TWI247805B - Method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacteria - Google Patents

Method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacteria Download PDF

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TWI247805B
TWI247805B TW088116544A TW88116544A TWI247805B TW I247805 B TWI247805 B TW I247805B TW 088116544 A TW088116544 A TW 088116544A TW 88116544 A TW88116544 A TW 88116544A TW I247805 B TWI247805 B TW I247805B
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Yoko Asakura
Jun Nakamura
Eiichiro Kimura
Kazuhiko Matsui
Tsuyoshi Ohsumi
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Ajinomoto Kk
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1247805 A7 B7 五、發明説明（1) 發明背景 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明是關於構築一種具有高產量之產製胺基酸能力 之細菌突變株的方法，以及經由此突變株的醱酵作用而產 製L -胺基酸的方法。 構築可經由醱酵而產製胺基酸之突變株的方法大致可 分爲兩種。一種是以一化學突變劑隨機導入突變至D NA 中，另一種是經由基因重組作用。就後者方法而言，若一 品系具有改良之產製所要物質的能力，此能力可經由加強 關於此物質生物合成代謝路徑之基因來達成，或經由減弱 一會破壞此物質的酵素基因。基於此觀點，爲加強指定之 基因，在細胞中利用一個能獨立於染色體外複製的質體。 然而利用質體加強指定基因之方法有一些問題，特別 是指定基因的加強程度常視所用質體的複製數目而異。因 此有一些種類的指定基因複製數目過多而導致表現過度進 而嚴重抑制生長，或所要物質的產製力較低。在此種情況 下，雖然使用小複製數目之質體對指定基因的加強程度較 低，但對指定基因的表現程度之控制是非常重要的。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 另一問題是質體的複製通常不穩定，且質體常被移除 〇 舉例言之，日本專利未審查公開案（以後文中稱爲J. P. KOKAI" ) N 〇 ： S h 〇 61 — 268185 揭示一 衍生自產製麩胺酸之棒狀桿菌的重組D N A，此重組D N A包含一 DNA片段具有產製麩胺酸去氫酶（GDH)基 因（glutamate dehydrogenase gene)，以及揭示一 DN A 片 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（公釐） -4- 1247805 Α7 Β7 五、發明説明（2) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 段（質體）含有細胞內自動複製的必要基因。此文獻谬也 揭示導入此重組D N A到一細胞內，而形成G D Η -加強 品系，藉此微生物生長而促進物質（譬如胺基酸和蛋白質 )的產製。 另一方面，在日本專利2，520，895中，將上 述的重組D Ν Α導入棒狀桿菌中得到一具有改良酵素活性 的品系，且經由醱酵此品系而產製L -麩胺酸。然而L -麩胺酸的產製及產量並不令人滿意。因此，需要進一步改 良L -麩胺酸的產製力。改良方法已達成，亦即將含有衍 生自產製麩胺酸之棒狀桿菌的產製麩胺酸去氫酶基因和異 檸檬酸合成酶基因（I CDH)兩種基因的重組DNA導 入至產製麩胺酸的棒狀桿菌內。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 更進一步，JP Kokai No. Hei 6 — 5 0 2 5 4 8 揭示棒 狀桿囷的表現’和含有一^棒狀桿菌品系和一分泌匣的分泌 系統；此分泌匣包含用於在此品系中表現的第一項功能性 D N A序列，用於編碼胺基酸的第二項D N A序列，以及 插入介於第一項D N A序列和第二項D N A序列間的第三 項D N A序列，其中該第三項D N A序列編碼的蛋白質要 素是選自P S 1和P S 2，其可保證此胺基酸，多胜肽和 /或蛋白質的分泌。具體言之，多胜肽的分泌已揭示於該 文獻中。特別的是誘發棒狀桿菌品系的N T G突變作用， 且篩選一具有4 一氟麩胺酸（4 F G )抗性的突變株，由 於4 F G類似麩胺酸，因此以P C G L 1 4 1轉形之。該 文獻中也揭示可從類似抗性細菌中取得加強表現G D Η的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -5- 1247805 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（3) 品系。該文獻中也揭示觀察到G D Η啓動子核苷酸序列 2 5 1到2 6 6的突變作用。 發明之揭示 本發明目標是提供構築突變株之方法，使其不需使用 質體就能適當加強或控制指定基因的表現，且可經由重組 作用或突變作用產製高產量的胺基酸。 本發明的另一目標是提供一 G D Η啓動子，其在棒狀 桿菌品系中不需要嚴重增加副產物天冬胺酸和丙胺酸的量 就具有產製高產量麩胺酸的能力。 本發明的另一目標是提供一具有上述G D Η啓動子序 列的G D Η基因。 本發明的進一步目標是提供一具有上述基因的棒狀細 菌品系，其能產製L -麩胺酸。 本發明的進一步目標是提供一方法，其係藉由醱酵作 用產製胺基酸，其中產製胺基酸的微生物係被構築後使用 〇 本發明的進一步目標是提供一產製麩胺酸的醱酵方法 ，其係經由利用產製麩胺酸之棒狀桿菌在低成本下增加麩 胺酸的產量。 本發明已有效率的解決上述的問題，在染色體上改變 胺基酸-生物合成基因的啓動子而控制指定基因的表現量 。特別的是，本發明已有效率解決上述問題，是經由在啓 動子的特區域- 3 5區域或- 1 0區域中導入特殊的突變 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 蚌 •項再填· 裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -6 - 1247805 Α7 Β7 五、發明説明（气 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 亦即本發明提供一產製具有改良之胺基酸或核苔酸產 製力之棒狀桿菌的方法，其步驟包括在棒狀桿菌染色體上 的胺基酸或核苷酸生物合成基因之啓動子序列中導入突變 而使其接近一致序列，或以重組作用在棒狀桿菌染色體上 的胺基酸或核苷酸生物合成基因之啓動子序列中導入一變 化而使其接近一致序列，以得到棒狀桿菌的胺基酸或核苔 酸產製突變株，培養此突變株，並篩選能大量產製指定之 胺基酸或核苷酸的突變株。 本發明也提供一產製麩胺酸去氫酶（GDH)基因的 啓動子，其中至少有一 DNA序列是選自下列各組（i ) 位在—3 5 區域的 CGGTCA，TTGTCA，TTG ACA 和 TTGCCA， （ii)TATAAT 序列或相同 於TATAAT序列但ATAAT中鹼基已被其它鹼基取 代而不會在- 1 〇區域抑制啓動子功能者，和（iii )該（ i )和（ϋ )之組合。 本發明也提供一具有上述啓動子的麩胺酸去氫酶基因 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明也提供一具有上述基因的產製L -麩胺酸棒狀 細菌。 本發明也提供一經由醱酵產製胺基酸的處理過程，其 步驟包括培養一經由上述方法所構築的棒狀桿菌，且在培 養基中生成具有改良產製胺基酸的能力，以及在培養基中 累積指定的胺基酸，並從培養基中收集此胺基酸。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 1247805 A7 ____ _B7_ 五、發明説明（与 本發明也提供一經由醱酵產製L -麩胺酸的處理過程 ’步驟包括在含有4 -氟麩胺酸之液態培養基中培養-產 製L -麩胺酸的棒狀微生物，以及在培養基中累積L -麩 胺酸，並從培養基中收集此胺基酸。 1行本發明的最佳方法 文中 > 產製麩胺酸的棒狀微生物〃一詞也包括分類爲 短桿菌屬（Brevibacterium) [ Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 ( 1 98 1 )〕的細菌，短桿菌屬過去被分類爲棒狀桿菌屬但 現在已不屬於，但仍非接近棒狀桿菌屬。因此本發明所使 用的突變株衍生自產製麩胺酸的短桿菌屬或棒狀桿菌如下 所示。棒狀桿菌屬及短桿菌屬的細菌都集合稱爲〜棒狀桿 菌〃，這些尙未牽涉麩胺酸產製力。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 嗜乙醯酸棒狀桿菌（Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC1 3870 乙醢鍵胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC1 5806 帚石南棒狀桿菌（Corynebacterium callunae) ATCC15991 變胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum) ATCC1 3032 分叉短桿菌（Brevibacterium divaricatum) ATCC14020 乳酸醱酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8- 1247805 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _ B7五、發明説明（1) ，乙醯鳥胺酸轉胺基酶，N -乙醯鳥胺酸酶·，鳥胺酸轉胺 基曱醯酶，精胺基琥珀酸合成酶，和精胺基琥珀酸酶。經 由這些酵素進行催化反應形成胺基酸。這些酵素是有效用 的。這些酵素依序分別由a r gA，a r gB，a r gC ，argD，aegE，argF，argG 和 argH 所編碼的酵素。 絲胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括3 -磷酸甘油酸 去氫酶，磷酸絲胺酸反式-澱粉酶，磷酸絲胺酸磷酸酶等 苯丙胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括生物合成酵素 ，譬如去氧阿拉賓庚酸磷酸合成酶（deoxyarabinohepturonic acid phosphoric acid synthetic enzyme) ，3 —去氫金雞納酸 合成酶，3 -去氫金雞納酸去水合酶，莽草酸去氫酸，莽 草酸激酶，5 -烯醇丙酮基莽草酸- 3 -磷酸合成酶，分 支酸（chorismic acid )合成酶，分支酸變位酶，代丙酮酸 去水酶（prephenate dehydroratase )等等。糖代謝酵素譬如 轉酮醇酶，轉醛醇酶，磷酸烯醇丙酮酸合成酶等等。 色胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括屬於色胺酸操縱 子（operon)的酵素，除了上述苯丙胺酸醱酵所需之各種有 效酵素之外，也包括上述絲胺胺酸醱酵所需之各種有效酵 素。 脯胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括r -麩胺酸激酶 ，r -麩胺酸半醛去氫酶，吡咯啉- 5 -羧化鹽還原酶， 和上述麩胺酸醱酵所需之各種有效酵素。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 項再填· 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10- 1247805 A7 B7 五、發明説明（今 麩醯胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括麩醯胺酸合成 酶，和上述麩胺酸醱酵所需之各種有效酵素。 在肌核苷（inosine )的產製中，加強5 -磷酸核糖基 1 一二磷酸合成酶，5 -磷酸核糖基1 一二磷酸轉胺基酶 ，磷酸核糖基胺基咪唑羧醯胺轉甲醯基酶等等的表現被認 爲是有用的。 在鳥嘌呤核苷（guanosine )的產製中，加強5 > -肌 核脊酸去氫酶和5 / -黃核脊酸胺酶之表現，加入5 -磷 酸核糖基1 一二磷酸合成酶’ 5 -磷酸核糖基1 一二磷酸 轉胺基酶，及磷酸核糖基胺基咪唑羧醯胺轉甲醯基酶等被 認爲是有用的。 在腺苔（adenosine )的產製中，加強腺核脊號ί自酸合 成酶和5 -磷酸核糠基1 -二磷酸合成酶，5 -磷酸核糖 基1 -二磷酸轉胺基酶，及磷酸核糖基胺基咪唑羧醯胺轉 甲_基酶等的表現被認爲是有用的。 在核苷酸的產製中，加強磷酸核糖基轉移酶，肌核苷 激酶，鳥嘌呤核苷激酶和腺苷激酶的表現被認爲是有用的 〇 在本發明中產製胺基酸的棒狀細菌突變株的取得，是 在一產製胺基酸的棒狀桿菌之染色體上對所要之胺基酸-生物合成基因的啓動子序列造成突變而得，此類啓動子序 列如上述的G D Η，以化學劑對基因重組導入一突變而使 其接近一致序列。 、、一致序列〃一詞是指在各種啓動子排列中出現頻率 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事 項再填· :寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -11 - 1247805 A7 _B7_ 五、發明説明（ 產製麩胺酸去氫酶的基因具有上述啓動子。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} C S的啓動子具有位在一 3 5區域中的TTGACA 序列和/或位在一 1 0區域中的T A T A A T序列，且沒 有任何序列會抑制啓動子功能。本發明也提供C S基因具 有上述啓動子。 使用於i cd的啓動子是具有TTGCCA或TTG A CA序列之第一個或第二個啓動子在一 3 5區域，和/ 或具有TATAAT序列之第一個或第二個啓動子在 - 1 0區域，但其不抑制啓動子的功能。本發明也提供具 有上述啓動子的icd基因。 使用於PDH的啓動子是具有TTGC CA序列在 一 3 5區域和/或TATAAT序列在—1 0區域，且其 不抑制啓動子的功能。本發明也提供具有上述啓動子的 P D Η基因。 本發明也提供具有上述基因的產製L -麩胺酸棒狀桿 菌。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 藻朊酸琥珀酸合成酶的啓動子是那些具有至少一個 DNA序列是選自位在一 3 5區域之TTGCCA，ΤΤ GCTA和TTGTCA和/或位在—1 〇區域的TAT AAT序列，或以其它鹼基置換位在TATTAT中之A T A A T鹼基，但其不抑制此啓動子功能者。本發明也提 供具有上述啓動子的藻朊酸琥珀酸合成酶。 本發明也提供具有上述基因的產製精胺酸之棒狀桿菌 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】〇X297公釐） -14- 1247805 A7 B7 五、發明説明（ψ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 培養本發明的棒狀桿菌可得到胺基酸，其中以產製L -麩胺酸爲佳’是在液態培養基中形成所指定的胺基酸並 藉此累積，並從此培養基中收集胺基酸。 使用於培養本發明之上述品系細菌的液態培養基是包 含蔗糖，氮源，無機鹽，生長因子等的一般培養基。 碳源包括碳水化合物類的葡萄糖，果糖，蔗糖，糖蜜 和澱粉水解物；醇類的乙醇和甘油；和有機酸類的醋酸。 氮源包括硫酸銨，硝酸銨，氯化銨，磷酸銨，醋酸銨，氨 ，蛋白腺，肉萃取物，酵母菌萃取物和玉米液。當使用需 特別營養素之突變株時，則加入所要求之物質以樣品或天 然物質形式加入培養液中。 在限制生物素之下棒狀桿菌常產製L -麩胺酸。因此 ，在培養基需限制生物素的量或以界面活性劑或青黴素等 對生物素具抑制影響的物質加入培養基中。 醱酵作用最好以搖動培養方法或有氧轉動培養方法在 有氧條件下進行，而培養液p Η維持在5到9持續2到7 天。以尿素，碳酸齡，氣態氨，氨水等等控制ρ Η値。培 養溫度以2 4〜3 7 °C爲佳。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 利用離子-交換樹脂方法或結晶法等常用方法控制液 體培養液中L -麩胺酸的產製和累積。L -麩胺酸的分離 可藉由吸附在陰離子-交換樹脂或經由中和結晶作用。 根據本發明，在產製胺基酸的棒狀桿菌胺基酸-生物 合成基因的啓動子區域導入一突變來調控指定基因的表現 ，因此可藉此得到高產量的指定胺基酸。此外，根據本發 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15- 1247805 A7 B7 五、發明説明（1)3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 明的細菌並未發生任何指定基因的流失，與質體相較之下 能穩定得到高產量的指定胺基酸。如此，本發明具重要的 工業價値。 本發明提供各種啓動子，特別是G D Η的啓動子能賦 與產製胺基酸的能力，特別是麩胺酸，在棒狀桿菌品系內 不需增加副產物天冬胺基和丙胺酸的量就可得高產量麩胺 酸。 在本發明中，對產製L -麩胺酸的棒狀桿菌導入突變 ，使所得品系的突變發生在G D Η基因的啓動子區域中， 而此品系對4 -氟麩胺酸具抗性，且能在培養基中得到高 產量的麩胺酸。因此，本發明非常有助於工業上之利用。 下列範例將更進一步例證本發明。 範例1 :突變之G D Η啓動子的製作 以下列的定位突變方法製備突變的G D Η啓動子： (1 )具有各種突變型式之啓動子的GDH基因之製備： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 野生型棒狀桿菌GDH基因啓動子- 3 5區域和 - 1 0區域的序列顯示在序列1。野生型的啓動子序列已 發表於文獻〔Molecular Microbiology ( 1992)，6，3 1 7- 326〕 ο 攜帶具有突變啓動子之G D Η基因的質體之製備方法 如下：如圖1所示，以細菌基因體D Ν Α純化套組〃（ Advanced Genetic Technologies Corp.)製備野生型棒狀桿菌 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " -16- 1247805 A7 B7 五、發明説明（妒 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ATCC 1 3 869的染色體基因作爲模板。經由P C R在G D Η 基因的上游和下游序列中增幅G D Η基因。兩末端皆爲鈍 端。所得產物插入到質體p H S G 3 9 9 ( Takara Shuzo 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Co.，Ltd.)的S m a I位置。然後從具有棒狀桿菌複製起源 的質體P SAK4中取得複製起源，即將上述質體插入 PSAK4的Sa1 I位置而得到質體pGDH。經由 此方法，可使用序列表中所顯示之G D Η基因上游引子序 列1到6爲引子，得到具有上述各別啓動子序列的G D Η 基因。利用定序決定確認任何突變，和啓動子序列中的非 突變序列。P S A Κ 4的構築如下：質體Ρ Η Κ 4 ( J. Ρ. KOKAI No. Hei 5-7 49 1)具有衍生自質體 pHMl 5 1 9〔 Agric. Biol. Chem·，48，2901- 1903 (1984)〕的複製起源，而 Ρ Η Μ 1 5 1 9能在已得到的棒狀桿菌中自動複製，因此 以B a m Η I和Κ ρ η 1分解而得到具有複製起源的 DN Α片段。然後使用DN Α -鈍端套組（Blunting kit of Takara Shuzo Co.，Ltd.)處理得到鈍端的D N A片段。然後 連結S a 1 I連接子（linker )所得之產物插入 ρ H S G 2 9 9 ( Takara Shuzo Co·，Ltd·)的 S a 1 I 位 置而得到質體P SAK4。 (2 )比較具有各別啓動子序列之G D H的表現程度： 如上述所製備之質體以電穿透作用（JL P. KOKAI No. Hei 2-207791 )導入野生型的棒狀桿菌品系中。爲比較這些 品系的G D Η表現程度，G D Η的特殊活性是得自Sahm et 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -17- 1247805 A7 B7 五、發明説明（垆 al.的上述方法。結果顯示在表1。 表1 品系 啓動子-35 序列-10 GDH的特殊活性 相對値 ATCC 1 3869 TGGTCA CATAAT 7.7 0.1 /pGDH TGGTCA CATAAT 82.7 1.0 /p6-2 CGGTCA CATAAT 33.1 0.4 /p6-4 TGGTCA TATAAT 225.9 2.7 /p6-3 TTGACA TATAAT 327.2 4.0 /p6-7 TTGCCA TATAAT 407.0 4.9 /p6-8 TTGTCA TATAAT 401.3 4.9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
