BR112018015551A2

BR112018015551A2 - processo para a produção de um produto de fermentação

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Publication number: BR112018015551A2
Application number: BR112018015551A
Authority: BR
Inventors: Sabbatini Fabio
Original assignee: Beta Renewables Spa
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2018-12-26
Also published as: RS58780B1; HUE044785T2; SI3208341T1; EP3208341A1; EP3208341B1; PL3208341T3; US20190055585A1; HRP20190359T1; BR112018015551B1; US11155838B2; DK3208341T3; LT3208341T; CN108699574B; WO2017144388A1; PT3208341T; ES2713749T3; CN108699574A

Abstract

a presente invenção refere-se a um processo para a produção de um produto de fermentação a partir de uma pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica que compreende água, glicose e xilose solúveis em água e matéria-prima lignocelulósica pré-tratada insolúvel em água. o processo compreende pelo menos duas etapas de conversão. um primeiro meio de conversão que compreende uma primeira porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima ligno-celulósico, e uma levedura capaz de fermentar glicose e xilose é criado primeiramente, em seguida, a levedura é deixada converter pelo menos 50% da glicose e menos de 20% da xilose do primeiro meio de conversão em uma primeira levedura propagada e uma primeira porção do produto de fermentação em uma primeira etapa de conversão que tem uma primeira taxa de conversão açúcar-células em uma faixa de 5% a 25%. um segundo meio de conversão que compreende pelo menos uma porção da primeira levedura propagada e uma segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica são então criados, em seguida, a levedura é deixada converter pelo menos uma porção da glicose e xilose solúveis em água no segundo meio de conversão em pelo menos uma segunda levedura propagada e uma segunda porção do produto de fermentação em uma segunda etapa de conversão com uma segunda taxa de conversão açúcar-células que é menor do que a primeira taxa de conversão açúcar-células. preferencialmente, a primeira etapa de conversão compreende pelo menos uma primeira fase que é uma fase aeróbia e uma segunda fase que é uma fase anaeróbia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0001] A fermentação de açúcares monoméricos a álcool por meio de levedura é muito bem conhecida há milhares de anos. Ou seja, a cerveja tem sido produzida por quase todas as culturas e populações na história da espécie humana. No campo de biocombustíveis, matérias-primas de primeira geração que possuem um elevado teor de amido, tal como milho, têm sido utilizadas com sucesso em escala industrial para produzir etanol. Processos fermentativos de tecnologia de primeira geração tiram vantagem da instalação para hidrolisar a matéria-prima para a produção de um mosto hidrolisado que apresenta uma concentração muito alta de açúcares monoméricos C6, predominantemente glicose, e muito pouco ou nenhum inibidor de levedura, tal como ácido acético. Além disso, nenhuma hemicelulose derivada de açúcares, tal como xilose, está presente na matéria-prima de primeira geração.

[0002] O uso de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica apresenta uma série de problemas de exigência, a maioria deles decorrentes na condução do processo em escala industrial. A maioria dos problemas está relacionada com tornar o processo economicamente viável; outros estão ligados a características específicas do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica que tornam a utilização de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica mais difícil do que no caso de um hidrolisado de primeira geração.

[0003] Um primeiro inconveniente na fermentação de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é a presença de açúcares monoméricos C5, principalmente xilose. Xilose é conhecida por ser difícil ou impossível de ser convertida por enzimas naturais e leveduras, e coquetéis

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2/40 especiais de enzimas geneticamente modificadas e leveduras têm sido engenheirados para converter a porção hemicelulósica. Mesmo com levedura geneticamente modificada para tornar possível fermentar tanto glicose quanto xilose, a conversão de xilose é lenta.

[0004] Uma segunda desvantagem na fermentação de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é a baixa concentração de açúcar de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, que é tipicamente menor que 100 g de açúcares totais por kg de hidrolisado em base úmida. Sob baixa concentração de açúcar, a taxa de absorção de açúcares pela levedura é lenta e, desse modo, é facilitada a propagação de contaminantes biológicos, tais como bactérias, que consomem uma parte relevante dos açúcares disponíveis para produzir bioprodutos não desejados, tal como ácido láctico. O problema é ainda reforçado pela taxa de conversão lenta de xilose pela levedura. Desse modo, a esterilização do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica por meio de agentes químicos ou bioquímicos, tais como antibióticos, ou por meio de agentes físicos, tais como calor ou luz, é frequentemente praticada, aumentando a totalidade dos custos.

[0005] Uma terceira desvantagem na fermentação de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é a presença de compostos inibidores no hidrolisado. Compostos tais como ácido acético, ácido fórmico, furfural, que são tipicamente produzidos no pré-tratamento ou hidrólise da matéria-prima lignocelulósica, reduzem a capacidade da levedura em absorver açúcares, ou pelo menos a taxa de absorção. Remoção de compostos inibidores em várias fases a montante para a conversão de levedura é frequentemente praticada, aumentando de novo a totalidade dos custos.

[0006] Um importante problema em um processo de fermentação de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é reduzir a quantidade de levedura totalmente necessária, o que tem um grande impacto no

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3/40 custo do produto final. Para resolver o problema, uma etapa de propagação é normalmente praticada, na qual a levedura é inserida em um meio de propagação em condições que promovem o crescimento da levedura, permitindo desse modo produzir mais células de levedura a serem usadas em um processo de fermentação seguinte. A propagação pode ser realizada em modo em lote, em lote com alimentação e contínuo. Embora a propagação de uma levedura em um meio de propagação que compreende açúcares sintéticos -tanto xilose quanto glicose tem sido demonstrada ser eficaz em escala de laboratório, têm sido propostas diferentes abordagens para propagar a levedura em um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica para reduzir os custos de meio de propagação.

[0007] Tipicamente, todo o processo para a conversão de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em produtos de fermentação é separado em uma ou mais etapas de propagação, seguidas por uma ou mais etapas de fermentação. A propagação e as etapas de fermentação são especializadas para produzir um produto específico. A etapas de propagação é conduzida de modo a dedicar a quantidade máxima permitida de carbono no meio de propagação para produzir células de levedura, minimizando a quantidade de carbono convertido em outros produtos, tal como etanol, que são considerados subprodutos na etapa de propagação. A etapa de fermentação é conduzida, em vez de disso, maximizar a quantidade do carbono no meio de fermentação para produzir etanol, que é o produto final da fermentação, por meio da levedura propagada na etapa de propagação. A etapa de propagação é conduzida em condições aeróbicas, desse modo o ar sob um fluxo elevado tem de ser inserido no hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica tem de ser agitado sob alta intensidade para promover o contato da levedura com ar. O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é com frequência produzido em forma de

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4/40 pasta; assim, é difícil e caro ser agitado. A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ser separada em um componente líquido que compreende água e glicose e xilose solúveis em água e um componente sólido que compreendendo matéria-prima lignocelulósica pré-tratada insolúvel em água, novamente aumentando os custos do processo.

[0008] WO2009155633A1 descreve a utilização de um substrato que compreende material contendo composto C5, na cultura da levedura Saccharomyces ou na produção de um produto de levedura Saccharomyces, em que o material contendo composto C5 é: (a) material contendo composto C5 obtido de hidrolisado lignocelulósico; (b) material contendo composto C5 obtido a partir da fermentação de hidrolisado lignocelulósico; ou (c) uma mistura de (a) e (b). O pedido de patente também descreve um método de produção de biomassa de levedura Saccharomyces ou um produto de levedura Saccharomyces usando o substrato, o método compreendendo a incubação de um substrato que compreende um material contendo composto C5 com uma levedura Saccharomyces em condições que levam ao crescimento da levedura Saccharomyces ou à produção do produto. Portanto, o pedido de patente é omisso sobre problemas específicos e soluções afins envolvidos na propagação de leveduras em um hidrolisado lignocelulósico.

[0009] WO2014072232A1 descreve um processo para a propagação aeróbica de levedura no qual a levedura é cultivada em um reator, compreendendo as etapas de: a) encher o reator com uma fonte de carbono e uma população inicial de levedura, b) opcionalmente cultivar a população inicial de levedura no reator em modo em lote, c) medir o pH no reator, d) adicionar hidrolisado lignocelulósico ao reator em modo em lote com alimentação sob uma taxa de forma a ajustar o pH no reator em um valor predeterminado, e e) após propagação suficiente, isolar levedura do reator. A fonte de carbono da etapa a) pode ser hidrolisado

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5/40 lignocelulósico diluído, em que a diluição do hidrolisado lignocelulósico é proporcionada para reduzir os efeitos de compostos inibidores do hidrolisado lignocelulósico. Controlar um crescimento em modo em lote com alimentação é difícil em escala industrial e aumenta os custos, bem como manter condições aeróbicas em um processo de propagação em um hidrolisado lignocelulósico, o que requer forte agitação e elevado fluxo de ar. Além disso, o pedido de patente não reconhece a presença de contaminantes biológicos como crítica na etapa de propagação. Notadamente, afirma que contaminação bacteriana ou por levedura selvagem é raramente um problema durante a propagação, porque tanques de propagação de levedura são menores e podem ser mais facilmente limpos do que tanques de fermentação. Além da limpeza, produtos antibacterianos podem ser adicionados para impedir o crescimento de micróbios indesejados.

