BR112015031080B1

BR112015031080B1 - Método para converter biomassa em etanol ou outros produtos

Info

Publication number: BR112015031080B1
Application number: BR112015031080-0A
Authority: BR
Inventors: Lee R. Lynd; Julie M. D. Paye
Original assignee: The Trustees Of Dartmouth College
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2014-06-14
Publication date: 2021-12-21
Also published as: EP3008196A1; BR112015031080A2; CN105849271A; EP3008196B1; CN105849271B; EP3008196A4; WO2014201439A1

Abstract

métodos para intensificar a conversão microbiana de biomassa celulósica com aumento mecânico. a presente invenção refere-se a um sistema e métodos para converter biomassa sem nenhum tratamento substancial. a combinação de um sistema microbiano e o uso de ruptura mecânica pode ser de ajuda para realizar a taxa alta de conversão sem o custo extra de efeitos secundários indesejáveis tipicamente associados com o processo de pré-tratamento.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] A presente invenção refere-se a este pedido que reivindica prioridade para o pedido de patente U.S. 61/835.447, depositado no dia 14 de junho de 2013, cujo conteúdo inteiro está aqui incorporado por referência.

ANTECEDENTES I. Campos da Invenção

[0002] A descrição refere-se à conversão de biomassa para biocombustível ou outros produtos úteis. Mais particularmente, a descrição pertence ao uso de microrganismos e força mecânica para intensificar a conversão de biomassa.

II. Descrição da Técnica Relacionada

[0003] A biomassa é um material relativamente não dispendioso, renovável e abundante, que pode ser usado para gerar combustíveis, produtos químicos, fibras e energia. Entretanto, a utilização em grande escala de biomassa de planta é impedida, pelo menos em parte, pela falta de tecnologias capazes de eficientemente converter a biomassa em frações de componentes ou intermediários reativos em custo baixo. Por exemplo, a maioria das biomassas de plantas é resistente à digestão pela celulose.

[0004] Pré-tratamento de biomassa pode render a biomassa mais receptiva para a digestão enzimática. O pré-tratamento pode remover componentes de biomassa tais como lignina e/ou hemicelulose, que impedem o acesso a enzimas de celulase. O pré-tratamento pode também causar mudanças estruturais (por exemplo, tamanho de partícula, porosidade, área de superfície) na biomassa. Várias tecnologias de pré-tratamento de biomassa têm sido desenvolvidas. Exemplos desses desenvolvimentos incluem o uso de ácidos ou bases diluídas, explosão a vapor, auto-hidrólise, pH controlado, AFEX, e pré- tratamento de amônia aquosa.

[0005] Com base nos resultados colhidos de estudos, usando matéria prima alimentícia de madeira e celulases fúngicas, é comum acreditar-se que o pré-tratamento de biomassa celulósica é requerido para toda biomassa. De acordo com este critério, pré-tratamento usando temperatura alta e/ou produtos químicos é necessário antes do processamento biológico, a fim de alcançar rendimentos economicamente viáveis mediante subsequente hidrólise enzimática.

[0006] Entretanto, o pré-tratamento adiciona o custo e pode afetar o desempenho durante a fermentação subsequente. Custos de capital e operacionais para pré-tratamento são substanciais, e o pré- tratamento ainda aumenta os custos de processamento por negativamente impactar o desempenho das operações de processamento a jusante. Em particular, todos os pré-tratamentos conhecidos produzem compostos que inibem hidrólise e fermentação, ou requerem recuperação de reagentes químicos (por exemplo, amônia ou líquidos iônicos), ou ambos.

SUMÁRIO

[0007] As instrumentalidades presentemente descritas avançam a técnica provendo um sistema e método para converter biomassa efi-cientemente. Em uma modalidade, altas taxas de solubilização de matéria prima alimentícia celulósica, podem ser alcançadas com pouco ou nenhum pré-tratamento, usando micróbios celulolíticos em conjunto com ruptura mecânica de partículas de lignocelulose durante o processo de conversão.

[0008] O campo de biocombustível celulósico tem operado com base na compreensão de que o pré-tratamento é requerido para toda biomassa. É mostrado aqui que tal etapa de pré-tratamento pode ser eliminada. Para os propósitos desta descrição, o termo "pré- tratamento" se refere ao processo de contatar a biomassa com quaisquer produtos químicos em vez de água. Para os propósitos desta descrição, o termo "pré-tratamento" não inclui o uso de autoclave.

