen la recombinación homóloga, las técnicas de desactivación, RNAi, etc.
Los microorganismos de este aspecto de la presente invención se cultivan típicamente en condiciones efectivas en un medio que soporta su crecimiento y permite la expresión de las enzimas descritas aquí. Así, por ejemplo el medio puede comprender formiato (por ejemplo, 0,1% - 1% de formiato de sodio). Típicamente, el medio también comprende un aceptor de electrones tal como nitrato, sulfato u oxígeno a niveles bajos (1-5%). El medio puede comprender también sales, minerales, metales y otros nutrientes adecuados tales como vitaminas. Las células de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. El cultivo puede llevarse a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de un experto en la técnica.
Se apreciará que hasta que el microorganismo se transforme de ser un microorganismo heterótrofo a un microorganismo formatotrófico o microorganismo autótrofo, el microorganismo se cultiva en un medio de cultivo que comprende otras fuentes de carbono tales como glucosa o glicerol.
Después de la generación de los microorganismos como se describe aquí, preferiblemente se seleccionan creciendo (es decir, cultivando) sobre un sustrato particular. Preferiblemente, los microorganismos se cultivan durante al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos una semana, al menos un mes, al menos tres meses en los que cualquier célula viable que quede después de ese tiempo es el microorganismo seleccionado.
Así, por ejemplo en el caso de la generación de un microorganismo formatotrófico, el microorganismo debe cultivarse en un medio de cultivo que comprende formiato como la fuente de carbono. En el caso de un microorganismo autótrofo, el microorganismo debe cultivarse en un medio de cultivo que comprende dióxido de carbono como la fuente de carbono y una fuente de electrones externa como se describe aquí más adelante.
El formiato que se utiliza puede provenir de cualquier fuente, por ejemplo, formiato de sodio, formiato de potasio, ácido fórmico o anhídrido de ácido fórmico, etc.
Alternativamente, y/o adicionalmente, el formiato se puede generar utilizando electricidad. El CO2 puede reducirse directamente en el cátodo (los electrones se derivan de la división del agua en el ánodo, por ejemplo) para generar formiato con una eficacia relativamente alta.
Para el generar el formiato para su uso por el microorganismo, el microorganismo se coloca en un biorreactor en un fluido (por ejemplo, agua). El cátodo puede colocarse opcionalmente dentro del biorreactor en contacto con el microorganismo. Alternativamente, el cátodo puede colocarse en un contenedor separado para el biorreactor y el formiato se pueden canalizar a la cámara que comprende el microorganismo. El fluido puede contener otros elementos requeridos por el microorganismo para el crecimiento, como por ejemplo sales, minerales, metales y otros nutrientes, como las vitaminas.
Ejemplos de dichos biorreactores y métodos adicionales se proporcionan en Li y colaboradores, Science, 2012, Vol 335, page 1596, Rabaey y colaboradores, Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22: 371-377; Lovley y colaboradores, Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22: 441-448; Lovley D.R., Environmental microbiology reports, 2011, 3(1), 27-35; Nevin y colaboradores, Microbiology, May/June 2010 Volume I Issue 2; Rabaey y colaboradores, Applied and Industrial Microbiology, Nature Reviews, October 2010, Volume 8, page 706-716.
Los electrodos se pueden fabricar a partir de dichos polímeros conductores y materiales metálicos que incluyen óxido de estaño e indio (ITO), grafito, platino y plata.
Por lo tanto, se contempla un sistema para el microorganismo descrito aquí y un electrodo para proporcionar electrones para generar formiato. El sistema puede comprender además un mecanismo(s) para separar, recoger, y/o recuperar un biocombustible que es generado por el microorganismo (como se detalla más adelante).
La presente descripción prevé que cuando el medio comprende formiato (y opcionalmente acetato), el tiempo de duplicación del microorganismo (por ejemplo, bacteria) puede ser entre 1 - 20 horas, opcionalmente entre 3 - 12 horas por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11 horas.
