BRPI0612966B1

BRPI0612966B1 - Method for the treatment of biomass

Info

Publication number: BRPI0612966B1
Application number: BRPI0612966-8A
Authority: BR
Inventors: B. Dunson James; Tucker Melvin; Elander Richard; M.Hennessey Susan
Original assignee: E.I.Du Pont De Nemours And Company
Priority date: 2005-04-12
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2017-12-05
Also published as: JP2008535664A; BRPI0612939B1; CN101160409A; CN101160405A; WO2006110899A2; EP1869202A2; CA2603128C; BRPI0612939A2; CA2603774C; US20070037259A1; CN101155928A; US20070031953A1; JP2008535524A; WO2006110901A2; CN101155928B; CN101160388B; JP5149785B2; JP5118626B2; CN101160405B; CA2603128A1

Abstract

método para o tratamento de biomassa a presente invenção refere-se a biomassa que foi tratada previamente utilizando uma baixa concentração de amônia aquosa em alta concentração de biomassa. a biomassa tratada previamente é ainda hidrolisada com uma associação de enzima de sacarificação. os açúcares fermentáveis liberados pela sacarificação podem ser utilizados para a produção de alvos químicos pela fermentação.

Description

“MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE BIOMASSA” [001] O presente pedido reivindica os benefícios do Pedido Provisório US 60/670437, depositado em 12 de abril de 2005.

Declaração dos Direitos Governamentais [002] A presente invenção foi realizada com o suporte do governo dos Estados Unidos da América sob o Contrato de numero 04-03-CA-70224 concedido pelo Departamento de Energia. O governo possui certos direitos sobre a presente invenção.

Campo pa Invenção [003] São fornecidos os métodos para o tratamento da biomassa a fim de obter açúcares fermentáveis. Especificamente, os açúcares fermentáveis são obtidos pelo tratamento prévio da biomassa sob condições de concentração alta de sólidos e baixa de amônia, seguido pela sacarificação.

Antecedentes da Invenção [004] As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos, tais como resíduos agrícolas, madeira, resíduos de silvicultura, lodo da fabricação de papel, e resíduos sólidos industriais e municipais, fornecem uma matéria-prima de grande potencial de renovação para a produção de substâncias químicas, plásticos, combustíveis e suprimentos. As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostos de polímeros de carboidratos que compreendem a celulose, hemicelulose, glucanos e lignina são, em geral, tratados por uma variedade de meios químicos, mecânicos e enzimáticos para liberar principalmente os açúcares de hexose e de pentose, que podem ser fermentados a produtos úteis.

[005] Os métodos de tratamento prévio são utilizados para fabricar os polímeros de carboidrato de materiais de celulose e lignocelulose, disponíveis mais rapidamente para as enzimas de sacarificação. Os métodos de tratamento prévio padrão têm utilizado historicamente e principalmente os ácidos fortes em temperaturas elevadas; entretanto, devido aos altos custos de energia, altos custo de equipamento, altos custos de recuperação do catalisador de tratamento prévio e incompatibilidade com as enzimas de sacarificação, têm sido desenvolvidos métodos alternativos, tais como tratamento prévio enzimático ou o uso de ácido ou de base em temperaturas mais amenas onde a menor hidrólise dos polímeros de carboidrato da biomassa ocorre durante o tratamento prévio, requerendo melhores sistemas enzimáticos para sacarificar ambas a celulose e a hemicelulose.

[006] Uma série de métodos de tratamento prévio que utilizam base foi proposta. Gould (Biotech. and Bioengr. (1984) 26: 46-52) descreve um método de tratamento prévio para a biomassa de lignocelulose utilizando peróxido de hidrogênio (H202). O tratamento é mais eficiente utilizando H202 em uma quantidade de pelo menos 0,25 em peso/ peso com relação ao substrato.

[007] Teixeira, L. et al., (Appl. Biochem. and Biotech. (1999) 77-79: 19-34) descreve uma série de tratamentos prévios de biomassa utilizando quantidades estequiométricas de hidróxido de sódio e hidróxido de amônio, com uma concentração de biomassa muito baixa. A razão da solução e da biomassa é de 14:1.

[008] Elshafei, A. et al., (Bioresource Tech. (1991) 35: 73-80) examinou o tratamento prévio da forragem de milho utilizando NaOH.

[009] Kim, T e Y. Lee (Bioresource Technology (2005) 96: 2007-2013) relatou o uso de altas quantidades de amônia aquosa para o tratamento prévio da forragem de milho.

[010] O documento WO 2004/081185 descreve os métodos para hidrolisar a lignocelulose, que compreende o contato da lignocelulose com uma substância química; a substância química pode ser uma base, tal como o carbonato de sódio ou o hidróxido de potássio, em um pH de cerca de 9 a cerca de 14, sob condições moderadas de temperatura, pressão e pH.

[011] As patentes US 5.916.780 e US 6.090.595 descrevem um processo de tratamento prévio em que uma razão especificada de arabínoxilano e de polissacarídeos totais de não amido {AXI NSP) é avaliada e utilizada para selecionar a matéria prima.

[012] A fim de ser um processo economicamente competitivo, um processo comercial para a produção de açúcares fermentáveis a partir uma fonte de biomassa renovável requer a hidrólise de carboidratos na biomassa lignocelulósica para fornecer altos rendimentos de açúcares em altas concentrações, utilizando baixas quantidades de substâncias químicas, para produzir uma fonte de açúcares fermentáveis com baixa toxicidade com relação aos organismos fermentadores que convertem açúcares a substâncias químicas e combustíveis de valor agregado.

Descrição Resumida da Invenção [013] A presente invenção fornece um método para o tratamento da biomassa para produzir açúcares fermentáveis. O processo da presente invenção envolve uma etapa de tratamento prévio, em que a biomassa, concentrações rei ativam ente altas, é tratada com uma baixa concentração de amônia com relação ao peso seco da biomassa. Seguindo o tratamento prévio, a biomassa é tratada com uma associação de enzima de sacarificação para produzir açúcares fermentáveis, Em uma realização da presente invenção, o processo compreendei (a) colocar em contato a biomassa com uma solução aquosa que compreende a amônia para formar uma mistura de amônia aquosa e biomassa, em que a amônia está presente em uma concentração pelo menos suficiente para manter o pH alcalino na mistura de amônia aquosa e biomassa, mas em que dita amônia está presente a menos do que cerca de 12% em peso com relação ao peso seco da biomassa, e ainda em que o peso seco da biomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso com relação ao peso da mistura de amônia aquosa e biomassa; e (b) colocar em contato o produto da etapa (a) com uma associação de enzima de sacarificação sob condições apropriadas para produzir açúcares fermentáveis.

[014] A biomassa refere-se a qualquer material celulósico ou lignocelulósico, por exemplo, culturas de bioenergia, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, resíduos de terrenos, madeira, resíduos de silvicultura e suas combinações. A solução aquosa que compreende amônia pode ser derivada a partir de gás amônia, hidróxido de amônia, uréia e suas combinações. De acordo com o processo da presente invenção, a solução aquosa que compreende amônia pode compreender pelo menos uma base adicional. Em adição, de acordo com o processo da presente invenção, pode ser aplicado vácuo à biomassa antes do contato da biomassa com uma solução aquosa que compreende amônia. A amônia também pode ser removida antes da etapa (b); a amônia pode ser reciclada de volta ao reator de tratamento prévio. A amônia e a biomassa podem ser reagidas no processo da presente invenção em uma temperatura que está entre cerca de 4SC e cerca de 200QC. Um plastificante, agente amaciante ou suas combinações podem ser utilizados no processo da presente invenção. Em adição, pode ser aplicada uma energia à biomassa antes ou durante a etapa (a), antes ou durante a etapa (b), ou uma combinação das mesmas a fim de reduzir i tamanho, aumentar a área de superfície exposta e/ou aumentar a acessibilidade de celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa.

[015] A associação de enzima de sacarificação pode compreender uma ou mais glicosidases; as glicosidases podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em glicosidases hidrolisantes de celulose, glicosidases hidrolísantes de hemicelulose e glicosidases hidrolisantes de amido. Outras enzimas na associação de enzima de sacarificaçâo podem incluir peptidases, lípases, ligninases e esterases de feruloíla.

Breve Descrição das Figuras [016] A Figura 1 mostra o crescimento da Zymomonas mobilis 8b (descrita no pedido de patente US 2003/ 0162271 A1, exemplos IV, VI e XII) na presença ou ausência de acetamida e ácido acético.

Descrição Detalhada da Invenção [017] Os Depositantes incorporam especificamente todo o conteúdo de todas as referências citadas nessa descrição. Ainda, quando uma quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro é dado como um intervalo, intervalo preferido ou uma lista de valores preferidos superiores e valor preferidos inferiores, isto deve ser entendido como descrevendo especificamente todos os intervalos formados a partir de qualquer par de qualquer limite de intervalo superior ou valor preferido e qualquer limite de intervalo inferior ou valor preferido, independentemente se os intervalos são descritos separadamente. Onde um intervalo de valores numéricos é citado no presente, a menos que especificado de outra maneira, o intervalo pretende incluir suas extremidades, e todos os números inteiros e frações dentro do intervalo. Não é pretendido que o escopo da presente invenção seja limitado aos valores específicos citados na definição de um intervalo.

[018] A presente invenção fornece um processo para o tratamento de biomassa para produzir os açúcares fermentáveis: o processo envolve uma etapa de tratamento prévio em que a biomassa, em concentração relatívamente alta, é tratado com uma concentração relativamente baixa de amônia com relação ao peso seco da biomassa. A biomassa tratada com amônia é então digerida com uma associação de enzima de sacarificação para produzir açúcares fermentãveís.

Definições [019] No presente relatório descritivo, uma série de termos é utilizada. As seguintes definições são fornecidas: [020] O termo “açúcar fermentável” refere-se a oligossaearídeos e monossacarídeos que podem ser utilizados como uma fonte de carbono por um microorganismo em um processo de fermentação.

[021] O termo “lignocelulósico” refere-se a uma composição que compreende ambas a lignina e a celulose. O material lignocelulósico também pode compreender a hemícelulose.

[022] O termo “celulósico” refere-se a uma composição que compreende a celulose.

[023] Por "peso seco" de biomassa, entende-se o peso da biomassa que possui toda ou essencialmente toda a água removida. O peso seco é tipicamente medido de acordo com a American Society for Testing and Materials (ASTM) Padrão E1756-01 (Método de Teste Padrão para a Determinação de Sólidos Totais na Biomassa) ou Technical Association of the Pulp and Paper Industry, Inc. (TAPPI) Padrão T-412 om-02 (Umidade na Polpa, Papel e Cartolina).

[024] O termo “alvo químico” refere-se a uma substância química produzida pela fermentação. A substância química é utilizada em um sentido amplo e inclui moléculas, tais como proteínas incluindo, por exemplo, peptídeos, enzimas e anticorpos.

[025] Um alvo químico que é “derivado da biomassa" é um alvo químico produzido por um processo pelo qual a biomassa é hidrolisada para liberar açúcares fermentãveís, e os açúcares fermentãveís são fermentados utilizando pelo menos um biocatalisador para produzir um alvo químico desejável.

[026] Os termos “plastificante” e “agente amaciante” referem-se a materiais que causam a redução das forças intermolecu lares coesivas ao longo ou entre as cadeias poliméricas. Tais materiais podem agir, por exemplo, na diminuição da cristalinidade ou na quebra de ligações entre as fibras de carboidrato de lignina e de não lignina (por exemplo, celulose ou hemicelulose).

[027] O termo “sacarificação” refere-se à produção de açúcares fermentáveis a partir de polissacarídeos.

[028] O termo “biomassa tratada previamente” significa biomassa que foi submetida ao tratamento prévio antes da sacarificação.

[029] O termo “biomassa” refere-se a qualquer material celulósico ou lignocelulósico e inclui os materiais que compreendem celulose e, opcionalmente, compreendem ainda a hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa também pode compreender os componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídio. De acordo com a presente invenção, a biomassa pode ser derivada a partir de uma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; por exemplo, a biomassa pode compreender uma mistura de espigas de milho e forragem de milho ou uma mistura de grama e folhas. A biomassa inclui, mas não está limitada a, culturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, lodo da fabricação de papel, resíduos de terrenos, resíduos de madeira e de silvicultura. Os exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados a, grãos de milho, espigas de milho, resíduos de plantação, tais como cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, grama do gênero Panicum, resíduos de papéis, bagaço da cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos do processamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbusto e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal. Em uma realização, a biomassa que é útil para a presente invenção inclui a biomassa que possui um valor de carboidrato relativamente alto, é relativamente denso, e/ou é relativamente fácil de coletar, transportar, armazenar e/ou manipular. Em uma realização da presente invenção, a biomassa que é útil inclui as espigas de milho, as forragens de milho e o bagaço da cana de açúcar.

[030] Para os propósitos da presente invenção, uma “solução aquosa que compreende amônia” refere-se ao uso de gás amônia (NH3), compostos que compreendem íons amônio (NH4+) tais como hidróxido de amônio ou sulfato de amônio, compostos que liberam amônia na degradação tais como uréia, e as suas combinações em um meio aquoso.