[00010] US8450094 descreve um método de propagação de uma levedura em um meio de propagação, no qual xilose é alimentada ao meio como fonte de carbono para o crescimento de massa celular. Uma primeira massa de células é propagada sob condições aeróbicas com um fluxo de ar de pelo menos 1,0 volume de ar por volume de meio por minuto em uma segunda massa de células, que é opcionalmente propagada em uma etapa seguinte em uma terceira massa celular. O método sequencial descrito na patente para a produção de uma quantidade razoável de levedura requer longos tempos de propagação em condições favoráveis a contaminantes biológicos, exigindo desse modo a esterilização da fonte de carbono.

[00011] Há assim a necessidade de um processo industrial para produzir um produto de fermentação a partir de um hidrolisado de matériaprima lignocelulósica em forma de pasta, em que ao mesmo tempo é produzida a maioria da levedura necessária. Acredita-se que o processo descrito supera as desvantagens acima mencionadas na utilização de

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6/40 uma pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, proporcionando uma solução de custo eficaz para produzir um produto de fermentação a partir de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em escala industrial.

SUMÁRIO [00012] Este relatório descreve um processo para produzir um produto de fermentação a partir de uma pasta de hidrolisado de matériaprima lignocelulósica que compreende água, glicose solúvel em água e xilose solúvel em água, e matéria-prima lignocelulósica pré-tratada insolúvel em água, compreendendo o processo as etapas de: criar um primeiro meio de conversão que compreende uma primeira porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e uma levedura capaz de converter glicose e xilose em uma levedura de propagação e um produto de fermentação; permitir que a levedura converta pelo menos 50% da glicose solúvel em água e menos de 20% da xilose solúvel em água do primeiro meio de conversão em uma primeira levedura propagada e uma primeira porção do produto de fermentação em uma primeira etapa de conversão que apresenta uma taxa de conversão açúcar-células em uma faixa de 5% a 25%, em que a primeira taxa de conversão açúcar-células é uma razão em peso por cento da glicose e xilose convertidas na levedura propagada na primeira etapa de conversão para a glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas no primeiro meio de conversão, com base em carbono; criar um segundo meio de conversão que compreende pelo menos uma porção da primeira levedura propagada e uma segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica; permitir que a levedura converta pelo menos uma porção da glicose e da xilose solúveis em água no segundo meio de conversão em pelo menos uma segunda levedura propagada e uma segunda porção do produto de fermentação em uma segunda etapa de conversão que tem uma segunda taxa de conversão

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7/40 açúcar-células que é inferior à primeira taxa de conversão açúcar-a-células, em que a segunda taxa de conversão açúcar-células é uma razão em peso por cento da glicose e xilose solúveis em água convertidas na levedura propagada na segunda etapa de conversão para glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas no segundo meio de conversão, com base em carbono.

[00013] É também descrito que a primeira etapa de conversão pode compreender pelo menos uma primeira fase que é uma fase aeróbia e uma segunda fase que é uma fase anaeróbia, em que a fase aeróbia é conduzida durante um tempo de um intervalo de 3 horas a 12 horas.

[00014] É ainda descrito que a primeira etapa de conversão pode ser conduzida durante um primeiro tempo de conversão que é menor do que um valor selecionado do grupo que consiste em 30 horas, 20 horas, 15 horas e 10 horas.

[00015] É também descrito que a primeira etapa de conversão pode ser conduzida inserindo ar sob uma vazão que se situa em uma faixa selecionada do grupo que consiste em 0,1 vvh a 10 vvh, de 0,1 vvh a 5 vvh, e de 0,5 vvh a 3 vvh.

[00016] É ainda descrito que a primeira etapa de conversão pode ser conduzida misturando o primeiro meio de conversão sob uma densidade de potência por peso menor que 100 W/tonelada do primeiro meio de conversão em base úmida.

[00017] É também descrito que a primeira taxa de conversão açúcarcélulas pode se situar em uma faixa selecionada do grupo que consiste em 5% a 20% e de 10% a 20%.

[00018] É ainda descrito que a segunda etapa de conversão pode ser conduzida em condições anaeróbias durante pelo menos 80% do segundo tempo de conversão.

[00019] É também descrito que a segunda etapa de conversão pode ser conduzida durante um segundo tempo de conversão que é maior do

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8/40 que o primeiro tempo de conversão e menor do que um valor selecionado do grupo que consiste em 72 horas, 60 horas e 50 horas.

[00020] É ainda descrito que pelo menos 80% da glicose solúvel em água e da xilose em solúvel em água podem ser convertidos na segunda etapa de conversão.

[00021 ] É também descrito que a segunda taxa de conversão açúcarcélulas pode ser maior do que 2%.

[00022] É ainda descrito que a matéria seca do primeiro e segundo meios de conversão pode ser inferior a 30% e maior do que um valor percentual selecionado do grupo que consiste em 5%, 10%, 15% e 20%. [00023] É também descrito que o primeiro meio de conversão e o segundo meio de conversão podem adicionalmente compreender uma fonte de nitrogênio.

[00024] É ainda descrito que nenhuma vitamina e/ou oligoelementos podem ser adicionados ao processo.

[00025] É também descrito que a pasta de hidrolisado de matériaprima lignocelulósica pode não ser submetida a qualquer esterilização. [00026] É ainda descrito que a primeira etapa de conversão pode ter uma densidade de levedura de partida entre 1 x 10⁶ e 1 x 10⁸ células de levedura por miligrama do primeiro meio de conversão em base úmida. [00027] É também descrito que a primeira etapa de conversão pode ter uma densidade de levedura final que se situa entre 1 x 10⁷e 1 x 10⁹ células de levedura por miligrama do primeiro meio de conversão em base úmida.

[00028] É ainda descrito que a segunda etapa de conversão pode ter uma densidade de levedura de partida que é maior do que a densidade de levedura de partida da primeira etapa de conversão.

[00029] É também descrito que a primeira etapa de conversão e a segunda etapa de conversão podem ser conduzidas em recipientes separados.

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9/40 [00030] É ainda descrito que o produto de fermentação pode ser etanol.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [00031] A FIGURA 1 é a curva de saturação de oxigênio na primeira etapa de conversão de dois testes experimentais em escala de laboratório.

[00032] A FIGURA 2 é a curva de saturação de oxigênio na segunda etapa de conversão de dois testes experimentais em escala de laboratório.

DESCRIÇÃO DETALHADA [00033] Este relatório descreve um processo que compreende pelo menos duas etapas de conversão sequenciais de uma pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em um produto de fermentação por meio de uma levedura, no qual ao mesmo tempo que em cada etapa uma porção da quantidade total de glicose e xilose solúveis em água do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é convertida em células de levedura utilizadas no processo descrito. As células de levedura produzidas na primeira etapa de conversão são chamadas uma primeira levedura propagada e são, em seguida, são usadas na segunda etapa de conversão. Em cada etapa, o produto da fermentação é, assim, o produto de conversão principal, mas a primeira etapa de conversão é realizada em condições mais favoráveis à propagação de levedura do que na segunda etapa de conversão. Desse modo, na primeira etapa de conversão a percentagem da quantidade total de glicose solúvel em água e xilose solúvel em água convertidas em levedura é maior do que a percentagem da quantidade total de glicose solúvel em água e xilose solúvel em água convertidas em levedura na segunda etapa de conversão. Em cada etapa de conversão, existe uma taxa de conversão açúcar-células. A taxa de conversão açúcar-células é a razão em percentagem em peso da quantidade de glicose solúvel em água e xilose solúvel

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10/40 em água convertidas em levedura para a quantidade de glicose solúvel em água e xilose solúvel em água que é totalmente convertida nessa etapa com base em carbono e expressa como percentagem, e não em relação à quantidade de glicose e xilose solúveis em água totalmente disponível na etapa. Por questão de clareza, a taxa de conversão açúcar-células da quantidade de glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas na primeira etapa de conversão pode ser menor do que na segunda etapa de conversão. Isso pode ocorrer, por exemplo, no caso em que a primeira etapa de conversão é conduzida por um primeiro tempo de conversão que é mais curto do que o tempo de conversão da segunda etapa de conversão. Mas, em relação à respectiva fracção convertida de glicose e xilose solúveis em água, propagação de levedura na primeira etapa de conversão é mais favorável do que na segunda etapa de conversão. A glicose e xilose solúveis em água que não são convertidas na primeira etapa de conversão não são desperdiçadas, uma vez que são preferencial mente introduzidas e convertidas na segunda etapa de conversão.

[00034] De acordo com um aspecto, o processo descrito proporciona uma solução que pode ser implementada em escala industrial, superando os problemas que ocorrem em uma planta de conversão real.

[00035] De acordo com outro aspecto, o processo descrito permite produzir a levedura necessária para a produção do produto de fermentação, partindo de uma pequena quantidade de levedura, reduzindo assim sensivelmente os custos de fermentação.

[00036] De acordo com um aspecto adicional, no processo descrito a propagação de levedura ocorre sobre uma pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica já disponível na planta de conversão, evitando desse modo ou reduzindo grandemente os custos associados a fontes de carbono caras.

[00037] De acordo com um aspecto adicional, o processo descrito

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11/40 permite a utilização de uma pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica que pode conter contaminantes biológicos em um nível não desprezível, sem o uso de qualquer agente ou procedimento de esterilização.

[00038] De acordo com um aspecto adicional, o processo descrito pode ser conduzido sem o uso de vitaminas e outros nutrientes dispendiosos.

