ES2335828T3 - Bacterias corineformes para producir l-glu. - Google Patents

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Sohei Kanno
Mikiko Suga
Eiichiro Kimura
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Tsuyoshi Ohsumi
Tsuyoshi Nakamatsu
Osamu Kurahashi
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Abstract

Un método de producción de ácido L-glutámico, que comprende la etapa de cultivar una bacteria corineforme que expresa una enzima codificada por un gen que biosintetiza ácido L-glutámico, seleccionada entre el grupo que consiste en glutamato deshidrogenasa (GDH), citrato sintasa (CS), isocitrato deshidrogenasa (ICDH), piruvato deshidrogenasa (PDH) y aconitasa (ACO), y en el que una secuencia del promotor de dicho gen que biosintetiza ácido L-glutámico, situada sobre un cromosoma de la bacteria, contiene por lo menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en i) una secuencia TTGTCA, TTGACA o TTGCCA en la región -35 de la secuencia del promotor; ii) la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y iii) una combinación de (i) y (ii).

Description

Bacterias corineformes para producir L-GLU.
Fundamento de la invención
La presente invención se refiere a un método de construcción de una cepa mutante capaz de producir ácido L-glutámico con alto rendimiento, y a un método de producción de ácido L-glutámico por fermentación con el mu-
tante.
Los métodos de construcción de cepas mutantes que pueden emplearse para producir aminoácidos por fermentación, pueden clasificarse ampliamente en dos métodos. Uno de ellos comprende introducir en un DNA mutaciones aleatorias con un mutágeno químico, y la otra comprende la recombinación genética. En este último método, puede desarrollarse una cepa que tiene capacidad mejorada de producción de la sustancia deseada, mediante intensificación de un gen sobre un camino metabólico relacionado con la biosíntesis de la sustancia pretendida, o por debilitación de un gen de una enzima relacionada con la destrucción. A este respecto, para intensificar un gen pretendido, ha sido utilizado, principalmente, un plásmido capaz de replicarse de modo autónomo, independientemente del cromosoma de una célula.
Sin embargo, el método de intensificación con un plásmido del gen pretendido presenta problemas. En particular, el grado de enriquecimiento del gen pretendido es variable, dependiendo del número de copias del propio plásmido. Por consiguiente, para algunos tipos de genes pretendidos, las copias son con frecuencia demasiadas y,como resultado de ello, la expresión se hace excesiva, el crecimiento resulta seriamente inhibido o la capacidad de producción de la sustancia pretendida disminuye. En tales casos, aun cuando el grado de intensificación del gen pretendido puede hacerse disminuir usando un plásmido de un número de copias pequeño, la variedad del plásmido está limitada en muchos casos, y es imposible la regulación que se pretende obtener del nivel de expresión del gen.
Otro problema es que, dado que la replicación del plásmido es con frecuencia inestable, el plásmido resulta eliminado.
Por ejemplo, la Solicitud de Patente Japonesa Publicada, sin examinar, (a la que se hace referencia en esta memoria más adelante como "J.P. KOKAI") No. 61-268185, describe un DNA recombinante que comprende un fragmento de DNA que contiene un gen que produce glutamato deshidrogenasa (GDH) (gen de glutamato deshidrogenasa) que deriva de una bacteria corineforme que produce glutamato, y un fragmento de DNA (plásmido) que contiene un gen necesario para la replicación autónoma en la célula. Asimismo está descrito en ella que por introducción del DNA recombinante en una célula, puede cultivarse una cepa enriquecida en GDH para mejorar la producción de sustancias (tales como aminoácidos y proteínas) con microorganismos.
Por otra parte, en la Patente Japonesa No. 2.520.895, el DNA recombinante antes descrito es introducido en una bacteria corineforme obteniendo una cepa que posee actividad enzimática mejorada, y se produce ácido L-glutámico por fermentación con la cepa. No obstante, la producción y el rendimiento de ácido L-glutámico eran insatisfactorios todavía. Por tanto, se ha pedido mejorar adicionalmente la productividad de ácido L-glutámico. Se ha indicado que la petición ha sido alcanzada mediante la introducción en una bacteria corineforme, de un DNA recombinante que comprende dos tipos de genes., a saber, un gen que produce glutamato deshidrogenasa derivado desde una bacteria corineforme que produce glutamato, y un gen de isocitrato deshidrogenasa (ICDH).
Además, la J.P KOKAI No. 6-502548 describe un sistema de expresión y un sistema de secreción de Corynebacterium que comprende una cepa de una bacteria corineforme y una casete secretora que comprende la primera secuencia de DNA funcional para la expresión en la cepa, codificando la segunda secuencia de DNA aminoácidos polipéptidos y/o proteínas, estando insertada la tercera secuencia de DNA entre la primera secuencia de DNA y la segunda secuencia de DNA, en el que la tercera secuencia de DNA codifica el elemento proteínico seleccionado entre PS1 y PS2, lo que garantiza la secreción de los aminoácidos, polipéptidos y/o proteínas. Específicamente, la secreción de polipéptidos está descrita en ella y, en particular, se llevó a cabo mutagénesis de NTG con una bacteria corineforme y un mutante resistente al 4-fluoroglutamato (4FG) que es un análogo al glutamato, que es seleccionado y sometido a la transformación con PCGL141. Se describe en ella que puede obtenerse una cepa que posee una expresión intensificada de GDH de la bacterias resistentes al análogo. También se describe en ella que se observó una mutación en la secuencia de los nucleótidos No. 251 a No. 266 del promotor de GDH.
Patek et al., 1996, describen la clonación y mapeo de los promotores de cinco genes de C-glutamicum aislados previamente. Un análisis comparativo reveló secuencias conservadas aproximadamente 35 bp y 10 bp aguas arriba del sitio de comienzo de la transcripción.
Descripción de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar un método de construcción de un mutante capaz de intensificar o regular adecuadamente la expresión de un gen deseado sin usar un plásmido, y capaz, asimismo, de producir ácido L-glutámico con alto rendimiento, por recombinación o mutación génica.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un promotor para la GDH capaz de comunicar capacidad de producción de ácido glutámico con alto rendimiento a una cepa de una bacteria corineforme sin aumentar grandemente la cantidad de ácido aspártico y de alanina que se obtienen como subproductos.
Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar un gen de GDH que tiene la secuencia del promotor para GDH anteriormente descrito.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una cepa de una bacteria corineforme que posee el gen antes descrito y que es capaz de producir ácido L-glutámico.
Otro objeto de la presente invención en proporcionar un método de producción de aminoácidos por fermentación en el que se usa el microorganismo que produce aminoácidos construido de ese modo.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de fermentación para producir ácido L-glutámico a bajo costo, aumentando el rendimiento de ácido L-glutámico mediante el uso de una bacteria corineforme que produce ácido L-glutámico.
La presente invención ha sido completada sobre la base del descubrimiento de que los problemas anteriormente descritos pueden ser resueltos eficazmente modificando de diversos modos el promotor de genes de realización de la biosíntesis del ácido L-glutámico, situados en un cromosoma, para regular la cantidad de la expresión de los genes deseados. En particular, la invención ha sido completada sobre la base del descubrimiento de que el problema descrito puede ser resuelto eficazmente mediante la introducción de una mutación específica en la región -35 o en la región -10, que son regiones específicas del promotor.
Específicamente, la presente invención se refiere a:
1.
Un método de producción de ácido L-glutámico, que comprende la etapa de cultivar una bacteria corineforme que expresa una enzima codificada por un gen que biosintetiza ácido L-glutámico, seleccionada entre el grupo que consiste en glutamato deshidrogenasa (GDH), citrato sintasa (CS), isocitrato deshidrogenasa (ICDH), piruvato deshidrogenasa (PDH) y aconitasa (ACO), y en el que la secuencia del promotor de dicho gen que biosintetiza ácido L-glutámico, situada en un cromosoma de la bacteria, contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en
i)
la secuencia TTGTCA, TTGACA o TTGCCA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
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2.
El método del párrafo 1, en el que el promotor del gen de GDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:
i)
la secuencia TTGTCA, TTGACA o TTGCCA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
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3.
El método del párrafo 1, en el que el promotor del gen de CS contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:
i)
la secuencia TTGACA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
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4.
El método del párrafo 1, en el que el promotor del gen de ICDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en
i)
la secuencia TTGACA en la región -35 de la secuencia del promotor,
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
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5.
El método del párrafo 1, en el que el promotor del gen de PDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en
i)
la secuencia TTGCCA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
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6.
Un método de producción de ácido L-glutámico, que comprende la etapa de cultivar una bacteria corineforme que expresa una enzima codificada por el gen de la citrato sintasa (CS), en el que una secuencia de promotor del gen de CS situada sobre un cromosoma de la bacteria, contiene la secuencia ATGGCT en la región -35 de la secuencia del promotor, y la secuencia TATAAC en la región -10 de la secuencia del promotor.
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La memoria descriptiva especifica un método de producción de bacterias corineformes que tienen una capacidad mejorada de producir aminoácidos o ácidos nucleicos, que comprende las etapas de introducir una mutación en una secuencia del promotor de genes que realizan la biosíntesis de aminoácidos o de ácidos nucleicos, situados en el cromosoma de una bacteria corineforme, para hacerla cercana a la secuencia de consenso, o introducir mediante recombinación génica un cambio en la secuencia del promotor de genes que realizan la biosíntesis de aminoácidos o de ácidos nucleicos, situados en el cromosoma de una bacteria corineforme, para hacer a dicha secuencia próxima a la secuencia de consenso, obteniendo mutantes del microorganismo corineforme que produce aminoácidos o ácidos nucleicos, cultivar los mutantes y seleccionar un mutante capaz de producir en gran cantidad el aminoácido o el ácido nucleico deseados.
La memoria descriptiva especifica también un promotor para el gen que produce la glutamato deshidrogenasa (GDH), que posee la secuencia de (i) al menos una secuencia de DNA seleccionada entre el grupo que consiste en CGGTCA, TTGTCA, TTGACA y TTGCCA en la región -35, (ii) la secuencia TATAAT o la misma secuencia TATAAT pero en la que la base de ATAAT ha sido reemplazada por otra base en la región -10, o (iii) una combinación de (i) y (ii), en el que la secuencia no inhibe la función del promotor.
La memoria descriptiva especifica también un gen que produce glutamato deshidrogenasa que posee el promotor descrito.
La memoria descriptiva especifica también un microorganismo corineforme que produce L-glutamato, que posee el gen antes descrito.
Descripción breve de los dibujos
La Fig. 1 muestra el curso de construcción de un gen de GDH que tiene un promotor mutante.
La Fig. 2 muestra el curso de construcción de un gen de CS que tiene un promotor mutante.
La Fig. 3 muestra el curso de construcción de un vector transportador que lleva el gen lacZ como gen informador.
Modo mejor para llevar a cabo la invención
La expresión "microorganismo corineforme que produce ácido glutámico" tal como se emplea en esta memoria, incluye también bacterias que fueron clasificadas anteriormente como pertenecientes al género Brevibacterium, pero que en la actualidad están integradas en el género Corynebacterium [Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)], así como bacterias del género Brevibacterium que están muy próximas a las del género Corynebacterium. Por tanto, los mutantes utilizados en la presente invención pueden ser derivados de las bacterias corineformes que producen ácido glutámico, del género Brevibacterium o Corynebacterium que se indican seguidamente. A las bacterias del género Corynebacterium y a las del género Brevibacterium se hará referencia, colectivamente, como "bacterias corinefomes" en tanto en cuanto estas bacterias no afecten a la productividad de ácido glutámico.
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium callunae
ATCC15991
Corynebacterium glutamicum
ATCC13032
Brevibacterium divaricatum
ATCC14020
Brevibacterium lactofermentum
ATCC13869
Corynebacterium lilium
ATCC15990
Brevibacterium flavum
ATCC14067
Corynebacterium melassecola
ATCC17965
Brevibacterium saccharolyticum
ATCC14066
Brevibacterium immariophilum
ATCC14068
Brevibacterium roseum
ATCC13825
Brevibacterium thiogenitalis
ATCC19240
Microbacterium ammoniaphilum
ATCC15354
Corynebacterium thermoaminogenes
AJ12310 (FERM 9246)
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Son ejemplos de enzimas efectivas que intervienen en la biosíntesis GDH, citrato sintasa (CS), isocitrato deshidrogenasa (ICDH), piruvato deshidrogenasa (PDH) y aconitasa (ACO), para la fermentación del ácido glutámico.
En la presente invención, se obtiene un mutante de una bacteria corineforme que produce aminoácidos, introduciendo una mutación en la secuencia de un promotor de genes que realizan biosíntesis, situados en el cromosoma de una bacteria corineforme que produce ácido L-glutámico, tal como la secuencia del promotor anteriormente descrita para GDH, para preparar ácido L-glutámico, para hacer dicha secuencia próxima a una secuencia de consenso, con un compuesto químico o introduciendo la mutación mediante recombinación genética, para obtener un mutante del microorganismo corineforme que produce ácido L-glutámico.
La expresión "secuencia de consenso" es una secuencia que aparece con la máxima frecuencia en diversas secuencia de promotores. Tales secuencias de consenso incluyen, por ejemplo, las de E. coli y las del Bacillus subtilis. La secuencia de consenso de E. coli ha sido descrita por Diane K. Hawley y William R. McClure en Nuc. Acid. Res. 11:2237-2255 (1983), y la del B. subtilis ha sido descrita por Charles et al., en Mol. Gen. Genet. 186:339-346
(1982).