[031] A concentração de amônia utilizada no presente método é, de maneira mínima, uma concentração que é suficiente para manter o pH da mistura de amônia aquosa e de biomassa alcalina e, de maneira máxima, menos de cerca de 12% em peso com relação ao peso seco da biomassa. Esta baixa concentração de amônia é suficiente para o tratamento prévio, e a baixa concentração também pode ser menos do que cerca de 10% em peso com relação ao peso seco da biomassa. Uma concentração muito baixa de 6% de amônia com relação ao peso seco da biomassa, ou menos, também pode ser utilizada para o tratamento prévio. Por alcalino entende-se um pH superior a 7,0. Particularmente apropriado é um pH da mistura de amônia aquosa e de biomassa que é superior a 8. Em uma realização, a amônia está presente a menos do que cerca de 10% em peso com relação ao peso seco da biomassa. Particularmente apropriada é a amônia a menos do que cerca de 6% em peso com relação ao peso seco da biomassa.

[032] A amônia conforme utilizada no presente processo fornece vantagens sobre outras bases. A amônia se divide em uma fase líquida e uma fase vapor. Os gases de amônia podem se difundir mais facilmente através da biomassa do que uma base líquida, resultando em um tratamento prévio mais eficaz em baixas concentrações. A amônia também é mostrada no presente, no Exemplo 11, para competir com a hidrólise, por meio de amonólise, dos acetil ésteres na biomassa para formar a acetamida. A acetamida é menos tóxica do que o acetato para certos organismos fermentadores, tal como a Zymomonas mobilis (conforme demonstrado no presente, no Exemplo 12). Assim, a conversão dos acetil ésteres para a acetamida ao invés de para ácido acético reduz a necessidade de remover o ácido acético. O uso de amônia também reduz a exigência de suplementar o meio de crescimento utilizado durante a fermentação com uma fonte de nitrogênio. Em adição, a amônia é um material de baixo custo e assim, fornece um processo econômico. A amônia também pode ser reciclada para o reator de tratamento prévio durante o tratamento prévio ou seguinte ao tratamento prévio, permitindo assim um processo mais econômico. Por exemplo, seguindo o tratamento prévio, conforme a temperatura é diminuída àquela apropriada para a sacarificação, o gás de amônia pode ser liberado, opcionalmente, na presença de vácuo, e pode ser reciclado. Em um processo contínuo, a amônia pode ser continuamente reciclada.

[033] De acordo com o presente método, a solução aquosa que compreende a amônia pode, opcionalmente, compreender pelo menos uma base adicional, tal como hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio. Pelo menos uma base pode ser adicionada em uma quantidade que é combinada com o amônio para formar uma quantidade de base total que é menos do que cerca de 20% em peso com relação ao peso seco da biomassa. De preferência, a segunda base total mais a amônia está em uma quantidade que é menos do que cerca de 15% em peso. A(s) base(s) adicional(is) pode(m) ser utilizada(s), por exemplo, para neutralizar os ácidos na biomassa, para fornecer íons metálicos para as enzimas de sacarificação, ou para fornecer íons metálicos para o meio de crescimento da fermentação.

[034] No presente método, o peso seco da biomassa está em uma concentração inicial de pelo menos cerca de 15% até cerca de 80% do peso da mistura de amônia aquosa e biomassa. De maneira mais apropriada, o peso seco da biomassa está em uma concentração de cerca de 15% a cerca de 60% do peso da mistura de amônia aquosa e biomassa. A porcentagem de biomassa na mistura de amônia aquosa e biomassa é mantida alta para minimizar a necessidade pela concentração de açúcares resultante da sacarificação da biomassa tratada previamente, para o uso na fermentação. A alta concentração de biomassa também reduz o volume total do material de tratamento prévio, tornando o processo mais econômico.

[035] A biomassa pode ser utilizada diretamente conforme obtida a partir da fonte, ou a energia pode ser aplicada à biomassa para reduzir o tamanho, aumentar a área de superfície exposta, e/ou aumentar a disponibilidade de celulose, hemicelulose, e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa para as enzimas de amônia e de sacarificação utilizadas na segunda etapa do método. Os meio de energia úteis na redução do tamanho, aumento a área de superfície exposta, e/ou aumento da disponibilidade de celulose, hemicelulose, e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa para as enzimas de amônia e de sacarificação, incluem, mas não estão limitadas a, moagem, compressão, trituração, despedaçamento, corte, refinação em disco, ultra-som e microondas. Esta aplicação de energia pode ocorrer antes ou durante o tratamento prévio, antes ou durante a sacarificação ou qualquer combinação dos mesmos.

[036] O tratamento prévio da biomassa com solução de amônia é realizado em qualquer recipiente apropriado. Tipicamente o recipiente é um que pode suportar a pressão, possui um mecanismo de aquecimento, e possui um mecanismo para a mistura de conteúdos. Os recipientes disponíveis comercialmente incluem, por exemplo, o reator Zipperclave® (Autoclave Engineers, Erie, PA), o reator Jaygo (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ), e um reator de pistola de vapor ((descrita nos Métodos Gerais; Autoclave Engineers, Erie, PA). Os reatores de escalas muitos maiores com capacidades similares podem ser utilizados. Alternativamente, a biomassa e a solução de amônia podem ser combinadas em um recipiente, então, transferida a outro reator. Além disso, a biomassa pode ser tratada previamente em um recipiente, então, processada adicionalmente em outro reator, tal como o reator de pistola de vapor (descrito nos Métodos Gerais; Autoclave Engineers, Erie, PA).

[037] Antes do contato da biomassa com uma solução aquosa que compreende amônia, pode ser aplicado vácuo ao recipiente contendo a biomassa. Ao evacuar o ar dos poros da biomassa, pode ser obtida uma melhor penetração de amônia na biomassa. O período de tempo para a aplicação de vácuo e a quantidade de pressão negativa que é aplicada à biomassa irá depender do tipo de biomassa e pode ser determinado empiricamente de modo a atingir um tratamento prévio ótimo da biomassa (conforme medido pela produção de açúcares fermentáveis seguindo a sacarificação).

[038] O contato da biomassa com uma solução aquosa que compreende a amônia é realizado em uma temperatura de cerca de 4-C a cerca de 200-C. O contato inicial da biomassa com a amônia a 4QC, permitindo a impregnação a esta temperatura, foi descoberta por aumentar a eficiência de sacarificação pela biomassa nativa não tratada previamente. Em outra realização, dito contato da biomassa é realizado em uma temperatura de cerca de 75SC a cerca de 150SC. Ainda em outra realização, dito contato da biomassa é realizado em uma temperatura superior a 90-C a cerca de 150-C.

[039] O contato da biomassa com uma solução aquosa que compreende a amônia é realizado por um período de tempo de até cerca de 25 horas. Períodos mais longos de tratamento prévio são possíveis, entretanto, um menor período de tempo pode ser preferível por razões práticas e econômicas. Tipicamente um período de tratamento de contato da amônia é de cerca de 8 horas ou menos. Períodos mais longos podem fornecer o benefício de reduzir a necessidade de aplicação de energia para a quebra da biomassa, portanto, um período de tempo de até cerca de 25 horas pode ser preferível.

[040] Em uma realização, o processo de tratamento prévio pode ser realizado em uma temperatura relativamente alta for um período de tempo relativamente curto, por exemplo, de cerca de 100QC a cerca de 150QC por cerca de 5 minutos e cerca de 2 horas. Em outra realização, o processo de tratamento prévio pode ser realizado em uma temperatura inferior por um período de tempo relativamente longo, por exemplo, de cerca de 75SC a cerca de 100SC por cerca de 2 horas e cerca de 8 horas. Em ainda outra realização, o processo de tratamento prévio pode ser realizado na temperatura ambiente (cerca de 22 a 26SC) ou mesmo por um período de tempo mais longo de cerca de 24 horas. Outras combinações intermediárias de temperatura e tempo também podem ser utilizadas.

[041] Para o processo de tratamento prévio, a temperatura, o tempo para o tratamento prévio, a concentração de amônia, a concentração de uma ou mais bases adicionais, a concentração de biomassa, o tipo de biomassa e o tamanho de partícula da biomassa são relacionados; assim estas variáveis podem ser ajustadas conforme o necessário para obter um produto ótimo para ser colocado em contato com uma associação de enzima de sacarificação.

[042] Um plastificante, agente amaciante, ou as combinações dos mesmos, tais como os polióis (por exemplo, glicerol, etileno glicol), ésteres de polióis (por exemplo, monoacetato de glicerol), éteres de glicol (por exemplo, dietileno glicol), acetamida, etanol e etanolaminas, podem ser adicionados no processo de tratamento prévio (isto é, a etapa (a)). Um plastificante pode ser adicionado como um componente da solução de amônia aquosa, como uma solução separada, ou como um componente seco.

[043] A reação de tratamento prévio pode ser realizada em qualquer recipiente apropriado, tal como um reator em batelada ou um reator contínuo. Um técnico no assunto irá reconhecer que, em maiores temperaturas (acima de 100eC), será necessário um recipiente de pressão. Um recipiente apropriado pode ser equipado com os meios, tais como impulsores, para a agitação da mistura de amônia aquosa e biomassa. O projeto do reator é discutido em Lin, K. H., e Van Ness, H. C. (em Perry, R. H. e Chilton, C. H. (eds), Chemical Engineer’s Handbok, 5â edição (1973), capítulo 4, McGraw-HilI, Nova Iorque). A reação de tratamento prévio pode ser realizada como um processo em batelada, ou como um processo contínuo.

[044] É bem conhecido dos técnicos no assunto que uma fonte de nitrogênio é necessária para o crescimento de microorganismos durante a fermentação; assim o uso de amônia durante o tratamento prévio fornece uma fonte de nitrogênio e reduz ou elimina a necessidade de suplementar o meio de crescimento utilizado durante a fermentação com uma fonte de nitrogênio. Se o pH do produto do tratamento prévio exceder aquele a qual as enzimas de sacarificação são ativas, ou exceder o intervalo apropriado para o crescimento microbiano na fermentação, os ácidos podem ser utilizados para reduzir o pH. A quantidade de ácido utilizado para obter o pH desejado pode resultar na formação de sais em concentrações que são inibidoras das enzimas de sacarificação ou do crescimento microbiano. A fim de reduzir a quantidade de ácido necessário para obter o pH desejado e para reduzir o custo do material bruto de NH3 no presente processo de tratamento prévio, o gás amônia pode ser evacuado do reator de tratamento prévio e reciclado. Tipicamente, pelo menos um porção de amônia é removida, o que reduz o pH, mas deixa algum nitrogênio que fornece este nutriente para o uso na fermentação subsequente.

[045] A fim de obter quantidades suficientes de açúcar da biomassa, a biomassa pode ser tratada previamente com uma solução de amônia aquosa uma vez ou mais de uma vez. Da mesma maneira, uma reação de sacarificação pode ser realizada uma ou mais vezes. Ambos os processos de tratamento prévio e de sacarificação podem ser repetidos se desejado para obter maiores rendimentos de açúcares. Para avaliar o desempenho dos processos de tratamento prévio e de sacarificação, separadamente ou em conjunto, o rendimento teórico de açúcares derivados da biomassa de partida pode ser determinado e comparado para os rendimentos medidos.

Sacarificação [046] Seguindo o tratamento prévio, o produto compreende uma mistura de amônia, biomassa parcialmente degradada e açúcares fermenta ve is. Antes do processamento adicional, a amônia pode ser removida da biomassa tratamento prévio pela aplicação de vácuo. A remoção da amônia diminui o pH e, portanto, é utilizado um ácido menos neutralizante para obter o pH desejado para a sacarificação e a fermentação. Isto resulta em uma menor carga de sal na mistura do tratamento prévio. Tipicamente, permanece alguma amônia, que é desejada para fornecer uma fonte de nitrogênio para a fermentação.

[047] A mistura do tratamento prévio é então, hidrolisada adicionalmente na presença de uma associação de enzima de sacarificação para liberar os oligossacarídeos e/ou os monossacarídeos em um hidrolisado. As enzimas de sacarificação e os métodos para o tratamento da biomassa são analisados por Lynd, L. R., et al., (Microbiol. Mol. Rev. {2002} 66: 506-577). Em uma realização preferida, toda a mistura de tratamento prévio que compreende ambas as frações solúveis e insolúveis é utilizada na reação de sacarificação.

[048] Em outra realização, antes da sacarificação, a fração aquosa compreende a amônia e os açúcares solubilizados podem ser separados dos particulados insolúveis permanecentes na mistura. Os métodos para a separação das frações solúveis das insolúveis incluem, mas não estão limitadas a, decantação e filtração. Os particulados insolúveis podem ser reciclados no reator de tratamento prévio. Os particulados insolúveis podem, opcionalmente, ser lavados com um solvente aquoso (por exemplo, água) para remover os açúcares adsorvidos antes de serem reciclados no reator de tratamento prévio. A fração insolúvel pode então ser submetida ao tratamento adicional com a solução de amônia aquosa conforme descrito acima para o tratamento prévio, seguido pela sacarificação com uma associação de enzima de sacarificação. A fração solúvel também pode ser concentrada antes da sacarificação utilizando um processo apropriado, tal como a evaporação.