De acuerdo con un aspecto, el microorganismo es uno que produce un producto importante industrialmente, por ejemplo, un biocombustible. Alternativamente, o adicionalmente, el microorganismo expresa enzimas de modo que es capaz de producir un producto importante industrialmente, por ejemplo, biocombustible. Se apreciará que la precisa elección de enzimas se selecciona de acuerdo con el microorganismo particular que se está utilizando. Alternativamente, o adicionalmente, el microorganismo expresa un producto importante industrialmente, por ejemplo una proteína recombinante. Productos industriales importantes adicionales incluyen antibióticos u otros productos farmacéuticos, disolventes, pigmentos, aditivos alimenticios, monómeros para la industria del plástico y polímeros de valor industrial.
Los biocombustibles incluyen por ejemplo, un alcohol (por ejemplo, metanol, etanol, propanol, isobutanol, y nbutanol, etc), un hidrocarburo (por ejemplo, un alcano tal como metano, etano, propano, butano, un alqueno tal como etileno, propileno, isoprenos, un alquino tal como acetileno, etc) hidrógeno, un biodiesel (ésteres alquílicos (metilo, propilo o etilo) de cadena larga), un aldehido o cetonas (por ejemplo, acetona, formaldehído, 1-propanal, etc). El biocombustible puede ser un sólido, un líquido o un gas.
Microorganismos industrialmente útiles incluyen la producción de etanol por Saccharomyces y la producción de butanol por Clostridium.
Otros microorganismos industrialmente útiles incluyen aquellos en la producción de monómeros plásticos y disolventes.
La proteína recombinante puede ser cualquier proteína, por ejemplo una proteína humana utilizada con fines medicinales. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen anticuerpos, insulina, interferón, hormona del crecimiento, eritropoyetina, hormona del crecimiento, hormona estimulante del folículo, factor VIII, alfa galactosidasa A del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) y glucocerebrosidasa.
Como se mencionó, con el fin de expresar proteínas recombinantes en el microorganismo, las secuencias de polinucleótidos que las codifican se insertan en los vectores de expresión como se describió aquí anteriormente. Se apreciará que, aparte de contener los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica el polipéptido útil industrialmente), el constructo de expresión para la expresión del polipéptido útil industrialmente también puede incluir secuencias diseñadas para optimizar la estabilidad, producción, purificación, rendimiento o actividad del polipéptido expresado.
Dependiendo del vector y del sistema huésped utilizado para la producción, los polipéptidos resultantes de la presente descripción pueden permanecer o dentro de la célula recombinante, secretada en el medio de fermentación, secretada en un espacio entre dos membranas celulares, tal como el espacio periplásmico en E. coli; o retenido en la superficie exterior de una célula o membrana viral.
Después de un tiempo predeterminado en el cultivo, se efectúa la recuperación del polipéptido recombinante.
La frase “recuperar el polipéptido recombinante” utilizada aquí se refiere a la recogida de todo el medio de fermentación que contiene el polipéptido y no implica necesariamente etapas adicionales de separación o purificación.
Por lo tanto, los polipéptidos de la presente descripción se pueden purificar utilizando una variedad de técnicas de purificación de proteínas estándar, tales como, pero no limitadas a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en fase reversa, cromatografía con concanavalina A, chromatofocusing y solubilización diferencial.
Para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada puede diseñarse para codificar el polipéptido de la presente descripción y el resto escindible fusionado. Dicha proteína de fusión puede diseñarse de modo que el polipéptido pueda aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, por inmovilización en una columna específica para el resto escindible. Cuando el sitio de escisión se diseña entre el polipéptido y el resto escindible, el polipéptido se puede liberar de la columna cromatográfica mediante tratamiento con una enzima o un agente apropiado que escinde específicamente la proteína de fusión en este sitio (por ejemplo 26, 27).