La mutación puede ser causada o bien en solo una secuencia del promotor tal como la secuencia para GDH, o en dos o más secuencias del promotor tales como las secuencias para GDH, citrato sintasa (enzima que sintetiza citrato) (CS) e isocitrato deshidrogenasa (ICDH).
En la presente invención, el mutante obtenido de este modo es cultivado para obtener el mutante capaz de producir una gran cantidad de ácido L-glutámico.
Ya ha sido explicado que en la fermentación de ácido glutámico, la GDH que deriva de una microorganismo corineforme que produce glutamato posee su propia secuencia de promotor en su región aguas arriba (Sahm et al., Molecular Microbiology (1992), 6, 317-326).
Por ejemplo, el promotor para la GDH de la presente invención, el gen de GDH que posee la secuencia de promotor para GDH y la cepa de bacteria corineforme que produce L-glutamato, que tiene este gen, pueden obtenerse, por ejemplo, mediante los métodos que siguen.
A saber, la cepa es sometida a una tratamiento de mutagénesis tal como irradiación con UV, rayos X o radiación, o tratamiento con un mutágeno, para obtener una cepa resistente al ácido 4-fluoroglutámico sobre un medio de cultivo con agar, en placa, que contiene ácido 4-fluoroglutámico. Es decir, las células mutagenizadas son sembradas en un medio de cultivo con agar, en placas, que contiene ácido 4-fluoroglutámico en una concentración tal que inhibe el crecimiento de las células parentales, y se separa el mutante que ha crecido de este modo.
Además, la secuencia del promotor de genes de GDH puede ser reemplazada por secuencias modificadas de diversos modos mediante mutagénesis dirigida al sitio, y se examina la relación existente entre las secuencias respectivas y la actividad de GDH para seleccionar de este modo aquellas que tienen alta productividad de L-glutamato.
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La secuencia de DNA de la región -35 del promotor del gen que produce la GDH es, al menos, una secuencia de DNA seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias TTGTCA, TTGACA y TTGCCA, y/o la secuencia de DNA de la región -10 del promotor es la secuencia TATAAT.
La secuencia del promotor del gen de GDH está descrita, por ejemplo, en la publicación antes descrita de Sahm et al., Molecular Microbiology (1992), 6, 317-326. Está descrita en ella como Seq ID No. 1. La propia secuencia del gen de GDH ha sido descrita también por Sahm et al., en Molecular Microbiology (1992), 6, 317-326, como Seq ID
No.1.
De modo semejante, la mutación puede ser introducida en el promotor para la enzima que sintetiza citrato (CS) o la enzima que sintetiza isocitrato (ICDH).
Por tanto, los promotores para la GDH son aquellos que tienen al menos una secuencia de DNA seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias TTGTCA, TTGACA y TTGCCA en la región -35 y/o la secuencia TATAAT en la región -10. También se proporcionan genes para producir la glutamato deshidrogenasa, que tienen el promotor anteriormente descrito.
Los promotores para CS son aquellos que tienen la secuencia TTGACA en la región -35 y/o la secuencia TATAAT en la región -10, que no inhiben la función del promotor. También se proporcionan genes de CS que poseen el promotor antes descrito.
Los promotores para ICDH son aquellos que poseen la secuencia TTGCCA o TTGACA en el primero o el segundo promotor en la región -35 y/o la secuencia TATAAT en el primero o el segundo promotor en la región -10, que no inhiben la función del promotor. También se proporcionan los genes icd que poseen el promotor antes descrito.
Los promotores para PDH son aquellos que tienen la secuencia TTGCCA en la región -35 y/o la secuencia TATAAT en la región -10, que no inhiben la función del promotor, También se proporcionan genes de PDH que tienen el promotor antes descrito.
Los promotores para la argininosuccinato sintasa son aquellos que tienen al menos una secuencia de DNA seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias TTGCCA, TTGCTA y TTGTCA en la región -35 y/o la secuencia TATAAT en la región -10, o la base de ATAAT de la secuencia TATTAT ha sido reemplazada por otra base, que no inhiben la función del promotor. También se proporcionan genes de la argininosuccinato sintasa que tienen el promotor antes descrito.
Puede obtenerse ácido L-glutámico cultivando una bacteria corineforme de la presente invención, lo que produce ácido L-glutámico en un medio de cultivo líquido formando y acumulando con ello ácido L-glutámico, y recogiendo el aminoácido desde el medio de cultivo.
El medio de cultivo líquido que se usa para cultivar la cepa de la bacteria de la presente invención, antes descrita, es un medio de nutrición ordinario que contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, factores de crecimiento, etc.
Las fuentes de carbono incluyen hidratos de carbono tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas e hidrolizados de almidón; alcoholes tales como etanol y glicerina; y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Las fuentes de nitrógeno incluyen sulfato amónico, nitrato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, acetato amónico, amoniaco, peptona, extracto de carne, extracto de levadura y líquido de macerado de maíz. Cuando se utiliza un mutante auxótrofo, las sustancias requeridas se añaden al medio como los reactivos o sustancias naturales que los con-
tienen.
Las bacterias corineformes producen, habitualmente, ácido L-glutámico en condiciones de biotina reducidas. Por tanto, la cantidad de biotina del medio está restringida o se añade una sustancia que inhibe el efecto de la biotina tal como un tensioactivo o penicilina.
La fermentación se lleva a cabo, preferiblemente, con agitación del cultivo o agitando el cultivo con aireación, al tiempo que se mantiene el pH del cultivo en el intervalo de 5 a 9 durante 2 a 7 días. El pH se regula, preferiblemente, con urea, carbonato cálcico, amoniaco gaseoso, agua amoniacal o semejante. La temperatura del cultivo es, preferiblemente, de 24 a 37ºC.
El ácido L-glutámico producido y acumulado de este modo en el líquido de cultivo, se recoge mediante un método normal tal como un método que utiliza una resina de intercambio iónico o un método de cristalización. Específicamente, el ácido L-glutámico se separa por adsorción sobre una resina de intercambio aniónico o mediante cristalización con neutralización.
Según la presente invención puede obtenerse ácido L-glutámico con alto rendimiento introduciendo una mutación en la región del promotor de genes de biosíntesis del ácido L-glutámico, de una bacteria corineforme que produce ácido L-glutámico, para regular la expresión de los genes deseados. Además, dado que en las bacterias según la presente no tiene lugar eliminación alguna del gen deseado, al contrario de los casos en que se usa un plásmido, el ácido L-glutámico puede ser obtenido de modo estable con un rendimiento elevado. Así pues, la ventaja industrial de la invención es grande.
Las presente invención describe diversos promotores, en particular, promotores para GDH, capaces de comunicar el poder de producir ácido L-glutámico con alto rendimiento a cepas de bacterias corineformes sin aumentar la cantidad de ácido aspártico y de alanina que se obtienen como subproductos.
En la presente invención, se somete a mutagénesis una bacteria corineforme que produce L-glutamato, se recoge una cepa en la que la mutación introducida en una región del promotor del gen de GDH y que es resistente al ácido 4-fluoroglutámico, y se cultiva la cepa obteniendo ácido glutámico con alto rendimiento. Así pues, la presente invención es muy ventajosa desde el punto de vista industrial.
Los Ejemplos que siguen ilustran adicionalmente la presente invención.
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Ejemplo 1 Producción de promotor mutante de GDH
Se preparó un promotor mutante de GDH mediante el método de mutagénesis dirigida al sitio, del modo siguiente:
(1) Preparación de genes de GDH que poseen varios promotores mutantes
La secuencia de tipo salvaje de la región -35 y de la región -10 de un promotor del gen de GDH de una bacteria corineforme, se muestra en la secuencia 1. La secuencia del promotor de tipo salvaje ya ha sido indicada [Molecular Microbiology (1992), 6, 317-326].
El método de preparación de un plásmido que es portador del gen de GDH, que tiene un promotor mutante, es el siguiente.
Como muestra la Fig. 1, un gen cromosómico de una cepa de tipo salvaje de una bacteria corineforme ATCC13869 preparada con el "Kit de Purificación de DNA Genómico Bacteriano" (Advanced Genetic Technologies Corp.) se usó como molde para una PCR. La amplificación génica se llevó a cabo por PCR usando secuencia aguas arriba y aguas abajo del gen de GDH. Ambos extremos fueron transformados en extremos romos. El producto obtenido de este modo fue insertado en el sitio SmaI del plásmido pHSG399 (un producto de Takara Shuzo Co., Ltd.). Después, un origen de replicación tomado desde el plásmido pSAK4 que tiene el origen de replicación capaz de replicación en una bacteria corineforme, fue introducido en el sitio SalI del plásmido obteniendo el plásmido pGDH. Por este método pueden obtenerse genes de GDH que tienen cada una de las secuencia de promotor anteriormente descritas, usando un cebador que posee cada una de las secuencias de Seq ID No. 1 a Seq ID No. 6 indicadas en el Listado de Secuencias, como el cebador aguas arriba para genes de GDH, respectivamente. Se confirmó secuenciando el fragmento amplificado por PCR que no había ocurrido en el fragmento amplificado una mutación distinta de la mutación introducida en la secuencia del promotor. El pSAK4 se construyó del modo siguiente: el plásmido pHK4 obtenido previamente (J. P. KOKAI No. 5-7491) que posee un origen autónomo de replicación derivado del plásmido pHM1519 [Agric. Biol. Chem. 48, 2901-2903 (1984)], que es capaz de replicarse autónomamente en microorganismos del género Corynebacterium, se somete a digestión con las enzimas de restricción BamHI y KpnI obteniendo un fragmento de DNA que lleva el origen de replicación. Luego el fragmento obtenido de este modo es hecho de extremos romos con el DNA-Blunting Kit (Blunting Kit de Takara Shuzo Co., Ltd.) Después de ligación con el engarce SalI, el producto así obtenido fue insertado en el sitio SalI del plásmido pHSG299 (un producto de Takara Shuzo Co., Ltd.) obteniendo el plásmido pSAK4.
(2) Comparación de los grados de expresión de GDH que tiene cada una de las secuencias del promotor
Cada uno de los plásmidos preparados según se ha descrito anteriormente, fue introducido en cepas de tipo salvaje de la bacteria corineforme ATCC13869 mediante el método de electroporación (se hace referencia de J. P. KOKAI No. 2-207791). Para comparar los grados de expresión de GDH para estas cepas, se determino la actividad específica de GDH mediante el método de Sahm et al., anteriormente descrito, Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA I
1
Las cepas ATCC 13869/p6-2 a ATCC 13869p6-8 correspondían a las secuencias de Seq ID No. 2 a Seq ID No. 6, respectivamente. Estas secuencias eran las mismas que la secuencia No. 1(tipo salvaje) excepto que las partes subrayadas habían sido cambiadas, como sigue:
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Secuencia
2
Estas eran las de DNA de doble cadena, lineal, sintético.
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Ejemplo 2 Preparación de cepas mutantes (1) Preparación de cepas mutantes resistentes al ácido 4-fluoroglutámico
La cepa AJ13029 es una cepa mutante que produce ácido glutámico y que está descrita en el documento WO96/
06180. Aun cuando esta cepa no produce ácido glutámico a la temperatura de cultivo de 31,5ºC, produce ácido glutámico incluso en ausencia de un inhibidor de biotina cuando la temperatura de cultivo se cambia a 37ºC. En este Ejemplo, se usó la cepa Brevibacterium lactofermentum AJ13029 como la cepa parental para preparar las cepas mutantes. No es preciso indicar que puede usarse como cepa parental cualquiera de las cepas productoras de ácido glutámico diferente de la AJ13029, para prepara cepas mutantes resistentes al ácido 4-fluoroglutámico.
La cepa AJ13029 fue cultivada en el medio de agar CM2B (Tabla 2) a 31,5ºC durante 24 horas, obteniendo las células bacterianas. Las células fueron tratadas con una solución acuosa conteniendo 250 \mug/ml de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, a 30ºC, durante 30 minutos. Después, una suspensión de las células que tenían un grado de supervivencia de 1%, fue sembrada en placas del medio de cultivo con agar (Tabla 3) que contenía ácido 4-fluoroglutámico (4FG). Se formaron colonias después de incubar las placas a 31,5ºC durante 20 a 30 horas. En este experimento, se preparó primeramente un medio inclinado que contenía 1 mg/ml de 4FG y después una capa del mismo medio sin 4FG se formó horizontalmente sobre él. Así se obtuvo un gradiente de concentración de 4FG sobre la superficie del medio con agar. Cuando la placa se inoculó con las células mutantes obtenidas según se ha descrito, se formó una línea divisoria en el borde del límite de crecimiento de la cepa. Las cepas bacterianas que formaron colonias en una zona que contenía 4FG de una concentración mayor que la de la línea divisoria, fueron tomadas. De este modo se obtuvieron alrededor de 50 cepas resistentes a 4FG partiendo de aproximadamente 10.000 células mutagenizadas.
TABLA 2 Medio de agar CM2B
3
TABLA 3 Medio de agar
4
(2) Confirmación de la capacidad de producción de ácido L-glutámico de cepas mutantes resistentes a 4FG
La capacidad de producción de ácido glutámico de aproximadamente 50 cepas mutantes obtenidas en (1) anterior y de la cepa parental AJ13029, fueron confirmadas según se describe a continuación.