[049] Antes da sacarificação, o produto de tratamento prévio pode ser tratado para alterar o pH, a composição ou a temperatura tal que as enzimas da associação de enzima de sacarificação serão ativas. O pH pode ser alterado através da adição de ácidos na forma sólida ou líquida. Alternativamente, o dióxido de carbono (C02), que pode ser recuperado da fermentação, pode ser utilizado para diminuir o pH. Por exemplo, o C02 pode ser coletado de um fermentador e alimentado, tal como por borbulhamento, dentro do produto de tratamento prévio enquanto o pH é monitorado até o pH desejado ser obtido. A temperatura pode ser trazida a uma temperatura que é compatível com a atividade da enzima de sacarificação, conforme registrado abaixo. Quaisquer cofatores requeridos para a atividade das enzimas utilizadas na sacarificação podem ser adicionados.

[050] A associação de enzima de sacarificação compreende uma ou mais enzimas selecionadas principalmente, mas não exclusivamente, do grupo das “glicosidases” que hidrolisam as ligações éter de di-, oligo-, e polissacarídeos e são encontradas na classificação de enzimas EC 3.2.1.x (Enzime Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA com Supplement 1 (1993), Supplement 2 (1994), Supplement 3 (1995), Supplement 4 (1997) e Supplement 5, [em Eur. J. Biochem. (1994) 223: 1-5, Eur. J. Biochem. (1995) 232: 1-6, Eur. J. Biochem. (1996) 237: 1-5, Eur. J. Biochem. (1997) 250: 1-6 e Eur. J. Biochem. (1999) 264: 610-650, respectivamente]) do grupo geral das “hidrolases” (EC3.). As glicosidases úteis no presente método podem ser categorizadas pelo componente da biomassa que elas hidrolisam. As glicosidases úteis para o presente método incluem as glicosidases que hidrolisam celulose (por exemplo, celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β-glucosidases), glicosidases que hidrolisam hemicelulose (por exemplo, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases), e glicosidases que hidrolisam amido (por exemplo, amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Em adição, pode ser útil adicionar outras atividades à associação da enzima de sacarificação tais como peptidases (EC 3.4.x.y), lipases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x), ligninases (EC 1.1.1.x), e estearases de feruloíla (EC 3.1.1.73), para auxiliar na liberação de polissacarídeos dos outros componentes da biomassa. É bem conhecido no estado da técnica que os microorganismos que produzem enzimas hidrolisantes de polissacarídeos exibem freqüentemente uma atividade, tal como a degradação da celulose, que é catalisada por diversas enzimas ou por um grupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato. Deste modo, uma “celulase” de um microorganismo pode compreender um grupo de enzimas, todos os quais podem contribuir para a atividade degradante da celulose. As preparações de enzimas comerciais e não comerciais, tais como celulase, podem compreender numerosas enzimas dependendo do esquema de purificação utilizado para obter a enzima. Portanto, a associação da enzima de sacarificação do presente método pode compreender a atividade da enzima, tal como a “celulase", entretanto, é reconhecido que esta atividade possa ser catalisada por mais de uma enzima.

[051] As enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente, tal como a celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) e xilanase Multifect® (Genencor). Em adição, as enzimas de sacarificação podem ser produzidas biologicamente, incluindo a utilização de microorganismos recombinantes.

[052] Um técnico no assunto saberia como determinar a quantidade eficaz de enzimas para o uso nas associações e ajustar as condições para a atividade ótima da enzima. Um técnico no assunto também saberia como otimizar as classes de atividades de enzimas requeridas dentro da associação para obter a sacarificação ótima de um dado produto de tratamento prévio sob as condições selecionadas.

[053] De preferência, a reação de sacarificação é realizada na, ou próxima a, temperatura e pH ótimo para as enzimas de sacarificação. A temperatura ótima utilizada na associação de enzima de sacarificação no presente método varia de cerca de 15SC a cerca de 100SC. Em outra realização, a temperatura ótima varia de cerca de 20-C a cerca de 80SC. O pH ótimo pode variar de cerca de 2 a cerca de 11. Em outra realização, o pH ótimo utilizado na associação de enzima de sacarificação no presente método varia de cerca de 4 a cerca de 10.

[054] A sacarificação pode ser realizada por um período de tempo de muitos minutos a cerca de 120 horas e, de preferência, de cerca de muitos minutos a cerca de 48 horas. O tempo para a reação irá depender da concentração da enzima e da atividade específica, bem como, do substrato utilizado e as condições ambientais, tais como temperatura e pH. Um técnico no assunto pode prontamente determinar as condições ótimas de temperatura, pH e tempo a serem utilizadas com um substrato particular e com a(s) associação(ões) de enzima(s) de sacarificação.

[055] A sacarificação pode ser realizada em batelada ou como um processo contínuo. A sacarificação também pode ser realizada em uma etapa, ou uma série de etapas. Por exemplo, as diferentes enzimas requeridas para a sacarificação podem exibir diferente pH ou temperatura ótima. Um primeiro tratamento pode ser realizado com a(s) enzima(s) em uma temperatura e pH, seguida pelo segundo ou terceiro (ou mais) tratamentos com diferente(s) enzima(s) em diferente(s) temperatura(s) e/ou pH. Em adição, o tratamento com as diferentes enzimas em etapas seqüenciais pode ser no mesmo pH e/ou temperatura, ou diferentes pHs e temperaturas, tais como utilizando as hemicelulases estáveis e mais ativas em maiores pHs e temperaturas, seguido pelas celulases que são ativas em baixos pHs e temperaturas.

[056] O grau de solubilização dos açúcares da biomassa seguida da sacarificação pode ser monitorado pela medida da liberação dos monossacarídeos e oligossacarídeos. Os métodos para a medida de monossacarídeos e oligossacarídeos são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, a concentração de açúcares redutores pode ser determinada utilizando o ensaio do ácido 1,3-dinitrosalicílico (DNS) (Miller, G. L., Anal. Chem. (1959) 31: 426-428). Alternativamente, os açúcares podem ser medidos por HPLC utilizando uma coluna apropriada conforme descrito abaixo no presente, na seção de Métodos Gerais.

[057] Os açúcares fermentáveis liberados da biomassa podem ser utilizados pelos microorganismos apropriados para produzir alvos químicos.

Seguindo a sacarificação, mas antes da fermentação, a mistura da sacarificação pode ser concentrada por evaporação, por exemplo, para aumentar a concentração de açúcares fermentáveis. Opcionalmente, o líquido no produto de sacarificação pode ser separado dos sólidos em um método contínuo ou em batelada. Opcionalmente, o líquido ou todo o produto de sacarificação pode ser esterilizado antes da fermentação. Dependendo do(s) microorganismo(s) utilizado(s) durante a fermentação e do pH utilizado durante a sacarificação, o pH pode ser ajustado para aquele apropriado para a fermentação. Em adição, a mistura de sacarificação pode ser suplementada com nutrientes adicionais requeridos para o crescimento microbiano. Os suplementos podem incluir, por exemplo, extrato de levedura, aminoácidos específicos, fosfato, fontes de nitrogênio, sais e elementos traços. Os componentes requeridos para a produção de um produto específico, feito por um biocatalisador específico, também podem ser incluídos, tais como um antibiótico para manter um plasmídeo ou um cofator requerido em uma reação catalisada por enzima. Os açúcares adicionais também podem ser incluídos para aumentar a concentração total de açúcares. A mistura de sacarificação pode ser utilizada como um componente em um caldo de fermentação, por exemplo, perfazendo entre cerca de 100% e cerca de 10% do meio final.

[058] A temperatura e/ou os gases de vapor (headspace) também podem ser ajustados, dependendo das condições úteis para a fermentação do(s) microorganismo(s). A fermentação pode ser aeróbia ou anaeróbia. A fermentação pode ocorrer subseqüente à sacarificação, ou pode ocorrer concomitantemente à sacarificação pela sacarificação e fermentação simultânea (SSF). A SSF pode manter os níveis de açúcar baixo, produzidos pela sacarificação, reduzindo desta maneira a inibição potencial do produto das enzimas de sacarificação, reduzindo a disponibilidade do açúcar para os microorganismos contaminantes, e melhorando a conversão da biomassa tratada previamente para monossacarídeos e para oligossacarídeos.

[059] Os alvos químicos que podem ser produzidos pela fermentação incluem, por exemplo, ácidos, álcoois, alcanos, alquenos, aromáticos, aldeídos, cetonas, biopolimeros, proteínas, peptídeos, aminoácidos, vitaminas, antibióticos e produtos farmacêuticos. Os álcoois incluem, mas não estão limitados a, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol e sorbitol. Os ácidos incluem o ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, 3-hidroxipropiônico, ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico e ácido levulínico. Os aminoácidos incluem o ácido glutâmico, ácido aspártico, metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina e tirosina. Os alvos químicos adicionais incluem metano, etileno, acetona e enzimas industriais.

[060] A fermentação de açúcares a alvos químicos pode ser realizada por um ou mais catalisadores apropriados em fermentações únicas ou em múltiplas etapas. Os biocatalisadores podem ser microorganismos selecionados a partir da bactéria, fungos filamentosos e leveduras. Os biocatalisadores podem ser os microorganismos do tipo selvagem ou microorganismos recombinantes, e incluem a Escherichia, Zymomonas, Saccharomyces, Candida, Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Em outra realização, os biocatalisadores podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces cerevisiae, Clostridia thermocellum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Pichia stipitis recombinantes.

[061] Muitos biocatalisadores utilizados na fermentação para produzir os alvos químicos foram descritos e outros podem ser descobertos, produzidos através de mutação ou manipulado através dos meios de recombinação. Qualquer biocatalisador que utiliza os açúcares fermentáveis produzidos no presente método pode ser utilizado para fabricar o(s) alvo(s) químico(s) que é conhecido por produzir, por fermentação no presente método.

[062] A fermentação dos carboidratos a acetona, butanol e etanol (fermentação ABE) pelos solvotogênicos Clostridia é bem conhecida (Jones and Woods (1986) Microbiol. Rev. 50: 484-524). Um processo de fermentação para a produção de altos níveis de butanol, e que também produz acetona e etanol, utilizando uma cepa mutante de um Clostridium acetobutylicum é descrito no documento US 5.192.673. O uso de uma cepa mutante de Clostridium beijerinckii para a produção de altos níveis de butanol, e que também produz acetona e etanol, é descrito no documento US 6.358.717. As cepas modificadas geneticamente de E. coli também foram utilizadas como biocatalisadores para a produção de etanol (Underwood et al., (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68: 6263-6272). Uma cepa modificada geneticamente de Zymomonas mobilis que possui uma produção aprimorada de etanol é descrita no documento US 2003/0162271 A1.

[063] O ácido láctico foi produzido em fermentações pelas cepas recombinantes de E. coli (Zhou et al., (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 399-407), cepas naturais de Bacillus (documento US 2005/0250192), e Rhizopus oryzae (Tay e Yang (2002) Biotechnol. Bioeng. 80: 1-12). As cepas recombinantes de E. coli foram utilizadas como biocatalisadores na fermentação para produzir 1,3-propanodiol (documentos US 6.013.494, US 6.514.733), e ácido adípico (Niu et al., (2002) Biotechnol. Prog. 18: 201-211). O ácido acético foi feito pela fermentação utilizando Clostridia recombinante (Cheryan et al., (1997) Adv. Appl. Microbiol. 43: 1-33), e cepas de leveduras recém identificadas (Freer (2002) World J. Microbiol. Biotechnol. 18: 271-275). A produção de ácido succínico pela E. coli recombinante e outra bactéria é descrita no documento US 6.159.738, e pelo mutante de E. coli recombinante (em Li net al., (2005) Metab. Eng. 7: 116-127). O ácido pirúvico foi produzido pela levedura mutante Torulopsis glabrata (Li et al., (2001) Appl. Microbiol Technol. 55: 680-685) e pelo mutante E. coli (Yokota et al., (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 2164-2167). As cepas recombinantes de E. coli utilizadas como biocatalisadores para a produção de ácido para-hidroxicinâmico (documento US 2003/0170834) e ácido quínico (documento US 2006/0003429).