ATCC 13869/P6 — 2 到 ATCC 1 3 8 6 9 / p 6 - 8分別相對應到序列號碼2到6。除 了下列劃線部分改變之外，這些序列與序列號碼1 (野生 型）相同： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -18- 1247805 A7 B7 五、發明説明（仴 序列號碼
1 5，-TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGC CATAATTTGAACGT-3,
2 CGGTCA CATAAT 3. TGGTCA TATAAT 4, TTGACA TATAAT 5. TTGCCA TATAAT 6. TTGTCA TATATT 這些序列是雙股D N A的合成線形D N A。 範例2 :突變株品系之製備： (1 )誘發突變株品系對抗4 -氟麩胺酸： AJ 13029是揭示在W〇96/06180中的 產製麩胺酸之突變株品系。雖然在3 1 . 5 °C的培養溫度 下不能產製麩胺酸，但若培養在3 7 °C之下即使沒有生物 素-抑制劑也能產製麩胺酸。在此範例中，利用乳酸醱酵 短桿菌A J 1 3 0 2 9品系作爲親代以衍生突變株品系。 當然除了 A J 1 3 0 2 9之外的產製麩胺酸品系可使用作 爲親代，來衍生具4 -氟麩胺酸抗性的突變株品系。 將品系A J 1 3 0 2 9之微生物培養於3 1 · 5 °C的 C Μ 2 B瓊脂培養基（表2 ) 2 4小時以取得細胞。以 2 5 0微克/毫升的Ν -甲基一 Ν -硝基一 Ν —亞硝基胍 於3 0 °C處理3 0分鐘。然後將具有存活率1 %的細胞懸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 _項再填. 裝- 訂 费 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19- 1247805 A7 _ B7_ 五、發明説明（1)7 浮液塗於含有4 -氟麩胺酸（4 F G )的瓊脂平板培養（ 表3 )。於3 1 _ 5 °C培養2 〇到3 0小時可形成菌落。 在此實驗中，首先製備含有1毫克/毫升4 F G的斜面培 養基，然後製備相同培養基但不含4 F G的斜面及平面培 養基。如此，則可在瓊脂培養基表面得到4 F G濃度梯度 。當上述所得之突變株細胞接種於此平板時，在此品系的 生長限制邊界會形成一界線。此品系在含有較高濃度 4 F G的區域所形成的菌落多於界限的菌落。因此從約 1 0，0 0 0突變株品系得到約5 0個品系可抗4 F G。 表2 C Μ 2 B瓊脂培養基 成分 濃度 I--------裳— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 蛋白腺（Nippon Seiyaku Co.) 酵母菌萃取物（Difco Co.) N a C 1 d -生物素 瓊脂 (pH7 . 2 :以K〇H調整） 1 0 %1.0%0 . 5 % 1 0微克/升 1.5% 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 社 印 製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 20- 1247805 A7 B7 五、發明説明（货 表3 瓊脂培養基 組成分 數量/每1公升水 葡萄糖 10克 MgS〇4 · 7H2O 1克 FeS〇4 · 7H2O 0-01 克 MnS〇4 · 4-6H2O 0.01 克 硫胺素鹽酸鹽 0.2毫克 L生物素 0.05毫克 (NH4)2S〇4 5克 Na2HP〇4 · 12H2O 7.1克 KH2PO4 1·36 克 瓊脂 15克 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -21 - 1247805 A7 ___B7__ 五、發明説明（炉
Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.)檢驗是否形成 L —麩胺 酸。結果發現5 0個品系的培養中，有兩個品系的麩胺酸 產量高於親代品系，以及區分出一較高的G D Η活性（品 系Α和品系Β )。決定此二品系的G D Η活性發現這兩個 品系的特殊G D Η活性皆增加（表5 )。以Ε· R. Bormann et al. [Molecular Microbiol·，6，317-326 (1996)]的方法決定 G D H活性。分析G D H的鹼基序列發現突變點只在 GDH的啓動子區域內（表6)。 表4 (請先閱讀背面之注意事 ▼項再填· :寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 成分 培養基A 培養基Β 葡萄糖 3克/100毫升 5克/100毫升 ΚΗ2ΡΟ4 0.14克/100毫升 0.14克/100毫升 MgS〇4 · 7H2〇 0.04克/100毫升 0.04克/100毫升 FeS〇4 · 7H2〇 0.001克/100毫升 0.001克/100毫升 MnS〇4 · 4H2〇 0.001克/100毫升 0.001克/毫升 (NH4)2S〇4 1·5克/100毫升 2.5克/毫升 黃豆蛋白質水解液 1·5克/100毫升 0.38毫升/100毫升 硫胺素鹽酸鹽 0.2毫克/升 0.2毫克/升 生物素 0.3毫克/升 0.3毫克/升 抗發泡劑 0.05毫克/升 0.05毫克/升 C a C 0 3 5每100克/升 5每100克/升 酸鹼値 7·0(以Κ0Η調整） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -22- 1247805 A7 B7 五、發明説明（ψ 表5 突變株品系的麩胺酸形成和G D Η活性 品系 Glu(g/dl) GDH特殊活性 相對値 AJ13029 2.6 7.7 1.0 FGR1 2-9 23.1 3.0 FGR2 3.0 25.9 3.4 表6 突變株品系G D Η啓動子區域中的鹼基序列 品系 GDH啓動子序列 -35 -10 AJ13029 TGGTCA TTCTGTGCGACACTGC CATAAT FGR1 TGGTCA TTCTGTGCGACACTGC ΤΑΤΑΑΤ FGR2 TTGTCA T-CTGTGCGACACTGC ΤΑΤΑΑΤ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 範例3 導入突變到產製麩胺酸棒狀桿菌的C S基因啓動 子區域內： 在此範例中，一品系能加強編碼麩胺酸去氫酶（ GDH)基因的啓動子，並產製檸檬酸合成酶（CS)。 (1 ) g 1 t A基因的選殖： 棒狀桿菌的g 1 t A基因的鹼基序列是編碼檸檬酸合 成酶，且已被證明〔Microbial. 140，1 8 1 7- 1 828 ( 1 994)〕。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23- 1247805 A7 _ B7 五、發明説明（夺 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以這些序列爲基礎的合成引子顯示在序列號碼7和序列號 碼8 。另一方面，使用細菌基因體D N A純化套組（ Advanced Genetic Technologies Corp.)製作乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 869的染色體DNA。加入無菌水到〇 . 5微克染 色體DNA，1 〇微微莫耳的各別寡核苷酸，8微升 dNTP混合物（每一各2 . 5毫莫耳濃度），5微升 1 0 X L a T a Q 緩衝液（Takara Shuzo Co·，Ltd·)和 2 單位 L a 丁 a q ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)之混合液中使 其最終P C R反應液爲5 0微升。此反應液於9 4 °c 3 0 秒（分開雙股），5 5 °C 1 5秒（結合）和7 2 °C 3秒（ 加長作用）條件下進行3 0 -循環的P C R，以熱循環器 τ P 2 4 0 (Takara Shuzo Co·，Ltd.)增幅包含 g 1 t A 基 因及其啓動子的3 k b p D ΝΑ片段。之後以SUPREC0 2 (Takara Shuzo Co.，Ltd.)純化所得之增幅片段，然後使其 成爲鈍端。將此產物與S m a I完整分解之 p H S G 3 9 9 (Takara Shuzo Co·, Ltd.)混合以連接起來 。使用 DNA 連接套組 v e r 2 ( Takara Shuzo Co., Ltd. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 )進行連接作用。連接反應完全後，將之轉形到大腸桿菌 J Μ 1 〇 9 反應潛能細胞（Takara Shuzo Co·，Ltd.)內。將 轉形產物塗到含有1 0微克/毫升I PTG (異丙基硫化 半乳糖苷），40微克/毫升X-Gal(5-溴一4一 氯一 3 -吲哚基一沒一 D —半乳糖苷）和40微克/毫升 氯黴素的L培養基（含有1 〇克/升bactotryptone，5克/ 升細菌酵母菌萃取物，5克/升Na C 1和1 5克/升瓊 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -24- 1247805 A7 B7 五、發明説明（孪 月曰，pH7 . 2)。過仅培養之後’挑起白色菌落並分別 培養這些轉形菌落品系。 以鹼性方法（由Nippon Seibutsu Kogaku-kai編輯和 Baifukan 發行的 Seibutsu Kogaku Jikken-sho，ρ·1〇5，1 992 ) 從已轉形品系製備質體。並製備限制酶圖譜，相同之限制 酶圖譜顯示在圖2，命名爲、、pHSG3 99CS〃 。 (2)導入突變到g 1 tA啓動子中： 使用 Mutan-Super Express Km ( Takara Shuzo Co., Ltd. )將突變導入g 1 t A啓動子區域內。此方法具體描述如 下。以EcoRI和Sa 1 I完全分解pHSG399CS以得到 含有gl tA基因的EcoRI— Sa 1 I片段，然後與 完全用EcoRI和Sal I分解的pKF19kM( Takara Shuzo Co.，Ltd.)片段連接起來。連接完全之後將其 轉形到大腸桿菌J Μ 1 0 9 ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)反應 潛能細胞內。將轉形產物塗於含有1 〇微克/毫升 I PTG，40微克/毫升X — Ga 1和25微克/毫升 康納黴素（kanamycin )的L培養基。過夜培養之後，挑起 白色菌落並分別培養這些轉形品系。從這些已轉形品系中 製備質體並將那些含有g 1 t A基因者命名爲 P K F 1 9 C S。
使用p K F 1 9 C S爲模板和顯示在號碼9 ，1 0及 1 1之序列的末端磷酸化之合成D N A爲引子進行P C R ，而引子是以Mu tan Super Express Km舖選出的。將P C R 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事 項再填< :寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -25- 1247805 A7 _ B7 五、發明説明（年 產物轉形到大 桿囷 MV 1 1 8 4 (Takara Shuzo Co·，Ltd· )反應潛能細胞內。然後將轉形產物塗於含有2 5微克/ 毫升康納黴素的L -培養基。過夜培養之後，分別得到個 別之已轉形品系菌落。從這些已轉形品系中製備質體 D N A。經由 Sanger 方法〔】· Mol. Biol·，143，1 6 1 ( 1 980)〕 以合成的No . 1 2 DNA序列決定g 1 tA啓動子位 置的鹼基序列。具體而言，以染劑終止定序套組（Applied Biosystems )和 Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems)分析決定序列鹼基。顯示在表7之序列所置換 的g 1 t A啓動子區域的產物分別命名爲 PKF19CS1，pKF19CS2 和 PKF19CS4。 表7 -35區域 -10區域
PKF19CS ATGGCT TATAGC PKF19CS1 ATGGCT TATAAC PKF19CS2 ATGGCT TATAAT PKF19CS4 TTGACA TATAAT (3)突變株gltA質體的構築： 步驟（2 )中所構築的P K F 1 9 C S pKF19CSl ，pKF19CS2 和 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事 項再填. :寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -26- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247805 A7 _______B7_ 五、發明説明（妒 PKF19CS4 以 Sa 1 I 和 EcoRI ( Takara Shuzo Co·，Ltd·)完整分解。另一方面，具有衍生自質體 P A Μ 3 3 〇 [ Japanese Patent Publication for Opposition
Purpose (文中稱爲、、j. p. Κ0ΚΑΓ ) N o · S h o 5 8 - 6 7 6 9 9〕的複製起源而能在棒狀桿菌中自動複 製的質體 pSFK6 ( Japanese Patent Application No. Hei 1 1 -69 8 96 )，使用E c o R I和S a 1 I完整分解，所得片 段與含有g1tA的2.5kb片段連接在一起。連接完 全之後轉形到大腸桿菌J Μ 1 〇 9反應潛能細胞內。將轉 形產物塗於含有1 〇微克/毫升I PTG，4 0克/毫升 X-Ga1和25微克/毫升康納黴素的L一培養基。過 夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉形品系。從 轉形品系中製備質體。這些含有g 1 t A基因的質體分別 命名爲 pSFKC，pSFKCl， PSFKC2 和 pSFKC4 0 (4 )決定突變株g 1 t A質體在棒狀桿菌內的C S表現 將上述步驟（3 )所構築的質體導入乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3869內。具體而言，此過程是以電脈衝方法（j. P. KOKAI No. Hei 2-07791 )進行。使用含有2 5微克/毫升 康納黴素的C Μ 2 B平板培養基（包含1 〇克/升 bactotrypton，1 〇克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升 NaCl，1〇微克/升生物素和15克/升瓊脂； 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I-------------IT-----00 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -27- 1247805 A7 B7 五、發明説明（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} P Η 7 · 0 )於3 1 °C篩選轉形產物。培養兩夜之後取得 各別的菌落。這些含有pSKFC，pSKFCl， PSKFC2和pSKFC4之轉形子分別命名BLCS ，BLCS1 ，BLCS2和BLCS4。將轉形株接種 在含有表8中所示之成分的培養基中。然後於3 1°C培養 到葡萄糖完全消耗完之前。離心培養液以區分出細胞。以 含有2 0 0毫莫耳濃度麩胺酸鈉的5 0毫莫耳濃度 t r i s緩衝液（p Η 7 . 5 )淸洗細胞，然後再以相同 溶液懸浮之。以U D - 2 0 1 ( Τ〇Μ Υ )超音波分解之 後離心（1 0，0 0 0 g )，移除剩餘仍未分解之細胞而 得到一粗略酵素溶液。根據 Methods Enzymol. 13，3-11 ( 1 969)決定檸檬酸合成酶的活性。具體而言，將此粗略酶溶 液加入含有100毫莫耳濃度Tr i s H C 1 ( p Η 8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 )，0 _ 1毫莫耳濃度DTNB，200毫莫耳濃度麩胺 酸鈉和0 . 3毫莫耳濃度乙醯輔酶A的反應液中，然後以 Hitachi分光光度儀在3 0°C，4 1 2 nm決定其吸光度增 加。更進一步，加入草醋酸至其最終濃度爲0. 5毫莫耳 濃度。決定在4 1 2 n m時增加之吸光度，從背景値推縯 獲得檸檬酸合成酶的活性。以Protein Assay (BI0-RAD)決定 粗略酵素溶液中的蛋白質濃度。使用牛血淸白蛋白爲標準 蛋白質。結果顯示在表9中。比較突變g1tA啓動子和 野生型g 1 t A啓動子的檸檬酸合成酶活性之活性增加情 形加以確認。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28- 1247805 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格{ 210X297公釐） -29- 1247805 A7 _ B7 五、發明説明（2乃 P S F K T 7 ( Japanese Patent Application No. Hei 11- 8 1 693 )作爲複製質體載體，在棒狀桿菌對溫度敏感。使用 Sa 1 I 和 Bs tPI 完整分解 pKFCSl， pKF C S 2和PKF C S 3並使其成爲鈍端，作爲突變 g1tA啓動子序列。然後與已用SmaI完整分解之 p S F K T 2連接起來。連接完全之後，轉形到大腸桿菌 J Μ 1 〇 9 ( Takara Shuzo Co·，Ltd·)內。將轉形產物塗於 含有1 0微克/毫升I PTG，4 0微克/毫升X -G a 1和2 5微克/毫升康納黴素的L 一培養基。過夜培 養之後，挑起白色菌落並分別培養這些已轉形品系。從已 轉形品系中製備質體。含有g 1 t A基因的溫度-敏感性 穿梭載體命名爲pSFKTCl，PSFKTC2和 p S F K T C 4。 (6)導入突變g1tA啓動子到染色體內： 將 pSFKTCl，PSFKTC2 和 p S F K T C 4以電脈衝方法分別導入乳酸醱酵短桿菌F GR 2品系。使用含有2 5微克/毫升康納黴素的 CM2 B平板培養基於2 5 °C篩選轉形產物。完整導入之 後所得之品系培養於C Μ 2 B液態培養基，然後稀釋濃度 爲每一平板1 03到1 05d f u塗於含有2 5微克/毫升 康納黴素的C Μ 2 B平板上於3 4 °C培養。如此’則具有 溫度-敏感性之質體的品系由於在此溫度之下質體複製受 到抑制而變成對溫度敏感，所以不會形成菌落。另一方面 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事 ▼項再填. :寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -30- 1247805 A7 B7 五、發明説明（2今 ，質體D NA整合插入到染色體的品系者因可形成菌落而 能被篩選出來而取得個別分開之菌落。