La cepa AJ13029 y las cepas mutantes fueron cultivadas, cada una, en medio de agar CM2B a 31,5ºC durante 20 a 30 horas. Un medio líquido que tenía la composición indicada como "medio A" en la Tabla 4, fue inoculado con las células así obtenidas, y se comenzó el cultivo en agitación a 31,5ºC. Aproximadamente 22 horas después, se añadió medio de nueva aportación de modo que la concentración final fuera la del medio B indicado en la Tabla 4. La temperatura se cambió a 37ºC y luego se continuó el cultivo durante 24 horas aproximadamente. Una vez completado el cultivo, se examinó el cultivo con un Biotic Analyzer (un producto de Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) para determinar si se había producido o no ácido L-glutámico. Se encontró así que cuando se hubieron cultivado las 50 cepas, se separaron dos cepas que tenían un rendimiento de ácido glutámico superior al obtenido con las cepas parentales y una alta actividad de GDH (cepa A y cepa B). La actividad de GDH de cada una de ellas se determinó encontrando que la actividad de GDH específica de ambas de ellas había aumentado (Tabla 5). La actividad de GDH se determinó mediante el método de E. R. Bormann et al., [Molecular Microbiol., 6, 317-326 (1996)]. Mediante secuenciación de los genes de GDH, se identificó que los puntos de mutación se encontraban solamente en la región del promotor de GDH (Tabla 6).
TABLA 4
5 
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TABLA 5 Formación de ácido glutámico y actividad de GDH de cepas mutantes
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TABLA 6 Secuencias de DNA en la región del promotor de GDH de cepas mutantes
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Ejemplo 3 Introducción de una mutación en la región del promotor del gen de CS de una bacteria corineforme que produce glutamato
En este Ejemplo, se obtuvo una cepa que tenía un promotor intensificado para los genes que codifican la glutamato deshidrogenasa (GDH) y la enzima que sintetiza citrato (CS).
(1) Clonación del gen gltA
La secuencia del gen gltA de una bacteria corineforme que codifica la enzima que sintetiza citrato, ya ha sido explicada [Microbiol. 140, 1817-1828 (1994)]. Sobre la base de esta secuencia, fueron sintetizados los cebadores que se indican en Seq ID No. 7 y Seq ID No. 8. Por otra parte, se preparó DNA cromosómico desde Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 usando el Kit de Purificación de DNA Genómico Bacteriano (Advanced Genetic Technologies Corp.). Se añadió agua esterilizada a una mezcla de 0,5 \mug del DNA cromosómico, 10 pmol de cada uno de los oligonucleótidos, 8 \mul de mezcla de dNTP (2,5 mM cada uno), 5 \mul de tampón 10xLa Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) y 2 U de La Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) obteniendo 50 \mul de "cocktail" de reacción de PCR. El "cocktail" de reacción se sometió a PCR. Las condiciones de la PCR fueron: 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación de extremos complementarios a 55ºC durante 15 segundos y extensión a 72ºC durante 3 segundos, usando el Thermal Cycler TP240 (Takara Shuzo Co., Ltd.), amplificando aproximadamente 3 Kbp de fragmentos de DNA que contenían el gen gltA y su promotor. Los fragmentos amplificados obtenidos de este modo fueron purificados con SUPRECO2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) y después hechos de extremos romos. La operación de realización de extremos romos se llevó a cabo con el Blunting Kit de Takara Shuzo Co., Ltd. El fragmentos con los extremos romos se mezcló con el pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.), y se sometió a digestión completa con SmaI para realizar la ligación La reacción de ligación se llevó a cabo con el Kit de Ligación de DNA ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) Una vez completada la ligación se realizó la transformación con células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Las células fueron sembradas en placas de medio L (que comprendía 10 g/l de bactotriptona, 5 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de aguar; pH 7,2) que contenían 10 \mug/ml de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido), 40 \mug/ml de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido) y 40 \mug/ml de cloranfenicol. Después de cultivarlas durante la noche, se tomaron colonias blancas para obtener las cepas transformadas después de aislamiento de colonias individuales.
Partiendo de las cepas transformadas se prepararon plásmidos mediante el método alcalino (Seibutsu Kogaku Jikken-sho compilado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai y publicado por Baifukan, p. 105, 1992). Se prepararon mapas de enzimas de restricción y el plásmido que tiene el mismo mapa de restricción que el mapa mostrado en la Fig. 2 fue denominado "pHSG399CS".
(2) Introducción de mutaciones en el promotor de gltA
Se usó el Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.) para la introducción de mutaciones en la región del de promotor de gltA. El método se describe específicamente a continuación. Se sometió a digestión completamente el plásmido pHSG399CS con EcoRI y SalI obteniendo genes gltA que contienen el fragmento EcoRI-SalI, que fueron ligados al fragmento obtenido por digestión completa de pKF19kM (Takara Shuzo Co., Ltd.) con EcoRI y SalI. Una vez completada la ligación, se llevó a cabo la transformación con células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Col. Ltd.). Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenían 10 \mug/ml de IPTG, 40 \mug/ml de X-Gal y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche se tomaron las colonias blancas y se obtuvieron transformantes mediante el aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se prepararon plásmidos y el plásmido que contenía el gen gltA se denominó pKF19CS.
Se llevó a cabo una PCR usando como molde el plásmido pKF19CS y el DNA sintético fosforilado en 5' indicado en la secuencia de Seq ID No. 9, Seq ID No. 10 y Seq ID No. 11, junto con el cebador de selección procedente del Mutan-Super Express Km. La transformación se llevó a cabo con células competentes de E. coli MV1184 (Takara Shuzo Co., Ltd.) usando el producto de la PCR. Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche se tomaron las colonias y se obtuvieron transformantes después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se preparó DNA plasmídico. La secuencia de la región del promotor de gltA se determinó mediante el método de Sanger [J. Mol. Biol. 143, 161 (1980)] usando DNA sintético que poseía la secuencia de Seq ID No.12. Específicamente, la secuencia se determinó con un Dye Terminator Sequencing Kit (Applied Biosystems) y se analizó mediante el Genetic Analyzer AB1310 (Applied Biosystems). Los plásmidos en los que la región del promotor de gltA había sido reemplazada por la secuencia indicada en la Tabla 7 fueron denominados, respectivamente, pKF19CS1, pKF19CS2 y pKF19CS4.
TABLA 7
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(3) Construcción de un plásmido de gltA mutante
Los plásmidos pKF19CS, pKF19CS1, pKF19CS2 y pKF19CS4 construidos en la etapa (2) fueron sometidos a digestión completa con SalI y EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) Por otra parte, el plásmido pSFK6 (Solicitud de Patente Japonesa No. 11-69896, publicada como JP2000-26228) que tenía un origen de replicación derivado del plásmido pAM330 que puede replicarse autónomamente en una bacteria corineforme (Publicación de Patente Japonesa con el Fin de Oposición) ((a las que alude en lo sucesivo como "J.P. KOKAI") No. 58-67699) se sometió a digestión completa con EcoRI y SalI. El fragmento obtenido se ligó con aproximadamente el fragmento de 2,5 kb que contenía el gltA. Una vez completada la ligación, se llevó a cabo la transformación con células competentes de E. coli JM109. Las células fueron sembradas en placas del medio L que contenía 10 \mug/ml de IPTG, 40 \mug/ml de X-Gal y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche se tomaron las colonias y se obtuvieron los transformantes después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se prepararon plásmidos. Los plásmidos que contenían el gen gltA fueron denominados, respectivamente, pSFKC, pSFKC1, pSFKC2 y pSFKC4.
(4) Determinación de la expresión de CS partiendo del plásmido de gltA mutante en bacterias corineformes
El plásmido construido en la etapa (3) anterior fue introducido en la cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869. Específicamente, este tratamiento fue realizado mediante el método de impulso eléctrico (J.P. KOKAI No. 2-07791). Los transformantes fueron seleccionados a 31ºC con placas de medio CM2B (que comprendía 10 g/l de bactotriptona, 10 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl, 10 \mul de biotina y 15 g/l de agar; pH 7,0) que contenían 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante dos día, se tomaron las colonias y los transformantes que contenían pSFKC, pSFKC1, pSFKC2 y pSFKC4 fueron denominados, respectivamente, BLCS, BLCS1, BLCS2 y BLCS4, respectivamente, después de aislamiento de colonias individuales. Un medio que tenía la composición indicada en la Tabla 8 fue inoculado con el transformante. El cultivo se continuó a 31ºC y se terminó antes de que la glucosa se hubiera consumido completamente. El líquido del cultivo se centrifugó para separar las células. Las células se lavaron con solución de tampón Tris 50 mM (pH 7,5) que contenía 200 mM de glutamato sódico y después se suspendieron en la misma solución tampón. Después de tratamiento con ultrasonidos con UD-201 (TOMY) seguido de centrifugación (10.000 g) las células que permanecían sin romperse fueron separadas obteniendo una solución de la enzima cruda. La actividad de citrato sintasa puede determinarse según Methods Enzymol. 13, 3-11 (1969). Específicamente, la solución de enzima cruda se añadió a una mezcla de reacción que contenía 100 mM de Tris.HCl (pH 8), 0,1 mM de DTNB, 200 mM de glutamato sódico y 0,3 mM de acetil CoA, y se determinó el ruido de fondo como el aumento de absorbancia en 412 nm a 30ºC, determinada mediante un espectrofotómetro U-3210 de Hitachi. Después, se añadió ácido oxalacético en una cantidad tal que su concentración final pudiera ser 0,5 mM. Se determinó el aumento de absorbancia en 412 nm, de lo cual se dedujo el valor del ruido de fondo para determinar la actividad de la citrato sintasa. La concentración de proteína de la solución de enzima cruda se determinó mediante el Ensayo de Proteínas (BIO-RAD). Se usó albúmina de suero bovino como la proteína patrón. Los resultados se exponen en la Tabla 9. Se confirmó que la actividad de citrato sintasa de los promotores de gitA mutantes había aumentado en comparación con la del promotor de gitA de tipo salvaje.
TABLA 8
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TABLA 9
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(5) Introducción del gen gltA mutante en un plásmido sensible a la temperatura
Para integrar en un cromosoma secuencias mutantes del promotor de gitA se conoce un método en el que se utiliza un plásmido cuya replicación en una bacteria corineforme es sensible a la temperatura (J.P. KOKAI No. 5-7491). Se usó como vector plasmídico el pSFKT2 (Solicitud de Patente Japonesa No. 11-81693 publicada como JP 2000-270872), cuya replicación en una bacteria corineforme es sensible a la temperatura. Se usaron como las secuencias mutantes del promotor de gltA los plásmidos pKFCS1, pKFCS2, y pKFCS3 sometidos a digestión completa con SalI y BstPI y hechos de extremos romos. Estos fueron ligados al pSFKT2, sometido a digestión completa con SmaI. Una vez completada la ligación, se llevó a cabo la transformación con células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía 10 \mug/ml de IPTG, 40 \mug/ml de X-Gal y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche se tomaron las colonias blancas y los transformantes fueron obtenidos después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se prepararon plásmidos. Los vectores transportadores sensibles a la temperatura que contenían el gen gltA fueron denominados, respectivamente, pSFKTC1, pSFKTC2 y pSFKTC4.
(6) Introducción del promotor de gltA mutante en un cromosoma
pSFKTC1, pSFKTC2 y pSFKTC4 fueron introducidos, cada uno, en la cepa de Brevibacterium lactofermentum FGR2 mediante el método de impulso eléctrico. Los transformantes fueron seleccionados en placas de medio CM2B que contenía 25 \mug/ml de kanamicina, a 25ºC. Después de introducir cada uno de los plásmidos, cada una de las cepas obtenida fue cultivada en medio líquido CM2B, sembrada en placas de CM2B que contenía 25 \mug/ml de kanamicina, después de dilución hasta una concentración de 10^{3} a 10^{5} cfu por placa y se cultivó a 34ºC. La cepa que tenía el plásmido sensible a la temperatura se hizo sensible a la kanamicina debido a que la replicación del plásmido estaba inhibida a esta temperatura y, por tanto, no podían formarse colonias. Por otra parte, la cepa que tenía DNA plasmídico integrado en el cromosoma puedo ser seleccionada debido a que formaba colonias. Las colonias obtenidas de este modo fueron tomadas y separadas en las respectivas colonias. Desde la cepa se extrajo el DNA cromosómico. Se llevó a cabo una PCR usando el DNA cromosómico como molde y los cebadores de secuencia indicados como Seq ID No. 8 y Seq ID No. 13. Aproximadamente 3 kb de fragmentos amplificados fueron confirmados. De este modo se probó que en esta cepa el gen gltA mutante derivado del plásmido sensible a la temperatura, había sido integrado cerca del gen gltA en el cromosoma hospedante mediante recombinación homóloga. Las cepas derivadas de los plásmidos pSFKTC1, 2 y 4 fueron denominadas, respectivamente, BLCS11, BLCS12 y BLCS14.
(7) Preparación de promotores de gltA sustituidos
Primeramente se obtuvieron cepas sensible a la kanamicina a partir de las cepas BLCS11, BLCS12 y BLCS14 que tenían integrado en ellas obtenido por recombinación homóloga, el gen gltA mutante. Las cepas que tenían integrado en ellas el plásmido fueron diluidas y sembradas en placas de medio CMM2B y cultivadas luego a 34ºC. Después de la formación de colonias, se obtuvieron réplicas de las placas usando placas de CM2B que contenían 25 \mug/ml de kanamicina, y se cultivó a 34ºC. De este modo se obtuvieron cepas sensibilizadas a la kanamicina.