La recuperación de biocombustibles puede recuperarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Alcoholes tales como etanol, metanol, y/o butanol se pueden recuperar del material líquido mediante tamices moleculares, destilación, y/u otras técnicas de separación. Por ejemplo, el etanol se puede concentrar mediante destilación fraccionada a aproximadamente el 90% o aproximadamente el 95% en peso. Existen varios métodos disponibles para purificar más el etanol más allá de los límites de la destilación, y estos incluyen el secado (por ejemplo, con óxido de calcio o rocalla), la adición de pequeñas cantidades de benceno o ciclohexano, tamices moleculares, membrana, o por reducción de la presión.
El gas producido, por ejemplo, como producido por el metabolismo anaeróbico o la fotosíntesis, puede procesarse para separar los componentes de metano y/o hidrógeno. Metano, hidrógeno, o biogás pueden extraerse del sistema como gas de tubería.
De acuerdo con la descripción, el metano y/o hidrógeno pueden recuperarse como un producto de biocombustible. El metano puede recuperarse y/o purificarse a partir del biogás mediante métodos conocidos y sistemas conocidos que están disponibles comercialmente, incluyendo sistemas de membrana conocidos para la separación de gases en función de diferentes permeabilidades. Véase, por ejemplo, el documento de Patente U.S. Patent. No. 6,601,543 que se incorpora aquí por referencia. Alternativamente, varios métodos de adsorción se pueden utilizar para separar metano e hidrógeno.
Otras formas para recoger los productos del biocombustible incluyen centrifugación, fraccionamiento por temperatura, métodos cromatográficos y métodos electroforéticos.
En ciertos aspectos, los componentes de recuperación/purificación de biocombustibles pueden integrarse en el sistema de cultivo de microorganismos (por ejemplo, biorreactor), por ejemplo, conectando el dispositivo o aparato respectivo a los efluentes de gases o líquidos de los biorreactores. Los biocombustibles purificados y los productos de bioenergía pueden alimentarse en un contenedor(es) separado(s).
Como se mencionó aquí anteriormente, los microorganismos de la presente descripción se pueden utilizar para eliminar el acetato de un medio que contiene acetato.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente descripción se proporciona un método para eliminar el acetato de un medio que contiene acetato que comprende poner en contacto el medio que contiene acetato con un microorganismo que expresa una enzima que convierte, en una sola etapa, la acetil-CoA a piruvato en presencia de formiato, con el medio, eliminando así el acetato del medio que contiene acetato.
La acumulación de acetato puede tener lugar en dos circunstancias principales: (1) en muchos procesos de fermentación industrial, el acetato se acumula como resultado del metabolismo de desbordamiento; (2) en el hidrolizado del material lignocelulósico, el acetato es un producto inevitable de la despolimerización de hemicelulosa porque los arabinoxilanos están acetilados.
La acumulación de acetato puede dificultar el proceso de fermentación, ya que inhibe muchos procesos metabólicos centrales. Se han sugerido varias estrategias para reducir el efecto inhibitorio del acetato en la fermentación, incluyendo su eliminación química del medio, el diseño de bacterias tolerantes al acetato y la reducción del nivel de acetato mediante su consumo metabólico. En línea con esta última estrategia, los presentes inventores contemplan que la síntesis de piruvato a través de PFL puede utilizarse para reducir la concentración de acetato en el medio.
Para implementar esta estrategia de manera eficiente, se debe diseñar una cepa dedicada, que se basa en PFL para generar piruvato.
El microorganismo se puede modificar genéticamente para expresar PFL o puede depender de cepas de tipo nativo que expresan altos niveles de PFL.
Para la eliminación del acetato, los presentes inventores contemplan la regulación posterior o la eliminación de al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más transportes de azúcar y la utilización de genes y sobreexpresión de PFL como se describió aquí anteriormente.