[0009] É descrito aqui um sistema para converter biomassa em etanol ou outros produtos desejados. Em uma modalidade, o sistema descrito pode conter uma biomassa compreendendo partículas lignocelulósicas, um reator para manter a biomassa, um microrganismo capaz de fermentar a biomassa para produtos desejados, e meios para mecanicamente romper as partículas lignocelulósicas. Em um aspecto, a biomassa não foi pré-tratada. Em outro aspecto, a biomassa não é pré-tratada com quaisquer produtos químicos. Em outro aspecto, a biomassa entrou em contato com a água somente antes do tratamento. Em outro aspecto a biomassa foi submetida à autoclave antes de ser carregada no reator. Em outro aspecto, o reator é um reator fechado.

[00010] É também descrito um método para converter biomassa em etanol ou outros produtos desejados. Em uma modalidade, o método inclui (a) adicionar a biomassa e um microrganismo para um reator, em que o microrganismo é capaz de solubilizar a biomassa e fermentar os produtos de solubilização. Em um aspecto, a biomassa contém partículas lignocelulósicas. Em outra modalidade, o método inclui (b) romper mecanicamente as partículas lignocelulósicas da biomassa, e (c) fermentar a biomassa com o microrganismo para produzir produtos de fermentação desejados, tais como etanol, entre outros. Em um aspecto, as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente. Em outro aspecto, a etapa (b) é realizada continuamente ou intermitentemente (por exemplo, 5 minutos em um tempo).

[00011] Em outra modalidade, o método descrito pode incluir (a) adicionar uma biomassa e um microrganismo a um reator, (b) fermentar a biomassa com o microrganismo para formar um primeiro produto fermentado, (c) mecanicamente romper o primeiro produto fermentado da etapa (b), e (d) fermentar o produto da etapa rompido mecanicamente (c), em que as etapas (b)-(d) são repetidas N vezes, e N é um número inteiro igual ou mais do que 1. Em um aspecto, N é na faixa de 1 a 10.

[00012] Em outra modalidade, a trituração de sólidos fermentados pode ser realizada em cerca de 8%, 10%, 12% ou 15% (peso/peso) de sólidos.

[00013] Em outra modalidade, mais de 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% de açúcar na biomassa é solubilizado depois de 5 dias com incubação com ruptura mecânica intermitente.

[00014] Em outra modalidade, um ou mais microrganismos podem ser usados, e os microrganismos são capazes de fermentar a biomassa para produtos desejados. Em outra modalidade, os microrganismos são capazes de solubilizar a biomassa e fermentar os produtos de solubilização. O sistema microbiano, como descrito aqui, pode incluir cultura pura ou co-cultura de microrganismos tais como Clostridium thermocellum, Clostridium claraflavum, Caldicellusiruptor bescii, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum e combinações dos mesmos. A título de exemplo, cepas que podem ser usadas no sistema microbiano incluem, mas não são limitadas a Clostridium thermocellum DSM1313, Clostridium thermocellum ATCC27405, Clostridium claraflavum 42A, Clostridium claraflavum DSM19732, entre outros.

[00015] Em outra modalidade, a fermentação microbiana e a ruptura mecânica do material celulósico podem ocorrer simultaneamente durante a fermentação. Em outra modalidade, a fermentação microbiana e a ruptura mecânica do material celulósico podem ocorrer sequencialmente durante a fermentação.

[00016] Em outra modalidade, o sistema pode ainda incluir um meio de energização para usar a pressão desenvolvida no reator para ligar o meio de ruptura mecânica. A pressão pode ser do gás gerado pela fermentação no reator, ou ela pode vir da pressão estática desenvolvida no fundo do fermentador (ou reator). Por exemplo, a produção de CO2 por organismos de fermentação pode estar contida, o que pode resultar em um aumento transitório na pressão. Este aumento na pressão pode ser usado como uma força motriz para impulsionar as pastas fluidas celulósicas através de um orifício (por exemplo, de um reator para outro, como uma configuração contínua de cascata), ou alternativamente pode ser usada para aumentar a pressão do sistema de fermentação (ou porção do mesmo).