然後從此品系萃取 染色體D N A作爲模板，序列號碼8和1 3爲引子進行 P C R。之後確認約3 k b的增幅片段。如此則證明此品 系已經由同質性重組作用將衍生自溫度敏感性質體的突變 g 1 tA基因整合插入到宿主染色體接近g 1 tA基因中 。衍生自P S F K T C 1，2和4的品系分別命名爲 BLCS1 1，BLCS12 和 BLCS14。 (7 ) g 1 t A啓動子一取代品系之取得： 首先，從BLCS11 ，BLCS12和 B L C S 1 4品系得到突變g 1 t A基因藉由同質性重組 作用整合插入到染色體的康納黴素-敏感性品系。將此質 體整合插入之品系稀釋後塗於C Μ 2 B平板上並於3 4 °C 培養。形成菌落之後複印到含有2 5微克/毫升康納黴素 的C Μ 2 B平板上，然後於3 4 °C培養。如此則得到康納 黴素-敏感性品系。 從康納黴素敏感性品系中萃取染色體作爲模板，序列 號碼7和8爲引子進行P C R以製備g 1 t A基因片段。 然後使用SUPREC〇2(Takara Shuzo C〇·，Ltd·)純化後以序 列號碼1 3爲引子進行定序反應決定其中之啓動子區域的 序列。結果，與表7中的p K F 1 9 C S 1啓動子序列相 同之品系命名爲GB01 ，與pKFl9CS2啓動子序 列相同之品系命名爲G B 〇 2 ，以及和P K F 1 9 C S 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 項再填{ί 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -31 - 1247805 A7 _ B7 五、發明説明（2$ 啓動子序列相同之品系命名爲G B 〇 3。當質體及複製之 g 1 t A基因從染色體被移除時，原先位於染色體上的野 生型g 1 t A基因也一起與載體質體被移除，然而藉由質 體導入的突變株g 1 t A基因仍留在染色體上。此事實指 出基因取代已發生。 (8 )檸檬酸合成酶之g 1 t A啓動子突變株的活性測定 檸檬酸合成酶的活性測定可經由步驟（7 )中所得到 的 FGR2，GB01，GB03 和 FGR2/ p S F K C品系以相同於步驟（4 )之方法處理進行。結 果顯示在表1。結果確認g 1 t A啓動子取代之品系的檸 檬酸合成酶合性高於其親代品系。 表1 0 品系_吸光度/分/毫克 相對活性 FGR2 7.9 1.0 GB01 9.5 1.2 GB02 15.0 1.9 GB03 31.6 4.0 FGR2/pSFKC 61.6 7.8 (9 ) g 1 t A啓動子取代品系培養的結果·· 將上述步驟（7 )所得之每~品系接種到含有表1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公羞） -一·* -32- (請先閱讀背面之注意事_ ，項再填. :寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247805 A7 ^___B7 五、發明説明（30 中所顯示之成分的接種培養基中，在3 1 . 5 °C搖動培養 2 4小時。取3 0 0毫升之具有顯示在表1 1之成分的主 要培養基於5 0 0毫升玻璃瓶醱酵器中，然後加熱滅菌。 取4 0毫升之上述接種培養物接種到此培養基內。然後於 3 1 · 5 °C開始培養，其攪動速率及通氣速率分別控制在 800 到 1 300 r pm 及 1/2 到 1/1 vvm。以氣 態氨維持培養液p Η値爲7 · 5。初始培養8小時之後將 溫轉移到3 7 °C。得2 0到4 0小時內葡萄糖完全消耗時 就終止培養，而L -麩胺酸則形成且累積於培養液中。 結果如表1 2中所顯不，G B 0 2和G B 〇 3品系的 L 一麩胺酸產量有較大改進，而非GB 〇 1及FGR2/ P S FKC品系。從這些事實得知藉由導入突變到 g 1 t A啓動子中可增加C S活性2到4倍得到好結果， 改良麩胺酸的產製量。 (請先閲讀背面之注意事- 裝— 寫本頁) -訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -33- 1247805 A7 B7 五、發明説明（31) 表 濃度 _成分 葡萄糖 KH2PO4 MgS〇47H2〇 FeS〇47H2〇 MnS〇44H2〇 黃豆蛋白質水解物 生物素 硫胺素鹽酸鹽 接種培養基 50克/升 1克/升 (M克/升 10毫克/升 10毫克/升 20毫克/升 0.5毫克/升 2毫克/升 主要培養基 1 50克/升 2克/升 1 · 5克/升 15毫克/升 15毫克/升 50毫克/升 2毫克/升 3毫克/升 (請先閲讀背面之注意事_ 項再填· :寫本頁) 表1 2 品系 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 F G R 2 G B 0 1 G B 0 2 G B 0 3 F G R 2
p S F K C L -麩胺酸（克/升） 8 . 9 9.1 9 . 4 9.4 9.1 範例4 導入突變到麩胺酸產製菌棒狀桿菌的I C D Η基 因啓動子區域中： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -34- 1247805 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7____五、發明説明（3今 19〇bp (第一個啓動子）和約7〇bp (弟一個啓動 子）之位在一 1 0類似區域之D N A序列中導入突變。使 用 Mutan-Super Express Km(Takara Shuzo Co.，Ltd·)導入 突變到i c d基因上游區域內。此方法具體敘述如下。使 用P s t I完整分解pHSG399icd以得到含有i c d基因啓 動子的p s t I片段。然後將此片段與已使用P s t I完 整分解的 pKF 1 8 kM ( Takara Shuzo Co·，Ltd·)連接在 一起。完全連接之後轉形到大腸桿菌J M 1 〇 9 ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)反應潛能細胞內。將轉形產物塗到含有 10微克/毫升IPTG，40微克/毫升X - Ga 1和 2 5微克/毫升康納黴素的L -培養基上。過夜培養之後 ，挑起白色菌落並分別培養這些轉形品系。從被轉形品系 中製備質體，並命名含有i c d基因啓動子的質體爲 p K F 1 8 i c d。 使用p K F 1 8 i c d爲模板，及序列號碼1 6， 1 7，1 8，1 9，2 0和2 1及一篩選引子的5 >末端 磷酸化合物D N A進行P C R。將P C R產物轉形到大腸 桿菌J Μ 1 〇 9反應潛能細胞內。將轉形產物塗於含有 2 5微克/毫升康納黴素的L -培養基上。過夜培養之後 分別得到個別之已轉形品系菌落。從被轉形品系中製備質 體D N A，並以序列號碼2 2的合成D Ν Α使用Sanger的 方法〔J. Mol. Biol.，143，1 6 1 ( 1 980)〕決定 i c d 啓動子位 置的鹼基序列。具體而言，使用染劑終止定序套組（ Applied Biosystems)決定驗基序列，並使用 Genetic (請先閲讀背面之注意事_ 項再填- :寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -36 - 1247805 A7 B7 五、發明説明（34
Analyzer ABI310 ( Applied Biosystems )進行分析。以表 7 中所顯示之序列置換i c d啓動子區域所得之質體命名爲 PKF18ICD1 ， pKF18ICD2 ， pKF18ICD3 ， pKF18ICD4 ’ pKF18ICD5hdr pKF18ICD6。其中，以 Ps t I 完整分解 PKF18ICD2得到含有i c d基因的啓動子P s t I片段。 將此片段與已使用P s t I完整分解的pKF 1 8KM ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)連接起來。完全連接之後，轉形到 大腸桿菌J Μ 1 0 9 ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)反應潛能細 胞內。將轉形產物塗於含有1 0微克/毫升I PTG， 4 0微克/毫升X - G a 1和2 5微克/毫升康納黴素的 L -培養基上。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養 這些轉形品系。從被轉形品系中製備質體，並將含有 1 c d基因啓動子者命名爲pKF18ICD2。使用 pKF18ICD2 爲模板，及序列號碼2 0和2 1及一篩選引子的5 /末端 磷酸化合成DNA進行PCR。將PCR產物轉形到大腸 桿菌J Μ 1 〇 9反應潛能細胞內。將轉形產物塗於含有 2 5微克/毫升康納黴素的L -培養基上。過夜培養之後 ，分別得到個別之已轉形品系菌落。從被轉形品系製備質 體D N A，並以序列號碼2 2的合成D Ν Α決定位在 i c d啓動子位置內的鹼基序列。以表1 3中所顯示之序 列置換i c d啓動子區域所得之質體命名爲PKF18ICD25和 PKF18ICD26。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事 項再填. :寫本頁} 經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製 -37 - 1247805 A7 _ B7 五、發明説明（3今 表1 3 質體 第一個啓動子 第二個啓動子 -35 -10 -35 -10
PKF18ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCAT PKF18ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA CACCAT PKF18ICD02 TTGACA TATAAT TTTCCA CACCAT PKF18ICD03 TTGACT TAAAGT TTTCCA CACCAT PKF18ICD04 GCGACT TAAAGT TTTCCA TATAAT PKF18ICD05 GCGACT GAAAGT TTGCCA TATAAT PKF18ICD06 GCGACT GAAAGT TTGACA TATAAT PKF18ICD25 TTGACA TATAAT TTGCCA TATAAT PKF18ICD26 TTGACA TATAAT TTGACA TATAAT (請先閱讀背面之注意事 項再填· :寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3 )爲決定啓動子活性的質體構築： 爲更簡單決定啓動子活性，利用報告基因來間接決定 啓動子活性是可行的。理想之報告基因的特性是其活性能 簡單被決定，甚至當一胺基酸加到N -末端時其活性並不 會顯著變低，且不能產生背景反應，並具有適合基因操作 的限制酶切入位置。因爲大腸桿菌的/3半乳糖苷酶（ L a c Z )被廣泛使用作爲報告基因，且棒狀桿菌屬沒有 乳糖同化能力的基因〔；1.〇611.八0?1_1^(：1*〇1^〇1,，18，399-4 1 6 ( 1 97 2)〕，因此參考L a c Z是適宜的報告基因。然後 構築攜帶L a c z作爲報告基因的質體PNEOL (圖3 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNs ) A4規格（210X297公釐） -38- 1247805 A7 B7 五、發明説明（39 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )。此構築過程敘述如下。使用得自大腸桿菌 ME8459 (ME8459存放於基因學國家硏究所（ 曰本））的染色體D N A爲模板’顯示在序列號碼2 3和 24之合成DNA爲引子進行PCR。使用SmaI和 B amH I完整分解此P CR產物，然後與已用 Hi ndlll 分解並爲鈍端之 pKF3 ( Takara Shuzo Co.， Ltd.)片段連接在一起。完全連接之後，轉形到大腸桿菌 J Μ 1 〇 9 (Takara Shuzo Co·，Ltd.)反應潛能細胞內。將 轉形產物塗於含有2 5微克/毫升康納黴素的L -培養基 上。過夜培養之後，分別得到個別之已轉形品系菌落。從 被轉形品系中製備質體。其中取一質體命爲pKF3nptn。然 後使用Sa 1 I分解pKF3nptn。另一方面，使用Sma I 和S a 1 I完整分解並爲鈍端之範例1 ( 1 )中所敘述的 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 p S AK 4。將這些片段連接在一起以構築一往返載體 p N E ◦，可在棒狀桿菌中複製。此質體對氯黴素和康納 黴素具抗性。更進一步，使用S m a I和 S s e 8 3 8 7 I完整分解PNE〇。所得之結果片段與 已使用Ps t I和Sma I完整分解之pMC1871 ( Farmacia Biotech)連接在一起。如此，往返載體 p NE 0 L能在棒狀桿菌中複製，且具有n 一端缺乏第8 胺基酸之L· a c Z的報告基因就構築完成了（參閱圖3 ) 〇 (4 )突變株i c d啓動子活性的測定 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） — 一~ -39 - 1247805 A7 B7_ 五、發明説明（叼 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 具有上述步驟（2)中所構築之突變i c d啓動子的 質體，亦即 pKF18ICDl ，PKF18ICD2，PKF18ICD3， PKF18ICD4，pKF18ICD5 ，PKF18ICD6 ’ pKF18ICD25 ’ PKF18ICD26 和 PKF18ICD 等，使用 Sacn 和 PstI 完 全分解然後爲鈍端。之後與已使用S m a I切割的 p N E ◦ L片段連接起來。完全連接之後轉形到大腸桿菌 J Μ 1 〇 9反應潛能細胞內。將轉形產物塗於含有 I PTG，X— Ga 1和40微克/毫升氯黴素的L —培 養基中。過夜培養之後，挑起藍色菌落並分別培養這些轉 形品系。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 從已轉形品系中製備質體。具有能產製I c D Η和 L a c Ζ結合蛋白質之結構的質體命名爲pNEOICDl， pNE〇ICD2，pNE〇ICD3，pNE〇ICD4，pNE〇ICD5，pNE〇ICD6 ，pNE〇ICD25，pNE〇ICD26禾D pNEOUCD。使用電脈衝方法 將這些質體和p N E〇L導入乳酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 869 內。這些轉形產物的篩選是使用含有2 5微克/毫升康納 黴素和4 0微克/毫升X - G a 1的CM2 B平板培養基 (含有1 0克/升bactotryptone，1 0克/升細菌酵母菌萃 取物，5克/升NaCl ，10微克/升生物素和15克 /升瓊脂，PH7 . 0)在3 It培養兩晚。完全導入之 後，形成菌落並分別挑起個別之菌落。含有pNEOICDl， pNE〇ICD2，pNE〇ICD3，pNE〇ICD4，pNE〇ICD5，pNE〇ICD6 ，PNEOICD25，pNE〇ICD2 6禾口 pNEOLICD的車專形產物分另!J命 名爲 BLAC1 ，BLAC2 ，BLAC3 ，BLAC4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -40- 1247805 A7 ----— —_B7_ 五、發明説明（3弓 ’BLAC5，BLAC6，BLAC25， BLAC26 ，BLAC 和 BNEOL 。除了 bnE〇之 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 外’全部轉形產物形成藍色菌落。如範例3中的步驟（4 )之相同方法，從轉形產物製備粗製的酵素溶液，除了將 細胞改爲由、、Z -緩衝液〃（含有1 0毫莫耳濃度κ C 1 ’ 1毫莫耳濃度MgS〇4，270微克/1〇〇毫莫耳濃 度2— ME和NaP i ，PH7 . 5)的緩衝溶液淸洗及 懸浮之。L a c Z的活性測定如下：Z 一緩衝液與粗製的 酵素溶液混合。將〇 N P G溶於Z -緩衝液中至最終濃度 爲〇 · 8晕:克/毫升加入到反應混合物中，以Hitachi分光 光度計U - 3 2 1 〇於3 0。(：測量在4 2 0 n m的增加吸 光度。所得値即爲L a c Z的活性。粗製的酵素溶液中的 蛋白質濃度以Protein Assay (BIO-RAD)測定。使用半血淸白 蛋白作爲標準蛋白質。結果顯示在表1 4中。結果確認表 現I C D Η - L a c Z結合蛋白質之品系的L a c Z活性 在i c d啓動子的變異高於野生型I CDH - L a c Z結 合蛋白質之表現。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -41 - 1247805 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3弓 表1 4 品系 吸光度/分/毫克 相對活性 BNE0L 未測定 0.0 BNE0LI 42 1.0 BNE0LI-1 84 2.0 BNE0LI-2 168 4.0 BNE0LI-3 80 1.9 BNE0LI-4 126 3.0 BNE0LI-5 139 3.3 BNE0LI-6 84 2.0 BNEOLI-25 168 4.0 BNEOLI-26 170 4.0 (5 )將突變株i c d基因導入溫度一敏感性質體內： 質體載體 pSFKT2 ( Japanese Patent Application No. Hei 1 1 -8 1 693 )是溫度一敏感性的複製子，可使用於棒 狀桿菌中。使用P s t I完整分解pKF18ICDl，PKF18ICD2 ，pKF18ICD3，pKF18ICD4，pKF18ICD5，pKF18ICD6， PKFICD25和pKFICD26，所得之片段使用作爲突變的i c d 啓動子。然後將此片段與已使用P s t I完整分解的 p S F K T 2連接起來。完全連接之後將之轉形到大腸桿 菌 J Μ 1 〇 9 ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)反應潛能細胞內。 將轉形產物塗於含有1 0微克/毫升I PTG，4 0微克 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I ^IT (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -42- 1247805 A7 ____B7_ 五、發明説明（49 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) /毫升X - G a 1和2 5微克/毫升康納黴素的L 一培養 基上。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉形 品系。從已轉形品系中製備質體。含有i c d啓動子的溫 度—敏感性穿梭載體命名爲pSFKTIl，PSFKTI2，pSFKTI3 ，PSFKTI4，pSFKTI5，pSFKTI6，PSFKTI25 和 pSFKTI26。 (6 )將突變株i c d啓動子導入染色體內 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用電脈衝方法將上述步驟（5 )中所敘述構築的質 體個別導入乳酸醱酵短桿菌G B 0 2品系中。此轉形產物 的篩選是在2 5 °C，使用含有2 5微克/毫升康納黴素的 M2 B平板培養基（含有1 〇克/升bactotryptone，1 0克 /升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl ，10微克/ 升生物素和15克/升瓊脂，pH7 · 0)。完全導入之 後’將培養在Μ 2 B液態培養基中所得的品系塗到含有 2 5微克/毫升康納黴素的CM2 Β平板上，以每一平板 稀釋爲1 0 3到1 〇 5 c f u的濃度於3 4 °C培養。如此， 則具有溫度-敏感性之質體的品系由於在此溫度之下質體 複製受到抑制而變成對溫度敏感，所以不會形成菌落。另 一方面’質體D NA整合插入到染色體品系者因可形成菌 落1而能被篩選出來而取得個別分開之菌落。從此品系中萃 取染色體D N A作爲模板，序列號碼1 3和1 5爲引子進 行P C R。