Se extrajo el cromosoma de la cepa sensible a la kanamicina y se llevo a cabo una PCR con cebadores que poseían la secuencia indicada en Seq ID No. 7 y Seq ID No. 8, para preparar fragmentos del gen gltA. Los fragmentos amplificados obtenidos de este modo fueron purificados con SUPRECO2 (Takara Shuzo Co. Ltd.) y sometidos después a la reacción de secuenciación usando un cebador de Seq ID No. 13 para determinar la secuencia de su región del promotor. Como resultado de ello, la cepa que tenía la misma secuencia del promotor que la del plásmido pKF19CS1 de la Tabla 7, fue denominada GB01, la cepa que tenía la misma secuencia del promotor que la del pKF19CS2 fue denominada GB02 y la cepa que tenía la misma secuencia del promotor que la del pKF19CS4 fue denominada GB03. Se ha indicado que en estas cepas, el gen gltA de tipo salvaje, localizado originariamente en el cromosoma, había sido escindido con el plásmido vector, mientras que el gen gltA mutante introducido por el plásmido había permanecido en el cromosoma cuando el plásmido y el gen gltA duplicado habían sido escindidos desde el cromosoma.
(8) Determinación de la actividad de citrato sintasa de cepas del promotor de gltA mutante
Las actividades de la citrato sintasa fueron determinadas tratando ñas cepas FGR2, GB01, GB02, GB03 y FGR2/
pSFKC obtenidas en la etapa (7) del mismo modo que el de la etapa (4). Los resultados están indicados en la Tabla 10. Se confirmó que la actividad de citrato sintasa de la cepa del promotor de gltA sustituido, era mayor que la de sus cepas parentales.
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TABLA 10
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(9) Resultados del cultivo de cepas del promotor de gltA sustituidas
Cada una de las cepas obtenidas en la etapa (7) anterior, fue inoculada en un medio de cultivo de siembra que tenía la composición indicada en la Tabla 11, y el cultivo se agitó a 31,5ºC durante 24 horas. 300 ml de un medio de cultivo principal que tenía la composición que se indica en la Tabla 11, fueron colocados en frascos de vidrio fermentadores, de 500 ml, y después se esterilizó por calentamiento y se inoculó con 40 ml del cultivo de siembra según se ha descrito anteriormente, El cultivo se inició en una temperatura de 31,5ºC al tiempo que la velocidad de agitación y el grado de aireación se regulaban a 800 a 1300 rpm y ½ a 1/1 vvm, respectivamente. El pH del líquido de cultivo se mantuvo en 7,5 con amoniaco gaseoso. La temperatura se cambió a 37ºC 8 horas después de la iniciación del cultivo. El cultivo se termino cuando la glucosa se había consumido totalmente, en 20 a 40 horas, y se determinó la cantidad de ácido L-glutámico formado y acumulado en el líquido de cultivo.
Como resultado de ello, la mejora más importante en lo referente al rendimiento de ácido L-glutámico se confirmó al usar las cepas GB02 y GB03 en vez de las GB01 y FGR2/pSFKC, como muestra la Tabla 12. De estos hechos se desprende que se habían obtenido buenos resultados introduciendo la mutación en el promotor de gltA aumentándose la actividad de CS de 2 a 4 veces para la mejora del rendimiento de ácido glutámico producido mediante estas cepas.
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TABLA 11
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TABLA 12
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Ejemplo 4 Introducción de una mutación en la región del promotor del gen de ICDH de una bacteria corineforme que produce glutamato
En este Ejemplo fueron producidas cepas que tenían promotores intensificados para genes que codifican glutamato deshidrogenasa, citrato sintasa e isocitrato deshidrogenasa.
(1) Clonación del gen icd
La secuencia de DNA del gen icd de una bacteria corineforme, que codifica la isocitrato deshidrogenasa, ha sido ya esclarecida [J. Bacteriol. 177, 774-782 (1995)]. Sobre la base de esta secuencia fueron sintetizados los cebadores indicados en Seq ID No. 14 y Seq ID No. 15. Se llevó a cabo una PCR usando DNA cromosómico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 como molde, amplificando aproximadamente 3 kbp de un fragmento de DNA que contenía el gen icd y su promotor. El fragmento amplificado obtenido de este modo fue sometido a digestión completa con EcoRI y mezclado con el obtenido por digestión completa del plásmido pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) con EcoRI realizando la ligación. Una vez completada la ligación, se llevó a cabo la transformación usando células competentes de E. coli JM109. Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía 10 \mug/ml de IPTG, 40 \mug/ml de X-Gal y 40 \mug/ml de cloranfenicol. Después de incubar durante la noche, se tomaron las colonias blancas y los transformantes fueron obtenidos después de aislamiento de colonias individuales.
El plásmido que es portador del gen icd fue denominado pHSG399icd.
(2) Introducción de mutaciones en el promotor de icd
La posición exacta del promotor del gen icd no ha sido determinada todavía. La posibilidad de aumentar el nivel de transcripción de mRNA del gen icd, fue investigada modificando artificialmente la secuencia aguas arriba del gen que codifica ICDH en una secuencia semejante a la del promotor. Específicamente, fueron introducidas mutaciones en la región parecida a -10 existente en la secuencia de DNA aproximadamente 190 bp aguas arriba (el primer promotor) y aproximadamente 70 bp (el segundo promotor) aguas arriba del primer ATG de la proteína de ICDH.
Se usó el Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo Co.m Ltd.) para la introducción de mutación en una región aguas arriba del gen icd. El método se describe específicamente a continuación. Se sometió a digestión completa el plásmido pHSG399icd con PstI obteniendo el promotor del gen icd que contenía el fragmento PstI. Los fragmentos fueron ligados con el fragmento obtenido por digestión completa de pKF18kM (Takara Shuzo Co., Ltd.) con PstI. Una vez completada la ligación, se llevó a cabo la transformación con células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Las células fueron sembradas en el medio L que contenía 10 \mug/ml de IPTG, 40m \mug/ml de X-Gal y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche se tomaron las colonias blancas y se obtuvieron transformantes después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se prepararon plásmidos y el plásmido que contenía el promotor del gen icd fue denominado pKF18icd.
Se realizó una PCR usando el plásmido pKF18icd como molde y DNA sintético fosforilado en 5' que se muestra en Seq ID No. 16, Seq ID No. 17, Seq ID No. 18, Seq ID No. 19, Seq ID No. 20 y Seq ID No. 21, y el cebador de selección. Estos productos de la PCR fueron usados para transformar células competentes de E. coli JM109. Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche, las colonias que se formaron fueron tomadas y los transformantes fueron obtenidos después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se preparó DNA plasmídico y se determinó la secuencia de la región del promotor de icd usando el DNA sintético que se indica en Seq ID No. 22, mediante el método de Sanger [J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)].Específicamente, la secuencia de DNA se determinó con el Dye Terminator Sequencing Kit (Applied Biosystems), y se analizó con el Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems). Los plásmidos obtenidos reemplazando la región del promotor de icd por la secuencia indicada en la Tabla 7, fueron denominados pKF18ICD1, pHF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5 y pKF18ICD6, respectivamente. Entre ellos, el pKF18ICD2 fue sometido a digestión completa con PstI obteniendo el fragmento PstI que contenía el promotor del gen icd. El fragmento fue ligado con el fragmento obtenido por digestión completa con PstI del plásmido pKF18kM (Takara Shuzo Co., Ltd.) Una vez completada la ligación se llevó a cabo la transformación con células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía 10 \mug/ml de IPTG, 40 \mug/ml de X-Gal y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche se tomaron las colonias blancas y las cepas transformadas fueron obtenidas después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de las cepas transformadas se prepararon plásmidos y el plásmido que contenía el promotor del gen icd fue denominado pKF18ICDM2. Se llevó a cabo una PCR usando como molde el plásmido pKF18ICDM2 y el DNA sintético fosforilado en 5' que se indica en Seq ID No. 20 y Seq ID No. 21, y el cebador de selección. La transformación de células competentes de E. coli JM109 se llevó a cabo con el producto de la PCR. Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche las colonias formadas de este modo fueron tomadas y se obtuvieron transformantes después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se prepararon DNA plasmídicos y se determinó la secuencia de la región del promotor de icd usando el DNA sintético que se indica en Seq ID No. 22. Los obtenidos reemplazando la región del promotor de icd por la secuencia que se indica en la Tabla 13, fueron denominados, respectivamente, pKF18ICD25 y pKF18ICD26.
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TABLA 13
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(3) Construcción de plásmidos para determinar la actividad de un promotor
Para determinar fácilmente la actividad de un promotor un método posible es la determinación indirecta de la actividad del promotor usando un gen informador. Las propiedades deseables que se requieren del gen informador son que la actividad pueda determinarse con facilidad, que incluso cuando se añada un aminoácido a un extremo N terminal la actividad no disminuya grandemente, que la reacción de fondo no tenga lugar y que haya un sitio de escisión con una enzima de restricción, adecuado para la manipulación génica. Debido a que la \beta-galactosidasa (LacZ) de E. coli se usa profusamente como gen informador y que las bacterias del género Corynebacterium no poseen capacidad de asimilación de la lactosa [J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 399-416 (1972)], se determinó que el gen LacZ era el gen informador óptimo. Después se construyó el plásmido pNEOL que es portador de LacZ como el gen informador (véase la Fig. 3) El proceso de construcción se describe en detalle seguidamente. Se llevó a cabo una PCR usando como molde el DNA cromosómico obtenido de E. coli ME8459 (la cepa ME8459 fue depositada en el National Institute of Genetics (Japón)), con el DNA sintético indicado en Seq ID No. 23 y Seq ID No. 24 como el cebador. El producto de la PCR fue sometido a digestión completa con SmaI y BamHI, se ligó después con los fragmentos obtenidos por digestión de pKF3 (Takara Shuzo Co., Ltd.) con HindIII y se obtuvieron extremos romos. Una vez completada la ligación, se realizó la transformación con células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.), Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche las colonias formadas de este modo fueron tomadas y separadas en las respectivas colonias obteniendo la cepa transformada. El plásmido obtenido partiendo de la cepa transformada se denominó pKF3nptII. Después, este plásmido se sometió a digestión con SalI. Por otra parte, el plásmido pSAK4 descrito en el Ejemplo 1 (1) fue sometido a digestión completa con SmaII y SalI y se hicieron extremos romos. Estos fragmentos fueron ligados juntos para construir el vector transportador pNEO que puede replicarse en una bacteria corineforme. Esta plásmido era capaz de comunicar resistencia al cloranfenicol y resistencia a la kanamicina a los hospedantes. Después el plásmido pNEO fue sometido a digestión completa con SmaI y Sse8387l. Los fragmentos resultantes fueron ligados con los obtenidos mediante digestión completa del pMC1871 (Farmacia Biotech.) con PstI y SmaI. De este modo se construyó el vector transportador pNEOL, que puede replicarse en una bacteria corineforme y que tiene el gen LacZ que carece de 8 aminoácidos en el extremo N-terminal, como gen informador (véase la Fig. 3).
(4) Determinación de la actividad del promotor de icd mutante
Los plásmidos que tenían el promotor de icd mutante construidos en la etapa (2) anteriormente descrita, es decir los plásmidos pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25, pKF18ICD26 y pKFICD, fueron sometidos a digestión completa con SaclI y PstI y luego hechos de extremos romos. Estos plásmidos fueron ligados con el fragmento obtenido por digestión de pNEOL con SmaI. Una vez completada la ligación, se realizó la transformación con células competentes de E. coli JM109. Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía IPTG, X-Gal y 40 \mug/ml de cloranfenicol. Después de incubar durante la noche, se tomaron las colonias azules y se obtuvieron las cepas transformadas después de aislamiento de colonias indivi-
duales.
Partiendo de las cepas transformadas se prepararon plásmidos. Los plásmidos que tenían una estructura capaz de producir una proteína fusionada de ICDH y LacZ fueron denominados pNEOICD1, pNEOICD2, pNEOICD3, pNEOICD4, pNEOICD5, pNEOICD6, pNEOICD25, pNEOICD26 y pNEOLICD, respectivamente. Cada uno de estos plásmidos o pNEOL fue introducido en Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 mediante el método de impulso eléctrico. Los transformantes fueron seleccionados usando placas de medio CM2B (que comprendía 10 g/l de bactotriptona, 10 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl, 10 \mug/l de biotina y 15 g/l de agar y que tenía un pH 7,0) conteniendo 25 \mug/ml de kanamicina y 40 \mug/ml de X-Gal, a 31ºC, durante dos días. Una vez completada la introducción, las colonias formadas de este modo fueron tomadas y aisladas como colonias individuales. Los transformantes que contenían pNEOICD1, pNEOICD2, pNEOICD3, pNEOICD4, pNEOICD5, pNEOICD6, pNEOICD25, pNEOICD26 y pNEOLICD fueron denominados BLAC1, BLAC2, BLAC3, BLAC4, BLAC5, BLAC6, BLAC25, BLAC26, BLAC y BNEOL, respectivamente. Todos los transformantes distintos de BNEO formaron colonias azules. Se prepararon soluciones de enzimas crudas partiendo de los transformantes del mismo modo que el de la etapa (4) del Ejemplo 3, excepto que se usó tampón de lavado y de suspensión "Tampón Z" (que comprendía 10 mM de KCl, 1 mM de MgSO_{4}, 270 \mug/100 mM de 2-ME y NaPi, y que tenía un pH 7,5). La actividad de LacZ se determinó del modo siguiente: se mezcló Tampón Z con la solución de enzima cruda, se añadió a la mezcla resultante ONPG en Tampón Z teniendo la concentración final de 0,8 mg/ml, y se determinó el aumento de la absorbancia a 420 nm, a 30ºC con un espectrofotómetro Hitachi U-3210, como la actividad de LacZ. La concentración de proteína de la solución de enzima cruda se determinó mediante el Ensayo de Proteínas (BIO-RAD). Se usó albúmina de suero bovino como la proteína patrón Los resultados se indican en la Tabla 14. Se confirmó que la actividad de LacZ de la cepa que tenía una mutación en el promotor de icd y que expresa la proteína fusionada ICDH-LacZ, era mayor que la que expresaba la proteína fusionada ICDH-LacZ de tipo salvaje.