[00039] No contexto da presente descrição, a expressão conversão de um açúcar solúvel em água é usada para indicar um processo para produzir um produto geral a partir do açúcar solúvel em água; o produto geral compreende um produto de propagação, que é uma nova biomassa de levedura, e um produto de fermentação, tal como etanol.

[00040] No contexto da presente descrição, por propagação de uma levedura, ou crescimento de levedura, ou produção de uma levedura, entende-se o processo de aumentar a quantidade de levedura, ou biomassa de levedura, obtida alimentando uma quantidade inicial de levedura com uma fonte de carbono e opcionalmente outros nutrientes em condições adequadas. O aumento da quantidade de biomassa de levedura ou de levedura ocorre elevando o número de células de levedura total mente produzidas, e pode ser verificado mediante determinação da densidade de células no início e no final da(s) etapa(s) de propagação ou etapa(s) de conversão, ou durante a etapa ou etapas de propagação ou conversão. A densidade celular pode ser determinada contando as células de levedura presentes em amostras representativas do meio de conversão em momentos diferentes da etapa ou etapas de propagação.

[00041 ] A levedura do processo descrito é capaz de fermentar não apenas açúcares monoméricos C6, de preferência glicose, mas também açúcares monoméricos C5, preferencial mente xilose. Como uma levedura que ocorre naturalmente não é tipicamente capaz de assimilar xilose, a

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12/40 levedura utilizada no processo descrito é de preferência uma levedura que não ocorre naturalmente ou derivada de uma levedura que não ocorre naturalmente.

[00042] O termo levedura de ocorrência não natural significa que o organismo microbiano tem pelo menos uma alteração genética que não é normal mente encontrada em uma cepa de ocorrência natural das espécies mencionadas, incluindo cepas que ocorrem naturalmente das espécies mencionadas, a fim de tornar a levedura que ocorre naturalmente capaz de fermentar tanto glicose quanto xilose. As alterações genéticas podem incluir, por exemplo, modificações que introduzem ácidos nucleicos passíveis de expressão que codificam polipeptídios metabólicos, outras adições de ácidos nucleicos, supressões de ácidos nucleicos e/ou outra perturbação funcional do material genético da levedura. Tais modificações podem incluir, por exemplo, regiões de codificação e seus fragmentos funcionais, para polipeptídios heterólogos, homólogos ou tanto heterólogos quanto homólogos para as espécies mencionadas. Modificações adicionais podem incluir, por exemplo, regiões reguladoras não codificadoras em que as modificações alteram a expressão de um gene ou operon.

[00043] A levedura que não ocorre natural mente da presente invenção pode conter alterações genéticas estáveis, que se referem a levedura que pode ser propagada por mais de cinco gerações sem perda da alteração. De um modo geral, as alterações genéticas estáveis incluem modificações que persistem por mais de 10 gerações; particularmente, modificações estáveis persistirão por mais de cerca de 25 gerações, e mais particularmente, modificações genéticas estáveis serão maiores que 50 gerações, incluindo indefinidamente.

[00044] A levedura da presente invenção pode ser selecionada de qualquer gênero e espécie de leveduras conhecidos. As leveduras são descritas, por exemplo, por N.J.W. Kreger-van Rij, The Yeasts, Vol. 1

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13/40 de Biology of Yeasts, Cap. 2, A.H. Rose e J.S. Harrison, Eds. Academic Press, Londres, 1987. Em uma modalidade de realização da presente invenção, a levedura é selecionada do grupo que consiste em Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, P haff la, Rhodotorula, Yarrowia e Schwann io myces. De preferência, a levedura é selecionada de cepas de Saccharomyces cerevisiae.

[00045] No processo descrito, a principal fonte de carbono utilizada é um hidrolisado em forma de pasta derivado de uma matéria-prima lignocelulósica. Uma descrição detalhada de uma matéria-prima lignocelulósica pode ser encontrada em WO2015028156A1, págs. 11-14, que é aqui incorporado como referência. Uma matéria-prima lignocelulósica preferida é selecionada do grupo de resíduos agrícolas, em particular palhas, tais como palha de trigo, palha de arroz, ou bagaço, tal como bagaço de cana-de-açúcar. As madeiras duras e as madeiras macias também se beneficiam desse processo. Opcionalmente, podem também ser usadas outras fontes de carbono, tais como melaço ou açúcares sintéticos, mas os açúcares monoméricos do hidrolisado de matériaprima lignocelulósica são preferencial mente pelo menos 80% em peso, mais preferencial mente pelo menos 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, das fontes de carbono totais utilizadas no processo. Em uma modalidade de realização ainda mais preferida, o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é a única fonte de carbono usada no processo descrito para a propagação da levedura.

[00046] A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é de preferência derivada da matéria-prima lignocelulósica por meio de um processo multietapas que compreende pré-tratar a matéria-prima lignocelulósica para produzir uma matéria-prima lignocelulósica pré-tratada

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14/40 e submeter a matéria-prima lignocelulósica pré-tratada a hidrólise enzimática. O pré-tratamento aumenta a acessibilidade dos hidratos de carbono contidos na matéria-prima à ação de enzimas. Um pré-tratamento preferido compreende tratar hidrotermicamente a matéria-prima lignocelulósica com água na fase de vapor em um reator pressurizado, e explodir com vapor a matéria-prima tratada hidrotermicamente liberando rapidamente a pressão aplicada à matéria-prima. O tratamento hidrotérmico é conduzido de preferência a uma temperatura em um intervalo de 130Ό a 230Ό durante um tempo de 1 minuto a 180 mi nutos. O reator é preferencial mente pressurizado por vapor a uma pressão de pelo menos 1 MPa para obter uma ruptura eficaz da matéria-prima.

[00047] Em uma modalidade de realização da presente invenção, a matéria-prima lignocelulósica é submetida a um processo ou etapa de imersão para remover uma parte de compostos não lignocelulósicos contidos na matéria-prima lignocelulósica bruta, tais como sais inorgânicos, ceras e ácidos orgânicos, antes de ser hidrotermicamente tratada no reator pressurizado. Na etapa ou processo de imersão, contaminantes externos, tais como terra, pedras e resíduos de colheita, também podem ser separados. O processo de imersão compreende preferencialmente introduzir a matéria-prima lignocelulósica em um líquido de impregnação compreendendo água a uma temperatura de 20Ό a 100Ό, mais preferivelmente de 40Ό e 70Ό, e durante um t empo de impregnação que é de 30 segundos a 30 minutos, mais preferivelmente de 3 minutos a 15 minutos.

[00048] Opcionalmente, a matéria-prima lignocelulósica é submetida a um tratamento hidrotérmico preliminar em água ou um líquido que compreende água, para solubilizar uma porção dos hidratos de carbono insolúveis em água contidos na matéria-prima lignocelulósica, antes de ser introduzida no recipiente do reator pressurizado. O tratamento hidrotérmico preliminar é conduzido em condições pressurizadas na presença de água

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15/40 em fase vapor ou fase líquida, ou uma mistura de ambas, a uma temperatura de 100Ό a 190Ό, de preferência de 130Ό a 18 0Ό, e mais preferencialmente de 140Ό a 170Ό. O tratamento hidroté rmico preliminar é conduzido durante um tempo na faixa de 10 minutos a 3 horas, de preferência de 15 minutos a 3 horas, e mais preferencial mente de 20 minutos a 60 minutos. O tratamento hidrotérmico preliminar solubiliza principalmente o componente hemicelulósico da matéria-prima lignocelulósica, que pode ser submetida a degradação térmica a temperatura mais alta, e um líquido que compreende água e polímeros e oligômeros de xilose solúveis em água e opcionalmente outros açúcares derivados de hemicelulose é desse modo separado da matéria-prima lignocelulósica sólida.

[00049] A matéria-prima lignocelulósica pré-tratada é submetida a hidrólise enzimática para hidrolisar os açúcares poliméricos e oligoméricos em açúcares monoméricos, compreendendo glicose e xilose. A hidrólise enzimática compreende contatar a matéria-prima lignocelulósica pré-tratada em forma de pasta com uma enzima ou composição de enzima, em condições que promovem a atividade enzimática. Desse modo, uma pasta da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada é proporcionada misturando a matéria-prima lignocelulósica pré-tratada com um líquido que compreende água para ter um teor de matéria seca preferencialmente entre 10% e 25%; opcionalmente, quando é praticado o tratamento hidrotérmico preliminar, pode também ser usada pelo menos uma porção do líquido produzido que compreende água e polímeros e oligômeros de xilose solubilizados nela. A hidrólise enzimática é tipicamente conduzida sob um pH entre 4,5 e 5, a uma temperatura entre 45^QC e 55^QC e por um tempo de hidrólise de 24 horas a 72 horas, sob agitação de mistura.

[00050] A hidrólise enzimática pode ser realizada em uma ou mais etapas. De preferência, a hidrólise enzimática é realizada em duas etapas em recipientes de hidrólise separados. Nas primeiras etapas de hidrólise, que

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16/40 é conduzida durante um tempo entre 12 horas e 30 horas em um primeiro recipiente, uma hidrólise parcial da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada é obtida para alcançar a liquefação da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada, obtendo assim uma mistura parcialmente hidrolisada que tem uma viscosidade mais baixa que a pasta inicial. A mistura parcialmente hidrolisada é então deslocada para um segundo recipiente de hidrólise, em que uma segunda etapa de hidrólise é continuada durante um tempo entre 12 horas e 60 horas para obter a pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, compreendendo água, matéria-prima lignocelulósica prétratada residual insolúvel em água e glicose e xilose solúveis em água compreendendo glicose e xilose. A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode compreender adicional mente outros açúcares monoméricos solúveis em água C6 e C5, tipicamente em concentração mais baixa do que a de glicose e de xilose, respectivamente.