之後確認約3 k b的增幅片段。如此則證明此 品r系已經由同質性重組作用將衍生自溫度敏感性質體的突 變i c d基因整合插入到宿主染色體接近i c d基因中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -43- 1247805 A7 _ B7 __ 五、發明説明（41) (7 ) i c d啓動子一取代品系之取得： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 首先，從具有突變i c d基因如步驟（6 )中之敘述 藉由同質性重組作用整合插入到染色體的品系中得到康納 黴素-敏感性品系。將此質體整合插入之品系稀釋後塗於 C Μ 2 B平板上並於3 4 °C培養。形成菌落之後於含有 2 5微克/毫升康納黴素的C Μ 2 B平板上培養。如此則 得到康納黴素-敏感性品系。 從康納黴素敏感性品系中萃取染色體作爲模板，序列 號碼1 4和1 5爲引子進行P C R以製備i c d基因片段 。然後使用 SUPREC02(Takara Shuzo Co.，Ltd.)純化後以 序列號碼2 2爲引子進行定序反應決定其中之啓動子區域 的序列。結果，具有衍生自P S F K T I 1， pSFKTI 2，pSFKTI 3，pSFKTI 4， PSFKTI5，PSFKTI6，PSFKTI25 和 p S FKT I 2 6之i c d啓動子序列者分別命名爲 G C 0 1，GC〇2，GC〇3，GC〇4，GC05 ’ GC06，GC25和GC26。當質體及複製之i cd 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 基因從染色體被移除時，原先位於染色體上的野生型 i c d基因也一起與載體質體被移除，然而藉由質體導入 的突變i c d基因仍留在染色體上。 (8 )異檸檬酸去氫酶之i c d啓動子突變株的活性測定 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44- 1247805 A7 B7 五、發明説明（， 使用上述步驟（7 )中所得之8個品系及範例3中相 同方法之步驟（7 )所得的G B 〇 2品系製備I C D Η粗 製的酵素溶液。I C D Η活性的測定如下：將粗製的酵素 溶液加到含有35毫莫耳濃度Tr i s H C 1 (pH 7.5) ，1·5濃度MnS〇4〇.l毫莫耳濃度 NADP和1 _ 3毫莫耳濃度異檸檬酸的反應溶液中，在 3 0 °C使用Hitachi分光光度計U— 3 2 1 0測定3 40 n m時的吸光度增加情形。使用Protein Assay (BIO-RAD)測 定粗製的酵素溶液中的蛋白質濃度。結果顯示在表1 5中 。結果確認異檸檬酸去氫酶之i c d啓動子取代品系的活 性高於親代品系。 I 裝 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -45- 1247805 Α7 Β7 五、發明説明（3 表1 品系 吸光度/_克 相對活性 G B 0 2 G C 0 1 G C 0 2 G C 0 3 G C 0 4 G C 0 5 G C 0 6 G C 0 2 5 G C 〇 2 6 3 9 8 . 2 19.1 7 . 〇 12.5 19.1 10.5 3 0.4 2 4.2 1 _ 0 .1 4 . 9 1 · 8 3 . 2 4.9 2.7 7 . 8 6 · 2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (9 ) i c d啓動子取代品系的培養結果. 如範例3中步驟（9 )的相同方法培養上述步驟（7 )中的8個品系。結果使用品系GC〇2，， GC〇5 ’ GC2 5和GC2 6時確認其l 一繫胺酸產量 有改善，如表1 6中所顯示。結果發現導入突變到丨c d 啓動子中所得之品系的I C D Η活性至少增加3倍。 ---------------IT----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） -46- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247805 A7 ___ ___B7 五、發明説明（ 表1 6 品 系 L 一麩胺酸（克/ / 1 0 0毫升） G B 0 2 9 _ 2 G C 0 1 9 · 0 G C 0 2 9 . 5 G C 0 3 9 . 1 G C 0 4 9 · 4 G C 0 5 9 . 6 G C 0 6 9 _ 2 G C 2 5 9 · 9 G C 2 6 9 · 8 範例5 在棒狀桿菌麩胺酸產製細菌的P D Η基因啓動子 區域導入突變 (1 )從棒狀桿菌中選殖p d h Α基因
合成的引子序列號碼2 5和2 6，是篩選自大腸桿菌 ，綠膿桿菌和結核桿菌的丙酮酸去氫酶（P D Η )之E 1 次單位中具有高同質性的區域。使用細菌基因體D Ν Α純 化套組（Advanced Genetic Technologies Co rp.)從乳酸醱酵 短桿菌ATCC1 3 869中製備染色體DNA作爲模板，在PCR Technology ( Η· Erlich 編輯，Stockton Press 發行 1 9 8 9 )第8頁所敘述的標準反應條件下進行P C R。然後將反 應液載入瓊脂凝膠中進行電泳以確約1 · 3 k b的D N A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^------IT----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -47- 1247805 A7 B7 五、發明説明（岣 片段被增幅。使用合成性之序列號碼2 5和2 6的D N A 從兩末端測定所得之鹼基序列。以Sanger的方法〔h Mo1. Biol·，143，1 61 (1980)〕利用 D N A 定序套組（Applied
Biosystems Co.)測定鹼基序列。將決定之鹼基序列轉譯爲 胺基酸，並與大腸桿菌，綠膿桿菌和結核桿菌之丙酮酸去 氫酶的E 1次單位比較，以發現其中的高同質性區域。結 果判斷認爲P C R增幅的D N A片段是編碼乳酸醱酵短桿 菌ATCC13869之丙酮酸去氫酶E 1次單位的P d hA基因 的一部分。因此進一步選殖此基因的上游及下游。選殖方 法如下：使用限制酶E c 〇 R I ，B a m Η I ， Hindm，PstI ，SalI 和 Xbal ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)分解乳酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 869的染色體 以得到D N A片段。序列表中的引子序列號碼2 7和2 8 使用於選殖上游位置，引子序列號碼2 9和3 0使用於選 殖下游位置。利用L A P C R活體外選殖套組（Takara Shuzo Co.，Ltd.)進行選殖。使用P C R套組之後，以 EcoRI，Hindu，PstI，Sail 和 X a b I分解從上游位置所增幅的0 · 5，2 · 5， 3 _ 0，1 · 5和1 · 8kb的DNA片段；以及使用 B a m H i ，H i n d ΠΓ和P s t I分解從下游位置所增 幅的 1 · 5 ，3 · 5 和 1 . 〇kb 的 DNA 片段。DNA 片段的鹼基序列以上述之相同方法決定。結果發現此增幅 的D N A片段更進一步包含一約9 2 0個胺基酸的開放讀 譯區及一位在上游的假設啓動子區域。由於此開放讀譯區 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事- 項再填· :寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -48 - 1247805 A7 B7 五、發明説明（47) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) P d h A基因被選殖到，且不知單獨增幅此基因是否能改 善胺基酸的產量。在此情形下，因此想單獨增幅p d h A 基因看看是否可有效改善胺基酸的產量。 以已選殖之鹼基序列爲基礎合成顯示在序列號碼3 3 和3 4的引子。使用細菌基因體D N A純化套組（ Advanced Genetic Technologies Corp.)製備乳酸醱酵短桿菌 ATCC13869的染色體爲模板，依據pet Technology (Η· Erlich 編輯，Stockton Press 發行，1 9 8 9 )第 8 頁上敘 述之標準反應條件進行P C R以增幅p d h A基因。序列 號碼3 3的合成引子是對應到序列表中序列號碼3 2中的 p dhA基因第1 3 9 7鹼基到1 4 1 6鹼基。序列號碼 3 4則是一反股引子，其鹼基對應到序列表中序列號碼 3 2>的第5 3 5 5到5 3 74鹼基，從5 /位置表示。 利用常用方法純化P C R產物，然後與限制酶 S a 1 I和E c ο T 2 2 I作用。將此片段與已用 S a 1 I 和 P s t I 切割的 p S F K (Patent Application No. Hei 11-69896)經由連接套組（Takara Shuzo Co·，Ltd.) 連接在一起。之後轉形到大腸桿菌J M 1 0 9 ( Takara 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Shuzo Co.，Ltd.)反應潛能細胞內，將轉形產物塗於含有 1 0微克/毫升I PTG (異丙基一 /3 — D —硫化半乳糖 苷），40微克/毫升X — Gal (5 -溴—4 一氯一 3 -吲哚基一々一 d -半乳糖苷）和2 5微克/毫升康納黴 素的L-培養基（含有1 〇克/升bac totry ptone，5克/升 細菌酵母菌萃取物，5克/升Na C 1和1 5克/升瓊脂 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格〈210x297公釐） 1247805 A7 B7 五、發明説明（岣 ，Ρ Η 7 . 2 )。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培 養這些被轉形的菌落品系。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以鹼性方法（由Nippon Seibutsu Kogaku kai編輯和 Baifukan 發行的 Seibutsu Kogaku Jiken-sho，ρ·105，1992 )從 已轉形品系製備質體。決定D N A片段插入到載體中的限 制酶圖譜，並與序列表中序列號碼3 2所發表之P d h A 基因的限制酶圖譜作比較，含有D N A片段之質體若其插 入段有相同限制酶圖譜者命名爲pSFKBPDHA。 (3 )將 pSFKBPDHA導入到乳酸醱酵短桿菌 ATCC1 3 869和GC 2 5中並評價其醱酵實驗： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用電脈衝方法（J. Ρ. K〇KAI No· Hei 2-20779 1 )將質 體pSFKBPDHA轉形到乳酸醱酵短桿菌ATCC1 3869和 G C 2 5內而得到已轉形品系。經由導入質體pSFKBPDHA 到乳酸醱酵短桿菌ATCC1 3 869和GC2 5而得之產製L — 麩胺酸轉形品系 ATCC1 3869 / pSFKBPDHA和G C 2 5 / pSFKBPDHA 的培養如下：將所得的 ATCC 1 3 869 / pSFKBPDHA和G C 2 5 / pSFKBPDHA的培養如下··將所得 的 ATCC1 3869/pSFKBPDHA 和 G C 2 5 /pSFKBPDHA 細胞 培養在含有2 5微克/毫升康納黴素的CM2 B平板培養 基之後，所得的細胞接種到一培養基中（每1公升包8 0 克葡萄糖，1克KH2P〇4，〇 . 4克MgS〇4· 7H2〇，30 克（NH4) 2S〇4，〇 . 01 克 FeS〇4· 7H2〇，〇 · 〇1 克 MnS〇4· 7H2〇， 1 5毫升黃豆蛋白質水解物，2 0 0微克硫胺素鹽酸鹽， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -51 - 1247805 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（5t) 表1 7 品系 L-麩胺酸（克/每100毫升) ATCC1 3869/pSFK6 3.6 ATCC1 3869/pSFKBPDHA 3.8 GC25/pSFK6 5.1 GC25/pSFKBPDHA 5.3 從這些結果顯示在乳酸醱酵短桿菌ATCC1 3869和 G C 2 5中單一增幅P d h A基因，能明顯有效改善麩胺 酸的產量。 (4 )構築質體用以測定突變之P d h A啓動子活性： 爲製造丙酮酸去氫酶（PDH)的突變啓動子’將乳 酸醱酵短桿菌ATCC13869已選殖的P d hA基因先決定其 啓動子區域，經由不同的啓動子區域修飾來決定’可利用 /3 -半乳糖苷酶活性來測定。 從已選殖且證明之鹼基序列評估P d h A基因的啓動 子位置，結果推測可能位在序列表中序列號碼3 2的第 2252到22257及2279到2284的鹼基，分 別是位在- 3 5區域及- 1 0區域。因此合成序列表中序 列號碼3 5和3 6中的引子，與含有啓動子區域的 p d h A基因之來自乳酸醱酵短桿菌ATCC1 3 869染色體 D N A爲模板進行P C R增幅。合成的引子中，序列號碼 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） I--------φ-—------tr----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -53- 1247805 A7 ___B7_ 五、發明説明（51) 3 5對應到序列號碼3 2中的鹼基號碼2 1 9 4到 2221;但鹼基號碼2198已用C取代，以及鹼基號 碼2 2 0 〇和2 2 0 2已用G取代，且限制酶S m a I確 認序列已被插入。序列號碼3 6對應到序列號碼3 2中的 鹼基號碼2 3 7 2到2 3 9 8 ;但鹼基號碼2 9 3和 2 3 9 4已用G取代，且具有辨認序列之限制酶S m a I 已插入反股中。使用細菌基因體D N A純化套組（ Advanced Genetic Technologies Corp.)製備乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 869的染色體作爲模板，以PCR Technology ( Η· Erlich編輯，Stockton Press，1989)第8頁所欽述的標準反 應條件下進行P C R來增幅p d h A基因的啓動子區域。 利用常用的一般方法純化所得之P C R產物，然後使用限 制酶S m a I作用之。將此片段與已用限制酶S m a I切 割之pNEOL連接在一起，pNEOL能在缺乏 L a c Z基因啓動子區域的棒狀桿菌中複製（使用範例4 (3 )中的連接套組（Takara Shuzo Co·，Ltd.)。之後轉形 到大腸桿菌J Μ 1 〇 9反應潛能細胞內（Takara Shuzo Co.， Ltd.)，然後將轉形產物塗於含有4 0微克/毫升X -Gal (5 -溴—4 —氯一 3 —吲哚基—Θ — D —半乳糖 苷）和2 5微克/毫升康納黴素之L -培養基上（含有 1 0克/升bac to try p tone，5克/升細菌酵母菌萃取物，5 克/升NaC 1和15克/升瓊脂，PH7 · 2)。過夜 培養之後，挑起藍色菌落並分別培養這些轉形品系。使用 鹼性方法（Nippon Seibutsu Kogaku-kai 編輯，以及 Baifukan 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事_ 項再填· :寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社邱製 -54- 1247805 A7 _ B7 五、發明説明（岣 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 發行之 Seibutsu Kogaku Jikken-sho，ρ·105，1 992 )從已轉形 品系中製備質體。經由一般方法定序插入到載體的D N A 片段之後，此含有插入段D N A片段的質體命名爲 pNEOLBPDHAprol。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 更進一步，爲構築質體而合成之位在序列表中的序列 號碼3 7，3 8和3 9的引子，其中假設是啓動子位置的 區域已改變爲棒狀桿菌啓動子的一致序列。使用乳酸醱酵 短桿菌ATCC 1 3 869染色體DNA爲模板，各引子及序列號 碼3 6的引子進行P C R，所增幅的D N A片段其中的 P d h A基因啓動子區域已改變爲一致序列。在合成的引 子中，序列號碼3 7對應到序列號碼3 2中的鹼基號碼 2244到2273 ;而鹼基2255已被C取代，和鹼 基2 2 5 7已被A取代；且只有一 3 5區域已被改爲棒狀 桿菌的一致序列。序列號碼3 8對應到序列號碼3 2中的 鹼基2249到2288 ;鹼基號碼2279和2281 已被T取代；且只有- 1 〇區域已被改爲棒狀桿菌的一致 序列。序列號碼3 9對應到序列號碼3 2的鹼基號碼 2249到2288 ;鹼基號碼2255已被C取代，鹼 基號碼2 2 5 7已被A取代；以及鹼基號碼2 2 7 9和 2 2 8 1已被T取代；且一 3 5區域和—1 0區域皆改爲 棒狀桿菌的一致序列。使用細菌基因體純化套組（ Advanced Genetic Technologies Corp·)製備乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 869的染色體作爲模板，以PCR Technology ( Η. Erilich編輯，Stockton Press發行，1989 )第8頁所述的標 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） -55- 1247805 A7 _B7__ 五、發明説明（5今 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 準反應條件下進行P C R增幅p d h A基因的啓動子區域 ，其中的啓動子區域已利用引子改爲一致序列。所得的 P C R產物以常用方法純化，然後以限制酶S m a I作用 之。將此片段與已用限制酶S m a I切割的p N E〇L利 用連接套組（Takara Shuzo Co.，Ltd.)連接起來，其中的 pNE〇L能在缺乏啓動子區域的1 a c Z基因的棒狀桿 菌中複製。之後轉形到大腸桿菌J Μ 1 〇 9反應潛能細胞 (Takara Shuzo Co·，Ltd.)內，將轉形產物塗於含有4 0微 克/毫升X - Ga 1 (5 -溴一 4 一氯一 3 —吲哚基一 Θ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - D -半乳糖苷）和2 5微克/毫升康納黴素的L 一培養 基（包含1 0克/升bactotryptone，5克/升細菌酵母菌萃 取物，5克/升NaCL和1 5克/升瓊脂，pH7 · 2 )。過夜培養之後，挑起藍色菌落並分別培養這些轉形品 系。使用鹼性方法（Nippon Seibutsu Kogaku kai編輯，以及 Baifukan 發行之 Seibutsu Kogaku Jikken-sho，ρ·105，1992 ) 從已轉形品系中製備質體。經由一般方法定序插入到載體 的D N A片段，其中只有一 3 5區域已改爲一致序列，而 此種質體命名爲pNE〇LBPDHApi*o35 ;所含之DNA片段中 的序列只有- 1 0區域已改爲一致序列的質體則命名爲 pNEOLBPDHAprolO ；且若質體所含之DNA片段的—3 5 區域及- 1 0區域皆改爲一致序列者則命名爲 pNE〇LBPDHApro3510。 (5 )突變株p d h A啓動子活性的估計： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -56- 1247805 A7 15/ 五、發明説明（Μ 使用電脈衝方法（J· Ρ· ΚΟΚAI No· Hei 2-207791 )將質 體 pNEOLBPDHAprol ， pNEOLBPDH Apro 10 罕口 pNE〇LBPDHApi*o3510轉形到乳酸醱酵短桿菌ATCC13869中 而取得被轉形品系。以範例4 ( 4 )中所敘述的方法測定 所得之轉形產物的/3 -半乳糖苷酶活性。啓動子區域之序 列改爲一致序列之後的Θ -半乳糖苷酶活性顯示在表1 8 中，其中p d hA基因啓動子區域的/3 -半乳糖苷酶酵素 活性定爲1。 表1 8 品系 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) /3 -半乳糖苷酶活性 (相對値） ATCC1 3 869/pNEOLBPDHAprol 1 ATCC1 3 869/pNE〇LBPDHAprol0 6 ATCC1 3 869/pNEOLBPDHApro351Q_ 7.5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 這些結果指出假設的啓動子位置爲P d h A基因的啓 動子，且可經由改變此區域之序列爲一致序列而改變 p d h A的表現（增幅）。此事實表示經由改變P d h A 基因的啓動子區域，就能不需使用質體而改變表現。 (6 )構築質體用以製備啓動子變化的品系：