[064] Um mutante de Propionibacterium acidipropionici foi utilizado na fermentação para produzir ácido propiônico (Suwannakham e Yang (2205) Biotechnol. Bioeng. 91: 325-337), e ácido butírico foi utilizado pelo Clostridium tyrobutyricum (Wu e Yang (2003) Biotechnol. Bioeng. 82: 93-102). O propionato e o propanol foram feitos pela fermentação da treonina pela cepa de Clostridium sp. 17cr1 (Janssen (2004) Arch. Microbiol. 182: 482-486). Uma Aureobasidium pullulans do tipo levedura foi utilizada para fazer ácido glucônico (Anantassiadis et al., (2005) Biotechnol. Bioeng. 91: 494-501), por um mutante de Aspergillis niger (Singh et al., (2001) Indian J. Exp. Biol. 39: 1136-43). O ácido 5-ceto-D-glucônico foi feito por um mutante de Gluconobacter oxydans (Elfari et al., (2005) Appl Microbiol. Biotech. 66: 668-674), o ácido itacônico foi produzido pelos mutantes de Aspergillus terreus (Reddy e Singh (2002) Bioresour. Technol. 85: 69-71) o ácido cítrico foi produzido por um mutante de cepa de Aspergillus niger (Ikram-UI-Haq et al., (2005) Bioresour. Technol. 96: 645-648), e o xilitol foi produzido pela Candida guilliermondii FTI 20037 (Mussatto e Roberto (2003) J. Appl. Microbiol. 95: 331-337). Os biopoliésteres que contém 4-hidroxivalerato, e que também contém quantidades significativas de ácido 3-hidroxibutírico e ácido 3-hidroxivalérico, foram produzidos pelos Pseudomonas putida e Ralstonia eutropha (Gorenflo et al., (2001) Biomacromolecules 2: 45-57). O L-2,3-butanodiol foi feito pela E. coli recombinante (Ui et al., (2004) Lett. Appl. Microbiol. 39: 533-537).

[065] A produção de aminoácidos pela fermentação foi acompanhada utilizando cepas auxotróficas e cepas resistentes com aminoácidos análogos de Corynebacterium, Brevibacterium e Serratia. Por exemplo, a produção de histidina utilizando uma cepa resistente a um análogo de histidina é descrita na patente JP 8596/81 e utilizando uma cepa recombinante é descrita no documento EP 136.359. A produção de triptofano utilizando uma cepa resistente a um análogo de triptofano é descrita nas patentes JP 4505/72 e JP 1937/76. A produção de isoleucina utilizando uma cepa resistente a uma isoleucina análoga é descrita nas patentes JP 38995/72, JP 6237/76 e JP32070/79. A produção de fenilalanina utilizando uma cepa resistente a uma fenilalanina análoga é descrita na patente JP 10035/81. A produção de tirosina utilizando uma cepa que requer fenilalanina para o crescimento, resistente à tirosina (Agr. Chem. Soc. Japan 50 (1) R79-R87 (1976), ou uma cepa recombinante (EP 263515, EP 332234)), e a produção de arginina utilizando uma cepa resistente a um análogo de L-arginina (Agr. Biol. Chem. (1972) 36: 1675-1684, patentes JP 37235/79 e JP 150381/82) foram descritas. A fenilalanina também foi produzida pela fermentação em cepas de Eschericia coli ATCC 31882, 31883 e 31884. A produção de ácido glutâmico em uma bactéria corineforme recombinante é descrita no documento US 6.962.805. A produção de treonina por uma cepa mutante de E. coli é descrita em Okamoto e Ikeda (2000) J. Biosci Bioeng. 89: 87-79. A metionina foi produzida por uma cepa mutante de Corynebacterium lilium (Kumar et al., (2005) Bioresour. Technol. 96: 287-294).

[066] Os peptídeos, as enzimas e outras proteínas úteis também foram feitas por biocatalisadores (por exemplo, nos documentos US 6.861.237, US 6.777.207 e US 6.228.630).

[067] O tratamento prévio e a sacarificação da biomassa em açúcares fermentáveis, seguidos pela fermentação de açúcares a alvo químico, é exemplificado no Exemplo 9 do presente, para a produção de etanol a partir de espigas de milho tratadas previamente utilizando o Z. mobilis como o biocatalisador para a fermentação de açúcares a etanol. O método da presente invenção também pode ser útil para a produção de 1,3-propanodiol a partir da biomassa. A biomassa é submetida ao tratamento prévio e à sacarificação, de acordo com a presente invenção; seguida (ou durante) da sacarificação, a E. coli é utilizada para produzir 1,3-propanodiol conforme descrito no Exemplo 10 do presente.

[068] O alvo químico produzido na fermentação por biocatalisadores pode ser recuperado utilizando diversos métodos conhecidos no estado da técnica. Os produtos podem ser separados dos outros componentes da fermentação pela centrifugação, filtração, microfiltração e nanofiltração. Os produtos podem ser extraídos por trocas de íons, extração por solvente ou eletrodiálise. Os agentes de floculação podem ser utilizados para auxiliar na separação do produto. Como um exemplo específico, o 1-butanol bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentação utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica para as fermentações ABE (vide, por exemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49; 639-648 (1998), Groot et al., Process. Biochem. 27: 61-75 (1992), e suas referências no presente). Por exemplo, os sólidos podem ser removidos do meio de fermentação por centrifugação, filtração, decantação ou similares. Então, o 1-butanol pode ser isolado do meio de fermentação utilizando os métodos, tais como destilação, destilação azeotrópica, extração líquido-líquido, adsorção, esvaziamento de gás, evaporação de membrana ou pervaporação. A purificação do 1,3-propanodiol dos meios de fermentação pode ser acompanhado, por exemplo, ao submeter a mistura de reação à extração com um solvente orgânico, destilação e cromatografia por coluna (documento US 5.356.812). Um solvente orgânico particularmente bom para este processo é o ciclo-hexano (documento US 5.008.473). Os aminoácidos podem ser coletados pelo meio de fermentação pelos métodos tais como resina de adsorção de troca iônica e/ou cristalização.

Exemplos Métodos Gerais e Materiais [069] São utilizadas as seguintes abreviações: “HPLC” é Cromatografia Líquida de Alta Performance, “C” é centígrado, “kPa” é quiloPascal, “m” é metro, “mm” é milímetro, “kW” é quilowatt, “pm” é micrometro, “pL” é microlitro, “mL” é milímetro, “L” é litro, “min” é minuto, “mM” é milimolar, “cm” é centímetro, “g” é grama, “kg” é quilograma, “p" é peso, “h” é hora, “temp" ou “T” é temperatura, “teori” é teórico, “trat. pr.” é tratado previamente, “DWB” é o peso seco da biomassa.

[070] O ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida, extrato de levedura, ácido 2-morfolinoetanossufônico (MES), fosfato de potássio, glicose, xilose, triptona, cloreto de sódio e ácido cítrico foram obtidos pela Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Reatores de Tratamento Prévio Reator Zipperclave® [071] O reator Zipperclave® de 4 litros (Autoclave Engineers, Erie, PA) é um recipiente de pressão por batelada equipado com um balde Hastelloy® de 2,5 litros para o carregamento de biomassa e um agitador para misturar a biomassa. O recipiente de reação é cercado por um aquecedor elétrico controlado em uma temperatura de tratamento prévio desejada. A injeção da corrente direta também é utilizada para trazer rapidamente a biomassa até a temperatura de tratamento prévio. A pressão da corrente é ajustada e controlada para manter a temperatura de tratamento prévio desejada. O condensado do vapor formado pelo aquecimento do prato cabeça, recipiente e exterior ao balde do reator Zipperclave®, drenam a um reservatório formado entre o balde e a parede interna do reator, para evitar a diluição excessiva da calda tratada previamente.

Reator Jaygo [072] O reator Jaygo é um reator do tipo palheta horizontal (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ, EUA) de 130 litros (cerca de 51 cm de diâmetro x 91 cm de comprimento), fabricado pela liga Hastelloy® C-22. O reator é equipado com um revestimento de vapor capaz de aquecer a cerca de 177QC (862 kPa). A injeção direta de vapor também é utilizada para trazer rapidamente a biomassa para a temperatura de tratamento prévio. A pressão de vapor é ajustada e controlada para manter a temperatura de tratamento prévio desejada. Numerosas interfaces de comunicação permitem a injeção de outros solventes e líquidos quentes.

Reator de Pistola de Vapor no Sistema de Digestão em Batelada [073] O reator de pistola de vapor de 4 litros (Autoclave Engineers, Erie, PA) é um reator revestido por vapor que consiste em um comprimento de 102 mm sincronizado com um cano Hastelloy® 80 fechado por duas válvulas bola. Os aquecedores elétricos adicionais são colocados em toda a superfície exposta, não envolta do reator, e controlada em um ponto fixado da temperatura de tratamento prévio. A injeção de vapor direta também é utilizada para trazer rapidamente a biomassa à temperatura de tratamento prévio. A pressão de vapor é ajustada e controlada para manter a temperatura de tratamento prévio desejada. O fundo do reator é estreitado a 51 mm. Todo o material tratado previamente sai através de um molde substituível no fundo do reator e é coletado em uma bolsa de náilon (Hotfill®) de 0,21 m3 sustentada dentro de um tanque forte mente cercado, revestido e resfriado.

Disco de refinamento [074] O disco de refinamento é um refinador modelo Waldron Sprout de 30,5 cm (Andritz, Inc., Muncy, PA) equipado com um motor elétrico de 11 kW, O intervalo entre os pratos estacionários e os giratórios é variável. A velocidade da verruma de alimentação também é variável, de 0 a 88 rpm. A entrada do refinador foi modificada com seis interfaces de conexão de injeção para permitir a introdução do vapor, água quente ou outros gases e líquidos de varredura exatamente à frente do prato giratório do refinador. O refinador era equipado com pratos (Durametal, Corp., Tulatin, OR) no padrão D2A506 em Ni-Hard ou padrão 18034-A em Ni-Hard.

Reator de Tratamento Prévio e de Hidrólise Enzimática (PEHR1 [075] O PEH Reator de 9L (construído em NREL, Golden, CO; vide o pedido de patente provisório US CL3447) possui um recipiente de reação de aço inoxidável de cerca de 15 cm x 51 cm com uma lança de injeção para a introdução dos reagentes de processamento. A lança de injeção é conectada utilizando uma junta giratória a uma interface de conexão em um revestimento, em uma extremidade do recipiente que possui uma interface de conexão adicional para acessar o recipiente. Quatro septos percorrem o comprimento da parede do recipiente e são ligados perpendicularmente à parede. Os septos e 22 cilindros dos meios de atrito de cerâmica de 3,2 cm x 3,2 cm (E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH), que flutuam livremente no recipiente, aplicam a mistura mecânica à biomassa e ao reagente conforme o recipiente é rotacionado, promovendo a assimilação do reagente na biomassa. O PEH Reator é colocado em um Equipamento Bellco Cell-Production Roller (Bellco Technology, Vineland, NJ, EUA) que fornece um mecanismo para a rotação, e o reator com o equipamento de cilindros é alojado em uma câmara de temperatura controlada que fornece calor, Pode ser aplicado vácuo e pressão ao recipiente de reação ao ligar as fontes externas na interface de conexão da lança do revestimento. Métodos Analíticos Quantificação da Celulose [076] A quantidade de celulose em cada amostra de biomassa de partida foi determinada utilizando os métodos bem conhecidos no estado da técnica, tais como ASTM E1758-01 "Método padrão para a determinação de carboidratos por HPLC”.

Medidas do Teor de Açúcar, Acetamida» Ácido Láctico e Ácido Acético [077] Os açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose arabinose e manose), acetamida, ácido láctico e ácido acético em caldo de sacarificação foram medidos por HPLC (Agilent Model 1100, Agilent Technologies, Paio Alto, CA) utilizando as colunas Bio-Rad HPX-87P e Bio-Rad HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com colunas guarda apropriadas. O pH amostra foi medido e ajustado a 5-6 com ácido sulfúrico, se necessário. A amostra foi então passada através de um filtro de seringa de 0,2 pm diretamente em uma ampola de HPLC. As condições da corrida de HPLC foram como segue: - Biorad Aminex HPX-87P (para carboidratos): - Volume de injeção: 10 - 50 μL, dependente da concentração e dos limites do detector - Fase móvel: água de grau HPLC, 0,2 pm filtrado e degaseificado - Velocidade de fluxo: 0,6 ml_/ minuto - Temperatura da coluna: 80 a 85-C, temperatura da coluna guarda < 60eC - Temperatura do detector: o mais próximo possível da temperatura da coluna principal - Detector: índice de retração - Tempo da Corrida: 35 minutos da coleta de dados mais 15 minutos de pós corrida (com possíveis ajustes para os compostos eluídos posteriormente) - Biorad Aminex HPX-87H (para carboidratos, acetamida, ácido láctico, ácido acético e etanol): - Volume de injeção: 5-10 pL, dependente da concentração e dos limites do detector - Fase móvel: ácido sulfúrico a 0,01 N, 0,2 pm filtrado e degaseificado - Velocidade de fluxo: 0,6 mU minuto - Temperatura da coluna: 55SC - Temperatura do detector: o mais próximo possível da temperatura da coluna * Detector: índice de retração - Tempo da Corrida: 25 a 75 minutos da coleta de dados [078] Após a corrida, as concentrações na amostra foram determinadas a partir das curvas padrão para cada um dos componentes.

Exemplo 1 Tratamento Prévio da Forragem em Alta Concentração de Biomassa.