[00051] Ainda mais preferencial mente, a hidrólise enzimática é realizada de acordo com o ensinamento de WO2010113130, que é aqui incorporado como referência.

[00052] Pelo menos uma porção da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água pode ser removida da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica. Separação de matériaprima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água pode ser obtida, por exemplo, por decantação, centrifugação ou prensagem da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, ou uma combinação das mesmas. No entanto, mesmo que a presença de matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água no processo de propagação descrito possa dar origem a problemas de mistura, alguns açúcares monoméricos solúveis em água impregnados nos sólidos residuais podem se perder na etapa de separação; desse modo, em uma modalidade de realização preferida da presente invenção nenhuma remoção de sólido é praticada.

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17/40 [00053] O processo ou processos descritos acima para derivar a pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica da matéria-prima lignocelulósica são modalidades de realização exemplares e preferidas da presente invenção para fornecer a pasta de hidrolisado de matériaprima lignocelulósica usada como a fonte de carbono principal para a produção de um produto de fermentação de acordo com o processo descrito, e entende-se que elas não se destinam a limitar de qualquer forma o escopo da invenção.

[00054] A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ter um teor de matéria seca compreendida entre 5% e 30%, de preferência entre 10% e 20%.

[00055] A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica tem uma concentração de glicose que pode situar-se na faixa de 20 g/kg a 100 g/kg da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em base úmida, de preferência de 30 g/kg a 70 g/kg, e ainda mais preferencialmente de 40 g/kg a 50 g/kg.

[00056] A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica tem uma concentração de xilose que pode situar-se na faixa de 10 g/kg a 40 g/kg da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em base úmida, de preferência de 15 g/kg a 30 g/kg, e ainda mais preferencialmente de 20 g/kg a 25 g/kg.

[00057] A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode compreender ainda compostos inibidores selecionados das listas de ácido acético, ácido fórmico, furfural e hidroximetil furfural (5-HMF), que se formam em etapas ou processos de pré-tratamento e de hidrólise anteriores e inibem o crescimento da levedura, levando pelo menos a um retardamento na taxa de crescimento.

[00058] Particularmente, o ácido acético pode ter uma concentração que se situa na faixa de 2 g/kg a 7 g/kg da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em base úmida.

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18/40 [00059] A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ainda conter contaminantes biológicos, como normalmente ocorre na operação em escala industrial. Contaminantes biológicos são microrganismos diferentes da levedura que deve ser propagada de acordo com o processo descrito e cuja presença é em geral prejudicial ao rendimento do processo descrito, consumindo uma parte dos açúcares monoméricos totalmente disponíveis para o crescimento da levedura desejada. Contaminantes biológicos podem incluir bactérias e fungos, assim como leveduras diferentes da levedura desejada a ser propagada, tais como leveduras do tipo selvagem. Bactérias de ácido láctico, em particular, espécies Lactobacillus, são os contaminantes bacterianos primários. As concentrações de ácido láctico de misturas de fermentação são geralmente tomadas como uma medida do grau de contaminação. A contaminação biológica tem sido controlada por meio de esterilização do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, meios de conversão e equipamentos envolvidos no processo, o que pode ser obtido mediante adição de agentes antibacterianos, tais como antibióticos ou outros agentes assépticos, ou por procedimentos de esterilização, tal como pasteurização, aplicando agentes físicos, incluindo, entre outros, calor, luz e radiação, antes, entre ou durante o curso das operações de fermentação/propagação. Por esterilização considera-se aqui a redução da densidade de contaminantes biológicos por um fator de pelo menos 100. O uso de agentes antibacterianos e procedimentos de esterilização, o que introduz custos adicionais, é preferencial mente evitado no processo descrito, ao mesmo tempo que mantém o crescimento de contaminantes biológicos em um nível baixo razoável.

[00060] De preferência, o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica não é submetido a qualquer etapa ou procedimento de esterilização, que seriam difíceis e caros de praticar em escala industrial.

[00061] Preferencialmente, nenhum agente antibacteriano é usado

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19/40 no processo descrito, nem é adicionado ao hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica antes do processo descrito.

[00062] O processo descrito compreende pelo menos duas etapas de conversão, que podem ser conduzidas em um único recipiente ou em dois recipientes separados. A fim de minimizar os custos, o recipiente ou recipientes preferencial mente não são submetidos a qualquer esterilização e/ou limpeza entre e/ou durante as etapas de conversão. De preferência, cada etapa de conversão é conduzida em modo em lote, em que a pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é adicionada antes de iniciar a etapa de conversão, ou no início da etapa de conversão.

[00063] Um primeiro meio de conversão compreendendo uma primeira porção do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e uma quantidade de partida de levedura é criado primeiramente. Para limitar o efeito de crescimento competitivo de contaminantes biológicos, em uma modalidade de realização preferida, a pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é mantida a uma temperatura de 45Ό a 55Ό antes de ser utilizada no processo descrito, e ainda mais preferencialmente à temperatura da hidrólise enzimática ou da etapa de hidrólise enzimática final. Nessa temperatura, a atividade dos contaminantes biológicos é significativamente reduzida. A temperatura da porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica utilizada na primeira etapa de conversão é reduzida à temperatura da primeira etapa de conversão, que se situa preferencial mente na faixa de 28Ό a 35Ό. Trocadores de calor podem ser usados para resfriar a primeira porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica à temperatura da primeira etapa de conversão no primeiro recipiente de conversão ou antes de entrar no primeiro recipiente de conversão.

[00064] Água ou um líquido que compreende água e quantidades limitadas opcionais de fontes de carbono adicionais diferentes da pasta

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20/40 de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica podem ser usados para atingir o teor de matéria seca desejada. Uma das vantagens oferecidas pelo processo descrito é a possibilidade de ser realizado em uma matéria seca que é maior do que outros processos conhecidos que utilizam uma pasta de hidrolisado lignocelulósico como principal fonte de carbono. O teor de matéria seca em peso do primeiro meio de conversão é de preferência inferior a 30%, uma vez que seria difícil ser agitado, e é preferencial mente maior que 5%, mais preferivelmente maior que 10%, ainda mais preferivelmente maior que 15%, mais preferivelmente maior que 20%. A água ou o líquido que compreende água pode ser adicionada sob uma temperatura que é inferior à temperatura da primeira conversão para resfriar a primeira porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica.

[00065] Portanto, a densidade de contaminantes biológicos no primeiro meio de conversão no início da primeira etapa de conversão pode ser mantida em um nível razoável, que pode se situar em uma faixa de 10° UFC/ml a 10⁶ UFC/ml, preferivelmente de 10¹ UFC/ml a 10⁵ UFC/ml, e ainda mais preferivelmente de 10² UFC/ml a 10³ UFC/ml, do primeiro meio de conversão.

[00066] O primeiro meio de conversão pode ainda compreender uma fonte de nitrogênio, tipicamente ureia, que é uma fonte de nutrientes de baixo custo para a levedura, mas é preferencial mente livre de vitaminas e/ou oligoelementos adicionados, que são tipicamente utilizados em escala de laboratório como suplementos para crescimento, mas são extremamente caros. Em outras palavras, preferencial mente vitaminas e/ou oligoelementos não são adicionados à pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e aos meios de conversão durante o processo ou em etapas anteriores do processo.

[00067] Preferencial mente, o pH do meio de conversão é ajustado em um valor de 5,0 a 5,5, por exemplo, adicionando uma quantidade

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21/40 adequada de uma base (solução de NaOH). Se necessário, para manter o pH na faixa desejada, alíquotas adicionais da base podem ser adicionadas durante a primeira etapa de conversão.

[00068] A levedura pode ser adicionada ao primeiro meio de conversão, ou a componentes usados para formar o primeiro meio de conversão. Em uma modalidade de realização da presente invenção, a levedura é adicionada à primeira porção da pasta de hidrolisado de matériaprima lignocelulósica usada para formar o primeiro meio de conversão. A quantidade de levedura em contato com o primeiro meio de conversão variará de acordo com o volume total do primeiro meio de conversão. A levedura pode ser uma levedura fresca produzida em uma etapa de propagação ou conversão prévia. Preferencialmente, na primeira etapa de conversão é adicionada uma quantidade de levedura que tem uma densidade de levedura de partida que se situa entre 1 x10⁶e1 x10⁸células de levedura por miligrama do primeiro meio de cultura, em base úmida. [00069] Na primeira etapa de conversão, a levedura é mantida sob condições que promovem a conversão da glicose e xilose solúveis em água do primeiro meio de conversão em uma primeira levedura propagada e uma primeira porção do produto de fermentação, em que certa quantidade percentual da glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas é dedicada ao crescimento de biomassa de levedura. Desse modo, a primeira etapa de conversão caracteriza-se por uma primeira taxa de conversão açúcar-células, que é a razão percentual em peso de glicose solúvel em água e xilose solúvel em água convertidas na primeira levedura propagada para a quantidade total de glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas no primeiro meio de conversão, com base em carbono, e, uma vez que é uma razão percentual em peso, ela é expressa como percentagem. A primeira razão de conversão entre o açúcar e a célula está em uma faixa entre 5% e 25%, preferencialmente, entre 5% e 20% e, mais preferencial mente, entre 10% e 20%.