由於已證明可藉由在啓動子導入突變而改變P d h A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 _B7_____ 五、發明説明（3 的表現，因此構築質體用以製備p d h A基因啓動子變化 的品系。爲構築啓動子變化的品系，因此構築三種質體。 此三質體分別是其中的- 3 5區域，- 1 〇區域和兩區域 皆改爲一致序列。 以已被選殖之鹼基序列爲基礎，新合成序列號碼4 0 和4 1中的引子。在合成的引子中，序列號碼4 0是一反 股，其鹼基序列對應到序列號碼3 2中的鹼基號碼 2491到2521 ，其表示法是從開始’且在5# 末端附著上3個A和4個T。序列號碼3 3是反義股’對 應到序列號碼3 2中的ρ d h A基因的鹼基號碼5 0 2 0 到5 0 3 9，其表示法是從5 /開始。使用序列號碼3 3 和4 0爲引子，以細菌基因體D N A純化套組（Advanced Genetic Technologies Corp.)所製備的乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3869 的染色體爲模板，在 PCR Technology ( H. Erilich編輯，Stockton Press發行，1989)第8頁所敘述的 標準反應條件下進行P C R。更進一步使用序列號碼3 9 和4 1爲引子，乳酸醱酵短桿菌ATCC1 3869的染色體爲模 板進行P C R。使用常用方法純化所得到的P C R產物。 然後使用P C R產物經由序列號碼3 3和4 0爲引子進行 P C R，以及使用序列號碼3 9和4 1及序列號碼3 3和 4 1爲引子進行P C R。P C R條件如下：在反應液中此 四個D N A濃度爲1 〇微莫耳濃度，沒有使用模板，並使 用 L a t a g (Takara Shuzo Co·，Ltd·)。使用一般常用 方法純化P C R產物後與限制酶S a 1 I和X h ο I作用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事- •項再填· 寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -58- 1247805 A7 B7 五、發明説明（5今 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 。所得片段利用連接套組（Takara Shuzo Co·，Ltd·)與已切 割的溫度一敏感性質體p S F K T 2連接在一起，而 p S F Κ Τ 2能在棒狀桿菌中複製。之後轉形到大腸桿菌 J Μ 1 〇 9 反應潛能細胞（Takara Shuzo Co.，Ltd.)內，轉 形產物塗於含有1 0微克/毫升I PTG (異丙基一冷― 半乳糖苷），2 5微克/毫升康納黴素和4 0微克/毫升 X — Ga 1 (5 —漠一 4 —氯一3 — 口引 口朵基一/3 — D —半 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 乳糖有^的L —培養基（包含1 〇克/升bactotryptone，5 克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升Na C 1和1 5克/ 升瓊脂，P Η 7 . 2 )。過夜培養之後，挑起白色菌落並 分別培養這些被轉形的菌落品系。使用鹼性方法（由 Nippon Seibutsu Kogaku-kai 編輯和 Baifukan 發行的 Seibutsu Kogaku Jikken-sho，p.105，1 992 )從已轉形品系中製備質體 。之後定序插入到載體的D N A片段，然後與序列號碼 3 2中所發表之p d hA基因的鹼基序列作比較。含有 DNA片段的質體，其中的DNA片段序列只有啓動子的 - 3 5區域和- 1 0區域改爲棒狀桿菌的一致序列，此質 體命名爲 pSFKTPDHApi:o3510。 質體中的p d hA基因啓動子-3 5區域改爲棒狀桿 菌的一致序列，和p d h A基因啓動子一 1 〇區域改爲棒 狀桿菌一致序列的質體，除了分別以序列表中的序列號碼 3 7和3 9取代序列號碼3 9以外，皆是以上述相同方法 構築的。這些質體分別命名爲 pSFKTPDHApro35和 pSFKTPDHAprolO。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -59- 1247805 A7 ___ _ B7 五、發明説明（57) (7 )啓動子變化品系之製備： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) p d h A基因啓動子變化品系的製備是經由同質性重 組作用，利用上述步驟（6 )中用於製備啓動子變化品系 所構築的質體來進行。 首先，經由電脈衝方法（J. Ρ· ΚΟΚAI No. Hei 2-207791 )將質體pSFKTPDHApro3510轉形到G C 2 5用以製備啓動 子變品系。之後轉形產物塗於C Μ 2 B平板培養基（包含 1 0克/升聚蛋白腺，1 0克/升細菌酵母菌萃取物，5 克/升Na C 1 ，1 0微克/毫升生物素和1 5克/升瓊 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 脂，P Η 7 · 2 )並在2 5 °C培養以獲取被轉形品系。將 此產物於含有C Μ 2 B液態培養基的試管中培養過夜。然 後塗於含有2 5微克/毫升康納黴素的C Μ 2 Β平板培養 基，在3 4°C培養以獲取含有質體pSFKTPDHApro3510經由 同質性重組作用插入到染色體中的一次-轉形品系。分離 出單一菌落之後，將此品系於含有液體C Μ 2 B培養基的 試管中培養過夜。經過適當稀釋之後，塗於C Μ 2 Β平板 培養基在3 1 . 5 °C培養。菌落開始出現之後，此產物能 在含有2 5微克/毫升康納黴素的CM2 B平板培養基中 複製而得到康納黴素-敏感性品系。由於有兩種品系，亦 即具有野生型p d hA基因啓動子位置的品系，和另一具 有突變導入的品系，因此定序此部分。如此可獲得將突變 導入p d h A基因啓動子位置的啓動子變化品系。在此品 系中，pdhA基因的啓動子一 35區域和一 10區域已 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -60- 1247805 A7 _ B7 五、發明説明（, 改爲棒狀桿菌的一致序列。此品系命名爲G D 3 5 1 0。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 除了 以質體 pSFKTPDHApro35 和 pSFKTPDHAprolO 取代 質體pSFKTPDHApr〇3510用以製備啓動子變化品系之外，使 用上述的相同方法獲取P d hA基因啓動子的- 3 5區域 和- 1 0區域已改爲棒狀桿菌一致序列的品系。它們分別 命名爲GD35和GD10。 (8 ) p d h A基因啓動子變化品系之錐形瓶培養結果的 評估： 將上述所得的三種P d h A基因啓動子變化品系在錐 形瓶中培養以產製L -麩胺酸。將培養於C Μ 2 B平板培 養基中的啓動子變化品系GD3 5 1 0，GD3 5， G D 1 〇和G C 2 5細胞接種於培養基中（每公升水含有 30克葡萄糖，1克ΚΗ2Ρ〇4，0 · 4克MgS〇4· 7H2〇，30 克（NH4)2S〇4，0 · 01 克
FeS〇4· 7Η2〇，0 · 01 克 MnS〇4· 7Η2〇， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
1 5毫升黃豆水解物，200微克硫胺素鹽酸鹽’ 60微 克生物素和5 0克C a C〇3 ;使用ΚΟΗ調整pH到 8 _ 0 )。然後在3 1 . 5 °C搖動培養到培養基中的糖分 消耗爲止。所得的產物接種到上述相同成分的培養基中’ 以5 %的量於3 7 °C搖動培養到培養基中的糖分消耗爲止 。培養完全之後，使用 Biotic Analyzer AS-210 (Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.)測定液態培養基中所累積的L -麩胺酸數量。結果顯示於表1 9中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -61 - 1247805 A7 __________ B7_ 五、發明説明（61) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 位置，而能得到與L a c Z報告基因相同方向的質體 pNEOL — 1 ， pNE〇L — 2 ， pNEOL — 3 ， pNEOL — 4和pNEOL — 7。使用引子7和8 ， A J 1 2 0 9 2品系染色體D N A爲模板進行P C R所得 之DNA片段插入質體pNEOL的L a c Z報告基因的 上游而獲得對照組質體p N E 0 L - 〇。 將pNE〇L — 0，pNE〇L — l，pNE〇L — 2 ， pNEOL — 3 ， pNEOL — 4 和 pNE〇L — 7 導入A J 1 2 0 9 2品系內。使用電脈衝方法（〗.？· KOKAI No. Hei 2-20779 1 )將質體導入。把每一轉形產物塗 於含有4微克/毫升氯黴素的CM2 G平板培養（每1公 升純水包含1 0克聚蛋白腺，1 0克酵母菌萃取物，5克 葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，pH7 .2)，並 篩選氯黴素-抗性品系。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將這些品系——塗於瓊脂培養基（含有0 · 5克/ 100毫升）葡萄糖，1克/100毫升聚蛋腺白腺，1 克/100毫升酵母菌萃取物，0 · 5克/100毫升 NaCl和5微克/升氯黴素），在3 1 . 5°C培養20 小時。取所得的其中一細胞接種到一培養基中〔包含3克 /100毫升葡萄糖，1.5克/100毫升硫酸銨， 0 · 1 克/100 毫升 KH2P〇4，0 . 04 克/100 毫升MgS〇4，〇 . 〇〇1克/1〇〇毫升FeS〇4, 0 _ 01克/100毫升MnS〇4，5微克/毫升VB! ，5微克/1 0 0毫升生物素和4 5毫克/1 〇 〇毫升（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -64- 1247805 A7 Γ Β7 ------------^^_ 五、發明説明（6弓 以氮角度而言）的黃豆水解物〕。於3 1 _ $ c给養1 8 小時，所得細胞以範例4 ( 4 )中所敘述的方法測定冷〜 半乳糖苷酶活性。 A J 1 2 0 9 2 / p N E〇L — 〇所偵測的/3 —半乳 糖苷酶活性顯示在表2 0中，結果發現插入到1 a c Z基 因結構上游的D N A片段扮演啓動子的功能。此外，每一 質體一導入的品系皆比AJ 1 2092/PNEOL — 〇 具有較高的/3 -半乳糖苷酶活性。因此發現經由導入突變 到可能是啓動子序列的品系，其轉錄作用活性增加，結果 顯示在表2 0中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -65- 1247805 A7 __ B7 五、發明説明（， 表2 0 相對活性（AJ12092/pNE〇L-0=l) AJ12092 未偵測 AJ12092/pNEOL-0 1.0 AJ12092/pNEOL-l 2.8 AJ12092/pNEOL-2 2.7 AJ12092/pNEOL-3 1.8 AJ12092/pNE〇L-4 0.8 AJ12092/pNEOL-7 3.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 項再填· 裝· (4 )用於導入突變之質體的構築：
以A J 1 2 0 9 2品系的染色體D N A爲模板’使用 引子1 4和1 5 (具有序列號碼5 5和5 6 )進行P C R 。所得的DNA片段插入選殖用載體pHSG398 ( TaKaRa產品）之多選殖位置中的S m a I位置以構築質體 P 0。然後使用限制酶E c 〇 R V和B s ρ Η I分解P 0 ，同樣也使用限制酶E c 〇 R V和B s ρ Π分解 pNEOL — 3和pNE〇L 一 7。所得的DNA片段連 接在一起而獲得導入突變的質體P 3 (衍生自導入突變的 引子1 1之突變株）和P 7 (衍生自導入突變的引子1 3 之突變株）。 (5 )將突變-導入性質體導入到產製精胺酸的細菌內： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 訂 •瞀 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -66- 1247805 A7 ___B7 五、發明説明（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用電脈衝方法（J· Ρ· ΚΟΚAI No. Hei 2-20779 1 )將所 得質體導入產製精胺酸的乳酸醱酵短桿菌A J1 2 0 9 2 品系內。由於這些質體的自動複製功能在短桿菌內無效， 因此唯有經由同質性重組作用將主要質體插入整合到染色 體的品系才能被篩選爲C m -抗性品系。將突變-導入性 質體插入整合到染色體者，在含有5微克/毫升氯黴素的 CM2 G平板培養基（每1公升純水包含1 〇克聚蛋白腺 ，10克酵母菌萃取物，5克葡菊糖，5克NaCl和 1 5克瓊脂，ρ Η 7 . 2 )篩選氯黴素—抗性品系。然後 再進行一次同質性重組作用將指定的變化序列置換 a r g G基因的啓動子部分，因此篩選C m -敏感性品系 因此得到以P 3序列取代的品系（A J 1 2 0 9 2 -Ρ 3 )和Ρ 7序列取代的品系（A J 1 2 Ο 9 2 - Ρ 7 ) (6)argG基因的選殖 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以（1 )中所測定的鹼基序列爲基礎，合成具有位在 序列號碼4 6和4 7的寡核苷酸（引子5和6 )，及黃色 短桿菌的染色體DNA爲模板進行PCR。PCR反應進 行2 5次循環，每一循環包括9 4 °C : 3 0秒，5 5 °C : 1秒，7 2 °C : 2分鐘及3 0秒。如此所得的D N A片段 選殖到選殖用載體 pSTV29 ( Takara Shuzo Co·, Ltd.) 中多一選殖位置的S m a I位置。更進一步，將範例1中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -67- 1247805 A7 B7 五、發明説明（6今 的PSAK4以Sa1I處理所得的複製起源片斷插入 PSTV argG的Sa1I位置而製備pargG。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (7 )將p a r g G導入到短桿菌內： 使用電脈衝方法（J. ρ· ΚΟΚAI No· Hei 2-20779 1 )將質 體P a r g G導入乳酸醱酵短桿菌a J 1 2 0 9 2品系內 °然後將轉形產物於含有4微克/毫升氯黴素的CM2 G 平板培養基（每1公升純水包括1 〇克聚蛋白腺，1 〇克 酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂 ’ P Η 7 . 2 )篩選氯黴素一抗性品系。 (8 )啓動子變化品系的a r g G活性：
上述的兩種a r g G啓動子變化品系和使用質體經由 增幅a r gG所得的品系（AJ 12092/pa r gG )測定其a r g G活性。將這些品系--塗於瓊脂培養基 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (含有0.5克/100毫升葡萄糖，1克/1〇〇毫升 聚蛋白腺，1克/毫升酵母菌萃取物，〇 . 5克/毫升 NaCl和5微克/升氯黴素），在3 1 _ 5°C培養20 小時。然後將所得的每一細胞接種到培養基內〔包含3克 /100毫升葡萄糖，1.5克/100毫升硫酸銨， 〇· 1 克/100 毫升 KH2P〇4，〇 . 04 克/100 毫升MgS〇4，〇 · 〇〇1克/1〇〇毫升FeS〇4, 〇 · 01克/100毫升MnS〇4，5微克/毫升VBi ’ 5微克/1 0 0毫升生物素和4 5毫克/1 0 〇毫升（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -68- !2478〇5 Α7 Β7 Χ、發明説明（6今 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以氮而言）的黃豆水解物〕。在3 1 . 5 °C培養1 8小時 後’使用上述方法〔Journal of General Microbiology (1990) 測定所得細胞的A r g G活性。上述兩種A r g G啓動子 美化品系和使用質體經由增幅a r g G所得品系的 A r g G活性顯示在表2 1中。從表2 1顯然得知，將突 變導入啓動子的A j 1 2 0 9 2 - P 3的A r g G活性比 親代品約高兩倍，而A J 1 2 0 9 2 - P 7比親代品系高 約 3 倍。A J 1 2 0 9 2 / p a r g G 的 A r g G 活性比 親代品系高約4 . 5倍。 表2 1 相對活性（AI12092=1) AJ12092 1.0 AJ12092-P3 2.1 AJ12092-P7 2.9 A J 1 2092/pargG 4.4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (9 )由啓動子變化品系產製精胺酸： 在錐形瓶內培養每一 a r g G啓動子變化的品系。爲 對照用，也培養親代品系A J 1 2 0 9 2和 A J 1 2 0 9 2 / P a !· g G。將這些品系各別接種到培 養基上（含有0 . 1克/100毫升ΚΗ2Ρ〇4， 0 . 04克/毫升MgS〇4’ 0 · 001克/100笔升 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -69 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247805 A7 B7 五、發明説明（6?)