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TABLA 14
15
(5) Introducción del gen icd mutante en un plásmido sensible a la temperatura
Se usó el vector plasmídico pSFKT2 (Solicitud de Patente Japonesa No. 11-81693) cuya replicación en una bacteria corineforme era sensible a la temperatura. Los plásmidos pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKFICD25 y pKFICD26 fueron sometidos a digestión completa con PstI y los fragmentos obtenidos se usaron como las secuencias del promotor de icd mutante. Los fragmentos obtenidos de este modo fueron ligados con pSFKT2 digerido completamente con PstI. Una vez completada la ligación, se llevó a cabo la transformación con células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Las células fueron sembradas en placas de medio L que contenía 10 \mug/ml de IPTG, 40 \mug/ml de X-Gal y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche, se tomaron las colonias blancas y se obtuvieron cepas transformadas después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de las cepas transformadas se prepararon plásmidos. Los vectores transportadores, sensibles a la temperatura, que contenían el promotor de icd fueron denominados pSFKTI1, pSFKTI2, pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTl5, pSFKTI6, pSFKTI25 y pSFKTI26, respectivamente.
(6) Integración en un cromosoma del promotor de icd mutante
Los plásmidos construidos en la etapa (5) anterior fueron introducidos, cada uno, en la cepa de Brevibacterium lactofermentum GB02 mediante el método de impulso eléctrico. Los transformantes fueron seleccionados con placas de medio CM2B (que comprendía 10 g/l de bactotriptona, 10 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl, 10 \mug/l de biotina y 15 g/l de agar y que tenía pH 7,0), que contenían 25 \mug/ml de kanamicina, a 25ºC. Una vez completada la introducción, las cepas obtenidas fueron cultivadas en medio líquido CM2B, sembradas en placas de CM2B que contenían 25 \mug/ml de kanamicina después de diluir hasta una concentración de 10^{3} a 10^{5} cfu por placa, y se realizó el cultivo a 34ºC. La cepa que tenía el plásmido sensible a la temperatura se hizo sensible a la kanamicina debido a que la replicación del plásmido estaba inhibida a esta temperatura y, por consiguiente, no podía formar colonias. Por otra parte, la cepa que tenía el DNA plasmídico integrado en el cromosoma, pudo ser seleccionada debido a que podía formar colonias. Las colonias obtenidas de este modo fueron tomadas y separadas en colonias aisladas. Se extrajo desde la cepa el DNA cromosómico y se llevó a cabo una PCR usando como molde el DNA cromosómico con los cebadores indicados en Seq ID No. 13 y Seq ID No. 15. Fueron confirmados aproximadamente 3 kb de fragmentos amplificados. Se probó así que en esta cepa el gen icd mutante derivado del plásmido sensible a la temperatura había sido integrado cerca del gen icd del cromosoma hospedante mediante recombinación homóloga.
(7) Preparación de cepas que tienen el promotor de icd sustituido
En primer lugar, se obtuvieron cepas sensibles a la kanamicina partiendo de las cepas que tenían el gen icd mutante integrado en ellas mediante recombinación homóloga, según se ha descrito en la etapa (6). Las cepas que tenían el plásmido integrado en ellas fueron diluidas y sembradas en placas de CM2B y cultivadas luego a 34ºC. Después de la formación de colonias se hicieron réplicas sobre placas de CM2B que contenían 25 \mug/ml de kanamicina y se incubó a 34ºC. De este modo se obtuvieron cepas sensibles a la kanamicina.
Se extrajo el cromosoma desde las cepas resistentes a la kanamicina y se llevó a cabo una PCR usando los cebadores indicados en Seq ID No. 14 y Seq ID No. 15 para preparar fragmentos del gen icd. Los fragmentos amplificados obtenidos de este modo fueron purificados con SUPRECO2 (Takara Shuzo Co., Lts.) y sometidos después a la reacción de secuenciación usando el cebador indicado en Seq ID No. 22, para determinar la secuencia de su región del promotor. Como resultado de ello, las cepas que tenían secuencia del promotor de icd derivadas desde pSFKTl1, pSFKTI2, pSFKTl4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25 y pSFKTI26 fueron denominadas GC01, GC02, GC03, GC04, GC05, GC06, GC25 y GC26, respectivamente. En estas cepas, cuando el plásmido y el gen icd duplicado fueron escindidos desde el cromosoma, el gen icd de tipo salvaje, originalmente localizado sobre el cromosoma, fue escindido junto con el plásmido vector, mientras que el gen icd mutante introducido mediante el plásmido permaneció sobre el cromosoma.
(8) Determinación de la actividad de la isocitrato deshidrogenasa de las cepas mutantes que tenían el promotor de icd mutante
Se preparó una solución de enzima cruda de ICDH usando cada una de las 8 cepas obtenidas en la etapa (7) anterior y la cepa GB02, del mismo modo que el de la etapa (7) del Ejemplo 3. Se determinaron las actividades de ICDH del modo siguiente: La solución de la enzima cruda se añadió a una solución de reacción que contenía 35 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 mM de MnSO_{4}, 0,1 mM de NADP y 1,3 mM de ácido isocítrico, y se determinó el aumento de la absorbancia en 340 nm, a 30ºC, con un espectrofotómetro U-3210 de Hitachi, como la actividad de ICDH. La concentración de proteína de la solución de enzima cruda se determinó mediante el Ensayo de Proteínas (BIO-RAD). Se usó como proteína patrón albúmina de suero bovino. Los resultados se indican en la Tabla 15. Se confirmó que la actividad de isocitrato deshidrogenasa de cepas de promotor de icd sustituido era mayor que la de la cepa parental.
TABLA 15
17
(9) Resultados del cultivo de las cepas que contienen el promotor de icd sustituido
Cada una de las 8 cepas obtenidas en la etapa (7) anterior fue cultivada del mismo modo que en la etapa (9) del Ejemplo 3. Como resultado, se confirmó la mejora de rendimiento de ácido L-glutámico al usar una cualquiera de las cepas GC02, GC04, GC05. GC25 y GC26, como muestra la Tabla 16. Se encontró se habían obtenido buenos resultados introduciendo la mutación en el promotor de icd, aumentándose la actividad de ICDH hasta 3 veces por lo menos.
TABLA 16
18
Ejemplo 5 Introducción de una mutación en la región del promotor del gen de PDH de una bacteria corineforme que produce glutamato (1) Clonación del gen pdhA procedente de bacterias corineformes
Los cebadores indicados en Seq ID No. 25 y Seq ID No. 26, fueron sintetizados seleccionando regiones que tenían una homología elevada entre las subunidades EI de la piruvato deshidrogenasa (PDH) de Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa y Mycobacterium tuberculosis. Se llevó a cabo una PCR usando como molde el cromosoma de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, preparado con el Kit de Purificación de DNA Genómico, Bacteriano (Advanced Genetic Technologies Corp.), en las condiciones estándar de reacción que se describen en la página 8 de PCR Technology (compilada por H. Erlich y publicada por Stockton Press, 1989). La solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa encontrándose que se habían amplificado aproximadamente 1,3 kilobases de fragmento de DNA. La secuencia de ambos extremos del DNA obtenido fue determinada con el DNA sintético que se indica en Seq ID No. 25 y Seq ID No. 26, La secuencia s determinó mediante el método de Sanger [J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)] con el Kit de Secuenciación de DNA (Applied Biosystems Co.,). Una vez determinada la secuencia se dedujo la de los aminoácidos y se comparó con la de las subunidades E1 de piruvato deshidrogenasa derivada de cada una de las cepas Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Mycobacterium tuberculosis, encontrando una alta homología entre ellas. Por consiguiente, se determinó que el fragmento de DNA amplificado por PCR era parte del gen pdhA que codifica la subunidad El de la piruvato deshidrogenasa de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869. Se llevó a cabo la clonación de la región aguas arriba y aguas abajo del gen. El método de clonación fue el siguiente: Un cromosoma de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 fue sometido a digestión con las enzimas de restricción EcoRI, BamHI, HindIII, PstI, SalI y XbaI ((Takara Shuzo Co., Ltd.) obteniendo fragmentos de DNA. Se usó para la clonación el Kit de clonación in vitro LA PCR, (Takara Shuzo. Co. Ltd.), usando como cebadores las secuencias indicadas en Seq ID No. 27 y Seq ID No. 28 del Listado de Secuencias, para clonar la región aguas arriba, y las secuencias indicadas en Seq ID No. 29 y Seq ID No. 30 como cebadores para clonar la región aguas abajo. Después de llevar a cabo la PCR usando el kit, fragmentos de DNA de aproximadamente 0,5, 2,5, 3,0, 1,5 y 1,8 kilobases fueron amplificados para la región aguas arriba partiendo de los fragmentos obtenidos por digestión con EcoRI, Hind III, PstI, SalI y XbaI, respectivamente, y fragmentos de DNA de aproximadamente 1,5, 3,5 y 1,0 kilobases fueron amplificados para la región aguas abajo, partiendo de los fragmentos obtenidos por digestión con BamHI, HindIII y PstI, respectivamente. Las secuencias de estos fragmentos de DNA fueron determinadas del mismo modo que se ha descrito anteriormente. Se encontró que los fragmentos de DNA amplificados contenían, además, un marco de lectura abierto de aproximadamente 920 aminoácidos así como que una región que se suponía era la región del promotor, se encontraba presente en la región aguas arriba. Debido a que la secuencia de aminoácidos deducida desde la secuencia de DNA del marco de lectura abierto es altamente homóloga con la subunidad EI conocida de la piruvato deshidrogenasa, por ejemplo la de E. coli, resulta evidente que el marco de lectura abierto era el gen pdha que codifica la subunidad EI de la piruvato deshidrogenasa de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869. La secuencia de DNA del marco de lectura abierto se muestra en SEQ ID No. 31 del Listado de Secuencias. En Seq ID No. 31 del Listado de Secuencias, la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de DNA, se indica también, Puesto que el resto de metionina del extremo N-terminal de la proteína deriva de ATG que es un codón de iniciación, habitualmente no interviene en la función esencial de la proteína, y es bien sabido que el resto de metionina es separado por el efecto de peptidasa después de la traducción. Por consiguiente, en la proteína descrita, es posible que el resto de metionina del extremo N-terminal haya sido separado. No obstante, la secuencia GTC está presente en 6 bases aguas arriba del codón ATG, indicado en Seq ID No. 31 del Listado de Secuencias y también es posible que algún aminoácido haya sido traducido desde este punto. Piruvato deshidrogenasas de otros microorganismos tales como E. coli están compuestas de tres subunidades de E1, E2 y E3 y los genes que las codifican constituyen, en muchos casos, un operón. Sin embargo, ningún marco de lectura abierto fue considerado como que era la subunidad E2 y la subunidad E3 de las piruvato deshidrogenasas de aproximadamente 3 kilobases, aguas abajo del gen pdhA. En su lugar se mostró que una secuencia que se suponía que era un terminador, estaba presente en la región aguas abajo del marco de lectura abierto. Considerando estos hechos se supuso que las subunidades E2 y E3 de la piruvato deshidrogenasa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 estaban presentes en otra región sobre el cromosoma.
(2) Construcción de un plásmido para amplificar pdhA
Ya era evidente que la cepa obtenida mediante introducción de un gen que codifica tres subunidades constituyentes de la PDH de E. coli, en Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 proporciona un rendimiento aumentado de ácido glutámico (JP No. 10-360619, Solicitud de patente de prioridad para JP 11-356035, publicada como JP 2000-232.890). Sin embargo, en la PDH de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, solamente había sido clonado el gen pdhA que codifica la subunidad EI, y no se había llevado a cabo examen alguno para saber si la amplificación del gen sola es eficaz para mejorar el rendimiento de ácido glutámico. En estas circunstancias, se llevó a cabo un examen para saber si la amplificación del gen pdhA sola es eficaz para mejorar o no el rendimiento de ácido glutámico.
Los cebadores indicados en Seq ID No. 33 y Seq ID No. 34, fueron sintetizados sobre la base de las secuencias de DNA previamente clonadas. Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, preparado con el kit de Purificación de DNA Genómico, Bacteriano (Advanced Genetic Technologies Corp.), como molde, en las condiciones de reacción estándar que se describen en la página 8 de PCR Technology (compilada por H. Erlich y publicada por Stockton Press, 1989) para amplificar el gen pdhA. Entre los cebadores así sintetizados, la Seq ID No. 33 correspondía a la secuencia de bases No. 1397 a la No. 1416 del gen pdhA descrita en Seq ID No. 32 del Listado de Secuencias. La Seq ID No. 34 era la cadena complementaria de la secuencia de DNA correspondiente a la secuencia de las bases No. 5355 a No. 5374 de la Seq ID No. 32 del Listado de Secuencias, representada desde el lado 5'.