[00017] Ruptura mecânica de partículas lignocelulósicas pode ser realizada por um número de maneiras diferentes. A título de exemplo, a ruptura pode ser realizada usando partículas sólidas (por exemplo, esferas de metal) com densidade maior do que a água no reator (ou fermentador). Em outro aspecto, a ruptura pode ser realizada por exposição ao cisalhamento por mistura intensa, passagem através de um orifício ou bocal, ou ambos. Em outro aspecto, a ruptura pode ser realizada por pressão de ciclagem, que pode levar à formação de bolhas dentro das partículas de celulose devido ao C02 supersaturado. Em outro aspecto, a ruptura pode ser realizada enviando partículas lignocelulósicas através de uma laminadora (por exemplo, refinadora de disco) fora do fermentador e tornar a recicla-los para o fermentador depois do processamento mecânico. Em outro aspecto, os meios para romper mecanicamente e os meios de força, podem incluir um bocal ou um hidrociclone com esferas densas.

[00018] Em outra modalidade, os meios de ruptura mecânica podem incluir triturador de esfera, refinador de disco ou ambos. Em um aspecto, esferas de metal ou vidro, tendo um diâmetro uniforme, podem ser usadas. Em outro aspecto, esferas de metal tendo diâmetros diferentes podem ser usadas juntas para intensificar a ruptura. A título de exemplo, esferas de metal tendo diâmetros diferentes, variando de 2 mm a 50 mm, de 5 mm a 30 mm, ou de 8 mm a 20 mm podem ser usadas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00019] Figura 1 é um diagrama de fluxo mostrando as diferentes vias do processo de tratamento mecânico e bioquímico combinados.

[00020] Figura 2 mostra os resultados da solubilização de glucano, depois do Giro I e Giro 2, para cada uma das duas Vias A e B, respectivamente. A solubilização cumulativa de glucano é também mostrada na Figura 2.

[00021] Figura 3 mostra solubilização de glucano e xilano em switchgrass por SSF apresentando hidróllise de celulase fúngica, e por conversões microbianas usando vários sistemas microbianos.

[00022] Figura 4 mostra as altas conversões realizadas por conversões bacterianas/microbianas, e intensificadas pela força mecânica sobre a grama (lavada e não lavada) comparada às conversões mais baixas, obtidas de SSF apresentando celulase fúngica adicionada na madeira ou grama.

[00023] Figura 5 mostra resultados comparando solubilização de switchgrass depois de 5 dias de tratamento com diferentes microrganismos.

[00024] Figura 6 mostra os vários produtos dos experimentos de solubilização e conversão descritos na Figura 5

[00025] Figura 7 mostra resultados de solubilização de glucano comparativa em autoclave, mas não de switchgrass colhido em meados de junho e pré-tratado de outra maneira, e poplar por C. thermocellum e por SSF usando celulase fúngica e levedura.

[00026] Figura 8 mostra o impacto de sólidos reduzidos carregados na solubilização.

[00027] Figura 9 mostra os efeitos da data da colheita, escolha de biocatalisador, e tamanho de partícula na solubilização de glucano para autoclave lavado, mas não matérias primas alimentícias de outra maneira pré-tratadas.

[00028] Figura 10 mostra a solubilização comparativa de glucano submetido a autoclave, mas não de switchgrass colhida em meados de junho de outra maneira pré-tratada, por vários carregamentos de enzimas de C.thermocellum ou celulase fúngica depois de 5 dias em frascos de soro.

[00029] Figura 11 é um pedaço de terra mostrando a solubilização de glucano e xilano para múltiplos substratos e sistemas de conversão.

[00030] Figura 12 mostra a solubilização prevista e atual para múltiplos substratos e sistemas de conversão.

[00031] Figura 13 mostra o impacto da trituração de bolas em fermentações sucessivas de switchgrass submetidas ao autoclave, mas não colhidas em outubro e pré-tratadas de outra maneira.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00032] Normalmente, acredita-se que no campo de biocombustível celulósico, o pré-tratamento é requerido para a conversão eficaz de biomassa celulósica para etanol. O pré-tratamento adiciona os custos e pode afetar o desempenho durante a fermentação subsequente. Custos de capital e operacionais para pré-tratamento são substanciais, e o pré-tratamento ainda aumenta os custos de processamento por impactar negativamente o desempenho das operações de processamento a jusante. Em particular, todos os pré-tratamentos conhecidos produzem compostos que inibem a hidrólise e fermentação ou requerem a recuperação dos reagentes químicos (por exemplo amônia ou líquidos iônicos), ou ambos.