Los ejemplos de transporte de azúcar y genes que utilizan azúcar incluyen genes del sistema de fosfotransferasa (PTS) genes (ptsG, manZ, crr), glucoquinasa (glk), y xilosa (xylA). Genes adicionales incluyen malX, fruA, fruB, bglF, o crr, genes que están implicados en otros PTSs.
De acuerdo con un aspecto particular, el microorganismo no expresa o tiene un nivel de expresión regulado después de isocitrato liasa y/o malato sintasa. También se contempla la regulación posterior de otros genes responsables de la asimilación de acetato en el huésped.
Los métodos de genes que se regulan después se han descrito aquí anteriormente.
Para alimentar la asimilación de acetato de esta manera, se apreciará que el formiato debe estar presente en el medio o producido internamente. En el caso del metabolismo de desbordamiento, es posible que el formiato se produzca junto con el acetato (es decir, la fermentación ácida mixta) y, por lo tanto, ambos pueden ser re-asimilados juntos por la cepa dependiente de PFL dedicada. En otros casos, el ácido fórmico se puede agregar al medio como un sustrato auxiliar. Alternativamente, la presente descripción contempla que el microorganismo se puede diseñar de tal manera que sea capaz de generar formiato a partir de electrones, como se describe aquí más adelante o por cualquier otro medio que incluye los descritos en la solicitud Internacional de Patente PCT No. PCT/IL2013/050643. Otra opción es que el organismo produzca formiato de manera endógena para soportar la asimilación de acetato. Como se mencionó aquí anteriormente, los microorganismos de la presente descripción se pueden utilizar para eliminar formiato de un medio que contiene formiato. Al igual que en el caso del acetato, la acumulación de formiato en el medio de fermentación (por ejemplo, durante la fermentación ácida mixta) puede ser perjudicial para el crecimiento microbiano.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente descripción se proporciona un método para eliminar el formiato de un medio que contiene formiato que comprende poner en contacto un microorganismo que expresa una enzima que convierte, en una sola etapa, acetil-CoA a piruvato en presencia de formiato con el medio, eliminando así el formiato del medio que contiene el formiato.
El microorganismo se puede modificar genéticamente para expresar PFL o puede depender de cepas de tipo nativo que expresan altos niveles de PFL.
La acetil-CoA se puede proporcionar al microorganismo a partir de una fuente externa (es decir, añadir acetato al medio). Alternativamente, los microorganismos pueden modificarse genéticamente como se describió aquí anteriormente, de modo que sean capaces de generar una fuente interna de aceti- CoA.
De acuerdo con un aspecto particular, los microorganismos de este aspecto de la presente descripción se modifican de tal manera que la actividad de las enzimas fosfogliceromutasa, así como la fosfogluconato deshidratasa se regulan después. De esta manera, la glicólisis de EMP y ED ya no podría convertir los azúcares en la mayoría de los bloques de construcción celulares.
Los presentes inventores contemplan además la sobreexpresión de fosfocetolasa en estas cepas para restablecer la capacidad de la célula para crecer en azúcares, a medida que esté disponible un suministro constante de acetil-CoA. La actividad de isocitrato liasa se puede también regular después, lo que detiene la ruta de asimilación de acetato endógeno. Al hacerlo, la única forma en que la célula puede crecer es asimilando el formiato a través de la reacción inversa de la PFL. Dicha cepa puede cultivarse junto con la cepa de fermentación primaria, manteniendo la concentración de formiato dentro del medio en un mínimo.
Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunos aspectos de la descripción de manera no limitante.
Generalmente, la nomenclatura utilizada aquí y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente descripción incluyen técnicas de DNA molecular, bioquímico, microbiológico y recombinante. Dichas técnicas se explican a fondo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook y colaboradores, (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y colaboradores, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson y colaboradores, “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren y colaboradores (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1998); metodologías como se establece en los documentos de Patente Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y colaboradores, (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles se describen extensamente en patentes y bibliografía científica, véase, por ejemplo, los documentos de Patente Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., Ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y colaboradores, “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos en la misma son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector.