El producto de la PCR obtenido de este modo fue purificado por el método corriente y hecho reaccionare con las enzimas de restricción Sal I y EcoT22I. El fragmento fue ligado con pSFK (Solicitud de Patente No. 11-69896), escindido con las enzimas de restricción SalI y PstI, y ligado con un kit de ligación (Takara Shuzo Co. Ltd.) Después de la transformación con células competentes (Takara Shuzo Co. Lyd,) de E. coli JM 109, las células fueron sembradas en placas de medio L (que comprendía 10 g/l de bactotriptona, 5 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de agar, y que tenía un pH 7,2) que contenían 10 \mug/ml de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido), 40 \mug/ml de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido) y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche se tomaron las colonias blancas y se obtuvieron las cepas transformadas después de aislamiento de colonias individuales.
Partiendo de las cepas transformadas se prepararon plásmidos mediante el método alcalino (Seibutusu Kogaku Jikken-sho compilado por Nippon Seibutsu Kogaju kai y publicado por Baifukan, página 105, 1992). Se prepararon mapas de enzimas de restricción de fragmentos de DNA insertados en los vectores y se compararon con el mapa de enzimas de restricción del gen pdhA indicado en la secuencia No.32 del Listado de Secuencias. Un plásmido que contenía fragmentos de DNA insertados en él, que tenía el mismo mapa de enzimas de restricción que el del gen pdhA, fue denominado pSFKBPDHA.
(3) Introducción del pASFKBPDHA en Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y GC25, y evaluación de los experimentos de fermentación
Las cepas Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y GC25 fueron transformadas con el plásmido pSFKBPDHA mediante el método de impulso eléctrico (J.P. KOKAI No. 2-207791) obteniendo las cepas transformadas. El cultivo para producir ácido L-glutámico se llevó a cabo del modo siguiente con las cepas transformadas ATCC 13869/pSFKBPDHA y GC25/pSFKBPDHA obtenidas introduciendo el plásmido pSFKBPDHA en Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 y GC25: Células de ATCC 13869/pSFKBPDHA y GC25/pSFKBPDHA obtenidas por cultivo en placas del medio CM2B que contenía 25 \mug/ml de kanamicina, fueron inoculadas en un medio (que comprendía 1 litro de agua pura que contenía 80 g de glucosa, 1 g de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g de MgSO_{4}.7H_{2}O, 30 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,01 g de FeSO_{4}.7H_{2}O, 0,01 g de MnSO_{4}.7H_{2}O, 15 ml de hidrolizado de proteína de soja, 200 \mug de clorhidrato de tiamina, 60 \mug de biotina, 25 mg de kanamicina y 50 g de CacO_{3} y que tenía un pH ajustado a 8,0 con KOH). Luego el cultivo fue agitado a 31,5ºC hasta que el azúcar del medio se había consumido. Los productos obtenidos fueron inoculados en el medio de la misma composición que el descrito anteriormente (para GC25/pSFK6 y GCC25/pSFKBDHA) o el medio con Biotina eliminada de la composición tal como el descrito anteriormente (para ATCC13869/pSFK6 y ATCC13869/pSFKBPDHA), en una cantidad de 5%, y el cultivo en agitación se llevó a cabo a 37ºC hasta que el azúcar del medio se había consumido. Como testigo, cepas producidas por transformación de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y GC25 con el plásmido pSFK6 previamente obtenido, capaz de replicarse autónomamente en bacterias corineformes, mediante el método de impulso eléctrico (J.P. KOKAI No. 2-207791), fueron cultivadas del mismo modo que se ha descrito anteriormente. Una vez completado el cultivo, se determinó la cantidad de ácido L-glutámico acumulada en el medio de cultivo con el Biotic Analyzer AS-210 (un producto de Asahi Chemical Industry Co., Ltd.). Los resultados se exponen en la Tabla 17.
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TABLA 17
19 
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De estos resultados resulta evidente que incluso la amplificación del gen pdhA solo es lo suficientemente eficaz para mejorar el rendimiento de Glu en Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y GC25.
(4) Construcción de plásmidos para determinar la actividad del promotor de pdhA mutado
Para producir un mutante del promotor de la piruvato deshidrogenasa (PDH), se llevó a cabo la determinación de la región del promotor, previamente clonada, del gen pdhA de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, así como se realizó la determinación de la diferencia en la expresión ocasionada por la modificación de la región del promotor, determinando la actividad de \beta-galactosidasa.
La región del promotor del gen pdhA se supuso partiendo de la secuencia de DNA que ya había sido esclarecida por clonación. Como resultado se opinó que era posible que la base No. 2252 a la No. 2257 y la No. 2279 a la No. 2284 de Seq ID No. 32 del Listado de Secuencias fueran, respectivamente, la región -35 y la región -10. Por tanto, fueron sintetizados los cebadores indicados como Seq ID No. 35 y Seq ID No. 36 del Listado de Secuencias, y fragmentos de DNA que contenían la región del promotor del gen pdhA fueron amplificados por el método de PCR usando el DNA cromosómico de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 como molde. Entre los cebadores sintetizados, Seq ID No. 35 correspondía a la secuencia que se extiende desde la base No. 2194 hasta la base No. 2221 de la Seq ID No. 32; pero la base No. 2198 había sido reemplazada por C, y la base No. 2200 y la base No. 2202 habían sido reemplazadas por G, y había sido insertada la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción SmaL. La Seq ID No. 36 correspondía a la secuencia que se extiende desde la base No. 2372 hasta la base No. 2398 de Seq ID No. 32, pero la base No. 2393 y la base No. 2394 habían sido reemplazadas por G, y la cadena complementaria de la secuencia de DNA que tenía insertada en ella la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción SmaI, estaba representada desde el extremo 5'. Se llevó a cabo una PCR usando como molde el cromosoma de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, preparado con el kit de Purificación de DNA Genómico Bacteriano (Advanced Genetic Technologies Corp.), en las condiciones estándar de reacción descritas en la página 8 de PCR Technology (compilada por H. Erlich y publicada por Stockton Press, 1989) para amplificar la región del promotor del gen pdhA. El producto de la PCR obtenido de este modo fue purificado mediante el método ordinario y hecho reaccionar con la enzima de restricción SmaI. Los fragmentos fueron ligados con el plásmido pNEOL que carece de la región del promotor del gen lacZ que podía replicarse en una bacteria corineforme y que había sido sometido a digestión con la enzima de restricción SmaI, (Ejemplo 4 (3) con un Kit de Ligación (Takara Shuzo Co., Ltd.). Después de la transformación con células competentes (Takara Shuzo Co., Ltd.) de E. coli JM109, las células fueron sembradas en placas de medio L (que comprendía 10 g/l de bactotriptona, 5 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de agar y que tenía un pH de 7,2), que contenían 40 \mug/ml de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosidasa) y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche, se tomaron las colonias azules y las cepas transformadas fueron obtenidas después del aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se prepararon plásmidos mediante el método alcalino (Seibutsu Kogaku Jikken-sho compilado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai y publicado por Baifukan, página 105, 1982). Después de secuenciar fragmentos de DNA insertados en el vector por el método habitual, el plásmido que contenía el fragmento de DNA insertado en él fue denominado
pNEOLBPDHAprol.
Además, fueron sintetizados los cebadores indicados como Seq ID No. 37, Seq ID No. 38 y Seq ID No. 39 del Listado de Secuencias, para construir plásmidos en los que se suponía que una región que era el sitio del promotor había cambiado a la secuencia de consenso de promotores de bacterias corineformes. Usando cada uno de los cebadores y el cebador indicado en Seq ID No. 36, fragmentos de DNA en los que la región del promotor del gen pdHA había cambiado a la secuencia de consenso, fueron amplificados mediante el método de PCR usando como molde el DNA cromosómico de Brevibacterium lactofermentum ATCC13896. Entre los cebadores sintetizados el de Seq ID No. 37 correspondía a la secuencia que se extiende desde la base No. 2244 hasta la base No. 2273 de Seq ID No. 32; la base No. 2255 había sido reemplazada por C, y la base No. 2257 había sido reemplazada por A; por tanto solamente la región -35 había sido cambiada a la secuencia de consenso de las bacterias corineformes. La Seq ID No. 38 correspondía a la secuencia que se extiende desde la base No. 2249 hasta la base No. 2288 de la secuencia No.32; las bases No. 2279 y No. 2281 habían sido reemplazadas por T; por tanto, solamente la región -10 había sido cambiada a la secuencia de consenso de las bacterias corineformes. La secuencia No. 39 correspondía a la secuencia que se extiende desde la base No. 2249 hasta la base No. 2288 de Seq ID No. 32; la base No. 2255 había sido reemplazada por C, la base no. 2257 había sido reemplazada por A y las bases No. 2279 y No. 2281 habían sido reemplazadas por T; por tanto, ambas regiones, la región -35 y la región -10, habían sido cambiadas a la secuencia de consenso de las bacterias corineformes. Se llevó a cabo una PCR usando como molde cromosomas de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, preparados con el Kit de Purificación de DNA Genómico Bacteriano (Advanced Genetic Technologies Corp.), en las condiciones estándar de reacción descritas en la página 8 de PCR Technology (compilado por H. Erlich y publicado por Stockton Press, 1989), para amplificar la región del promotor del gen pdhA con estos cebadores de modo que la región de promotor había cambiado a la secuencia de consenso. Los productos de la PCR obtenidos de este modo fueron purificados por el método habitual y hechos reaccionar con la enzima de restricción SmaI. Los fragmentos fueron ligados con el plásmido pNEOL que carece de la región del promotor del gen lacZ, que podía replicarse en una bacteria corineforme y que había sido escindido con enzimas de restricción SmaI, con el Kit de Ligación (Takara Shuzo Co., Ltd.). Después de la transformación con células competentes (Takara Shuzo Co., Ltd.,) de E. coli JM109, las células fueron sembradas en placas de medio-L (que comprendía 10 g/l de bactotriptona, 5 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de agar y que tenía un pH de 7,2), que contenían 40 \mug/ml de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosidasa) y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche, se tomaron las colonias azules y las cepas transformadas fueron obtenidas después del aislamiento de colonias individuales. Partiendo de las cepas transformadas se prepararon plásmidos mediante el método alcalino (Seibutsu Kogaku Jikken-sho compilado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai y publicado por Baifukan, página 105, 1982). Después de secuenciar fragmentos de DNA insertados en el vector por el método habitual, el plásmido que contenía insertado en él los fragmentos de DNA, en los que solamente la secuencia de la región -35 había sido cambiada a la secuencia de consenso, fue denominado pNEOLBPDHApro35; el plásmido que contenía insertado en él fragmentos de DNA en los que solamente la secuencia de la región -10 había sido cambiada a la secuencia de consenso, fue denominado pNEOLBPDHApro10; y el plásmido que contenía insertado en él fragmentos de DNA en los que las secuencias de ambas regiones, la región -35 y la región -10, habían sido cambiadas a la secuencia de consenso, fue denominado pNEOLBPDHApro3510.
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(5) La evaluación de la actividad del promotor de pdhA mutado
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 fue transformada con los plásmidos denominados pNEOLBPDHApro1, pNEOLBPDHApro10 y pNEOLBPDHApro3510 mediante el método de impulso eléctrico (J.P. KOKAI No. 2-207791) obteniendo las cepas transformadas. La actividad de \beta-galactosidasa de los transformantes obtenidos se determinó mediante el método descrito en el Ejemplo 4(4). Después de cambiar la secuencia de la región del promotor a la secuencia de consenso, las actividades de \beta-galactosidasa fueron las expuestas en la Tabla 18, en la que la actividad enzimática de la \beta-galactosidasa que tenía la región del promotor del gen pdhA se indica como 1.
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TABLA 18
20
Estos resultados indican que la región del promotor supuesta era el promotor del gen pdhA y que la expresión de pdhA puede cambiarse (intensificarse) cambiando la secuencia de esta región a la secuencia de consenso. Este hecho indica que la expresión puede cambiarse, sin usar plásmidos, cambiando la región del promotor del gen pdhA.
(6) Construcción de plásmidos para preparar cepas variadas de promotor
Dado que se había probado que la expresión de pdhA puede cambiarse introduciendo mutaciones en el promotor, se construyeron plásmidos para preparar cepas modificadas con el promotor de pdhA. Se realizaron tres construcciones de los plásmidos para las cepas modificadas con el promotor. Estos eran plásmidos en que la región -35, la región -10 y ambas de ellas habían sido cambiadas a la secuencia de consenso, respectivamente.