Alta Temperatura e Comparação das Concentrações de Amõnia [079] O recipiente do reator Zipperclave® e o prato cabeça foram aquecidos previamente a uma temperatura de tratamento prévio alvo antes da introdução da carga de biomassa ao circular o vapor dentro do reator e ventilar diversas vezes. O condensado formado durante o aquecimento prévio foi removido por aspiração a vácuo antes do tratamento prévio. O balde Hastelloy® foi carregado com 0,635 cm (1/4 de polegada) de forragem moída (100 g, com base em peso seco) e inserido dentro do reator pré aquecido. O agitador do reator foi fixado em 20 rpm enquanto um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente interno e a à carga de biomassa. A solução de hidróxido de amônio de força necessária para fornecer um peso seco da concentração de biomassa de 30% em peso com relação ao peso da mistura de amônia aquosa e biomassa, bem como a concentração de amônia desejada listada na Tabela 1, foi injetada próxima ao fundo do recipiente com um bocal do tipo spray. As amostras de teste possuíam uma concentração de amônia final de 12% com relação ao peso seco da biomassa, enquanto as amostras com uma concentração de amônia final de 35% com relação ao peso seco da biomassa foram utilizadas como meio de comparação. Quando a temperatura da carga de biomassa atingiu 50QC, o vapor foi introduzido próximo ao fundo do reator para fluidizar e aumentar a temperatura da carga de biomassa a 140SC ou 170SC. Ao final do tratamento prévio, o reator foi despressurizado através de um condensador de ventilação, e um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado por 3 minutos para diminuir a temperatura e remover a amônia adicional da calda tratada previamente antes da abertura do reator e da recuperação da biomassa tratada previamente.

[080] Toda a calda não lavada, de tratamento prévio contendo 0,5 g de celulose (com base na composição inicial de matéria prima) foi adicionada em um volume final de 50 mL a um frasco de agitação de 125 mL. O ácido acético (10 a 100 pL) foi adicionado, para titular o pH da biomassa tratada previamente com amônia a 5,0 antes da adição de enzima por causa da sensibilidade das enzimas a ambientes de pH elevado. O pH foi controlado a 5,0 durante a sacarificação pela adição de 50 mM de tampão citrato e a temperatura foi mantida a 50eC. A celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY, EUA) foi adicionada à concentração listada para cada amostra na Tabela 1. O teor de açúcar no caldo da sacarificação resultante foi determinado após 96 horas de sacarificação de acordo com a medida do protocolo descrito nos Métodos Gerais. A liberação de açúcar após 96 horas é mostrada na Tabela 2. Os controles para este experimento foram (1) forragem de milho não tratado, que rendeu 23% do rendimento teórico de glicose (utilizando 56 mg de celulase/ g de celulose) e (2) vapor (140®C) de forragem de milho tratado previamente, que rendeu 40% do rendimento teórico de glicose (utilizando 56 mg de celulase/ g de celulose); a xilose não foi medida para os controles.

Tabela 1 Liberação do Açúcar a Partir da Forragem de Milho Tratada Previamente COm 96 Horas de Sacarificação [081 ] DWB: peso seco da biomassa.

[082] Estes resultados indicam que um tratamento prévio utilizando amônia a 12% por 15 minutos a 14QeC, seguido pela sacarificação, libera mais glicose e xilose do que o tratamento prévio na utilização de amônia a 35% por 5 minutos a 140-C, Desse modo, as vantagens de utilizar baixa concentração de amônia pode ser incorporada por um pequeno aumento no tempo do tratamento prévio.

Exemplo 2 Tratamento Prévio da Forragem em Alta Concentração de Biomassa.

Baixa Temperatura e Concentração Muito Baixa de Amônia [083] O reator Jaygo foi carregado com 0,635 cm de forragem moída (13 Kg, base de peso seco). Um vácuo (67,7 kPa) foi aplicado ao vaso, e a solução de hidróxido de amônio diluída foi injetada para fornecer uma concentração de amônia de 6,2 g de amônia/100 g de peso seco da biomassa e um peso seco da concentração de biomassa de 30% em peso com relação ao peso total da mistura amônia aquosa e biomassa. O vácuo foi aliviado e o vapor foi aplicado ao revestimento para aquecer a forragem a 100aC. A forragem encharcada foi mantida na temperatura por 8 horas com mistura constante a 32 rpm, então deixada resfriar ao longo da noite com mistura contínua da calda resultante.

[084] A calda de tratamento prévio não lavada e inteira contendo 0,5 g de celulose (com base na composição de matéria prima inicial) foi adicionada em um volume final de 50 ml_ a um frasco de agitação de 125 ml_. O ácido acético (10-100 pl_) foi adicionado, caso necessário para titular o pH da biomassa tratada previamente com amônia a 5,0 antes da adição da enzima por causa da sensibilidade das enzimas aos ambientes de pH elevado. O pH foi controlado a 5,0 durante a sacarificação pela adição de 50 mM de tampão citrato, e a temperatura foi mantida a 50SC. A celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, Nova Iorque, EUA) foi adicionada a 56 mg/ g de celulose. O teor de açúcar do caldo de sacarificação resultante foi determinado após 96 horas de sacarificação de acordo com os protocolos de medidas de açúcar descritos nos Métodos Gerais e é mostrado na Tabela 2.

Tabela 2 Liberação do Açúcar das Forragens de Milho Previamemte Tratadas a 96 Horas [085] Os resultados indicam que estas condições de tratamento prévio de concentrações muito baixas de amônia e baixas temperaturas (por um período de 8 horas) são tão eficazes quanto utilizar 12% de amônia a 140eC por 15 minutos.

Exemplo 3 Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Alta Concentração de Biomassa.

Baixa Temperatura, e Concentração Muito Baixa de Amônia Seguida pela Sacarificacão com Alta Concentração de Biomassa [086] As espigas de milho inteiras ou fracionadas (cerca de 13 kg, base de peso seco) foram colocadas no reator Jaygo. As espigas foram fracio nadas ao passar através do refinador em disco (Métodos Gerais) equipado com pratos G-2975. As espigas de milho fracio nadas resultantes foram passadas através de uma malha de 1,27 cm. Quaisquer pedaços retidos foram passados através do refinador em disco novamente com uma fenda menor de 0,5 cm. Foi aplicado vácuo ao reator e a solução de hidróxido de amônia diluída foi injetada para fornecer a concentração amônia final desejada (2% ou 6%), e a concentração de biomassa seca (30% ou 40%) como dado na Tabela 3. O vácuo foi aliviado e o vapor foi aplicado ao revestimento para aquecer as espigas de milho enquanto eram encharcadas a uma temperatura de 93eC para a amostra de espiga inteira e 85ÔC para as amostras de espigas fracionadas. Os períodos curtos de maiores velocidades do agitador (até 96 rpm) foram aplicados em uma tentativa de aumentar a velocidade de aquecimento. As espigas encharcadas foram mantidas em uma temperatura por 4 ou 8 horas com agitação constante a 32 rpm e então deixadas resfríar ao longo da noite com agitação contínua.

[087] Antes da biomassa tratada previamente ter sido removida do reator, o reator foi colocado sob vácuo a 90SC para retirar a amôria da biomassa tratada previamente. Antes da sacarificaçâo, o pH da biomassa de espiga de milho tratada previamente foi ajustado a 5,5 com ácido cítrico sólido. Cerca de 10 kg de espiga de milho inteira tratada previamente foi sacarifiçada em um reator Jaygo a 5ÜSC. Cerca, de 1,400 g da espiga de milho fracionada tratada previamente foram adicionados ao PEH Reator, junto com 22 cilindros de atrito de cerâmica ¢3,2 cm de diâmetro x 3,2 cm de comprimento; E. R, Advanced Ceramics, East Palestine, OH) para sacarificaçâo. Uma mistura de enzima de 28 mg de celulose Spezyme CP®/ g em forragem não tratada mais 28 mg/ g de celulose Multifect Xylanase® foi utilizada para cada reação de sacarificaçâo, O peso seco final da concentração de biomassa no início de cada sacarificaçâo era 30% com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificaçâo da biomassa tratada previamente. O PEHReator foi rotacionado axialmente a 19 rpm enquanto manteve uma temperatura de 50®C. O conteúdo de açúcar do caldo de sacarificaçâo resultante foi determinado de acordo com o protocolo de medidas de açúcar nos Métodos Gerais. A liberação do açúcar após 96 horas é mostrada na Tabela 3.

Tabela 3 Liberação de Açúcar das Espigas oe Milho Previamente Tratadas Utilizam do uma Alta Concentração de Biomassa (em Peso Seco) Durante a Sacarircacão [088] DWB: peso seco de biomassa (a porcentagem é calculada com relação ao peso total da mistura).

Exemplo 4 Tratamento Prévio oa Espiga de Milho em Alta Concentração de Bíomassa, Baixa Temperatura, e Concentração Muito Baixa de Amónia Seguida pela Sacarificacão de Alta Concentração de Bíomassa [089] As espigas de milho fracionadas (13 kg, base seca) foram colocadas no reator Jaygo. Após aplicar um vácuo no reator, a solução de hidróxido de amônio de força apropriada para fornecer 2% de amônia e 30% de peso seco da concentração de biomassa foi bombeada dentro do reator a 32 rpm de mistura na temperatura ambiente. Os conteúdos do reator foram então aquecidos a 95aC utilizando um revestimento de vapor de baixa pressão. Uma vez que o reator atingiu 95SC, uma injeção de vapor direta foi utilizada para aquecer os conteúdos do reator a 145eC. Quando o reator atingiu 145SC, os conteúdos do reator foram mantidos a essa temperatura por 20 min utilizando o vapor do revestimento e alguma injeção de vapor direta. Após 20 minutos, foi aplicado um vácuo na ventilação ao reator e o motor de desfibração foi ligado por 5 minutos. Após 1 hora, a água fria foi ligada no revestimento. Os teores do reator Jaygo foram resfriados entre 33eC e 37aC; então foi utilizado C02 para pressurizar o reator a 138 kPa. O C02 pressurizado da atmosfera foi mantido por 30 minutos. A temperatura final dos conteúdos do reator era entre 27BG e 31SC. O pH da biomassa encharcada/ tratada previamente foi de cerca de 7,5.

[090] A biomassa tratada previamente foi removida do reator Jaygo e transferido ao PEHReator para a sacarificação e um peso seco final da concentração de biomassa no início da sacarificação de 30% com relação ao peso total da mistura de associação de enzima sacarificada de biomassa tratada previamente. O pH foi então ajustado a 5,5 com ácido cítrico sólido, e o material digerido com 28 mg de celulose Spezyme CP®/ g e 28 mg/ g de celulose Multifect Xylanase®/ g em espiga não tratada conforme descrito no Exemplo 3. O teor de açúcar do caldo de sacarificação resultante foi determinado de acordo com o protocolo de medidas de açúcar nos Métodos Gerais. A liberação do açúcar após 96 horas de digestão é mostrada na Tabela 4.

Tabela 4 Liberação de Acúcar das Espigas de Milho Tratadas Previamente Utilizando uma Alta Concentração de Biomassa íem Peso Seco) Durante a Sacarificação Exemplo 5 Tratamento Prévio com Adição de Plastificante [091] A espiga de milho inteira foi tratada previamente conforme descrito no Exemplo 3 em peso seco da concentração de biomassa de cerca de 30% com relação ao peso total de mistura de amônía aquosa e biomassa, 100SC, por 8 horas no reator Jaygo com 3% em peso com relação ao peso seco da biomassa de glicerol adicionado para agir como um plastificante. Após o tratamento prévio o pH do material resultante foi ajustado a 5 com ácido cítrico sólido. A espiga tratada previamente foi então digerida conforme descrito no Exemplo 3. Uma mistura de enzima de 28 mg de celulose Spezyme CP®/ g em forragem não tratada mais 28 mg/ g de celulose Multifect Xylanase® em espiga não tratada foi utilizada. Após 96 horas de digestão, a concentração de glicose era de 92,3 g/Lea concentração de xilose era de 54,4 g/ L.

Exemplo 6 Refinamento do Disco da Biomassa Tratada Previamente [092] A forragem foi tratada previamente da maneira conforme descrita no Exemplo 1, com amostras diferentes possuindo baixa concentração de amônia (12%) ou concentrações comparativas de amônia (35%), e condições de temperatura, tempo e enzima conforme listado na Tabela 5. As espigas inteiras foram tratadas previamente conforme descrito no Exemplo 3 com diferentes amostras possuindo concentrações muito baixas de amônia (3% ou 6%), e outras condições conforme listadas na Tabela 5. Seguindo o tratamento prévio, as amostras foram passadas através de um refinador de disco Sprout Waldron. A fenda entre o prato estacionário e o prato giratório foi fixada a 0,254 mm (0,010 polegadas) e a velocidade de alimentação da verruma a 7 rpm. O material refinado foi sacarificado conforme descrito no Exemplo 2 e o teor de açúcar do caldo de sacarificação resultante foi determinado de acordo com o protocolo de medida de açúcar nos Métodos Gerais. Os resultados da sacarificação a 96 horas são mostrados na Tabela 5. Os resultados mostraram que com a refinação do disco antes da sacarificação, foi obtido uma melhor digestibilidade, ou foi eficaz o uso de menores concentrações de enzima.