[00033] Em adição ao custo benefício, o processamento da biomassa sem pré-tratamento pode também promover a recuperação de co-produtos, tais como proteína de alimento de lignina de peso molecular alto, e pode tornar o processamento de biomassa substancialmente menos perigoso. Se a biomassa celulósica pode ser processada com altos rendimentos e razoavelmente altas taxas sem pré-tratamento, isto provavelmente seria um avanço revolucionário resultando em processos que são muito menos dispendiosos, mais simples, e mais confiáveis. Tal avanço tem um claro potencial para apropriar-se de outras abordagens técnicas e ser de tremenda vantagem competitiva.

[00034] A desvantagem potencial de conversão da biomassa com pouco ou nenhum pré-tratamento pode incluir, por exemplo, incerteza a respeito do impacto das características da matéria prima alimentícia na receptibilidade para o processamento, a possibilidade de que a solubilização não será tão eficaz em altas concentrações, e que organismos termófilos não podem ser elaborados para realizar altos rendimentos de etanol e títulos. É descrito aqui que as taxas altas de solubilização de matérias primas alimentícias celulósicas podem ser realizadas com pouco ou nenhum pré-tratamento, usando micróbios celulolíticos em conjunto com ruptura mecânica de partículas de lignocelulose durante o processo de conversão.

[00035] A combinação de utilização de celulose microbiana com ruptura mecânica de partículas de lignocelulose, não tem sido mostrada para a produção de combustíveis ou produtos químicos de biomassa celulósica. A ruptura física durante o processo de conversão tem sido demonstrada. Ver, por exemplo, Ryu e Lee, Biotechnol Bioeng. 1983, 25(1):53-65; Jones e Lee, Biotechnol Bioeng. 1988, 31(1):35-40; Tjerneld et al., Bioseparation. 1990, 1(3-4):25563. Entretanto, todos esses estudos usaram hidrólise enzimática sem célula, em vez do sistema microbiano como descrito aqui. A presente descrição mostra a vantagem da conversão microbiana, em conjunto com a força mecânica sobre a conversão enzimática sem células.

[00036] Em outro aspecto, todos os estudos anteriores usaram um reator de atrito. Certas limitações foram observadas nos estudos de hidrólise enzimática em um reator de atrito. Essas limitações incluem, a título de exemplo, eficácia diminuída em sólidos altos, inativação de enzima acelerada, entre outras. Essas imitações associadas com hidrólise enzimática sem células em um reator de atrito, podem ser menos importante em um sistema microbiano por causa dos diferentes mecanismos envolvidos nos dois sistemas.

[00037] Em outro aspecto, a conversão microbiana combinada e a ruptura mecânica são prováveis de serem ambas menos dispendiosas e mais eficazes, quando comparadas à trituração antes da conversão por causa de (a) um amolecimento das partículas durante a conversão, que é esperado torna-las consideravelmente mais fáceis para disn1Pt, quando comparadas ao tamanho da redução de partícula antes da conversão, e (b) a geração de novas superfícies durante o processo de reação.

[00038] O termo "biomassa" se refere a materiais renováveis não fossilizados, que são derivados de, ou produzidos por organismos vivos. Em seu termo mais amplo, biomassa pode incluir biomassa animal, biomassa de planta, e resíduos de ser humano e materiais reciclados, entre outros. Exemplos de biomassa animal pode incluir sub-produto animal e resíduo animal, etc. Em uma modalidade desta descrição, biomassa se refere à biomassa de planta que inclui qualquer matéria derivada de planta (madeira ou não madeira) que está disponível em uma base sustentável. Biomassa de planta pode incluir, mas não é limitada a resíduos de cultura agrícola e resíduos tais como forragem de milho, palha de trigo, palha de arroz, bagaço de cana de açúcar e similares, safras de grama, tais como grama de triagem, alfafa, centeio do inverno, e similares. A biomassa de planta pode ainda incluir, mas não está limitada às safras de energia de madeira, resíduos de madeira e resíduos de árvores, reduções de florestas de madeira macia, resíduos de cascas, serragem, resíduos de indústria de papel e polpa ou fluxos de resíduos, fibra de madeira, e similares. Em áreas urbanas, uma biomassa de planta pode incluir resíduos de terrenos, tais como limitações de gramas, limitações de folhas das árvores, escova (?), etc., resíduo de processamento de vegetais, como também produtos de papel e papelão reciclados.