Los cebadores indicados en Seq ID No. 40 y Seq ID No. 41, fueron sintetizados de nuevo sobre la base de la secuencia de DNA que ya había sido clonada. Entre los cebadores sintetizados el Seq ID No. 40 era la cadena complementaria de la secuencia de DNA que correspondía a una secuencia que se extiende desde la base No. 2491 hasta la base No. 2521 de la Seq ID No. 32, que estaba representadas desde el extremo 5' y a la que corresponde una secuencia que comprende tres A's seguidas de cuatro T's en el extremo 5' terminal. La Seq ID No. 33 era la cadena complementaria de la secuencia de DNA que correspondía a la secuencia que se extiende desde la base No. 5020 hasta la base No. 5039 del gen pdhA de la Seq ID No. 32, que estaba representada desde el extremo 5'. Se llevó a cabo una PCR usando como cebadores la Seq ID No. 33 y la Seq ID No. 40 y como molde el cromosoma de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, preparado con el Kit de Purificación de DNA Genómico Bacteriano (Advanced Genetic Technologies Corp.), en las condiciones estándar de reacción que están descritas en la página 8 de PCR Technology (compilado por H. Erlich y publicado por Stockton Press, 1989). Después, se llevó a cabo una PCR usando la Seq ID No. 39 y la Seq ID No. 41 y el cromosoma de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. como molde Los producto de la PCR obtenidos de este modo fueron purificados del modo habitual. La PCR se llevó a cabo usando como cebadores los productos de PCR obtenidos usando la Seq ID No. 33 y la Seq ID No. 40, los productos de PCR obtenidos usando la Seq ID No. 39 y la Seq ID NO. 41 y las Seq ID No. 33 y 41. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: La concentración de estos cuatro DNAs podía ser 10 \muM en el "cocktail" de reacción, y se usó La taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), sin molde. Los productos de la PCR fueron purificados por el método habitual, y hechos reaccionar con las enzimas de restricción SalI y XhoI. Los fragmentos obtenidos de este modo fueron ligados con los fragmentos obtenidos por digestión con SalI del plásmido pSFKT2 sensible a la temperatura, que puede replicarse en una bacteria corineforme, usando el Kit de Ligación (Takara Shuzo Co., Ltd.). Después de la transformación con células competentes (Takara Shuzo Co. Ltd.,) de E. coli JM109, las células fueron sembradas en placas de medio L (que comprendía 10 g/l de bactotriptona, 5 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de agar y que tenía un pH de 7,2) que contenían 10 \mug/ml de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido), 40 \mug/ml de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosidasa) y 25 \mug/ml de kanamicina. Después de incubar durante la noche, se tomaron las colonias blancas y se obtuvieron transformantes después de aislamiento de colonias individuales. Partiendo de los transformantes se prepararon plásmidos mediante el método alcalino (Seibutsu Kogaku Jikken-sho compilado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai y publicado por Baifukan, página 105, 1982). Después de secuenciar fragmentos de DNA insertados en el vector, la secuencia de bases se comparó con la del gen pdhA indicada en la secuencia No. 32. El plásmido que contenía insertado en él fragmentos de DNA, en los que solamente las secuencias de la región -35 y de la región -10 del promotor habían sido cambiadas a la secuencia de consenso de las bacterias corineformes, fue denominado pSFKTPDHApro3510.
Un plásmido en el que la región -35 del promotor del gen pdhA había sido cambiada a la secuencia de consenso de bacterias corineformes, y también un plásmido en el que la región -10 del promotor del gen pdhA había sido cambiada a la secuencia de consenso de bacterias corineformes, fueron construidos del mismo modo que se ha descrito anteriormente, excepto que la Seq ID No. 39 del Listado de Secuencias fue reemplazada por la Seq ID No. 37 y Seq ID No. 38, respectivamente. Estos plásmidos fueron denominados pSFKTPDHApro35 y pSFKTPDHApro10, respectivamente.
(7) Preparación de cepas modificadas con promotor
Se prepararon cepas que tenían el promotor del gen pdhA modificado mediante el método de recombinación homóloga usando el plásmido para preparar cepas variadas de promotor construidas en la etapa (6) anteriormente descrita.
En primer lugar, la cepa GC25 fue transformada con el plásmido pSFKTPDHApro3510 para preparar una cepa modificada con el promotor mediante el método de impulso eléctrico ( J.P. KOKAI No. 2-207791). Las células fueron sembradas en placas de medio CM2B (que comprendía 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extracto de bactolevadura, 5 g/l de NaCl, 10 \mug/ml de biotina y 15 g/l de agar y que tenía un pH de 7,2) y se realizó el cultivo a 25ºC obteniendo cepas transformadas. Estos transformantes fueron cultivados en medio líquido CM2B, en tubos de ensayo, durante la noche, y luego fueron sembrados en placas de medio CM2B que contenían 25 \mug/ml de kanamicina y se realizó el cultivo a 34ºC, obteniendo una cepa causada por recombinación inmediata que contenía el plásmido pSFKTPDHApro3510 en su cromosoma insertado por el método de recombinación homóloga. Después de aislamiento de colonias individuales, esta cepa fue cultivada en medio líquido CM2B en tubos de ensayo, durante la noche. Después de dilución adecuada, se sembró en placas de medio CM2B y se realizó el cultivo a 31,5ºC. Después de que las colonias empezaron a aparecer, las réplicas fueron hechas en placas de medio CM2B que contenían 25 \mug/ml de kanamicina, obteniendo cepas sensibles a la kanamicina. Puesto que pudieran haber sido producidas dos tipos de cepas, es decir, una cepa que tuviera la secuencia de la cepa de tipo salvaje para la región del promotor del gen pdhA y otra cepa que tuviera la mutación introducido en ella, esta región fue secuenciada. De este modo se obtuvo una cepa modificada en el promotor en la que la mutación había sido introducida en la región del promotor del gen pdhA. En esta cepa, la región -35 y la región -10 del promotor del gen pdhA habían sido cambiadas a la secuencia de consenso de bacterias corineformes. Esta cepa fue denominada GD3510.
Del mismo modo descrito se obtuvieron cepas en las que la región -35 o la región -10 del promotor del gen pdhA habían sido cambiadas a la secuencia de consenso de bacterias corineformes, excepto que el plásmido pSFKTPDHApro3510 descrito para producir la cepa modificada en el promotor había sido reemplazado por los plásmidos pSFKTPDHApro35 y pSFKTPDHApro10 produciendo cepas modificadas en el promotor y estas cepas fueron denominadas GD35 y GD10, respectivamente.
(8) Evaluación de los resultados de cultivo en frasco, de cepas modificadas con el promotor del gen pdhA
El cultivo en frasco utilizado para producir ácido L-glutámico se llevó a cabo con tres tipos de cepas modificadas con el promotor del gen pdhA, obtenidas según se ha descrito antes. Cada una de las células de las cepas modificadas con promotor, GD3510, GD35, GD10 y GC25, obtenidas por cultivo en placas de medio CM2b, fue inoculada en un medio (que comprendía 1 litro de agua pura que contenía 30 g de glucosa, 1 g de KH_{2}PO_{4}, 0,4 g de MgSO_{4},7H_{2}O, 30 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,01 g de FeSO_{4}.7H_{2}O, 0,01 g de MnSO_{4}.7H_{2}O, 15 ml de hidrolizado de soja, 200 \mug de clorhidrato de tiamina, 60 \mug de biotina y 50 g de CaCO_{3}, y que tenía una pH ajustado a 8,0 con KOH). Después el cultivo se agitó a 31,5ºC hasta que el azúcar del medio se hubo consumido. Los productos obtenidos fueron inoculados en un medio de la misma composición que el descrito anteriormente, en una cantidad de 5% y se llevó a cabo el cultivo en agitación a 37ºC hasta que el azúcar del medio se hubo consumido. Una vez completado el cultivo, se determinó la cantidad de ácido L-glutámico que se había acumulado en el líquido de cultivo, con un Biotic Analyzer AS-210 (un producto de Asahi Chemical Industry Co., Ltd.). Los resultados se exponen en la Tabla 19.
TABLA 19
21
Resulta evidente de los resultados expuestos que las cepas obtenidas modificadas con el promotor proporcionaban rendimientos mejorados de Glu.
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Ejemplo 6 Introducción de una mutación en la región del promotor del gen GDH de una bacteria corineforme que produce glutamato (1) Construcción de plásmidos de gdh mutantes
Plásmidos que tenían la secuencia del promotor de GDH de la cepa FGR1 y de la cepa FGR2 descritas en el Ejemplo 2, fueron construidos mediante mutagénesis dirigida al sitio. Para obtener la secuencia del promotor de GDH de la cepa FGR1, se llevó a cabo una PCR usando el DNA sintético indicado en Seq ID No. 57 y el DNA sintético indicado en el No. 60, como los cebadores, y el DNA cromosómico de la cepa ATCC13869 como molde; y, por otra parte, se realizó una PCR usando el DNA sintético indicado en Seq ID No. 58 y el DNA sintético indicado en Seq ID No. 59 como cebadores, con el DNA cromosómico de la cepa ATCC 13869 como molde. También, se llevó a cabo una PCR usando los DNAs sintéticos indicados en Seq ID No. 57 y Seq ID No. 58 como cebadores, con una mezcla de estos productos de PCR como molde. El producto de PCR obtenido de este modo fue insertado en el sitio SmaI de pSFKT2 (Solicitud de Patente Japonesa No. 11-69896) construyendo el plásmido pSFKTG11. Para obtener la secuencia del promotor de GDH de la cepa FGR2, se llevó a cabo una PCR usando el DNA sintético indicado en Seq ID No. 57 y el DNA sintético indicado en Seq ID No. 62 como cebadores, y el DNA cromosómico de la cepa ATCC13869 como molde; y, por otra parte, se realizó una PCR usando el DNA sintético indicado en Seq ID No. 58 y el DNA sintético indicado en Seq ID No. 61 como cebadores y el DNA cromosómico de ATCC 13869 como molde. Además, se llevó a cabo una PCR usando el DNA sintético indicado en Seq ID No. 57 y Seq ID No. 58 como cebadores, y una mezcla de estos productos de PCR como molde. El producto de la PCR obtenido de este modo fue insertado en el sitio SmaI de pSFKT2 (Solicitud de Patente Japonesa No. 11-69896) construyendo el plásmido pSFKTG07. Se determinaron las secuencias de DNA de los fragmentos insertados en los sitios SmaI de pSFKTG11 y pSFKTG07 para confirmar que ninguna mutación se había introducido en otras regiones distintas de la región del promotor de GDH.
(2) Construcción de cepas modificadas con el promotor de gdh
Luego, los plásmidos pSFKTG11 y pSFKTG07 fueron introducidos en la cepa AJ13029 mediante el método de impulso eléctrico, y los transformantes que crecieron en placas de medio CM2B que contenían 25 \mug/ml de kanamicina, a 25ºC, fueron seleccionados. Los transformantes fueron cultivados a 34ºC para seleccionar cepas que fueran resistentes a la kanamicina a 34ºC. El hecho de que una cepa sea resistente a la kanamicina a 34ºC, indica que el pSFKTG11 ó el pSFKTG07 estaba integrado en el cromosoma de la cepa AJ13029. Se obtuvieron cepas sensibles a la kanamicina desde las cepas en las que el plásmido estaba integrado en el cromosoma. Las secuencias del promotor de GDH de estas cepas fueron determinadas. Las cepas que tenían la misma secuencia del promotor de gdh que las de el pSFKTG11 y el pSFKTG07, fueron denominadas GA01 y GA02, respectivamente.
(3) Confirmación de la productividad de ácido L-glutámico de cepas modificadas con el promotor de gdh
Las productividades de ácido glutámico de las cepas GA01 y GA02 y de la cepa parental AJ13029 fueron confirmadas del mismo modo que el del Ejemplo 2 (2) anteriormente indicado. Como resultado, se reconoció una mejora notable en la acumulación de ácido glutámico en las cepas GA01 yGA02, como muestra la tabla 23.
TABLA 23
22
4) Construcción de plásmido de gdh del tipo de auto-clonación
En primer lugar se construyó el vector de auto-clonación pAJ220. El pAJ226 (J. P. KOKAI No. 61-152289) se trató con EcoRV y PstI preparando un fragmento que contenía una región que podía replicarse autónomamente en una bacteria corineforme. El fragmento fue ligado con aproximadamente 0,7 kb del fragmento de DNA obtenido tratando pAJ224 (J. P. KOKAI No. Sho 61-152289) con EcoRV y PstI obteniendo el plásmidopAJ220. Este plásmido podía replicarse autónomamente en una bacteria corineforme y podía proporcionar al huésped resistencia a trimetoprima.
Se llevó a cabo una reacción de PCR usando el DNA sintético indicado en Seq ID No. 63 y Seq ID No. 64 como cebadores, y el DNA cromosómico de la cepa ATCC13869 de bacteria corineforme de tipo salvaje, como molde. El fragmento del gen gdh obtenido de este modo se insertó en el sitio BalI de pAJ220 construyendo el pAJ220G. El promotor estaba presente cerca del sitio BalI del pAJ220, y la expresión del gen insertado resultó aumentada dependiendo de la dirección del gen insertado en el sitio BalI. El pAJ220G y el pGDH fueron introducidos en la cepa ATCC 13869 mediante el método de impulso eléctrico. Las actividades de GDH de las cepas construidas de este modo fueron determinadas por el método expuesto en la etapa (1) antes descrita. Como resultado de ello, la actividad de GDH de la cepa en la que había sido introducido el pAJ220G era, aproximadamente, 1,5 veces mayor que el de la cepa en la que había sido introducido el pGDH como muestra la tabla 24.