Tabela 5 DlGESTIBtLIPAPE DO MATERIAL TRATADO PREVIAMENTE QUE FOI REFINADO EM

DlSCO ANTES DA SACAR1FI CAÇÃO

Exemplo 7 Tratamento por Pistola de Vapor da Biqmassa Tratada Previamente [093] A forragem foi tratada previa mente conforme descrito no Exemplo 1 utilizando as condições de 30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de amônia aquosa e bíomassa, 6% em peso de amõnia com relação ao DWB, 100eC, 8 horas, no reator Jaygo. A espiga foi tratada previamente conforme descrita no Exemplo 3 utilizando as condições de 40% em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de amônia aquosa e bíomassa, 6% em peso de amônia com relação ao DWB, 93BC, 8 horas, no reator Jaygo. As amostras de cada biomassa tratada previa mente foram carregadas em um reator de pistola de vapor de 4 litros. O material tratado previamente foi submetido a 170-C por 5 min ou 140SC por 20 min antes de ser liberado através de um molde. O material resultante foi sacarifiçado conforme descrito no Exemplo 2. Os resultados são dados na Tabela 6 abaixo. Os resultados mostraram que o tratamento pela pistola de vapor antes da saca rif icação aprimorou a liberação de glicose.

Tabela 6 Digestibilidape do Material Tratado Previamemte Após o Tratamento por _________Pistola de Vapor___________________________________ Exemplo 8 Modelagem do Tratamento Prévio com Amônia Reciclada [094] As vantagens da reciclagem da amônia foram examinadas com os modelos Aspen (Aspen Technologies, Cambridge, MA, versão 12.1) para dois esquemas de tratamento prévio: baixa temperatura (85SC), tempo de residência longo (4 horas) e alta temperatura (l30eC), tempo de residência curto (20 min). Em cada modelo existiu uma série de 3 tanques flash operando em pressões sucessivamente menores após o reator de tratamento prévio para fornecer um meio para a reciclagem de amônia. Conforme a corrente de alimentação entrava em cada tanque, ela se dividia em vapor e frações líquidas devido a redução na pressão. A fração do vapor foi reciclada para o tratamento prévio, enquanto a fração líquida foi para a próxima etapa no processo. Assumindo que 2% em peso de amônia com relação ao DWB e cerca de 27% em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de amônia aquosa e biomassa no tratamento prévio, o fornecimento de amônia fresca e das correntes de reciclagem para cada processo é mostrado na Tabela 7. Em ambos os modelos, os tanques flash operaram de modo similar tal que a reciclagem da amônia foi similar. Em ambos os cenários, mais da metade da amônía requerida foi fornecida através de reciclagem, reduzindo a necessidade e o custo da amônia fresca.

Tabela 7 Amônia Reciclada no Tratamento Prévio - Modelo de Resultados de Aspen Exemplo 9 Produção de Etanol a partir de Biomassa Tratada Previamente com Baixa Concentração Amônia e Espiga de Milho Sacarificapa e Comparação à Forragem Tratada Previamente com Muita Amônia e Sacarificada [095] O hídrolisado de espiga foi gerado pelo tratamento prévio de espigas inteiras no reator Jaygo por 8 horas a 939C com 6% em peso de amônia com relação ao peso seco da biomassa em uma concentração de biomassa em peso seco de 40% com relação ao peso total da mistura de amônia aquosa da biomassa, conforme descrito no Exemplo 3. Após o tratamento prévio, a amônia foi removida por aquecimento do reator a 90-G sob vácuo. O pH da biomassa tratamento prévio foi ajustado a 5 com ácido sulfúrico. A biomassa tratamento prévio foi sacarificada no reator Jaygo a 30% em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente com 28 mg/g de celulose Spezyme® celulase e 28 mg/g de celulose Multifect® xilanase por 168 horas a 505C e pH 5. O hidrolisado resultante foi utilizado para a fermentação de Zymomonas mobilis 8b em fermentadores Sixfors (INFORS AG, Suíça). A Zymomonas mobilis 8b é uma cepa de Zymomonas mobilis que foi modificada geneticamente para fornecer, em relação ao tipo selvagem, uma produção melhorada de etanol e é descrita no pedido de patente US 2003/0162271 A1 (Exemplos IV, VI e XII). O hidrolisado da espiga compreende 78 g/L de glicose, 51 g/L de xilose, 6 g/L de acetamida e 7 g/L de ácido acético. O hidrolisado de espiga de milho foi utilizado a 40% e 80% de força, com o balanço do meio sendo o meio aquoso concentrado que consiste de extrato de levedura, e quantidades de KH2P04 em quantidades tais que suas concentrações na calda final foram cerca de 5 g/L e 2 g/L respectivamente. Adicionalmente, na calda 40% hidrolisada, a glicose e a xilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazer suas concentrações ao mesmo nível que nas caldas 80% hidrolisadas. A fermentação foi realizada a 37SC. A agitação nos fermentadores era de 100 rpm e o pH foi mantido a 5,5 por adição de KOH a 2N. Os resultados são mostrados na Tabela 8. Os açúcares e o etanol foram analisados conforme descrito nos Métodos Gerais.

[096] Para fins de comparação, a forragem hidrolisada foi gerada pelo tratamento prévio da forragem com 35% em peso de amônia com relação ao peso seco da biomassa em um peso seco da concentração de biomassa de cerca de 30% em peso com relação ao peso total da mistura de amônia aquosa e biomassa a 170-C por 5 minutos no reator Zipperclave®, conforme descrito no Exemplo 1. A biomassa tratada previamente foi digerida enzimaticamente a 30% em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente com 224 mg/g de celulose Spezyme CP® celulase a 50eC e pH 5 para gerar uma alta concentração de açúcar hidrolisado para o teste de fermentação. O hidrolisado resultante compreendeu 88 g/l de glicose, 52 g/L de xilose, 9 g/L de ácido acético e 15 g/L de ácido láctico. Para a produção de etanol, a Zymomonas mobilis 8b foi fermentada em calda hidrolisada de 40% ou 80% (v/v). O volume remanescente foi feito de meio aquoso concentrado que consiste em extrato de levedura, KH2P04 e tampão MES em quantidades tais que suas concentrações na calda final seria de cerca de 10 g/L, 2 g/L e 0,1 M, respectiva mente. Adicional mente, na calda hidrolisada a 40%, a glicose e a xilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazer suas concentrações ao mesmo nível que a calda hidrolisada a 80%. A fermentação foi feita a 30SC e a pH 6 em 25 ml de frascos de agitação com 20 ml de volume trabalhado. A agitação foi mantida a 150 rpm. A análise foi com relação à amostra de fermentação do hidrolisado da espiga e os resultados são dados na Tabela 8.

Tabelas Utilização do Acúcar e Rendimentos do Etanol na Fermentação dos Hidrolisados de Espiga de Milho e de Forragem [097] Estes resultados mostraram que a fermentação para produzir etanol a partir de hidrolisado de espiga de milho de tratamento prévio com baixa concentração de amônia foi mais eficiente do que da forragem de tratamento prévio com muita amônia.

Exemplo 10 Produção do 1,3-Propanodiol da Biomassa de Espiga Sacarificapa e Tratada Previamente com Concentração Muito Baixa de Amônia [098] O hidrolisado gerado pelo tratamento prévio e pela sacarificação da espiga foi fermentado para produzir 1,3-propanodiol. O hidrolisado foi gerado pelo tratamento prévio de pedaços de espiga no reator de pistola de vapor. A primeira espiga de biomassa foi carregada no PEHReator (descrito nos Métodos Gerais), foi aplicado o vácuo e foi injetada a solução de hidróxido de amônio diluída para fornecer uma concentração de amônia de 4 g de amônia/ 100 g de peso seco da biomassa e um peso seco da concentração de biomassa de 30 g de peso seco da biomassa/100 g da mistura de amônia aquosa e biomassa. O recipiente do reator foi carregado com amônia e espiga e foi rotacionado a 4®C por 30 minutos. Os teores foram transferidos para o reator de pistola de vapor (descrito nos Métodos Gerais), a temperatura aumentou a 145°C, e a mistura foi mantida na temperatura por 20 minutos. O material da pistola de vapor foí descarregado em um tanque flash e foi mantido o vácuo no tanque flash para auxiliar na remoção de amônia. Após o ajuste do pH, a biomassa tratada previamente foi sacarifiçada a 30 g em peso seco de biomassa/100 g de mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente com 28,4 mg/g de celulose Spezyme CP® celulase e 10,1 mg de proteína ativa/ g de associação de enzima de celulose que consiste em β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase por 72 horas a 50-C e pH 5,5. O hidrolisado resultante foi utilizado como uma fonte de açúcar fermentãvel para a conversão a 1,3-propanodiol pela cepa de E. coli recombinante RJ8n pBE93-kl. A construção da cepa RJ8n pBE93-k1 é descrita em detalhes no documento WO 2004/018645 (Exemplo 7), e é um derivado da cepa RJ8n, descrita no documento US 6.358.716. O hidrolisado foi utilizado a 10% com o balanço sendo o meio aquoso que consiste em 7,5 g/L de KH2P04, 2,0 g/L de ácido cítrico*H20, 4,0 ml/L de NH40H a 28%, 3,0 g/L de (NH4)2S04, 2,0 g/L de MgS04*7H20, 0,2 g/L de CaCI2*2H20, 0,33 g/L de citrato de amônio férrico, 0,5 g/L de extrato de levedura, 0,1 mg/L de vitamina B12, 1,0 mg/L de FeS04*7H20, 1 mg/L de ZnS04*7H20, 1 g/L de CuS04*5H20, 1 mg/L de CoCI2*6H20, 0,3 mg/L de MnS04*7H20, 1 g/L de H3B04, 0,10 g/L de NaMo04*2H20, 10 mg/L de NaCI, com o pH final ajustado a 6,8. As culturas foram iniciadas a partir de reservas congeladas (15% de glicerol como crioprotetor) em 50 mL de meio em um frasco embaçado de 250 mL. As culturas foram incubadas a 34SC e 300 rpm de agitação por 24 horas. A quantidade de 1,3-propanodiol produzida foi medida por HPLC sob as seguintes condições: - Coluna: Showdex SH1011 - Volume de amostra: 20 pL

- Fase móvel: H2SO4 a 0,01 N - Velocidade de fluxo: 0,5 ml_/ minuto - Temperatura da coluna: 50SC - Detector: conjunto de fotodiodo Waters 996 - Temperatura do detector: 40SC - Tempo da Corrida: 40 minutos [099] Os resultados são mostrados na Tabela 9 abaixo. Os produtos da fermentação da glicose pela cepa RJ8n pBE93-k1 de E. coli incluem 0 glicerol (um metabólito intermediário) e o 1,3-propanodiol. Os experimentos foram realizados em frascos duplicados e testados a 24 horas. Neste sistema, a glicose no hidrolisado foi convertida a ambos 0 glicerol e 0 1,3-propanodiol.

Tabela9 Utilização dq Substrato e Formação do Produto pela Fermentação com E, cou Exemplo 11 Formação da Acetamida Durante o Tratamento Prévio [0100] As amostras derivadas de espigas de milhos tratadas previamente de acordo com os processos descritos no Exemplo 3 e Exemplo 4 foram analisadas para determinar os destinos dos grupos acetila na biomassa. Os caldos do tratamento prévio (mistura do tratamento prévio com sólidos insolúveis removidos) foram analisados quanto ao teor de ácido acétieo e acetamida conforme segue. O pH de cada amostra foi ajustado a cerca de 3 com H2S04 (72%). Para as medidas de acetamida, a amostra foi passada através de um filtro de 0,2 pm e analisadas por HPLC de acordo com as condições listadas abaixo. Para as medidas de acetato total (inclui o acetato presente como ácido acético e acetamida}, a amostra acidifícada foi autoclavada por 1 hora a 121 -C; a acetamida foi convertida quantitativamente a ácido acético durante esta etapa. Após a autoclave, a amostra foi deixada para resfriar. A amostra foi então passada através de um: filtro de 0,2 pm em uma ampola de amostra e analisada de acordo com as condições listadas abaixo. As concentrações de ácido acético e acetamida foram determinadas a partir das curvas padrão geradas para cada um, - Fase móvel: H2SO4 a 0,01 N, 0,2 pm filtrado e degaseificado - Velocidade de fluxo: 0,6 mU minuto - Temperatura da coluna; 55 a 65-C - Temperatura do detector: o mais próximo possível da temperatura da coluna - Detector; índice de retração - Tempo da Corrida: 60 minutos - Coluna: coluna Biorad Aminex HPX-87H com coluna guarda correspondente, [0101] Os resultados para as 3 diferentes condições de tratamento prévio analisadas são mostradas na Tabela 10. para cada caso» todos os grupos acetila foram solubilizados para o ácido acético ou a acetamida.