[00039] Em uma modalidade, biomassa de grama pode ser usada na presente descrição. Em outra modalidade, safras de cobertura de inverno, tal como centeio de inverno, podem ser usadas como uma matéria prima alimentícia de bioenergia, usando equipamento existente de "know-how" (conhecimento). Safras de cobertura de inverno têm pouca e discutivelmente nenhuma competição com safras de alimentos para terra ou reversas, e elas também positivamente causam impacto na qualidade da água e do solo, como também na renda da fazenda, e oferecem oportunidades de co-produtos importantes. Um estudo recente estimou que 200 milhões de toneladas secas de centeio de inverno por ano poderão ser produzidos nos Estados Unidos, em terra usada para crescimento de milho e soja, que têm um potencial de produção de combustível líquido igual àquele das indústrias dos Estados Unidos e do Brasil combinadas.

[00040] Usando o sistema e os métodos descritos aqui, outras matérias primas alimentícias celulósicas podem também ser processadas em biocombustíveis sem pré-tratamento. Exemplos de microrganismos podem incluir, mas não estão llimitados a C. thermocellum, C. clarafalvum, C. bescii ou C. thermocellum thermoanaerobacterium saccharolyticum co-culturas como sistemas de fermentação. Várias estratégias para aumento mecânico podem ser empregadas para ainda intensificar a conversão. Essas estratégias podem incluir, a título de exemplo, trituração de esferas in situ, passagem através de um bocal ou um misturador em linha de cisalhamento alto, e diversas configurações envolvendo o uso de pressão desenvolvida durante a fermentação como uma força motriz. O uso de fermentação de celulose microbiana e meios mecânicos, simultaneamente, pode comprovar ser um custo-eficaz e um meio eficiente para intensificar a conversão da biomassa.

[00041] Será prontamente aparente para aqueles versados na técnica que os sistemas e métodos descritos aqui podem ser modificados e substituições podem ser feitas usando equivalentes apropriados, sem se afastar do escopo das modalidades descritas aqui. Tendo agora descrito certas modalidades em detalhes, o mesmo será mais claramente compreendido pela referência aos exemplos a seguir, que são incluídos para fins de ilustração somente, e não são destinados a ser limitantes.

Exemplos Exemplo 1 A ruptura mecânica contribuiu para taxas de solubilização mais altas

[00042] Figura 1 é um diagrama de fluxo mostrando as diferentes vias do processo de tratamento mecânico e bioquímico combinado. Na Via A, a biomassa é submetida à trituração de esferas antes da fermentação. Na Via B, a biomassa é submetida à trituração de esferas entre os dois Giros de fermentações.

[00043] Figura 2 mostra resultados da solubilização de glucano depois do Giro I e Giro 2 para cada uma das duas Vias A e B, respectivamente. A solubilização cumulativa de glucano é também mostrada na Figura 2. Os diâmetros das esferas em média 1 e 2 foram 8 mm, 11 mm, e 20 mm. O diâmetro das esferas em média 3 foi 11 mm.

Exemplo 2 Comparando resultados da solubilização de SSF e vários microrganismos

[00044] Experimentos foram conduzidos para comparar os resultados de solubilização de SSF e vários microrganismos. Figura 3 mostra a solubilização de glucano e xilano em switchgrass por Simultânea Sacarificação e Fermentação (SSF), apresentando hidrólise de celulase fúngica e conversões microbianas, usando vários sistemas microbianos. Enquanto SSF realizou 13% de solubilização de celulose depois de 5 dias, a solubilização pela maioria de sistemas microbianos testados excedeu 60% de solubilização.

[00045] Figura 4 realça as diferenças entre conversão enzimática e microbiana, em estrutura fibrosa não tratada versus lignocelulose coberta de relva. Embora os desempenhos de celulases fúngicas fossem similares entre madeira e grama não tratadas (10% vs 11%), conversões microbianas de grama não tratada foram mais de 4 vezes maiores em grama do que em madeira (65% vs 14%). A conversão foi ainda aumentada para 78% introduzindo um meio de ruptura/aumento mecânico. Os resultados rotulados "lavado" foram realizados em switchgrass em que glucanos solúveis foram removidos (lavando durante a noite a 60 C). A solubilização de glucano por bactéria com aumento mecânico foi de 88% para switchgrassnão lavada (Figura 4).