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TABLA 24
23
(5) Investigaciones sobre la influencia de la actividad de gdh sobre el rendimiento y el Asp obtenido como subproducto
El pGDH y el pAJ220G fueron introducidos en la cepa AJ13029 mediante el método de impulso eléctrico. Cada una de estas cepas y las obtenidas en la etapa (2) anteriormente descrita, fue inoculada en un medio de cultivo de siembra (semilla) que tenía la composición indicada en la Tabla 22 y se llevó a cabo el cultivo en agitación a 31,5ºC durante 24 horas, obteniendo el cultivo de siembra. 300 ml de medio para el cultivo principal, que tenía la composición indicada en la Tabla 22, fueron colocados en cada uno de frascos de vidrio de fermentación, de 500 ml, y después se esterilizó por calentamiento. 40 ml de los cultivos de siembra descritos fueron inoculados en el medio. El cultivo se inició a una temperatura de 31,5ºC al tiempo que la velocidad de agitación y el grado de aireación se regulaban, respectivamente, en 800 a 1300 rpm y ½ a 1/1 vvm. El pH del líquido del cultivo se mantuvo en 7,5 con amoniaco gaseoso. La temperatura se cambió a 37ºC 8 horas después de iniciar el cultivo. El cultivo se concluyó cuando la glucosa se había consumido completamente, en 20 a 40 horas, y se determinó la cantidad de ácido L-glutámico producido y acumulado en el líquido de cultivo (Tabla 23). La actividad de GDH para obtener el máximo rendimiento fue, aproximadamente, 3 veces tan alta. Cuando la actividad de GDH se elevó adicionalmente, el grado de mejoría del rendimiento se redujo. Cuando la actividad de GDH se elevó hasta 16 veces, aproximadamente, el rendimiento se redujo bastante. Los aminoácidos obtenidos como subproductos fueron analizados con el Analizador de Aminoácidos L-8500, de Hitachi, encontrándose que a medida que se elevaba la actividad de GDH, la cantidad de ácido aspártico y de alanina que se habían acumulado, aumentaba. Estos resultados prueban los hechos siguientes: Para aumentar el rendimiento de ácido glutámico es necesario aumentar de modo adecuado la actividad de GDH para no causar un aumento notable de la cantidad de ácido aspártico y de alanina que se producen. Uno de los métodos eficaces para ello comprende la introducción de mutaciones diversas en el promotor de gdh para regular la actividad de GDH a 3 veces, aproximadamente, tan alta como la de la cepa parental.
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TABLA 25
24
TABLA 26 
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25
<110> Ajinomoto Co. Inc.
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<120> Método de construcción de una bacteria que produce aminoácidos y método de preparación de aminoácidos por fermentación con la bacteria construida que produce aminoácidos
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<130> Y1G-0426
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<160> 6
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<210> 1
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<211> 46
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<212> ácido nucleico
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 46
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<212> ácido nucleico
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttaattcttt gcggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 46
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<212> ácido nucleico
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 46
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<212> ácido nucleico
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttaattcttt gttgacatat ctgcgacact gctataattt gaacgt 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 46
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<212> ácido nucleico
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 46
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<212> ácido nucleico
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaattcttt gttgtcatat ctgogacact gctataattt gaacgt 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador A para la clonación de gltA procedente de Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador B para la clonación de gltA procedente de Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 1 para introducir una mutación en el promotor de gltA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcggtataa cgtgttaacc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 2 para introducir una mutación en el promotor de gltA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcggtataa tgtgttaacc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 4 para introducir una mutación en el promotor de gltA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador de la secuencia del promotor de gltA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agggatccgt ccagtctcag acagcatc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador universal M13RV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggaaacag ctatgac 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador A para la clonación de ICDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaattcgctc ccggtgcagc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador B para la clonación de ICDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgcagaat tccttgtcgg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 1 para introducir una mutación en el promotor de ICD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggattgctg gctataatgg tgtcgtga 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 2 para introducir una mutación en el promotor de ICD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caacccacgt tcagttgaca actactggat tgctggctat aatggtgtcg tga 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 3 para introducir una mutación en el promotor de ICD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 4 para introducir una mutación en el promotor de ICD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctgaaact gctataatag gcgccagc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 5 para introducir una mutación en el promotor de ICD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaaacacgg cgttgccatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador 6 para introducir una mutación en el promotor de ICD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaaacacgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador de la secuencia del promotor de ICD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcgggtcc agatgatctt ag 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador A para la amplificación de nptlI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggatcccgg atgaatgtca 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador B para la amplificación de nptlI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccggggtg ggcgaagaac tcc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para la amplificación del gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aci gti tci atg ggi cti ggi cc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para la amplificación del gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cct tci ccg tti agi gti gti cg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para la clonación in vitro del gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttg cag tta acc acg aag gtc agg ttg tcc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para la clonación in vitro del gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgg atg aga cca cgt gat tct ggc tcg tcc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para la clonación in vitro del gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aca gat cct gca cga agg cat caa cga ggc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para la clonación in vitro del gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tca tcg ctg cgg gta cct cct acg cca ccc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2766
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
\vskip0.400000\baselineskip
<220> gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
26 
\hskip1cm
28 
\hskip1cm
29 
\hskip1cm
30 
\hskip1cm
31 
\hskip1cm
32 
\hskip1cm
33 
\hskip1cm
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
35 
\hskip1cm
36 
\hskip1cm
37 
\hskip1cm
38 
\hskip1cm
39 
\hskip1cm
40 
\hskip1cm
41 
\hskip1cm
42 
\hskip1cm
43 
\hskip1cm
44 
\hskip1cm
45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para la construcción del plásmido de amplificación del gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aat gac agg agt caa cac cc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para la construcción del plásmido de amplificación del gen LA de pdhA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aca tgg aac agg caa ttc gc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para introducir una mutación en el promotor del gen LA de pdfA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgt ccc ggg ctg taa aac aaa tct tcg g 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para introducir una mutación en el promotor del gen LA de pdfA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atc ccc ggg ctt acc acc aag ttt tgc 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para introducir una mutación en el promotor del gen LA de pdfA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctt atg cgt tgc cac att cgt gca ctt cgg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para introducir una mutación en el promotor del gen LA de pdfA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcg ttg acc cat tcg tgc act tcg gtg tgc tat aat tag g 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para introducir una mutación en el promotor del gen LA de pdfA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcg ttg cca cat tcg tgc act tcg gtg tgc tat aat tag g 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220> cebador para introducir una mutación en el promotor del gen LA de pdfA en Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttt taa aac gtt ctg gag aag act cct gga gta atc cg 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
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<211> 20
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<212> ácido nucleico
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<220> cebador para introducir una mutación en el promotor del gen LA de pdfA en Brevibacterium lactofermentum 
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<400> 41
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cga tct tgc ctt cgc gtg cc 
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<210> 42
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<212> ácido nucleico
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agaccgccgg agtatgcaag aacgatgcgg 
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<212> ácido nucleico
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gacttcacca tcaatcatct tcttcaggta 
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accttcgacc agaccctggc taagggcttt 
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<212> ácido nucleico
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gcgatgacac cgtttttgtt ctcgc 
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ggcgacatcc ttgcccagat gatca 
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gacttcacca tcaatcatct tcttc 
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<212> ácido nucleico
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<220> cebador para introducir una mutación
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gttaatcgct tgctaatgca ggcaggtaag gtataacccg 
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gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataatccg 
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gggttccagc ctcgtgcgga attcgtggag 
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gcgttaccca gagctggatc ctcgg 
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<212> ácido nucleico
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<212> ácido nucleico
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ctttcccaga ctctggc 
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gctataattt gacgtgagca t 
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gctcacgtca aattatagca gtgtc 
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<212> ácido nucleico
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ttgttgtcat tctgtgcgac actgctataa tttgaacgtg agcagttaac agcc 
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<212> ácido nucleico
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<400> 62
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46 
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<212> ácido nucleico
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gctagcctcg ggagctctct aggag 
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<210> 64
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<211> 25
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<212> ácido nucleico
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<400> 64
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gatctttccc agactctggc cacgc 
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LISTADO DE SECUENCIAS 
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<110> Ajinomoto Co., Inc
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<120> Procedimiento para construir una bacteria que produce aminoácidos y procedimiento para producir aminoácidos por un método de fermentación con el uso de la bacteria construida que produce aminoácidos
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 82631 m3
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<140> 99944770.9
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<141> 1999-09-22
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<150> JP 10/271786
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<151> 1998-09-25
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10/271787
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1998-09-25
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<160> 66
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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ttaattcttt gttgtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt 
\hfill
46 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg 
\hfill
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<211> 30
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt 
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30 
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atcggtataa cgtgttaacc 
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20 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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atcggtataa tgtgttaacc 
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20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskip
agggatccgt ccagtctcag acagcatc 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggaaacag ctatgac 
\hfill
17 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaattcgctc ccggtgcagc 
\hfill
20 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
gatgcagaat tccttgtcgg 
\hfill
20 
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
tggattgctg gctataatgg tgtcgtga 
\hfill
28 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
caacccacgt tcagttgaca actactggattgctggctat aatggtgtcg tga 
\hfill
53 
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<211> 53
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggctgaaact gctataatag gcgccagc 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggaaacacgg cgttgccatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaaacacgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\newpage
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<400> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcgggtcc agatgatctt ag 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggatcccgg atgaatgtca 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 24
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcccggggtg ggcgaagaac tcc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
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\hskip-.1em\dddseqskip
acngtntcna tgggnctngg ncc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttcnccgt tnagngtngt ncg 
\hfill
23 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 27
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgcagttaa ccacgaaggt caggttgtcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggatgagac cacgtgattc tggctcgtcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acagatcctg cacgaaggca tcaacgaggc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcatcgctgc gggtacctcc tacgccaccc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2766
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2766)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
47 
\hskip1cm
48 
\hskip1cm
49 
\hskip1cm
50 
\hskip1cm
51 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 922
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
52 
\hskip1cm
53 
\hskip1cm
54 
\hskip1cm
55 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2360)..(5125)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
56 
\hskip1cm
57 
\hskip1cm
58 
\hskip1cm
59 
\hskip1cm
60 
\hskip1cm
61 
\hskip1cm
62 
\hskip1cm
63 
\hskip1cm
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 922
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
66 
\hskip1cm
67 
\hskip1cm
68 
\hskip1cm
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatgccagga gtcaacaccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acatggaaca ggcaattcgc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtcccgggc tgtaaaacaa atcttcgg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atccccgggc ttaccaccaa gttttgc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 39
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\hskip-.1em\dddseqskip
cttatgcgtt gccacattcg tgcacttcgg 
\hfill
30 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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gcgttgaccc attcgtgcac ttcggtgtgc tataattagg 
\hfill
40 
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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gcgttgccac attcgtgcac ttcggtgtgc tataattagg 
\hfill
40 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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ttttaaaacg ttctggagaa gactcctgga gtaatccg 
\hfill
38 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgatcttgcc ttcgcgtgcc 
\hfill
20 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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agaccgccgg agtatgcaag aacgatgcgg 
\hfill
30 
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<211> 30
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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gacttcacca tcaatcatct tcttcaggta 
\hfill
30 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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accttcgacc agaccctggc taagggcttt 
\hfill
30 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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gctaacaagc gcgatcgcga agctggcaac 
\hfill
30 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcgatgacac cgtttttgtt ctcgc 
\hfill
25 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggcgacatcc ttgcccagat gatca 
\hfill
25 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacttcacca tcaatcatct tcttc 
\hfill
25 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccaggtaca actgtctgaa ttgc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
gttaatcgct tgccaatgca ggcaggtaag gtataacccg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
gttaatcgct tgctaatgca ggcaggtaag gtataacccg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataacccg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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gttaatcgct tgttaatgca ggcaggtaag gtataatccg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataatccg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggttccagc ctcgtgcgga attcgtggag 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgttaccca gagctggatc ctcgg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagttgtggc tgatcg 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctttcccaga ctctggc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctataattt gacgtgagca t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctcacgtca aattatagca gtgtc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgttgtcat tctgtgcgac actgctataa tttgaacgtg agcagttaac agcc 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
70 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagcctcg ggagctctct aggag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatctttccc agactctggc cacgc 
\hfill
25

Claims (6)

1. Un método de producción de ácido L-glutámico, que comprende la etapa de cultivar una bacteria corineforme que expresa una enzima codificada por un gen que biosintetiza ácido L-glutámico, seleccionada entre el grupo que consiste en glutamato deshidrogenasa (GDH), citrato sintasa (CS), isocitrato deshidrogenasa (ICDH), piruvato deshidrogenasa (PDH) y aconitasa (ACO), y en el que una secuencia del promotor de dicho gen que biosintetiza ácido L-glutámico, situada sobre un cromosoma de la bacteria, contiene por lo menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en
i)
una secuencia TTGTCA, TTGACA o TTGCCA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método según la reivindicación 1, en el que el promotor del gen de GDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:
i)
una secuencia TTGTCA, TTGACA o TTGCCA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
\vskip1.000000\baselineskip
3. El método según la reivindicación 1, en el que el promotor del gen de CS contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:
i)
la secuencia TTGACA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
\vskip1.000000\baselineskip
4. El método según la reivindicación 1, en el que el promotor del gen de ICDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:
i)
la secuencia TTGACA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
\vskip1.000000\baselineskip
5. El método según la reivindicación 1, en el que el promotor del gen de PDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:
i)
la secuencia TTGCCA en la región -35 de la secuencia del promotor;
ii)
la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y
iii)
una combinación de (i) y (ii).
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un método de producción de ácido L-glutámico, que comprende la etapa de cultivar una bacteria corineforme que expresa una enzima codificada por el gen de citrato sintasa (CS), en el que una secuencia del promotor del gen de CS colocada sobre un cromosoma de la bacteria, contiene la secuencia ATGGCT en la región -35 de la secuencia del promotor y la secuencia TATAAC en la región -10 de la secuencia del promotor.
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