FeS〇4，0 · 01克/1〇〇毫升MnS〇4，5微克 /毫升VBi，5微克/1 〇 〇毫升生物素和4 5克/ 1 0 0毫升（以氮而言）的黃豆水解物）；然後再塗於_ 脂培養基（包含〇.5克/100毫升葡萄糖’1克/ 1 0 0毫升聚蛋白腺’ 1克/1 〇 〇毫升酵母菌萃取物’ 0.5克/100毫升NaC1和5微克/升氯黴素）’ 於3 1 _ 5 °C培養2 0小時°然後取這些細胞培養在含有 4克/1 0 0毫升葡萄糖和6 . 5克/1 0 0毫升硫酸銨 的錐形瓶中，於3 1 · 5 °C培養到葡萄糖完全消耗爲止。 使用0 · 2當量濃度的H C 1溶液將此培養液稀釋到 1 / 5 1的濃度測其吸光度（C D 6 2 0 )，精胺酸的形 成量（濃度：克/1 0 0毫升）及培養時間顯示在表2 2 中〇 從表2 2顯然得知使用a r g G啓動子變化品系時， 精胺酸的產量增加程度相當於使用質體增幅a r g G。啓 動子變化品系AJ12092-P3和AJ12092— P 7的培養時間與親代品系相同，但質體增幅品系的培養 時間較長。由此得知精胺酸產製力高於質體增幅品系。 本纸張尺度適用中周國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公羡） ---------#1^------、玎----- (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) -70- 1247805 A7 B7 五、發明説明（6今 表2 2 〇D 精胺酸 (克/100 毫升） 培養 時間 (小時） 產製力 (克/100毫 升/小時） AJ12092 0.502 1.25 48 0.026 AJ12092-P3 0.510 1.47 48 0.031 AJ12092-P7 0.514 1.43 48 0.030 AJ12092/pargG 0.520 1.47 52 0.028 (請先閱讀背面之注意事項再填. :寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 範例7 將突變導入產製麩胺酸之棒狀桿菌的G D Η基因 啓動子區域內 (1 )突變株g d h質體的構築： 使用定位突變法來構築具有範例2中所敘述之 F GR 1品系和F GR 2品系之GDH啓動子序列的質體 。爲取得F G R 1品系的G D Η啓動子序列，使用序列號 碼5 7和6 0的合成D Ν Α爲引子及ATCC 1 3 869的染色體 D N A爲模板進行P c R ;另一方面也使用序列號碼5 8 和5 9的合成DNA及ATCC138 69 的染色體DNA爲模板 進行P C R。更進一步，以這些p CR產物作爲模板，使 用序列號5 7和5 8的合成DNA爲引子進行P CR。將 所得的 P C R 產物插入 p S F K T 2 (Japanese Patent Application No· Hei 1 1-69896 )的 S m a I 位置而構築出 pSFKTGl 1。爲取得FGR2品系的GDH啓動子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -71 - 1247805 A7 B7 五、發明説明（％ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列，使用序列號碼5 7和6 2的合成D N A爲引子及 ATCC 1 3 869的染色體DNA爲模板進行P CR ;另一方面 也使用序列號碼5 8和6 1的合成D N A爲引子，及 ATCC 1 3 869的染色體DNA爲模板進行P CR。更進一步 ，以這些P C R產物爲模板，使用序列號碼5 7和5 8的 合成DNA爲引子進行PCR。所得的PCR產物插入 P S F K T 2 ( Japanese Patent Application No. Hei 11- 69 896 )的Sma I位置而構築出PSFKTG07。插入 pSFKTGl 1 和 pSFKTG〇7 Sma I 位置的 D N A片段必需測定其鹼基序列，以確認除了啓動子區域 以外沒有突變導入G D Η內。 (2 ) g d h啓動子變化品系的構築： 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 使用電脈衝方法將p S F K T G 1 1和 PSFKTG07導入AJ13029品系內，然後將轉 形產物生長於含有2 5微克/毫升康納黴素的CM2 B平 板上，於2 5 °C進行篩選。將轉形產物在3 4 t培養，以 篩選可在3 4 °C對康納黴素具抗性的品系。事實上有一品 系在3 4 °C對康納黴素具抗性，表示p S F K T G 1 1或 PSFKTG07整合插入到AJ13029品系的染色 體中。因此康納黴素-敏感性品系則從那些質體插入整合 到染色體中的品系中削減。測定這些品系的G D Η啓動子 序列，具有相同於pSFKTGl 1和PSFKTG07 之g d h啓動子序列的品系分別命名爲G A 〇 1和 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 __ B7_ 五、發明説明（70) G A 0 2。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (3 ) g d h啓動子變化品系之L 一麩胺酸產製力的確認 使用上述範例2 ( 2 )中的相同確認品系G A 〇 1和 G A 0 2和其親代品系的麩胺酸產製力。結果得知 G A 0 1和G A 0 2顯著增加麩胺酸的累積’結果顯示在 表2 3。 表2 3 品系 麩胺酸（克/100毫升） GDH的專一活性 相對値 AJ13029 2.6 7.7 1.0 GA01 3.0 22.3 2.9 GA02 2.9 27.0 3.5 (4 )自行選殖（self-cloning)型式之g d h質體的構築 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 首先，構築自行選殖載體PAJ 220。使用 EcoRV 和 Pst I 處理 pAJ 226 ( J. P. KOKAI No. Sho 6 1 - 1 52289 )，以製備含有可在棒狀桿菌內自動複製之 區域的片段。將此片段與約0 . 7 k b的D N A片段連接 起來而得到質體AJ220，而0 · 7kb的DNa片段 是以 EcoRV 和 Ps t I 處理 pAJ 224 (J. ρ· 本紙€尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） " ' -73- 1247805 A7 ____B7_ 五、發明説明（71) KOKAI No. Sho 6 1 - 1 52289 )所得到。此質體能在棒狀桿菌 內自動複製，且可使宿主對抗生素—trimethoprim具抗性。 使用序列號碼6 3和6 4的合成D N A爲引子，野生 型晶膜成長系統品系ATCC1 3869的染色體DNA爲模板進 行P C R。將所得的g d h基因片段插入p A J 2 2 0的 Ba 1 I位置而構築pAJ220G。啓動子位在靠近 pA J 2 2 0的B a 1 I位置，且表現的增加視基因插入 到B a 1 I位置的方向而定。使用電脈衝方法將 PAJ 220G和pGDH導入ATCC 1 3 869內。如此構築 之品系的G D Η活性測定，可經由上述步驟（1 )中的方 法進行。結果顯示於表2 4中，導入p A J 2 2 0 G之品 系的G D Η活性比導入d G D Η的品系高約1 · 5倍。 表2 4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 品系 GDH的專一活性 相對値 ATCC 1 3869 7.7 1.0 ATCC13869/pGDH 82.7 10·7 ATCC13869/pAJ220G 120.1 15.3 (5 ) g d h活性對產量及副產物天冬胺酸之影饗的硏究 調查 利用電脈衝方法將 pGDH 和 pAJ 2 2 0 G導入 A J 1 3 0 2 9內。將這些品系及上述步驟（2 )中所得 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -74- 1247805 A7 ___ B7_ 五、發明説明（β 的品系——接種到具有表2 5中所示之接種培養基內，於 3 1 · 5 °C搖動培養2 4小時以獲取這些接種物。取 3 0 0毫升的主要培養基於5 0 0毫升的玻璃醱酵瓶內， 主要培養基成分如表2 5中所示，然後加熱滅菌。將4 0 毫升之上述的接種培養基內的品系接種到主要培養基內， 在3 1 . 5 °C開始培養並伴隨8 0 0到1 3 0 0 r p m的 轉動及1 / 2到1 / 1 v v m的通氣量。使用氣態氨維持 1 / 1 p Η 7 · 5。開始培養8小時後將溫度移到3 7 t 。約2 0到4 0小時內葡萄糖完全耗盡時就終止培養，測 定所形成及累積在液態培養基中的L -麩胺酸數量（表 2 6 ) 。G D Η的活性最高可得到約3倍高的產量。當 G D Η活性更進一步再提高時，則產量的改良程度就會降 低。當G D Η活性提高到1 6倍時，產量會稍微減少。使 用Hitachi Amino Acid Analyzer L-8500來分析副產物胺基酸 的形成，結果發現G D Η活性提高時，天冬胺酸和丙胺酸 的累積量增加。這些結果證明下列事實：要增加麩胺酸的 產量必需適當增加G D Η的活性，才不致導致天冬胺酸和 丙胺酸的顯著增加。其中一有效方法就是將各種g d h啓 動子的突變導入以調控G D Η活性至3倍的親代品系即可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事 項再填」 :寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -75- 1247805 A7 B7 五、發明説明（73) 表2 5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 濃度 成分 接種培養 主要培養 葡萄糖 50克/升 150克/升 KH2P04 1克/升 2克/升 MgSCU · 7H2〇 0.4克/升 1.5克/升 FeSO^ · 7H2O 10毫克/升 15毫克/升 MnS〇4 · 4H2〇 10毫克/升 15毫克/升 黃豆蛋白質水解物 20毫克/升 50毫克/升 生物素 0.5毫克/升 2毫克/升 硫胺素鹽酸鹽 2毫克/升 3毫克/升 表2 6 麩胺酸 天冬胺酸 丙胺酸 GDH相對値 (克/100 (毫克/ (毫克/ 相對 品系 毫升） 100毫升） 100毫升 ) 活性 AJ13029 8.3 49 60 7.7 1.0 GA01 9.0 145 152 22.3 2.9 GA02 8.9 153 155 27.0 3.5 AJ 1 3029/pGDH 8.8 201 190 82.7 10.7 AJ1 3029/pAJ220G 7.5 290 590 120.12 15.6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -76- 1247805 A7 B7五、發明説明（74) 圖式之簡單說明 圖1顯示含有突變啓動子之G D Η基因的構築流程。 圖2顯示含有突變啓動子之C S基因的構築流程。 圖3顯示攜帶1 a c Ζ爲報告基因之穿梭載體的構築 流程。 (請先閲讀背面之注意事 4 •項再填· 裝— :寫本頁) 訂 管 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -77- 1247805 as Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 1 1 · 一種製造具有改良之胺基酸生產力的棒狀桿菌之 方法，其包含下述步.驟：在棒狀桿菌之染色體上的胺基酸 生合成基因的啓動子序列中導入取代、刪除、添加或彼之 結合的突變以使該啓動子序列接近棒狀桿菌之一致啓動子 序列，或藉由基因重組作用在棒狀桿菌之染色體上的胺基 酸生合成基因的啓動子序列中導入1或多個 齡之 改變 ，以使該啓動子序列接近棒狀桿菌之一致啓動子序列，進 而得到產製胺基酸之棒狀桿菌突變株；培養該突變株；及，篩 選能大量產製該所欲胺基酸之突變株。 、2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸是 選自麩胺酸，離胺酸，精胺酸，絲胺酸，苯丙胺酸，脯胺 酸或麩醯胺酸。 3 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸是 麩胺酸，且該生合成基因的啓動子是選自麩胺酸去氫酶（ GDH)基因啓動子，檸檬酸合成酶（C S )基因啓動子 ，異檸檬酸合成酶（I CDH)基因啓動子，丙酮酸去氫 酶（PDH)基因啓動子或烏頭酸酶（ACO)基因啓動 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· ▼項再填寫木 、?τ •豐 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 去 c c C 於鹼 酸自的 C 同他 胺選域 G 相其 魅是區.T 或被 該列 5 T 列已 中序 3 或序基 其 A I A T 鹼 ，乂在〇<:之 法D位 A AT 方之自 G T A 之有選TA A 項具係 T T T 3 所其，的 A 第子，A 域中 圍動列 C 區其 範啓序 τ ο 但 利因 AG1 列 專基 NT I 序 請 } D T 在 T 申 Η 個，位 A 如 D 1 A A .G 少 cilT 4 c 至 T c A c 酶 >G ， T 子氫 i G A 該 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2l〇X297公煃） —78 - 1247805 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 2 基取代，或（iii )該（i )和（ϋ )之組合，其中該序列 不抑制該啓動子之功能。 ( 5 ·如申請專利範圍第3項之方法，其中G D Η的啓 動子具有位在一 3 5區域的TGGTCA，和位在 —10區域的ΤΑΤΑΑΤ ;或，位在一35區域的ΤΤ GTCA，和位在—1 0區域的ΤΑΤΑΑΤ。 6 .如申請專利範圍第3項之方法，其中C S的啓動 子具有（i)位在一35區域的TTGACA序列，（ϋ )位在一 1 0區域的T A T A A Τ序列，或（iii )該（i )和（ii )組合之序列，且該序列不抑制該啓動子之功能 〇 7 .如申請專利範圍第3項之方法，其中I C D Η的 第一個和第二個啓動子中至少一個具有（i )位在- 3 5 區域的TTGCCA或TTGACA序列，（π)位在 一 10區域的ΤΑΤΑΑΤ序列，或（iii)該（i )和（ ϋ )組合之序列，且該序列不抑制該啓動子之功能。 8 ·如申請專利範圍第3項之方法，其中P D Η的啓 動子具有（i)位在一 35區域的TTGCCA序列，（ ϋ)位在一1 0區域的ΤΑΤΑΑΤ序列，或（ffi)該（ i )和（ϋ )組合之序列，且該序列不抑制简啓動子之功 會b 。 9 _如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸是 精胺酸，且該生合成基因的啓動子是精胺基琥拍 基因的啓動子。 本^張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ^79- 、-- II 裝 訂 (請先閲背背面之注意事項再填寫本頁) 1247805 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 〇 .如申請專利範圍第9項之方法，其中該精胺基 琥珀酸合成酶基因的.啓動子所具有之D N A序列是選自（ i )至少1個DNA序列，其係選自位在一 3 5區域的T 丁0(：0八，丁丁0(：丁厶或丁丁0丁0厶，（ii)位在 一 1 0區域的TATAAT序列或該丁 ATAAT序列但 其中ATAAC之鹼基已被其他鹼基取代，或（ifl)該（ i )和（ϋ )之組合，該序列不抑制該啓動子之功能。 1 1 ·如申請專利範圍第10項之方法，其中精胺基琥 珀酸合成酶基因的啓動子所具有之DNA序列是選自（i )位在—3 5區域的T T G T C A序列，（ϋ )位在 —1 0區域的T A T A A Τ序列，或（ffi )該（i )和（ U )之組合。 1 2 · —種經分離之麩胺酸合成酶基因，其含有具有 選自下述序列之啓動子： (i )位在—3 5 區域的 CGGTCA、TTGTC A、TTGACA 或 TTGCCA 序列， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (ϋ )位在一 1 0區域的T A T A A T序列或其衍生 物（其中該TATAAT序列中1或多個鹼基係由其他鹼 基取代）， (迅）該（i )和（ϋ )之組合.，或’ (iv )位在一 3 5區域的T G G 丁 C Α序列和位在 一 1 0區域的T A T A A T序列，其中該基因係選自麩胺 酸去氫酶（GDH)基因、檸檬酸合成酶（C S·)基因、 異檸檬酸合成酶（I CDH)基因、丙酮酸去氫酶（ 本&張尺度逋用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公羞1 :80- ： 1247805 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利乾圍 4 PDH)基因或烏頭酸酶（ACO)生成基因。 1 3 · —種經分.離之精胺酸合成酶基因，其含有具有 選自下述序列之啓動子： (i )位在—35 區域的 TTGCCA、TTGCT A或TTGTCA序列， (ii)位在一 1 〇區域的TAT AAT序列或其衍生 物（其中該TATAAT序列中1或多個鹼基係由其他鹼 基取代），或’ (iii )該（i )和（ii )之組合， 其中該基因係選自N -乙醯基麩胺酸合成酶基因、N -乙醯基麩胺酸激酶基因、N -乙醯基麩胺醯基磷酸還原 酶基因、乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶基因、N -乙醯基鳥胺 酸酶基因、鳥胺酸氨甲醯基轉移酶基因、精胺基琥珀酸合 成酶基因、或精胺基琥珀酸酶基因。 1 4 . 一種產製麩胺酸之棒狀桿菌，其含有申請專利 範圍第12項之麩胺酸合成酶基因。 1 5 . —種產製精胺酸之棒狀桿菌，其含有申請專利 範圍第13項之精胺酸合成酶基因。 1 6 · —種藉由醱酵作用產製胺基酸之方法，其包含 下述步驟：於培養基中培養由申請專利範圍竭1至1 1項 中任一項之方法所構築且具有改良的胺基酸生產力之棒狀 桿菌，或培養申請專利範圍第1 4或1 5項之棒狀桿菌， 以於該培養基中生成並因此累積所欲之胺基酸；·及，自該 培養基中收集該胺基酸。 (請先閲讀背面之注意事 4 -項再填」 裝--I 寫本頁) 訂 .