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22/40 [00070] Para calcular a taxa de conversão açúcar-células de uma etapa de conversão, a quantidade da glicose e xilose solúveis em água total mente convertidas pode ser calculada subtraindo a concentração de glicose e xilose solúveis em água presentes no meio de conversão ao fim da etapa de conversão. A concentração de açúcar pode ser determinada por análise de CLAE padrão. Claramente, se algum componente é adicionado ou removido do meio de conversão durante a etapa de conversão, ele tem de ser levado em conta na determinação da densidade, como é bem conhecido nas técnicas analíticas. Por exemplo, a água pode ser adicionada em certo tempo para diluir o meio de conversão, ou uma correção do pH é necessária, ou é adicionado açúcar adicional. Em uma modalidade de realização preferida da presente invenção, a pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica compreende ainda enzimas residuais da etapa ou etapas de hidrólise, uma porção das quais ainda está ativa. Mesmo se as condições de conversão não são ótimas para atividade da enzima, uma parte dos hidratos de carbono insolúveis em água na matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água pode ser hidrolisado a glicose e xilose adicionais solúveis em água que são, por conseguinte, disponíveis para a levedura. Também, nesse caso, a quantidade total de glicose e xilose convertidas pela levedura levará em conta a glicose e a xilose adicionais solúveis em água, que pode ser calculada a partir da medição da quantidade de açúcares insolúveis em água na matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água no final e no início da etapa de conversão. A glicose e a xilose solúveis em água totalmente convertidas leva em conta também a absorção de açúcar por contaminantes biológicos.

[00071 ] A densidade de células de levedura em termos de número de células de levedura por unidade de volume pode ser determinada pela contagem de células ou, alternativamente, por meio de medição da

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23/40 transmitância óptica. Uma vez conhecida a densidade da levedura, o peso médio de células de levedura pode ser facilmente calculado medindo o peso de células de levedura em uma amostra de referência que tem uma densidade de levedura de referência.

[00072] A taxa de conversão açúcar-células de uma etapa de conversão é expressa com base em carbono, que é como a relação entre o carbono contido na biomassa de levedura sob uma base seca no final da etapa de conversão e o carbono contido na glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas, em base seca.

[00073] O carbono contido na glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas pode ser derivado pelo teor de carbono na glicose e xilose solúveis em água presentes no meio de conversão no final e no início da etapa de conversão, como medido por análise elementar padrão. Alternativamente, ele pode ser derivado da concentração de glicose e xilose solúveis em água convertidas pela levedura que estão presentes no meio de conversão no final e no início da etapa de conversão, considerando as fórmulas estequiométricas da glicose e xilose solúveis em água.

[00074] O teor de carbono na levedura pode ser medido por análise elementar padrão da levedura seca. Alternativamente, ele pode considerado a conversão da relação de referência açúcar-células que é comumente utilizada no estado da técnica [ver, por exemplo, The Alcohol Textbook, Fifth Edition, W.M. I ng I edew et al., Nottingham University Press, Ethanol Technology, 2009, p. 133), que é de 0,50 g de levedura em base seca por grama de açúcar. Desse modo, se 2 g de glicose são convertidos apenas em levedura, 1 g de levedura em base seca é produzido. Por exemplo, se 1g de levedura é produzido e 10 g de glicose são totalmente convertidos, a taxa de conversão açúcar-células é: taxa de conversão açúcar-células = (1 g de levedura x 2 g de glicose por grama de levedura) /10 g de glicose = 20%.

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24/40 [00075] A mesma taxa de conversão de referência de 0,50 g de levedura em base seca por grama de açúcar é válida também no caso de xilose. Desse modo, é suficiente para medir o peso de levedura produzida, em base seca, e a quantidade de açúcares totais, incluindo glicose e xilose, para calcular facilmente a taxa de conversão açúcar-células de cada etapa de conversão.

[00076] Como é sabido no estado da técnica, as condições aeróbicas aumentam a quantidade de levedura propagada produzida. Condições aeróbicas são caracterizados por uma saturação de oxigênio significativa no meio de conversão que é maior do que 10%. A saturação de oxigênio é a razão entre a concentração de oxigênio dissolvido (O2) no meio de conversão e a quantidade máxima de oxigênio que se dissolve no meio de conversão nessa temperatura e pressão sob equilíbrio estável. Assim, um fluxo de oxigênio, ar ou outra mistura de gases compreendendo oxigênio sob uma vazão de 1 vvm ou mais, é tipicamente inserido no meio de conversão. Para promover a difusão de oxigênio no meio de conversão, agitação ou mistura do meio de conversão também é tipicamente proporcionada, 0 que é difícil ou dispendioso em matéria seca elevada, devido à alta viscosidade do meio de conversão.

[00077] No processo descrito, a primeira taxa de conversão açúcarcélulas no final da primeira etapa de conversão é preferencial mente obtida mantendo condições aeróbicas apenas por uma porção da primeira etapa de conversão. Em outras palavras, em relação à saturação de oxigênio significativa no meio de conversão, a primeira etapa de conversão compreende pelo menos duas fases, uma primeira fase que é uma fase aeróbia, seguida por uma segunda fase que é uma fase anaeróbia. Em uma modalidade de realização preferida da presente invenção, a fase aeróbia ocorre no início da primeira etapa de conversão, e é alcançada inserindo ar sob uma vazão moderada que se situa em uma faixa de 0,1 vvh a 10 vvh, de preferência de 0,1 vvh a 5 vvh, e mais

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25/40 preferencial mente de 0,5 vvh a 3 vvh. A primeira porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é introduzida no primeiro recipiente de conversão por gravidade a partir de uma entrada localizada a uma altura suficiente para criar borbulha na pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica ou meio de conversão já presente no primeiro recipiente de conversão. A primeira porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ser introduzida de modo a formar uma cascata para tirar vantagem da oxigenação natural da pasta de hidrolisado de matéria-prima lenhocelulósica que ocorre durante a transferência no primeiro recipiente de conversão. O nível inicial de saturação do oxigênio é de um valor elevado, sendo de preferência superior a 40%, e ainda mais preferivelmente maior do que 80%, e diminui durante a primeira etapa de conversão, devido à vazão de ar moderada. A vazão de ar moderada é utilizada para retardar a diminuição natural do nível inicial de saturação de oxigênio, a fim de obter uma fase aeróbia que é preferencial mente de 3 horas a 12 horas, mais preferencialmente desde 5 horas até 10 horas, e ainda mais preferencial mente de 7 horas a 8 horas. Durante a primeira etapa de conversão, o primeiro meio de conversão é mantido sob agitação moderada durante pelo menos uma parte do tempo do primeiro tempo de conversão a fim de melhorar a difusão do oxigênio. A agitação pode ser alcançada por meio de dispositivos de mistura mecânicos. A mistura é proporcionada para retardar e homogeneizar a diminuição natural do nível inicial de saturação de oxigênio, e uma potência moderada é suficiente para obter condições aeróbias durante um tempo nas faixas desejadas, mesmo no caso de uma pasta de matéria seca elevada. A potência usada para agitar o primeiro meio de conversão pode ser medida em termos da potência elétrica utilizada para agitar uma tonelada do primeiro meio de conversão em base úmida, que é uma densidade média em peso, e uma densidade de potência em peso média menor que 100 W/tonelada do

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26/40 primeiro meio de conversão em base úmida é preferencial mente utilizada no processo descrito.

[00078] As taxas de absorção de glicose e xilose é um parâmetro importante do processo descrito, especial mente no caso em que o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica compreende alguns contaminantes biológicos e nenhuma esterilização e agentes antibacterianos são usados, uma vez que nessas condições aumenta o crescimento competitivo de contaminantes biológicos. A absorção de glicose pela levedura é preferida em relação à absorção de xilose, desse modo a concentração de glicose no meio de conversão começará a diminuir, aa etapa que a absorção de xilose não prosseguirá de forma significativa até a concentração de glicose diminuir abaixo de um certo valor crítico. À medida que a afinidade da levedura pelos açúcares restantes (glicose e xilose) no meio de conversão diminui, a taxa de absorção total de glicose e xilose combinadas pela levedura diminuirá ao longo do tempo, tornando favorável o crescimento competitivo de contaminantes biológicos. Desse modo, no processo descrito, a primeira etapa de conversão é prolongada por um período de tempo suficiente para consumir pelo menos 50% da glicose contida no meio de conversão de partida e menos de 20% da xilose contida no meio de conversão de partida. Pretende-se que o consumo de glicose e xilose seja o consumo total ocorrido durante a etapa de conversão, e isso pode ser verificado medindo a concentração de açúcar correspondente no meio de conversão. Assim, o consumo total de a glicose e xilose combinadas que ocorre na primeira etapa de conversão inclui também a absorção de glicose e xilose combinadas por contaminantes biológicos, que se pretende seja minimizada no processo descrito, e o açúcar eventual mente convertido no produto de fermentação. Para melhorar o rendimento do processo em termos de biomassa de levedura produzida, preferencialmente a primeira etapa de conversão é conduzida por um primeiro tempo de conversão suficiente para

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27/40 consumir pelo menos 70% da glucose do meio de conversão de partida, e mais preferencial mente pelo menos 80%. Ao mesmo tempo, para evitar que a taxa de absorção total de açúcar atinja um valor crítico para crescimento competitivo de contaminantes biológicos, de preferência a primeira etapa de conversão é prolongada por um primeiro tempo de conversão suficiente para consumir menos de 10% da xilose no meio de conversão de partida, ainda mais preferencial mente menos do que 5%. Observa-se também que, enquanto a quantidade total de xilose consumida na primeira etapa de conversão é preferencial mente maior que 0, em alguns casos a xilose pode não ser apreciável mente consumida, pelo menos na primeira etapa de conversão. A primeira etapa de conversão pode ser conduzida por um primeiro tempo de conversão que é menor que 30 horas, mas preferencial mente menor que 20 horas, mais preferencial mente menor que 15 horas, e ainda mais preferencial mente menor que 10 horas.