Tabela 10 Conversão dos Grupos Acetila na Biqmassa em Acetamida Durante o Tratamento Prévio [0102] DWB, peso seco da biomassa, (a porcentagem é calculada com relação ao peso total da mistura de amónia aquosa e biomasa) [0103] Utilizando uma concentração de amónia de 6%, próximo a metade dos grupos acetila foram convertidos a acetamida, o que é não inibitório para o crescimento do biocatalisador conforme mostrado no Exemplo 12.

Exemplo12 Efeito da Acetamida e do Ácido Acético no Crescimento de Zymomqnas [0104] Para testar a toxicidade da acetamida e do ácido acético, a cepa de Z. mobilis 8b (descrita no Exemplo 9) foi cultivada na meio de fermentação em pH 6,0 com e sem acetamida ou ácido acético. O meio de fermentação foi composto de 10 g/ L de extrato de levedura, 2 g/ L de KH2P04, 70 g/ L de glicose, 40 g/ L de xilose e 0,1 M de tampão MES. O Z. mobilis 8b foi cultivado em frascos de agitação de Erlenmeyer embaçado de 25 mL rotacionados a 150 rpm a 30BC em meio não suplementado (controle), meio suplementado com 6 g/ L de acetamida ou meio suplementado com 7,2 g/ L de ácido acético. Conforme mostrado na Figura 1, a presença de acetamida não possui a influencia na taxa de crescimento ou na densidade final de Z. mobilis, enquanto que a presença de ácido acético resultou em uma taxa de crescimento reduzida e menor rendimento celular (conforme medido pela massa celular seca).

Exemplo 13 Tratamento Prévio do Bagaço em Alta Concentração de Biomassa. Alta Temperatura e Concentração Muito Baixa de Amònia. e Sacarificacão em Baixa e Alta Concentração [0105] O PEHReator (descrito nos Métodos Gerais), com nenhum meio de atrito, foi carregado com 1,27 cm de bagaço moído (370 g, base em peso seco). Este bagaço da cana de açúcar era a NIST Reference Material RM 8491, do clone da cana de açúcar H65-7052, originalmente obtido pela Hawaii Sugar Planters Associatíon, sub-estação Kunia, Oahu, HU. Ele foi moído em um moinho Wiley para passar através de uma malha de 2 mm, com as finas (+74 malha) removidas. O PEHReator foi resfriado a 4BC pela rotação em contato com gelo na superfície externa. Um vácuo foi aplicado ao recipiente de reação e foi injetada a solução de hidróxido de amônio diluído, que foi previamente resfriado em uma sala fria a 45C e passada através do tubo imerso em banho de água gelada, para fornecer uma concentração de amônia de 4 g/100 g de peso seco da biomassa e um peso seco da concentração da biomassa de 45g/ 100 g da mistura de amônia aquosa e biomassa total. O recipiente de reação carregado com amônia e bagaço foi resfriado a 4-C pela aplicação de gelo à superfície do recipiente do reator giratório, e rotacionado a 4SC por 30 min. Neste tempo, os conteúdos foram transferidos para o reator de pistola de vapor que é descrito nos Métodos Gerais. Uma vez que o reator de pistola de vapor foi carregado com a mistura de bagaço e amônia, a temperatura foi aumentada a 145SC e a mistura foi mantida nesta temperatura por 20 min. No final do tempo de tratamento prévio, o bagaço foi descarregado do reator de pistola de vapor através de um molde circular de 1 polegada em um tanque flash. Uma amostra de bagaço tratado previamente foi subseqüentemente sacarificado em um frasco de agitação e outra amostra (cerca de 163 g de peso seco) foi sacarificada no PEHReator. A sacarificação no frasco de agitação foi realizada em 5% de peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificação da biomassa tratada previamente, enquanto a sacarificação no PEHReator foi realizada a 30% do peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificação da biomassa tratada previamente. A temperatura foi mantida a 50QC.

[0106] Para a sacarificação do PEHReator, cerca de 476 g (cerca de 163 g de peso seco) de biomassa tratada previamente e 22 cilindros de atrito de cerâmica foram adicionados ao recipiente do reator. O pH foi ajustado a 5,0 - 5,5 com ácido cítrico sólido. O recipiente do reator foi mantido dentro de uma câmara de incubação controlada a 50SC e rotacionada axialmente a 19 rpm. O bagaço não tratado previamente também foi sacarificado a 5% em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarifícação da biomassa tratada prevíamente em um frasco de agitação. Todas as sacarificações foram feitas com 28,4 mg/g de celulose Spezyme CP® celulase e 28,4 mg/g de celulose Multifect® xilanase a 50SC e pH 5,5 por 96 horas. Os rendimentos dados na Tabela 11 abaixo são a liberação como porcentagem do rendimento teórico.

Tabela 11 Rendimentos Seguindo o Tratamento Prévio e a Sacabificacão do Bagaço [0107] ND: não determinado [0108] Os resultados demonstraram que o tratamento prévio do bagaço com concentração muito baixa de amônia permite a liberação substancial de açúcar quando comparado ao controle não tratado previa mente, e que a sacarifícação em alta concentração de biomassa seca no PEH Reator é muito eficaz na liberação de açúcares.

Exemplo 14 Tratamento Prévio da Serragem de Choupo Amarelo em Alta Concentração de Biomassa. Alta Temperatura e Concentração Muito Baixa de Amônia. e Sacarifícação a Baixa e Alta Concentração [0109] O PEH Reator, sem o meio de atrito, foi carregado com serragem de choupo amarelo (596 g, base em peso seco; adquirido da Sawmiller Inc., Haydenville, OH). Foi aplicado um vácuo ao recipiente do reator e a solução de hidróxido de amônia diluída foi injetada para fornecer uma concentração de amônia de 6g/100 g em peso seco de biomassa e um peso seco de concentração de biomassa de 44 g/ 100 g da mistura de amônia aquosa e biomassa. O recipiente do reator carregado com amônia e serragem de choupo amarelo foi trazido a 4SC conforme descrito no Exemplo 13, e rotacionado a 4QC por 30 min. Neste tempo, os conteúdos foram transferidos para o reator de pistola de vapor. Uma vez que o reator de pistola de vapor foi carregado com a mistura de amônia e choupo, a temperatura foi aumentada para 145eC e a mistura foi mantida nesta temperatura por 20 minutos. No final do tempo de tratamento prévio, a serragem de choupo amarelo foi descarregada do reator de pistola de vapor através de um molde circular de 1 polegada em um tanque flash. Uma amostra de serragem de choupo amarelo tratada previamente foi sacarificada subseqüentemente conforme descrito no Exemplo 13 em um frasco de agitação, e outra amostra foi sacarificada no PEHReator. A sacarificação do frasco de agitação foi realizada a 5% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente, enquanto que a sacarificação do PEHReator (utilizando cerca de 279 g em peso seco de serragem tratada previamente) foi realizada a 30% em peso seco de biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente. A serragem de choupo amarelo não tratado previamente também foi sacarificada a 5% em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente em um frasco de agitação. Todas as sacarificações foram feitas com 28,4 mg/ g de celulose de Spezyme CP® celulase e 24,8 mg/ g de celulose Multifect® xylanase a 50SC e pH 5,5 por 96 horas. Os rendimentos dados na Tabela 12 abaixo são a liberação ou cada açúcar como uma porcentagem do rendimento teórico.

Tabela 12 Rendimentos Seguindo o Tratamento Prévio e a Sacarificacão da Serragem de Choupo Amarelo ___________________________ [0110] ND: não determinado [0111] Os resultados demonstraram que o tratamento prévio da serragem de choupo amarelo com concentração muito baixa de amônia permite a liberação substancial de açúcar quando comparado ao controle não tratado previamente, e que a sacarificação em alto peso seco de biomassa no PEH Reator é mais eficaz na liberação de açúcares do que o frasco de mistura.

Exemplo 15 Produção de Etanol pela Fermentação de Levedura em Hiprousado a partir de Biomassa de Espiga de Milho Sacarificada e Tratada Previamente com Concentração Muito Baixa de Amônia [0112] O mesmo hidrolisado utilizado para produzir o 1,3-propanodiol no Exemplo 10 também foi utilizado para produzir etanol pela fermentação da levedura. Este hidrolisado foi utilizado como uma fonte de açúcar fermentável para a conversão a etanol pelo tipo selvagem de Saccharomyces cerevisiae nos frascos de agitação. O hidrolisado foi utilizado a 10% (v/v) de força, com o balanço sendo o meio aquoso consistindo em 10 g/ L de extrato de levedura e 20 g/ L de peptona. As leveduras foram cultivadas em 50 ml_ de meio em um frasco embaçado de 250 mL As culturas foram incubadas a 30ÇC com agitação a 250 rpm por 24 horas. A quantidade de etanol produzida foi medida por HPLC conforme descrito no Exemplo 9 e os resultados dos frascos em duplicata estão listados na Tabela 13 abaixo.

Tabela 13 Utilização do Substrato e Formação do Produto pela Fermentação com Levedura Exemplo 16 Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Maior Concentração de Biomassa Seca com Concentração Muito Baixa de Amônia [0113] O mesmo hidrolisado utilizado para produzir o 1,3-propanodiol no Exemplo 10 também foi utilizado para produzir ácido lactico com Lactobacillus brevis em frascos de agitação. O hidrolisado foi utilizado a 10% {v/v) de força, com o balanço sendo o meio aquoso consistindo em 5 g/ L de extrato de levedura e 10 g/ L de peptona, 2g/ L de citrato de amônia, 5 g/ L de acetato de sódio, 0,1 g/ L de MgS04, 0,05 g/L de MnS04 e 2 g/L de K2HP04 e 1 g/ L de Tween. Os Lactobacillus foram cultivados em 50 mL de caldo em um frascos embaçados de 250 mL. As culturas em duplicata foram incubadas a 34eC com agitação a 150 rpm por 24 horas. A quantidade de ácido láctico produzida foi medida por HPLC conforme descrito no Exemplo 10 e está listada na Tabela 14, As duas amostras do Frasco 2 são ensaios em duplicata da mesma cultura.

Tabela 14 Utilização do Substrato e Formação po Produto pela Fermentação com ________________________LAC TOBACiLLUS BREVIS______________________ Exemplo 17 Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Maior GoncentracÃo de Biomassa Seca com Concentração Muito Baixa de AmÔnia [0114] As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira de maxilas {motor de 2,2 kW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 0,95 cm, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc., Livingston, NJ), seguido pela seleção com uma malha Sweco equipado com uma malha de 1,9 cm padrão US. Aproximadamente 805 g de espigas fracionadas foram carregadas no PEHReator. O teor de umidade nas espigas era cerca de 7%. A atmosfera no recipiente do reator foi suprida 5 vezes com nitrogênio antes do carregamento. O reator, sem nenhum meio de atrito, foi aquecido previamente a 75SC antes do inicio do experimento, sem rotação. Quando a temperatura dentro do recipiente do reator estabilizou a 75-C, o mecanismo de rolamento da incubadora foi ligado e a rotação foi ajustada a 19 rpm, A quantidade apropriada de solução de hidróxido de amônia diluída para fornecer uma concentração de amônia de 6 g de amônia/100 g em peso seco de biomassa e uma concentração de sólidos de 50 g em peso seco da biomassa/ 100 g de peso total da mistura de biomassa e amônia foi então bombeada dentro do reator. O etanol a 1 g/100 g em peso seco de biomassa também foi adicionado na solução. A solução de amônia foi bombeada através de uma alça aquecida, em um banho de água aquecido a cerca de 755C, fabricada utilizando um reator Parr de 2 galões. A solução de hidróxido de amônia diluída e aquecida foi injetada por meio de uma lança de injeção dentro do recipiente do reator e pulverizada nas espigas fracionadas que giram e rolam no reator. O reator foi mantido a 75-C por 2 horas enquanto girava a 19 rpm. No final deste tempo, um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao vaso do reator por 30 min para remover a amônia e diminuir a temperatura dos conteúdos do reator a cerca de 50QC. O dióxido de carbono foi então injetado no reator para aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa de pressão de C02 no indicador e mantido na pressão por 30 min a 50SC.

[0115] Seguindo isto, o reator foi despressurizado, aberto e foi adicionado o meio de atrito. O pH dos conteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela injeção de tampão de ácido cítrico a 1 M a pH 4,8 utilizando a lança de injeção, para aumentar a força do tampão de ácido cítrico a cerca de 75 mM, mais a adição de monohidrato de ácido cítrico. Nem toda a amônia foi retirada na etapa a vácuo, nem neutralizada com C02. O tampão de ácido cítrico foi injetado dentro do reator seguindo o aquecimento a 50SC e então os conteúdos foram deixados para equilibrar ao incubar o reator a 50SC e 19 rpm por 1 hora. A injeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é girado utilizando a lança de injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniforme do tampão nas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foi removido do incubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesse acima de 5,5, então o monohidrato de ácido cítrico sólido adicional era adicionado e o reator era incubado com mistura a 50SC por 1 hora adicional. Este processo foi repetido até que o pH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez que o pH desejado era atingido, 12,9 mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa/ g de associação de enzima de celulose que consiste em β-glucosidase, xílanase, β-xilosidase e arabinoíuranosidase foram carregadas dentro do reator.O reator permaneceu na incubadora a 50SC e 19 rpm por 72 horas. Seguindo esse tratamento prévio e sacarificaçâo, o rendimento do monômero de glicose era de 62,0% e o rendimento do monômero de xilose era de 31,0%. O rendimento de glicose total era de 75,2% e o de xilose total era de 80,3%.