[00046] Como mostrado nas Figuras 3 e 4, a conversão de celulose microbiana mostra desempenho superior de hidrólise em substratos não tratados ou minimamente pré-tratados, quando comparados aos sistemas convencionais usando celulases fúngicas ou celulase sem célula (Figura 3). A conversão microbiana combinada com ruptura mecânica durante a conversão, pode ser mais eficaz do que a conversão microbiana sem força (ou ruptura) mecânica. Como mostrado na Figura 4, a conversão microbiana pode realizar cerca de 65% de conversão ou mais, na ausência de ruptura mecânica. Extensões de maiores de solubilização podem ser realizadas quando a ruptura mecânica é empregada.

[00047] Embora rendimentos de solubilização para switchgrass não pré-tratada tipicamente não necessite de ser aumentada por mais do que 5 vezes, a fim de alcançar altas extensões de solubilização geralmente requeridas para economia atraente, um aumento de apenas 30% ou mais ou menos, em um sistema de celulose microbiano, pode ser suficientemente custo eficaz. Desse modo, enquanto uma intensidade relativamente pequena de ruptura mecânica pode ser requerida para a conversão microbiana, ruptura muito mais grave (ou grosseira) pode ser requerida para a conversão de substratos não pré-tratados usando celulases fúngicas.

Exemplo 3 Comparar resultados da solubilização de vários microrganismos

[00048] Resultados de solubilização usando várias matérias primas alimentícias (switchgrass e poplar) e sistemas de conversão (C. therm & SSF com celulase fúngica, C. bescii, C. clariflavum, C. cellulolyticum, enriquecimento misturado) foram examinados e comparados. A solubilização submetida à autoclave, mas não de outra maneira de switchgrass lavada pré-tratada colhida em meados de junho, foi examinada usando um número de (?). Figura 5 mostra os resultados comparativos comparando solubilização da switchgrass depois de 5 dias de tratamento com diferentes microrganismos. Os parâmetros para esses testes foram: 5 g/L de glucano, 13 g/L de sólido, < 4 mm de tamanho de partícula, 2% de inoculação depois de 5 dias em frascos de soro. A associação foi enriquecida a 60 C em Avicel de composto de esterco de cavalo. Os resultados expressos como desvio de padrão médio +/- por três testes independentes, cada um realizado em triplicata. Como0 mostrado na Figura 5, C. thermocellum e Consortia, ambos mostraram cerca de 65% de solubilização, enquanto outros microrganismos testados mostraram percentagens de solubilização mais baixas.

[00049] Figura 6 mostra os produtos de solubilização para os experimentos na Figura 5.

[00050] Fermentação e produtos de hidrólise de switchgrass verde lavada (4 mm de tamanho de partícula) por vários microrganismos (2% de inoculação) depois de 5 dias. Consoftia foi enriquecida em Avicel de composto de excrementos de cavalo. Os resultados são expressos como média (11=3). Como mostrado na Figura 6, acetato estava presente em concentrações mais altas para todas as culturas e controles. Açúcares solúveis estavam presentes em níveis significativos para todas as culturas exceto o consórcio (no controle de pH).

Exemplo 4 Comparando resultados de solubilização de diferentes biomassas usando diferentes microrganismos e SSF

[00051] Solubilização de glucano autoclavado, mas não switchgrass e poplar, colhidos em meados de junho, mas não de outra maneira pré-tratados por diferentes microrganismos ou celulase, foram examinados.

[00052] Resultados de C. thermocellum e SSF usando celulase fúngica e levedura foram mostrados na Figura 7. Os testes foram conduzidos em diversos frascos por 5 dias de incubação. Cargas de celulase fúngica foram 4,5 mg Ctec2 por grama sólida e 0,5 mg Htec2 por grama sólida. Solubilização de switchgrass não inoculada (5 g/L de glucano, 13 g/L de sólido, <4 mm de tamanho de partícula) e poplar (5 g/L de glucano, 11 g/L de sólido, <0,5 mm de tamanho de partícula) foram menos de 10%. Os resultados são expressos como desvio médio padrão +/- para três experimentos independentes, cada um realizado em triplicata. Como mostrado na Figura 7, a conversão do termo C. excedeu SSF por cerca de duas vezes em carga de baixa enzima, e switchgrass de meados de junho foi muito mais reativa do que madeira para ambos os sistemas.