[00079] No final da primeira etapa de conversão, um primeiro caldo de conversão é obtido compreendendo água, uma primeira levedura propagada e uma primeira porção do produto de fermentação. A quantidade da primeira levedura propagada que pode ser 5 a 15 vezes a quantidade de levedura de partida correspondente, como resultado das condições aeróbicas impostas durante uma parte do primeiro tempo de conversão. A mesma faixa preferida aplica-se à densidade de células de levedura. De preferência, na primeira etapa de conversão, a densidade de levedura final situa-se entre 1 x 10⁷ e 1 x 10⁹ células de levedura por miligrama do primeiro meio de conversão em base úmida. O primeiro caldo de conversão compreende ainda glicose e xilose solúveis em água não consumidas pela levedura e matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água.

[00080] A primeira levedura propagada é então usada em uma segunda etapa de conversão para converter uma segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica. Em comparação

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28/40 com a primeira etapa de conversão, a segunda etapa de conversão é voltada para a produção do produto de fermentação, mas ao mesmo tempo convertendo uma pequena quantidade de glicose e xilose solúveis em água em uma segunda biomassa de levedura. Ao contrário da primeira etapa de conversão, a segunda etapa de conversão converte a maior parte da glicose e xilose solúveis em água disponíveis, e possivelmente toda a glicose e xilose solúveis em água; desse modo, é necessário um segundo tempo de conversão mais longo do que o primeiro tempo de conversão. A segunda etapa de conversão é conduzida para alcançar um rendimento de conversão de açúcar mais elevado do que na primeira etapa de conversão, e a segunda biomassa de levedura é, por conseguinte, produzida a fim de manter o segundo tempo de conversão tão baixo quanto possível, limitando o crescimento de contaminantes biológicos. A segunda etapa de conversão é realizada de modo a ter uma segunda taxa de conversão açúcar-células que é menor do que a primeira taxa de conversão açúcar-células. A segunda taxa de conversão açúcar-células é de preferência maior do que 2%. Mesmo que certa quantidade limitada de levedura externa ao processo descrito possa ser adicionada na segunda etapa de conversão, prefere-se que apenas a primeira levedura propagada, ou, pelo menos uma parte dela, seja usada. O segundo tempo de conversão é maior do que o primeiro tempo de conversão e de preferência menor que 72 horas, mais preferencialmente menor que 60 horas, e ainda mais preferencial mente menor que 50 horas. Em qualquer caso, é desejável que pelo menos 80% da glicose e xilose solúveis em água totalmente disponíveis no segundo meio de conversão sejam convertidos na segunda etapa de conversão. [00081 ] Um segundo meio de conversão é criado a partir de pelo menos uma porção da primeira levedura propagados e uma segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica. O procedimento usado para formar o segundo meio de conversão é semelhante

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29/40 ao procedimento para formar o primeiro meio de conversão, e as mesmas modalidades de realização preferidas da presente invenção aplicam-se mutatis mutandis à criação do segundo meio de conversão. Em uma modalidade de realização preferida da presente invenção, a primeira levedura propagada não é separada do primeiro caldo de conversão antes de ser usada para criar o segundo meio de conversão, e pelo menos uma porção do primeiro caldo populado e a segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima ligno-celulósica são misturadas em um segundo recipiente de conversão para formar o segundo meio de conversão. A glicose e xilose solúveis em água restantes que não foram convertidas no primeira etapa de conversão estão, por conseguinte, disponíveis para ser convertidas na segunda etapa de conversão e não são desperdiçadas. Nessa modalidade de realização da presente invenção, o segundo meio de conversão no inicio da segunda etapa de conversão compreenderá adicionalmente a primeira porção do produto de fermentação produzido na primeira etapa de conversão. Preferencialmente, a quantidade do primeiro caldo de conversão e a segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica são selecionadas para ter uma densidade de levedura de partida na segunda etapa de conversão que é maior do que a densidade de levedura de partida na primeira etapa de conversão. Uma densidade elevada de levedura de partida é preferida para reduzir o segundo tempo de conversão. A densidade de levedura de partida na segunda etapa de conversão pode situar-se entre 1 x 10⁶ e 1 x 10⁸ células de levedura por miligrama do segundo meio de conversão em base úmida. O primeiro caldo de conversão e a segunda porção da pasta de hidrolisado de matériaprima lignocelulósica são preferencial mente em uma proporção em peso em base úmida de 1:2 a 1:10, e ainda mais preferivelmente de 1:3 a 1:8.

[00082] Como na primeira etapa de conversão, também na segunda

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30/40 etapa de conversão a segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é de preferência mantida a uma temperatura de 45Ό a 55Ό antes de ser usada para criar o segu ndo meio de conversão, para limitar o efeito do crescimento competitivo de contaminantes biológicos.

[00083] Portanto, a densidade de contaminantes biológicos no primeiro meio de conversão no início da segunda etapa de conversão pode ser mantida em um nível razoável, que pode se situar em uma faixa de 10° UFC/ml a 10⁶ UFC/ml, preferivelmente de 10¹ UFC/ml a 10⁵ UFC/ml, e ainda mais preferivelmente de 10² UFC/ml a 10³ UFC/ml, do segundo meio de conversão.

[00084] A fim de manter baixa a segunda taxa de conversão açúcarcélulas, a segunda etapa de conversão é conduzida em condições anaeróbicas, ou predominantemente em condições anaeróbicas, isto é, condições anaeróbias são mantidas durante pelo menos 80% do segundo tempo de conversão. Se estiver presente, uma fase aeróbia pode estar presente de preferência no início da segunda etapa de conversão. Notadamente, de modo semelhante à primeira etapa de conversão, a segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e/ou o primeiro caldo populado são de preferência introduzidos no primeiro recipiente de conversão por gravidade a partir de uma entrada localizada a uma altura suficiente para criar borbulha na pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e/ou meio de conversão já presente no segundo recipiente de conversão. A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ser introduzida de modo a formar uma cascata para tirar vantagem da oxigenação natural da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica que ocorre durante a transferência no segundo recipiente de conversão. De preferência, ar não é introduzido na segunda etapa de conversão.

[00085] Durante a segunda etapa de conversão, o segundo meio de

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31/40 conversão pode ser mantido sob agitação moderada durante pelo menos uma parte do segundo tempo de conversão, a fim de melhorar a homogeneidade da pasta. A agitação pode ser alcançada por meio de dispositivos de mistura mecânicos. A mistura é proporcionada para retardar e homogeneizar a diminuição natural do nível inicial de saturação de oxigênio. Energia é usada para agitar o segundo meio de conversão. Uma densidade de potência média por peso inferior a 100 W/tonelada do segundo meio de conversão em base úmida é preferencialmente usada.

[00086] A segunda etapa de conversão produz um segundo caldo de fermentação em forma de pasta, que compreende água, o produto de fermentação e matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água. O produto de fermentação pode ser separado e recuperado do segundo caldo de fermentação.

Experimentos

Preparação do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica [00087] Palha de trigo foi selecionada para proporcionar o processo descrito.

[00088] Em primeiro lugar, o material de alimentação foi submetido a um processo de pré-tratamento, mediante aplicação de um tratamento hidrotérmico preliminar a uma temperatura de 158Ό durante 65 minutos, com uma primeira solubilização da matéria-prima. O processo gerou uma pasta pré-tratada de matéria-prima, que foi separada em uma porção de líquido, compreendendo principalmente xilo-oligômeros, e uma porção de sólido por meio de uma prensa. A porção sólida foi submetida a um tratamento hidrotérmico com vapor a 204Ό durante 4 minutos, seguido de explosão por vapor, para produzir uma matéria-prima lignocelulósica pré-tratada sólida.

[00089] A matéria-prima lignocelulósica pré-tratada sólida e a porção líquida compreendendo xilo-oligômeros foram misturadas em um biorreator,

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32/40 e água foi adicionada para obter uma pasta de matéria-prima lignocelulósica pré-tratada com um teor de matéria seca de 15% em peso, o pH foi ajustado em 5,0 ± 0,2 por adição de NaOH e, em seguida, a pasta de matéria-prima lignocelulósica pré-tratada foi submetida à hidrólise enzimática.