Exemplo 18 Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Maior Concentração de Sólidos com Concentração Muito Baixa de Amònia e Condições Alternadas [0116] As espigas de milho inteiras processadas com um moinho martelo (10 polegadas de moinho martelo, Glen Mills Inc., Clifton, NH) para passar através de uma malha de 1,27 cm. Cerca de 805 g de espiga de milho foram carregadas dentro do PEHReator. O teor de umidade nas espigas era de cerca de 7%. Também foram adicionados 22 cilindros de atrito de cerâmica (3,2 cm de diâmetro x 3,2 cm de comprimento; E. R. Advanced Geramics, East Palestine, OH), ao reator. O reator foi aquecido previamente a 95QC antes de iniciar o experimento, sem rotação. Um vácuo (cerca de 85 kPa} foi aplicado ao recipiente do reator antes de iniciar e o recipiente foi selado. Quando a temperatura dentro do recipiente do reator estabilizou a 95QC, o mecanismo de rolamento na incubadora foi ligado e a rotação foi ajustada a 19 rpm. A quantidade apropriada de solução de hidróxido de amônia diluída para fornecer uma concentração de amônia de 6 g de amônia/ 100 g em peso seco de biomassa e uma concentração de sólidos de 50 g em peso seco de biomassa/100 g em peso total da mistura de amônia e biomassa foi então bombeada dentro do reator. A solução de amônia foi bombeada através de uma alça aquecida em um banho de água aquecida utilizando um reator Parr de 2 galões. A solução de hidróxido de amônia diluída e aquecida foi injetada em uma lança de injeção dentro do recipiente do reator e pulverizada nas espigas fracionadas que giram e rolam no reator. O reator foi mantido a 955C por 2 horas enquanto girava a 19 rpm. No final deste tempo, um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao vaso do reator por 30 min para remover a amônia e diminuir a temperatura dos conteúdos do reator a cerca de 505C. O dióxido de carbono foi então injetado no reator para aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa de pressão no indicador e mantido na pressão por 30 min a 50SC.

[0117] Seguindo isto, o reator foi despressurizado aberto e o pH dos conteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela injeção de tampão de ácido cítrico a 1 M a pH 4,8, em que o monohidrato de ácido cítrico foi adicionado e dissolvido. O tampão de ácido cítrico foi injetado dentro do reator seguindo o aquecimento a 505C e então os conteúdos foram deixados para equilibrar ao incubar o reator a 50QC e 19 rpm por 1 hora. A injeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é girado utilizando a lança de injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniforme do tampão nas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foi removido do incubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesse acima de 5,5, então o monohidrato de ácido cítrico sólido adicional era adicionado e o reator era incubado com mistura a 50QC por 1 hora adicional. Este processo foi repetido até que o pH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez que o pH desejado era atingido, 12,9 mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa/ g de associação de enzima de celulose que consistia em β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregadas dentro do reator. O reator permaneceu na incubadora a 505C e 19 rpm por 72 horas. Seguindo esses tratamento prévio e sacarificação, o rendimento do monômero de glicose era de 50,7% e o rendimento do monômero de xílose era de 35,7%. Os rendimentos de glicose e xilose totais eram de 71,7% e 89,8%, respectivamente.

Exemplo 19 Tratamento Prévio oa Espiga de Milho com Concentração Muito Baixa de Amònia e Base Adicional [0118] As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira de maxilas (motor de 2,2 KW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 0,95 cm, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguido pela seleção com uma malha Sweco equipado com uma malha de 1,9 cm padrão US. Aproximadamente 460 g de espigas fracionadas foram carregadas no PEHReator. O teor de umidade nas espigas era cerca de 7%. O reator foi aquecido previamente a 95ÕC antes do inicio do experimento, sem rotação. Um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente do reator antes do início e o recipiente foi selado. Quando a temperatura dentro do recipiente reestabilizou a 959C, o mecanismo de rolamento da incubadora foi ligado e a rotação foi ajustada a 19 rpm. A quantidade apropriada de solução de hidróxido de amônia para fornecer uma concentração de amônia de 3,2 g de amônia/ 100 g em peso seco de biomassa e NaOH para fornecer uma concentração de 1,9 g de NaOH/100 g em peso seco da biomassa enquanto mantém a concentração de sólidos de 30 g em peso seco de biomassa/ 100 g de peso total da mistura de biomassa e amônia foi então bombeada dentro do reator. A amônia e a solução de base adicional foram bombeadas através de uma alça aquecida em um banho de água fervente fabricada utilizando um reator Parr de 2 galões. A solução de hidróxido de amônia diluída e aquecida foi injetada por meio de uma lança de injeção dentro do recipiente do reator e pulverizada nas espigas fracionadas que giram e rolam no reator. Seguindo a injeção, o vácuo no recipiente foi aliviado para pressão atmosférica. O reator foi mantido a 95SC por 30 min, então a temperatura foi diminuída a 85-C onde ela foi mantida por 4 horas. No final deste tempo, um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao vaso do reator por 30 min para remover a amônia e diminuir a temperatura dos conteúdos do reator a cerca de 50QC. O dióxido de carbono foi então injetado no reator para aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa de pressão no indicador e mantido na pressão por 30 min a 50SC.

[0119] Seguindo isto, o reator foi despressurizado aberto e o pH de todos os conteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela injeção de cerca de 75 mL de tampão de ácido cítrico a 1 M a pH 4,8, no qual o monohidrato de ácido cítrico foi adicionado e dissolvido. O tampão de ácido cítrico foi injetado dentro do reator seguindo o aquecimento a 50SC e então os conteúdos foram deixados para equilibrar ao incubar o reator a 50QC e 19 rpm por 1 hora. A injeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é girado utilizando a lança de injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniforme do tampão nas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foi removido do incubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesse acima de 5,5, então o monohidrato de ácido cítrico sólido adicional era adicionado e o reator era incubado com mistura a 50SC por 1 hora adicional. Este processo foi repetido até que o pH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez que o pH desejado era atingido, 28,4 mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 28,4 mg/ g de celulose Multifect foram carregados no reator. O reator permaneceu na incubadora a 50SC e 19 rpm por 72 horas. Seguindo esse tratamento prévio e a sacarificação, o rendimento do monômero de glicose era de 56,1% e o rendimento do monômero de xilose era de 39,5%. Os rendimentos de glicose e xilose total eram de 82,8% e 84,2%, respectivamente. Esses valores são as médias dos dois experimentos.

Exemplo 20 Tratamento Prévio à Temperatura Ambiente e com Concentração Muito Baixa de Amònia [0120] As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira de maxilas (motor de 2,2 kW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 0,95 cm, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguido pela seleção com uma malha Sweco equipado com uma malha de 1,9 cm padrão US, Aproximadamente 460 g de espigas fracionadas foram carregadas no PEHReator, O teor de umidade nas espigas era cerca de 7%. Também foram adicionados ao reator 22 cilindros de atrito cerâmico (3,2 cm de diâmetro x 3,2 cm de comprimento; E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH, EUA). Um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente do reator antes do início e o recipiente foi selado. Quando a temperatura dentro do reator reestabilizou a temperatura ambiente (22 a 26SC), o mecanismo de rolamento da incubadora foi ligado e a rotação foi ajustada a 19 rpm. A quantidade apropriada de solução de hidróxido de amônia diluída para fornecer uma concentração de amônia de 4 g de amônia/100 g em peso seco de biomassa e enquanto mantém uma concentração de sólidos de 30 g em peso seco de biomassa/ peso total da mistura de biomassa e amônia foi então bombeada dentro do reator. A solução de hidróxido de amônia diluída foi injetada por meio de uma alça de injeção em um recipiente do reator e pulverizada nas espigas fracionadas que giram e rolam no reator. Seguindo a injeção, o vácuo em cada recipiente foi aliviado para pressão atmosférica. O reator foi mantido a temperatura ambiente (22 a 26eC) por 24 horas. No final deste tempo, um vácuo (cerca de 81 kPa) foi aplicado ao vaso do reator por 30 min para remover a amônia. O dióxido de carbono foi então injetado no reator para aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa de pressão no indicador com C02 e mantido na pressão por 30 min a temperatura ambiente.

[0121] Seguindo isto, o reator foi despressurizado, aberto e o pH dos conteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela adição de monohidrato de ácido cítrico seguido por aquecimento a 505C e então foram deixados para equilibrar ao incubar o reator a 505C e 19 rpm por. O reator foi removido do incubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesse acima de 5,5, então o monohidrato de ácido cítrico sólido adicional era adicionado e o reator era incubado com mistura a 50SC. Este processo foi repetido até que o pH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez que o pH desejado era atingido, 12,9 mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por grama de associação de enzima de celulose que consistia em β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregadas dentro do reator. O reator permaneceu na incubadora a 50-C e 19 rpm por 72 horas. Seguindo esse tratamento prévio e sacarificação, o rendimento do monômero de glicose era de 41,7% e o rendimento do monômero de xilose era de 25,4%. Os rendimentos de glicose e xilose totais eram de 50,1% e 53,2%, respectivamente. Esses valores eram as médias dos 2 experimentos.

Reivindicações

Claims

1. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE BIOMASSA para produzir açúcar fermentável, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato a biomassa com uma solução aquosa que compreende amônia para formar uma mistura de amônia aquosa e biomassa, em que a amônia está presente em uma concentração para manter o pH alcalino da mistura de amônia aquosa e biomassa, mas em que dita amônia está presente a menos do que 12% em peso com relação ao peso seco da biomassa, e ainda em que o peso seco da biomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos 15% em peso com relação ao peso da mistura de amônia aquosa e biomassa, para produzir um produto de biomassa tratada previamente; e (b) colocar em contato o produto da etapa {a) com uma associação de enzima de sacaríficação que compreende uma glicosidase hidrolisante de celulose e uma glicosidase hídrolisante de hemicelulose sob condições apropriadas para produzir açúcares fermentáveis.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da mistura de amônia aquosa e biomassa é superior a 8.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é aplicado o vácuo à biomassa antes do contato da biomassa com uma solução aquosa que compreende amônia.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito peso seco da biomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos 15% a 80%.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que dito peso seco da biomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos 15% a 60%.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita amônia está presente a menos do que 10% com relação ao peso seco da biomassa.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que dita amônia está presente a menos do que 6% com relação ao peso seco da biomassa.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste em culturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, resíduos de terrenos, resíduos de madeira e de silvicultura.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste em grama do gênero Panicum, resíduos de papéis, lodo da fabricação de papéis, grãos de milho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço da cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos do processamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbustos e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste em espigas de milho, forragem de milho, cascas de milho, bagaço da cana de açúcar, forragem, grama do gênero Panicum, palha de trigo, feno, palha de cevada, palha de arroz e gramas.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste espigas de milho, forragem de milho, forragem e bagaço da cana de açúcar.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amônia é selecionada a partir do grupo que consiste em gás amônia, hidróxido de amônio, uréia e suas combinações.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita solução aquosa que compreende amônia compreende ainda pelo menos uma base adicional.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que dita pelo menos uma base é selecionada a partir do grupo que consiste em hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperatura de 45C a 200QC.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperatura de 75SC a 1505C.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperatura superior a 90SC a 150eC.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em um período de tempo de até 25 horas.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em um período de tempo de até 8 horas.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção de amônia de (a) é removida antes de (b).

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amônia de (a) é reciclada.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato de (b) é em peso seco da concentração de biomassa de pelo menos 15%.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas (a), (b) ou (a) e (b) é(são) repetidas pelo menos uma vez.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a adição de pelo menos um plastificante, agente amaciante ou suas combinações na etapa (a).

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos um plastificante, agente amaciante ou suas combinações são selecionados a partir do grupo que consiste em polióis, ésteres de polióis, éteres de glicol, acetamida, etanol e etanolamina.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a aplicação de energia antes ou durante a etapa (a), antes ou durante a etapa (b), ou uma combinação dos mesmos.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que dita energia é selecionada a partir do grupo que consiste em moagem, compressão, trituração, despedaçamento, corte, refinação em disco, ultra-som e microondas.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dióxido de carbono da fermentação é utilizado para ajustar o pH da mistura de tratamento prévio antes da sacarificação.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita associação de enzima de sacarificação compreende ainda pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em glicosidases de hidrólise de amido, peptidases, lipases, ligninases e estearases de feruloíla.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita associação de enzima de sacarificação compreende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β-glucosidases, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases, amilases, a-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (b) é realizado em uma temperatura de 15QC a 100eC e em um pH de 2 a 11.