豐 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 81 - 1247805 A7 B7 五、發明説明（） 序列表 <11〇>味之素股份有限公司 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <120>構築產製胺基酸之細菌的方法，及藉由醱酵該經構築之產製胺基酸的細菌以 製備胺基酸之方法 <130〉YIG-0426 <140>TW 088116544 <141>1999-09-27 <150〉JP 10/271，786 和 JP 10/271，787 <151> 1998-9-25 <160〉6 <210> 1 <211>46 <212>核酸 <400> 1 ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt <210>2 <211>46 <212>核酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400〉 2 ttaattcttt gcggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt <210>3 <211>46 <212>核酸 <400> 3 ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210〉4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -82 - 1247805 A7 五、發明説明（） <211> 46 <212>核酸 <400> 4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ttaattcttt gttgacatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210〉 5 <211> 46 <212>核酸 <400> 5 ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210> 6 <211〉 46 <212>核酸 <400〉 6 ttaattcttt gttgtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210> 7 <211〉 30 <212>核酸 <220>用於選殖乳酸醱酵短桿菌之g 1 t A的引子A <400> 7 gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210〉 8 <211〉 30 <212>核酸 <220>用於選殖乳酸醱酵短桿菌之g 1 t A的引子B <400> 8 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt <210〉 9 <211〉 20 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（） <212〉核酸 <220>用於導入突變到g 1 t A啓動子的引子1 <400> 9 atcggtataa cgtgttaacc <210> 10 <211> 20 <212>核酸 <220>用於導入突變到g 1 t A啓動子的引子2 <400> 10 atcggtataa tgtgttaacc <210> 11 <211〉 40 <212>核酸 <220>用於導入突變到g 1 t A啓動子的引子4 <400> 11 gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc <210〉 12 <211〉 28 <212>核酸 <220> g 1 t A啓動子序列引子 <400> 12 agggatccgt ccagtctcag acagcatc <210> 13 <211> 17 <212〉核酸 <220>通用引子Ml 3RV <400〉 13 caggaaacag ctatgac (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -84- 1247805 A7 B7 五、發明説明（） <210> 14 <211〉 20 <212>核酸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <220>用於選殖I C D Η的引子A <400> 14 gaattcgctc ccggtgcagc <210〉 15 <211〉 20 <212>核酸 <220〉用於選殖I C D Η的引子B <400> 15 gatgcagaat tccttgtcgg <210> 16 <211> 28 <212>核酸 <220>用於導入突變到I C D Η的引子1 <400> 16 tggattgctg gctataatgg tgtcgtga <210> 17 <211〉 53 <212>核酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220>用於導入突變到I C D Η的引子2 <400> 17 caacccacgt tcagttgaca actactggat tgctggctat aatggtgtcg tga <210> 18 <211〉 53 <212>核酸 <220>用於導入突變到I C D H啓動子的引子3 primer 3 for introducing a mutation of ICD promoter 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ ^5 - 1247805 A7 B7 五、發明説明（） <400〉 18 caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 19 <211> 28 <212>核酸 <220>用於導入突變到I C D H的引子4 <400> 19 ggctgaaact gctataatag gcgccagc <210> 20 <211> 51 <212>核酸 <220>用於導入突變到I C D H的引子5 <400> 20 ggaaacacgg cgttgccatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c <210〉 21 <211> 51 <212>核酸 <220>用於導入突變到I C D H的引子6 <400> 21 ggaaacacgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210〉 22 <211〉 22 <212>核酸 <220> ICDH啓動子序列引子 <400> 22 gtgcgggtcc agatgatctt ag <210〉 23 <211〉 20 <212>核酸 -86- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公董） n
247805 A7 B7五、發明説明（） <220>用於增幅n p t Π的引子A 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 23 gggatcccgg atgaatgtca <400> 24 <211〉 23 <212>核酸 <220>用於增幅n p t Π的引子B <400〉 24 gcccggggtg ggcgaagaac tcc <210> 25 <211> 23 <212>核酸 <220>用於增幅乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400> 25 aci gti tci atg ggi cti ggi cc <210> 26 <211> 23 <212>核酸 <220>用於增幅乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400> 26 cct tci ccg tti agi gti gti eg <210> 27 <211〉 30 <212>核酸 <220>用於活體外選殖乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400> 27 ttg cag tta acc aeg aag gtc agg ttg tec <210> 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -87- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247805 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） <211〉 30 <212〉核酸 <220>用於活體外選殖乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400> 28 tgg atg aga cca cgt gat tct ggc teg tee <210〉 29 <211〉 30 <212>核酸 <220>用於活體外選殖乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400〉 29 aca gat cct gca ega agg cat caa ega ggc <210> 30 <211〉 30 <212>核酸 <220>用於活體外選殖乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400> tea teg ctg egg gta cct cct aeg cca ccc <210> 31 <211〉 2766 <212>核酸 <213>乳酸醱酵短桿菌ATCC13869
<220>乳酸醱酵短桿菌ATCC13869的pdhA基因LA <400> 31 atg gee gat caa gca aaa ett ggt ggt aag ccc teg gat gac tct aac 48
Met Ala Asp Gin Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn 1 5 l〇 15 tie geg atg ate ege gat ggc gtg gca tct tat ttg aac gac tea gat 96
Phe Ala Met lie Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp 20 25 30 ---------------、1T----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -88 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247805 A7 B7 五、發明説明（） ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tea etc gac gga tta etc cag 144
Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gin 35 40 45 gag tet tet cca gaa cgt get cgt tac etc atg ett cgt ttg ett gag 192
Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu 50 55 60 cgt gca tet gca aag ege gta tet ett ccc cca atg aeg tea acc gac 240
Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp 65 70 75 80 tac gtc aac acc att cca acc tet atg gaa cct gaa ttc cca ggc gat 288
Tyr Val Asn Thr He Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp 85 90 95 gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att ege tgg aac gca gee 336
Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp He Arg Trp Asn Ala Ala 100 105 110 ate atg gtt cac ege get cag ega cca ggc ate ggc gtc ggc gga cac 384
He Met Val His Arg Ala Gin Arg Pro Gly lie Gly Val Gly Gly His 115 120 125 att tee act tac gca ggc gca gee cct ctg tac gaa gtt ggc ttc aac 432
He Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn 130 135 140 cac ttc ttc ege ggc aag gat cac cca ggc ggc ggc gac cag ate ttc 480
His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gin He Phe 145 150 155 160 ttc cag ggc cac gca tea cca ggt atg tac gca cgt gca ttc atg gag 528
Phe Gin Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu 165 170 175 ggt ege ett tet gaa gac gat etc gat ggc ttc cgt cag gaa gtt tee 576 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -89- ---------------IT------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1247805 A7 _ B7___ 五、發明説明（）
Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gin Glu Val Ser 180 185 190 cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac cca cac ggt atg aag 624 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Arg Glu Gin Gly Gly He Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys 195 200 205 gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt ctt ggc cca atg gat 672
Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp 210 215 220 gcc att tac cag gca cgt ttc aac cgc tac etc gaa aac cgt ggc ate 720
Ala lie Tyr Gin Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly He 225 230 235 240 aag gac acc tet gac cag cac gtc tgg gcc ttc ctt ggc gac ggc gaa 768
Lys Asp Thr Ser Asp Gin His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu 245 250 255 atg gac gag cca gaa tea cgt ggt etc ate cag cag get gca ctg aac 816
Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu lie Gin Gin Ala Ala Leu Asn 260 265 270 aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc aac ctg cag cgt etc 864
Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gin Arg Leu 275 280 285 gac gga cct gtc cgc ggt aac acc aag ate ate cag gaa etc gag tcc 912 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys lie He Gin Glu Leu Glu Ser 290 295 300 ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tet gtg ate aag gtt gtt tgg ggt cgc 960
Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val He Lys Val Val Trp Gly Arg 305 310 315 320 gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat ggt gca ctt gtt gag 1008
Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gin Asp Gly Ala Leu Val Glu 325 330 335 -90- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1247805 A7 B7 五、發明説明（） ate atg aac aac acc tee gat ggt gac tac cag acc ttc aag get aac 1056 lie Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gin Thr Phe Lys Ala Asn 340 345 350 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga cgt gac cca ege acc 1104
Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr 355 360 365 gca aag etc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa ate tgg aag ctg cca 1152
Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu He Trp Lys Leu Pro 370 375 380 cgt ggc ggc cac gat tac ege aag gtt tac gca gee tac aag ega get 1200
Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala 385 390 395 400 ett gag acc aag gat ege cca acc gtc ate ett get cac acc att aag 1248
Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val He Leu Ala His Thr lie Lys 405 410 415 ggc tac gga etc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt aac gca acc cac cag 1296
Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gin 420 425 430 atg aag aag ctg aeg ett gat gat ctg aag ttg ttc ege gac aag cag 1344
Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gin 435 440 445 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggc ate cca ate acc gat gag cag ctg gag aag gat cct tac ett cct 1392
Gly He Pro He Thr Asp Glu Gin Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro 450 455 460 cct tac tac cac cca ggt gaa gac get cct gaa ate aag tac atg aag 1440
Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu He Lys Tyr Met Lys 465 470 475 480 gaa cgt ege gca geg etc ggt ggc tac ctg cca gag cgt cgt gag aac 1488
Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐) :91 - . 1247805 A7 B7 五、發明説明（) 485 490 495 TAC GAT CCA ATT CAG GTT CCA CCA CTG GAT AAG CTT CGC TCT GTC CGT 1536
Tyr Asp Pro lie Gin Val Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Ser Val Arg (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 500 505 510 aag ggc tee ggc aag cag cag ate get acc act atg geg act gtt cgt 1584
Lys Gly Ser Gly Lys Gin Gin He Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Arg 515 520 525 acc ttc aag gaa ctg atg ege gat aag ggc ttg get gat ege ett gtc 1632
Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Val 530 535 540 cca ate att cct gat gag gca cgt acc ttc ggt ett gac tet tgg ttc 1680
Pro He lie Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe 545 550 555 560 cca acc ttg aag ate tac aac ccg cac ggt cag aac tac gtg cct gtt 1728