[00090] Um coquetel enzimático comercial CTec3 da Novozymes, capaz de hidrolisar tanto açúcares C6 quanto açúcares C5, foi adicionado correspondendo a uma dosagem de mg de proteína 7% por grama de glucanos na matéria-prima lignocelulósica pré-tratada e a pasta foi hidrolisada a 50Ό sob agitação contínua durante 72 h oras.

[00091] O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica resultante era uma pasta, possuindo uma matéria seca de 15% em peso, compreendendo uma fração líquida e uma matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água.

[00092] A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica foi mantida à temperatura de 50Ό até sua utilização no s experimentos de propagação seguintes. Nenhum antibiótico foi introduzido.

Experimentos de conversão [00093] O processo descrito foi comprovado tanto em escala de laboratório quanto em escala industrial. Os experimentos foram realizados sem qualquer esterilização entre as etapas de conversão e entre experimentos.

Escala de laboratório

Primeiro experimento de laboratório [00094] Na primeira etapa de conversão, o primeiro meio de conversão foi formado inserindo um volume de 1,2 I de pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósico quente em um primeiro biorreator e completando com solução de ureia sob 1,5 g/Ι. O pH foi ajustado em 5,2 ± 0,1 por controle com NaOH. Não foram usados vitaminas e outros nutrientes. O meio de cultura foi resfriado até 32Ό antes de introduzir a levedura. A matéria seca foi de cerca de 15%. A composição em base

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33/40 úmida do primeiro meio de conversão, correspondendo aproximadamente à composição da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, é apresentada na tabela 1. As composições são dadas em termos de componentes solúveis em água que são relevantes para o processo, e a matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água é separada em seus componentes principais (glucanos insolúveis, xilanos insolúveis e lignina e outros produtos insolúveis). Ácido acético, ácido fórmico, furfural, hidroximetil furfural são compostos inibidores de propagação de levedura.

[00095] Ácido láctico é produzido por contaminação bacteriana e por isso é considerado um marcador da presença de bactérias. Desse modo, certa contaminação biológica estava presente no hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica.

[00096] Primeira etapa de conversão foi realizada sob agitação, misturando o meio de cultura com um rotor a 300 rpm, em configuração de batelada, inserindo um fluxo de ar de 1 VVh. VVh corresponde ao volume de gás que fluindo por volume de meio de conversão por hora.

[00097] A densidade de células de levedura foi determinada por contagem de células (câmara de contagem de células Neubauer) e a composição do primeiro meio de conversão foi analisada por CLAE para determinar a concentração de glicose e xilose residuais e compostos essenciais para a propagação de levedura. Ambas as medições foram realizadas no início e no final da etapa de conversão.

[00098] Uma levedura comercial geneticamente modificada CelluX™2 distribuída por Leaf Technologies, capaz de fermentar glicose e xilose, foi inserida no primeiro meio de conversão sob uma densidade de levedura de partida de 1,3 x 10⁷ células de levedura por miligrama do primeiro meio de conversão, correspondendo a 0,2 g de levedura em base seca por grama do primeiro meio de conversão.

[00099] Primeira etapa de conversão foi conduzida durante um primeiro

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34/40 tempo de conversão de 14 horas para levar em conta a fase de latência inicial necessária para permitir que a levedura se adapte ao meio de conversão. A saturação de oxigênio, pC>2, foi medida durante a etapa de conversão por meio de uma sonda de pC>2 Mettler Toledo In Probe 6820 inserida no meio de conversão após calibração e é apresentada na Figura 1. pC>2 permaneceu em um nível quase estável perto de cerca de 70% por cerca de 3 horas, indicando que a levedura era quase inativa como esperado durante a fase de latência; em seguida, diminuiu progressivamente para 10% em cerca de 6,5 horas.

[000100] Uma concentração de células de levedura de 1,5 x 10⁸ células de levedura por miligrama foi obtida no primeiro caldo de conversão. Desempenhos de crescimento foram avaliados calculando um fator de crescimento, que é a relação entre as concentrações de células de levedura no final e no início da conversão. Um fator de crescimento de cerca de 11,5 foi obtido na primeira etapa de conversão, correspondendo a cerca de 2 g de levedura em base seca por kg do primeiro meio de conversão.

[000101] A composição do primeiro caldo de conversão é apresentada na tabela 1. Apesar da presença de enzimas remanescentes da etapa de hidrólise anterior, a elevada concentração de açúcar no caldo de conversão inibiu hidrólise adicional dos açúcares oligoméricos e dos glucanos e xilanos insolúveis.

[000102] Cerca de 33,9 g/kg de glicose foram convertidos (correspondendo a cerca de 76% da glicose inicial) e cerca de 1,3 g/kg de xilose (correspondendo a cerca de 7% da xilose inicial) foram consumidos na primeira etapa de conversão. Considerando a taxa de conversão de referência de 0,50 g de levedura por grama de açúcar, cerca de 4,2 g de açúcares do primeiro meio de conversão foram assim convertidos em levedura, por kg de meio de cultura, com uma taxa de conversão açúcarcélulas de cerca de 11%.

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35/40 [000103] A concentração de ácido láctico não aumentou significativamente, indicando que a propagação de bactérias contaminantes estava em níveis razoáveis. Certa quantidade de etanol também foi produzida. Tabela 1. Composição dos meios de conversão de partida (t = 0 h) e dos caldos de conversão (t = 14 h, t = 6 h) das experiências em escala de laboratório.

		Concentração [g/kg]
		Primeiro experimento em escala de laboratório	Segundo experimento em escala de laboratório
		Primeira etapa de conversão	Segunda etapa de conversão	Primeira etapa de conversão	Segunda etapa de conversão
		t = 0 h	t = 14 h	t = 0 h	t = 48 h	t = 0 h	t = 6 h	t = 0 h	t = 48 h
Componentes solúveis em água	glicose	44,49	10,6	34,64	0,01	38,08	12,77	33,98	0,11
xilose	17,86	16,57	16,54	0,8	18,09	17,07	15,97	0,73
glicerol	0,29	1,79	0,63	1,95	0,71	1,54	0,44	1,96
ácido fórmico	0,71	0,85	0,87	0,55	0,93	0,7	0,8	0,9
ácido lác- tico	0,19	0,22	0,24	0,27	0,2	0,24	0,26	0,26
ácido acé- tico	2,49	2,18	2,24	1,82	2,44	2,14	2,24	1,85
etanol	0	16,75	3,35	27,09	3,78	15,46	3,09	27,18
5-HMF	0,06	0,01	0,04	0	0,04	0,02	0,04	0
furfural	0,05	0	0,04	0	0,02	0	0,03	0
Oligômeros de glicose	7,44	5,38	7,38	5,21	7,03	6,82	7,32	5,80
Oligômeros de xilose	5,68	4,82	5,72	5,33	5,51	5,23	5,59	4,90
Componentes insolúveis em áqua	Glucan os insolúveis	18,62	18,60	18,63	15,51	18,62	18,65	18,63	16,89
Xilanos insolúveis	2,46	2,46	2,46	2,45	2,46	2,45	2,46	2,24
Lignina e outros insolúveis	49,8	50,4	49,8	50,1	49,9	50,0	49,8	50,1

[000104] Na segunda etapa de conversão, uma alíquota de 960 ml de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica quente foi introduzida em

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36/40 um segundo biorreator, idêntico ao primeiro biorreator, resfriada a cerca de 32Ό, em seguida um volume de 240 ml do primeiro caldo de conversão foi adicionado para formar o segundo meio de conversão. O pH foi ajustado em 5 ± 0,1 por uma solução de NaOH e suplementado com uma solução de ureia sob 1,0 g/l. Desse modo, na segunda etapa de conversão, o volume do primeiro caldo de conversão foi de cerca de 1:5 do volume total do segundo meio de conversão. A composição do segundo meio de conversão é apresentado na Tabela 1. Deve-se observar que o segundo meio de conversão contém um pouco de etanol primeiro caldo de conversão diluído com pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica fresca; a concentração de etanol foi suficientemente baixa para não criar problemas na segunda etapa de conversão. A concentração de partida de de glicose e xilose foram menores do que na primeira etapa de conversão, uma vez que alguns açúcares foram consumidos.

[000105] A densidade de levedura de partida foi de cerca de 3,2 x 10⁷ células de levedura por miligrama do segundo meio de conversão, correspondendo a cerca de 0,5 g de levedura em base seca por grama do segundo meio de conversão. A concentração pC>2 da segunda etapa de conversão, registrada na Figura 1, diminuiu de 50% a 10% em cerca de 2 horas.

[000106] A segunda conversão foi realizada durante 48 horas, na ausência de fluxo de ar, em configuração de batelada, mantendo uma temperatura de 32Ό sob agitação a 300 rpm. Na segunda etapa de conversão, hidrólise enzimática da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água foi continuada pelas enzimas contidas no hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e alguns açúcares adicionais foram disponibilizados para a levedura.

[000107] Uma concentração de células de levedura de 1,6 x 10⁸ células de levedura por miligrama foi obtida no segundo caldo de conversão,

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37/40 assim, foi obtido um fator de crescimento de cerca de 5, correspondendo a cerca de 2,5 g de levedura em base seca por kg do segundo meio de conversão.