Exemplo 5. Efeitos da quantidade de carga sólida sobre a solubilização

[00053] O impacto de carga de sólidos reduzida sobre a solubilização foi estudado.

[00054] A solubilização de glucano de switchgrass colhida em meados de junho e lavada com uma concentração de sólidos inicial de 13 g/L ou 2,5 g/L depois de 5 dias foi comparada. A carga de celulase fúngica foi 4,5 mg Ctec2/ g sólido e 0,5 mg Htec2 / g sólido. Os resultados são expressos com desvio padrão médio +/- para três experimentos independentes, cada um realizado em triplicata.

[00055] Como mostrado na Figura 8, a carga inicial de sólidos teve um impacto significativo sobre a solubilização de glucano por C. bescii, mas não por C. thermocellum ou SSE

Exemplo 6. Efeitos da data de colheita de biomassa e tamanho de partícula sobre a solubilização

[00056] A solubilização de glucano para matérias primas alimentícias lavadas, autoclavadas mas não de outra maneira pré- tratadas com uma função da data de colheita de switchgrass, escolha de biocatalisador, e tamanho de partícula foi estudada. C. thermocellum (quadrados preenchidos) ou celulase fúngica e levedura (diamantes abertos), com 5 dias de incubação em frascos de soro foram usados no estudo. A carga de celulase fúngica foi 4,5 mg Ctec2/ g de sólido e 0,5 mg Htec2 / g de sólido. A solubilização de switchgrass nova não inoculada (5 g/L de glucano, 13 g/L de sólido), switchgrass senescente (5 g/L de glucano, 12 g/L de sólido) e poplar (5 g/L de glucano, 11 g/L de sólido) foi menos do que 10%. Os resultados são expressos como desvio médio padrão +/- para três experimentos independentes, cada um realizado em triplicata.

[00057] Como mostrado na Figura 9, o tamanho de partícula não mostrou um impacto significativo para grama, poplar SSE. Entretanto, o tamanho de partícula pareceu ter algum impacto significativo para C. thermocellum sobre poplar.

[00058] A solubilização de switchgrass senescente foi cerca da metade daquela switchgrass colhida em meados de junho para ambos, C. thermocellum e SSF, sugerindo que a data da colheita também tem um impacto sobre a solubilização. Aqui novamente, C. thermocellum foi cerca de duas vezes eficaz como SSF sobre swtichgrass em todos os tamanhos de partículas e em ambas as maturidades.

Exemplo 7. Efeitos da carga de enzima e fonte de enzimas sobre a solubilização

[00059] Solubilização comparativa de glucano de switchgrass colhidos em meados de junho autoclavados, mas não pré-tratado de outra maneira por vários carregamentos de enzimas de C. thermocellum ou celulase fúngica, depois de 5 dias em frascos de soro. 5 g/L de glucano, 13 g/L de sólido, 4 mm de tamanho de partícula.

[00060] Enzimas de C. thermocellum foram purificadas pela purificação de afinidade (o) ou por concentração e dialização de caldo sem célula (o). A celulase fúngica foi incubada a 37 C na presença (X) ou ausência de levedura (a), em concentração de substrato mais baixa (A, 2,5 g/L de sólidos), ou temperatura de hidrólise aumentada (0 50 C). Os resultados são expressos como desvio médio padrão +/- (n=3 para celulase fúngica, n=2 para celulase de afinidade purificada, 11=1 para caldo concentrado dializado).

[00061] Como mostrado na Figura 10, 5 dias de solubilização de SSF não foi significativamente melhorado pela presença ou ausência de levedura, cargas de enzima maiores, temperatura de incubação mais alta, ou carga de matéria prima alimentícia mais baixa. C therm celulase foi muito mais eficaz do que a celulase fúngica em todas as cargas.

Exemplo 8. Solubilização de glucano e xilano por múltiplos substratos e sistemas de conversão

[00062] A solubilização de glucano e xilano por múltiplos substratos por sistemas de conversão foram examinados. Figura 11 mostra a solubilização de glucano e xilano por múltiplos substratos e sistemas de conversão.