Ejemplo 1
Generación de bacterias que expresan PFL y enzimas que activan PFL para permitir la síntesis de piruvato a partir de acetato y formiato suministrados de forma exógena.
Los presentes inventores construyeron una cepa de E. coli en la que se eliminó el gen aceA, que codifica la isocitrato liasa. Esta cepa no puede cultivarse en acetato ya que no puede correr la derivación de glioxilato dependiente de isocitrato liasa (Figura 1A). Los genes pflA y pflB, que codifican la enzima activadora de PFL y PFL, respectivamente, se clonaron en el plásmido pNiv, bajo la regulación de los sitios de unión al ribosoma RBSc [39]. La cepa AaceA se transformó con este plásmido y la bacteria se cultivó a 37°C bajo condiciones anaeróbicas en un medio mínimo suplementado con 0,2% de formiato de sodio, 0,2% de acetato de sodio y 25 mM de nitrato como un aceptor de electrones. Como se ilustra en la Figura 1B, el crecimiento se obtuvo con un tiempo de duplicación de 18 horas. Las mismas características de crecimiento se obtuvieron también a una mayor concentración de acetato. Sin embargo, la concentración de formiato no pudo incrementarse debido a su toxicidad. Como control, los presentes inventores intentaron cultivar una cepa de AaceA que alberga un plásmido que contiene mcherry en lugar de los genes de PFL, en las mismas condiciones. No se observó crecimiento (Figura 1B). También, al intentar cultivar la cepa de AaceA, transformada con el plásmido PFL, en medio sin formiato, no se produjo crecimiento. Estos hallazgos demuestran que la enzima PFL y su reacción inversa, que produce piruvato, se requieren para establecer el crecimiento en acetato en una cepa de AaceA. Notablemente, en esta cepa dependiente de PFL, >80% de la biomasa se deriva del piruvato producido por PFL.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo aislado que se modifica genéticamente para expresar piruvato formiato liasa (PFL) o 2-cetobutirato formiato liasa, en donde se elimina el gen que codifica para isocitrato liasa (aceA) y/o malato sintasa en el microorganismo, en donde acetil-CoA del microorganismo se convierte a piruvato en presencia de formiato en una reacción de una sola etapa, en donde el flujo neto de la reacción es en la dirección de la síntesis de piruvato.
2. El microorganismo aislado de la reivindicación 1, en donde dicha piruvato formiato liasa es codificada por un gen seleccionado del grupo que consiste en pflB, pflD y ybiW.
3. El microorganismo aislado de la reivindicación 1, que expresa además un polipéptido que activa dicha enzima de piruvato formiato liasa.
4. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es formatotrófico, autotrófico o metiltrófico.
5. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es una bacteria, una levadura o un hongo.
6. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que se modifica genéticamente para expresar un polipéptido humano.
7. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, capaz de producir un biocombustible.
8. Un cultivo celular que comprende un microorganismo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un medio adecuado para la propagación del microorganismo.
9. El cultivo celular de la reivindicación 8, en donde el medio comprende una cantidad de acetato y/o formiato que favorece que el flujo neto de la reacción sea en la dirección de la síntesis de piruvato.
10. Un método para generar un biocombustible que comprende cultivar el microorganismo de la reivindicación 7 bajo condiciones que permiten la formación de biocombustible, generando así el biocombustible.
11. Un método para generar un polipéptido humano que comprende cultivar el microorganismo de la reivindicación 6 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido humano, generado así el polipéptido humano.
12. Un método para eliminar el acetato de un medio que contiene acetato que comprende poner en contacto el microorganismo de la reivindicación 1, con dicho medio, eliminando así el acetato del medio que contiene acetato.
13. Un método para eliminar el formiato de un medio que contiene formiato que comprende poner en contacto el microorganismo de la reivindicación 1 con dicho medio, eliminando así el formiato del medio que contiene formiato.
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