[000108] As composições do segundo caldo de conversão mostra que quase todos os açúcares monoméricos no segundo meio de conversão foram consumidos pela levedura propagada, bem como açúcares monoméricos adicionais hidrolisados na segunda etapa de conversão, o que manteve sua capacidade de fermentar tanto glicose quanto xilose. Cerca de 55 g de açúcares/kg de primeiro meio de conversão foram assim convertidos em levedura, com uma taxa de conversão açúcar-células de cerca de 9%.

[000109] A contaminação bacteriana foi muito baixa ou desprezível, como evidenciado por concentração de ácido láctico que foi estável.

[000110] A eficiência de todo o processo de conversão é tipicamente descrita por meio de um fator de conversão de açúcar em etanol com base em carbono. Como é sabido no estado da técnica, o fator de conversão de açúcar em etanol ideal é de 0,51. Isso corresponde ao máximo de conversão de açúcares em etanol, sem propagação de levedura, como descrito pelas formulações estequiométricas. O fator de conversão total de açúcar em etanol é de cerca de 0,43, demonstrando que o processo descrito atinge um alto rendimento de etanol com uma quantidade muito baixa de levedura externa ao processo.

Segundo experimento de laboratório [000111] O segundo experimento foi realizado como no primeiro experimento, mas a alíquota remanescente do primeiro caldo de conversão no primeiro experimento foi usada como inóculo em vez de levedura seca fresca. Além disso, primeira etapa de conversão foi realizada durante 6 horas, uma vez que a levedura já estava adaptado ao meio de conversão. Composição do meio de conversão e caldos são apresentados na Tabela 1. O teor de glicose no primeiro meio de conversão era

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38/40 ligeiramente menor que no primeiro experimento, na medida em que um pouco de glicose na alíquota residual do primeiro experimento foi convertido. Além disso, um pouco de etanol estava presente, ainda que sob nenhum nível problemático. pC>2 da primeira etapa de conversão é apresentado na figura 1. pC>2 da segunda etapa de conversão era quase idêntico ao da etapa correspondente do primeiro experimento.

Principais parâmetros e resultado da primeira etapa de conversão: Densidade de levedura de partida: 5,3 x 10⁷ células de levedura por miligrama

Densidade de células de levedura final: 1,7 χ 10⁸ células de levedura por miligrama

Fator de crescimento: cerca de 3,2

Peso de levedura produzida: 1,8 g de levedura sob base seca por kg Açúcar total convertido: 26 g/kg

Taxa de conversão açúcar-célula: 13,4%

Principais parâmetros e resultado da segunda etapa de conversão:

Densidade de levedura de partida: 3,4 x 10⁷ células de levedura por miligrama

Densidade de células de levedura final: 1,5 χ 10⁸ células de levedura por miligrama

Fator de crescimento: cerca de 4,4

Peso de levedura produzida: 1,8 g de levedura sob base seca por kg Açúcar total convertido: 59 g/kg Taxa conversão açúcar-célula: 8%.

Fator de conversão total de açúcar em etanol de todo o processo: 0,43.

Validação de escala industrial [000112] O processo de conversão foi testado em um equipamento de escala industrial. O procedimento utilizado foi transposto de experimentos em escala de laboratório.

[000113] A primeira etapa de conversão foi conduzida em um primeiro

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39/40 recipiente cilíndrico. A agitação foi proporcionada por um rotor coaxial ao eixo do recipiente, girado a 38 rpm.

[000114] A segunda etapa de conversão foi conduzida em um segundo recipiente cilíndrico. A agitação foi proporcionada por um rotor coaxial ao eixo do recipiente, girado a 20 rpm.

[000115] pO² foi medido por meio de um conjunto de sondas dispostas em diferentes posições no interior do meio de conversão.

[000116] Curvas de pO² apresentaram perfis semelhantes aos de experiências em escala laboratorial.

[000117] O primeiro recipiente de conversão foi enchido com 350 m³ do primeiro meio de cultura e a primeira etapa de conversão foi realizada durante 18 horas. A segunda etapa de conversão foi realizada durante 60 horas sob 1.200 m³ do segundo meio de cultura total, o qual foi formado de acordo com a proporção de 4:1 (hidrolisado de fresco:primeiro caldo convertido).

[000118] Ambos os experimentos em escala de laboratório foram convertidos em escala industrial.

Principais parâmetros e resultado da primeira etapa de conversão: Condições do primeiro exp. em escala laboratorial Condições do segundo exp. em escala de laboratório

Conversão de glicose: 84% 97%

Conversão de xilose: 15% 13%

Taxa de conversão açúcar-células: 17% 20%

Principais parâmetros e resultado da segunda etapa de conversão:

Taxa de conversão açúcar-células: 12% 15% [000119] O consumo médio de potência elétrica foi de cerca de 90 W/tonelada do primeiro meio de conversão em base úmida ao longo de todo o processo.

[000120] Diferentes ensaios foram realizados, com consumo médio de potência elétrica média inferior a 100 W/tonelada do primeiro meio de

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40/40 conversão. Em alguns casos, um consumo médio de potência elétrica menor que 80 W/tonelada foi atingido.

[000121] A validação de escala industrial mostra que o processo descrito pode atingir um rendimento elevado de etanol com uma quantidade mínima de levedura externa ao processo, baixa contaminação bacteriana e um consumo de energia muito baixo.

Claims

1. Processo para produzir um produto de fermentação a partir de uma pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica que compreende água, glicose solúvel em água e xilose solúvel em água, e matéria-prima lignocelulósica pré-tratada insolúvel em água, processo este caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

criar um primeiro meio de conversão que compreende uma primeira porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e uma levedura capaz de converter glicose e xilose em uma levedura de propagação e um produto de fermentação;

permitir que a levedura converta pelo menos 50% da glicose solúvel em água e menos de 20% da xilose solúvel em água do primeiro meio de conversão em uma primeira levedura propagada e uma primeira porção do produto de fermentação em uma primeira etapa de conversão que apresenta uma taxa de conversão açúcar-células em uma faixa de 5% a 25%, em que a primeira taxa de conversão açúcar-células é uma razão em peso por cento da glicose e xilose convertidas na levedura propagada na primeira etapa de conversão para a glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas no primeiro meio de conversão, com base em carbono;

criar um segundo meio de conversão que compreende pelo menos uma porção da primeira levedura propagada e uma segunda porção da pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica;

permitir que a levedura converta pelo menos uma porção da glicose e da xilose solúveis em água no segundo meio de conversão em pelo menos uma segunda levedura propagada e uma segunda porção do produto de fermentação em uma segunda etapa de conversão que tem uma segunda taxa de conversão açúcar-células que é inferior à primeira taxa de conversão açúcar-a-células, em que a segunda taxa de conversão açúcar-células é uma razão em peso por cento da glicose e

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2/4 xilose solúveis em água convertidas na levedura propagada na segunda etapa de conversão para glicose e xilose solúveis em água totalmente convertidas no segundo meio de conversão, com base em carbono.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de conversão compreende pelo menos uma primeira fase que é uma fase aeróbia e uma segunda fase que é uma fase anaeróbia, em que a fase aeróbia é conduzida durante um tempo em um intervalo de 3 horas a 12 horas.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de conversão é conduzida durante um primeiro tempo de conversão que é menor do que um valor selecionado do grupo que consiste em 30 horas, 20 horas, 15 horas e 10 horas.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de conversão é conduzida por inserir ar sob uma vazão que se situa em uma faixa selecionada do grupo que consiste em 0,1 vvh a 10 vvh, de 0,1 vvh a 5 vvh e de 0,5 vvh a 3 vvh.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de conversão é conduzida por misturar o primeiro meio de conversão sob uma densidade de energia em peso menor que 100 W/tonelada do primeiro meio de conversão em uma base úmida.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a primeira taxa de conversão açúcar-células situa-se em uma faixa selecionada do grupo que consiste em 5% a 20% e 10% a 20%.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa de conversão é conduzida durante um segundo tempo de conversão que é maior

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3/4 do que o primeiro tempo de conversão e menor do que urn valor selecionado do grupo que consiste em 72 horas, 60 horas e 50 horas.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa de conversão é conduzida em condições anaeróbias durante pelo menos 80% do segundo tempo de conversão.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos 80% da glicose solúvel em água e da xilose solúvel em água são convertidos na segunda etapa de conversão.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a segunda taxa de conversão açúcar-células é maior do que 2%.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro meio de conversão e o segundo meio de conversão têm um teor de matéria seca que é inferior a 30% e maior do que um valor percentual selecionado do grupo que consiste em 5%, 10%, 15% e 20%.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro meio de conversão e o segundo meio de conversão compreendem adicionalmente uma fonte de nitrogênio.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que nenhuma vitamina e/ou oligoelementos são adicionados ao processo.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica não é submetida a qualquer esterilização.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de conversão tem uma densidade de levedura de partida entre 1 x 10⁶e 1 x

Petição 870180065660, de 30/07/2018, pág. 53/59

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10⁸ células de levedura por miligrama do primeiro meio de conversão em uma base úmida.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de conversão tem uma densidade de levedura final que se situa entre 1 x 10⁷ e 1 x 10⁹ células de levedura por miligrama do primeiro meio de conversão em umabase úmida.

17. Processo, de acordo com a reivindicação15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa de conversão tem uma densidade de levedura de partida que é maior do que a densidade de levedura de partida na primeira etapa de conversão.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de conversão e a segunda etapa de conversão são conduzidas em recipientes separados.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é etanol.