[00063] Figura 12 mostra a solubilização prevista e a atual por múltiplos substratos e sistemas de conversão. Os dados obtidos a partir de 3 substratos e 6 sistemas de conversão, confirmam a hipótese de não-carboidrato inerte, enquanto rejeitando a hipótese de "descascar cebola", que sugere que o não carboidrato é solubilizado para a mesma extensão que carboidrato.

Exemplo 9. Impacto de trituração de esfera em fermentações sucessivas

[00064] Os efeitos de trituração de esferas em fermentações sucessivas de switchgrass colhida em outubro autoclavada, mas não pré-tratada de outra maneira foram estudados. O termo "antes' se refere à trituração antes da primeira inoculação, e o termo "depois" se refere à trituração entre a primeira e a segunda inoculações.

[00065] Como mostrado na Figura 13, no caso de C. thermocellum, cinco minutos de trituração, depois da primeira fermentação, mas antes da segunda fermentação, resultaram em solubilização aumentada do carboidrato restante durante a segunda fase de fermentação. Mais especificamente, com a trituração entre a primeira fermentação e a segunda fermentação, mais do que 50% do carboidrato remanescente depois da primeira fermentação foi solubilizado. A mesma trituração antes da primeira fermentação não teve efeito quando em comparação aos controles de não trituração. Desse modo, ataques físicos e biológicos são muito mais eficazes quando feitos alternativamente (co-tratamento) em vez de sequencialmente (pré-tratamento).

[00066] A alta solubilização de switchgrass senescente, autoclavada mas de outro modo não pré-tratada, pode ser realizada por C. thermocellum com breve trituração, porém mais provavelmente não por SSF com o mesmo tratamento de trituração.

[00067] Os teores de todas as referências citadas (incluindo referências de literatura, patentes, pedidos de patente, e websites) que podem ser mencionados por todo este pedido ou listados abaixo são aqui expressamente incorporados por referência em suas inteirezas para qualquer fim dentro da presente descrição. A descrição pode empregar, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de microbiologia, biologia molecular e biologia de células, que são bem conhecidas na técnica.

[00068] Os métodos e sistemas descritos podem ser modificados sem se afastar do escopo deste. Deverá ser observado que a matéria contida na descrição acima, ou mostrada nos desenhos que acompanham, deverá ser interpretada como ilustrativa e não no sentido de limitação.

Claims

1. Método para converter biomassa em etanol ou outros produtos, caracterizado pelo fato de que compreende, em ordem sequencial: a) adicionar a dita biomassa e pelo menos um microrganismo para um reator para formar uma suspensão compreendendo a dita biomassa e o dito pelo um microrganismo, b) fermentar a dita biomassa com o pelo menos um microrganismo para formar um primeiro produto de fermentação compreendendo biomassa fermentada e o pelo menos um microrganismo, que é uma pasta contendo partículas lignocelulósicas no reator, c) romper mecanicamente o dito primeiro produto fermentado da etapa (b), em que a ruptura mecânica compreende trituração mecânica, d) fermentação do produto rompido mecanicamente da etapa (c) no reator da etapa (b), em que as ditas etapas (b) - (d) são repetidas N vezes antes de obter o dito etanol ou outros produtos, sendo N um número inteiro igual ou superior a 1 e a referida biomassa compreende partículas lignocelulósicas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que nenhuma reinoculação do dito pelo menos um microrganismo está incluída.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito reator é operado em batelada ou modo contínuo.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ruptura mecânica é realizada com um dispositivo de interrupção externo ao reator, em que o método compreende uma etapa de retirada da pasta contendo partículas lignocelulósicas do reator.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito reator é um reator fechado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que mais de 60% de açúcar na dita biomassa é solubilizada após 5 dias em cada uma das etapas (b) e (d).

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um microrganismo é pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em Clostridium thermocellum, Clostridium claraflavum, Clostridium cellulolyticum, Caldicellusiruptor bescii, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum e combinação dos mesmos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que não utiliza levedura ou celulase purificada.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que nenhum tratamento químico é aplicado à dita biomassa antes da etapa (b) para aumentar a acessibilidade da dita biomassa ao dito pelo menos um microrganismo.