Pro Thr Leu Lys lie Tyr Asn Pro His Gly Gin Asn Tyr Val Pro Val 565 570 575 gac cac gac ctg atg etc tee tac cgt gag gca cct gaa gga cag ate 1776
Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gin He 580 585 590 ctg cac gaa ggc ate aac gag get ggt tee gtg gca teg ttc ate get 1824 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Leu His Glu Gly lie Asn Glu Ala Gly Ser Val Ala Ser Phe He Ala 595 600 605 geg ggt acc tee tac gee acc cac ggc aag gee atg att ccg ctg tac 1872
Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met lie Pro Leu Tyr 610 615 620 ate ttc tac teg atg ttc gga ttc cag ege acc ggt gac tee ate tgg 1920 lie Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gin Arg Thr Gly Asp Ser He Trp 625 630 635 640 -92- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 _ B7_ 五、發明説明（） gca gca gcc gat cag atg gca cgt ggc ttc etc ttg ggc get acc gca 1968
Ala Ala Ala Asp Gin Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala 645 650 655 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ggt ege acc acc ctg acc ggt gaa ggc etc cag cac atg gat gga cac 2016
Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gin His Met Asp Gly His 660 665 670 tee cct gtc ttg get tee acc aac gag ggt gtc gag acc tac gac cca 2064
Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro 675 680 685 tee ttt geg tac gag ate gca cac ctg gtt cac cgt ggc ate gac ege 2112
Ser Phe Ala Tyr Glu He Ala His Leu Val His Arg Gly He Asp Arg 690 695 700 atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt ate tac tac ate acc ate 2160
Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val He Tyr Tyr lie Thr lie 705 710 715 720 tac aac gag cca acc cca cag cca get gag cca gaa gga ctg gac gta 2208
Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gin Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val 725 730 735 gaa ggc ctg cac aag ggc ate tac etc tac tee ege ggt gaa ggc acc 2256
Glu Gly Leu His Lys Gly He Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr 740 745 750 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggc cat gag gca aac ate ttg get tee ggt gtt ggt atg cag tgg get 2304
Gly His Glu Ala Asn He Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gin Trp Ala 755 760 765 etc aag get gca tee ate ett gag get gac tac gga gtt cgt gcc aac 2352
Leu Lys Ala Ala Ser He Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn 770 775 780 att tac tee get act tet tgg gtt aac ttg get ege gat ggc get get 2400
He Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 _B7__ 五、發明説明（） 785 790 795 800 cgt aac aag gca cag ctg cgc aac cca ggt gca gat get ggc gag gca 2448
Arg Asn Lys Ala Gin Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 805 810 815 ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tee ggc cca tac gtt gca gtg 2496
Phe Val Thr Thr Gin Leu Lys Gin Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val 820 825 830 tet gac ttc tee act gat ctg cca aac cag ate cgt gaa tgg gtc cca 2544
Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gin lie Arg Glu Trp Val Pro 835 840 845 ggc gac tac acc gtt etc ggt gca gat ggc ttc ggt ttc tet gat acc 2592
Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr 850 855 860 cgc cca get get cgt cgc ttc ttc aac ate gac get gag tee att gtt 2640
Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn He Asp Ala Glu Ser lie Val 865 870 875 880 gtt gca gtg ctg aac tee ctg gca cgc gaa ggc aag ate gac gtc tee 2688
Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys lie Asp Val Ser 885 890 895 gtt get get cag get get gag aag ttc aag ttg gat gat cct aeg agt 2736 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Val Ala Ala Gin Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser 900 905 910 gtt tee gta gat cca aac get cct gag gaa 2766
Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu <210> 32 <211〉 8556 <212>核酸 <213> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 -94- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 B7 五、發明説明（） <400〉 32 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) tcacgttacg gcgatcaaca ccgcaaccac tacgagaaga tctccaaacg agaccaagag 60 cgcttctaag cccgtctcat tttgcacctg ccattctgtg aggatatggc aggtgctttt 120 tcatgccact atcttggggt tctcggtatt agatcttctg ataaaaaccc gatagttttc 180 ttgcgctaga cactaattac ggcaccgctt aagcatggtc gtgacacgta aaacctgact 240 taggccattt tgatgtggtg tagatcatat tgacgtcaat gaatgaagtg actaactccg 300 ccgaatccac atcgtctaaa aggcctgggc gaccacgtaa agacgggcac gacgagaaga 360 tcatcgacgc aactttacgg ctcatcgaca gcaatcgtcc cgtcacggtc aatgcagttg 420 tcaaagaaag cggagtggca cgtgcagcgg tttatcgacg ctggcccagg ctagtggatc 480 tagtagcgga agctttagat gccgggcgag ctccagttga aatagatacc ccaggggaca 540 tcaaagagac cttgattgat gggctgttta caaatcaggc gaaaaccact ggagtctcct 600 atcctcgtca gcgatttcgc aaacggctcg agttggtgat gtcagatcaa gaattacagc 660 tcgcctaatg gaattcacat gtgaagagac gtcgagaagc aaatattcgc gcgctgcaag 720 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 tcgcgcaaga aaaaggccaa atccgggcgg atctagacat cgaggcgtgc ctcgatgcaa 780 tccttggggt gttttattac caatcggtcg cgcgtggagt aaatttcacc gaccaaggta 840 caacgcaacg atgcagagaa gccttggagg tgatctggca tggaatggaa ccttaaattc 900 aggttctgac gaggtgcgaa gcaagttgtc gcgcgccgca cctcagtatc cggatcaact 960 taatttcgaa gtgctgggtt ttctcgcgca tacccaatgc gtaccgatgt gcccatgagc 1020 gaaaaacagg ccacgataag tttcttaaaa cttatcgtgg cctgcttcta tatttgtgcg -95- 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 B7 五、發明説明（） 1080 ccctgacggg ctcgaaccgc cgacctgctg ggtgtaaacc agctgctctt ccagctgagc 1140 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) taaaggcgcg cacgtgcttt tctagaacca ccttggtggc ctcgaaagca acgagtgaaa 1200 tactaacaca caatctccac agacctaaaa tcgctgctca ggccgtggaa attagcgatt 1260 gttaaggctt cttgtttcca cgctggacga ggcaagaacc ttgccaatta ccgagacgtt 1320 ccgccttggt ctgcacgaga cctgccagtt gtgctgattc agagataact ccaggagcca 1380 gggctccttc tttaccaatg ccaggagtca acacccagat acgaccattc tcagcgaggg 1440 agcggatgga atccacaagt ccgtcgacga gatcgccgtc atcctcgcgc caccagagca 1500 gcacgacatc gcacagctcg tcggtttctt catcgagtag ttcctcaccg attgcatctt 1560 cgatggactc gctgatcagc gtgtcggaat cttcatccca tccaatttct tgaacgatat 1620 gacccgattg aatgccgagt agttgagcat aatcctgggc accttgcttg actgcgcccg 1680 gagcgtcggc cactttaata atcctcctcg tgtgggcccc gatgtgtttt tcgattacat 1740 ggattcaaca tgaaaccgcg gggctattga tatatccgaa ttgcacatta ccgtccaacc 1800 ggtactttga accacctttc cctggaattt tttccttttc ctcccccttt acgctcaaga 1860 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 atcaatgaat tcaatcactg gccagcgatt aacttttcga gttttcagtc ttggatttcc 1920 acaattctct tcaaaataat ggtggctaga tttttcatca aaccctcacc aaaaggacat 1980 cagacctgta gttttatgcg attcgcgtca aacgtgagag aaacatcaca tctcacggga 2040 aactacccga taattctttg caaaactttg caaagggtaa tgaacatgca gctagtttcc 2100 gtagaaatgt tctttaaaaa atccacaaca attgccagga agcacaccga ttgatggata 2160 cctgaaatcc cagtgagcgc accactcccc ttacgtcaca gtctgtaaaa caaatcttcg -96- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 B7 五、發明説明（） 2220 gtgttgcgta tccttgttaa taacttatgc gttgacccat tcgtgcactt cggtgtgcca 2280 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) caattaggta cgaccaagaa tgggaccggg aaaccgggac gtataaacga aataaaacat 2340 tccaacagga ggtgtggaa atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc 2392
Met Ala Asp Gin Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro 5 10 teg gat gac tet aac ttc geg atg ate ege gat ggc gtg gca tet tat 2440
Ser Asp Asp Ser Asn Phe Ala Met lie Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr 15 20 25 ttg aac gac tea gat ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tea etc 2488
Leu Asn Asp Ser Asp Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu 30 35 40 gac gga tta etc cag gag tet tet cca gaa cgt get cgt tac etc atg 2536
Asp Gly Leu Leu Gin Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met 45 50 55 ctt cgt ttg ctt gag cgt gca tet gca aag ege gta tet ctt ccc cca 2584 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Leu Arg Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro 60 65 70 75 atg aeg tea acc gac tac gtc aac acc att cca acc tet atg gaa cct 2632
Met Thr Ser Thr Asp Tyr Val Asn Thr He Pro Thr Ser Met Glu Pro 80 85 90 gaa ttc cca ggc gat gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att 2680
Glu Phe Pro Gly Asp Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp lie -97- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 1247805 A7 B7 五、發明説明（) 95 100 105 cgc tgg aac gca gcc ate atg gtt cac cgc get cag cga cca ggc ate 2728 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Arg Trp Asn Ala Ala He Met Val His Arg Ala Gin Arg Pro Gly lie 110 115 120 ggc gtc ggc gga cac att tee act tac gca ggc gca gee cct ctg tac 2776
Gly Val Gly Gly His lie Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr 125 130 135 gaa gtt ggc ttc aac cac ttc tic ege ggc aag gat cac cca ggc ggc 2824
Glu Val Gly Phe Asn His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly 140 145 150 155 ggc gac cag ate ttc ttc cag ggc cac gca tea cca ggt atg tac gca 2872
Gly Asp Gin He Phe Phe Gin Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala 160 165 170 cgt gca ttc atg gag ggt ege ett tet gaa gac gat etc gat ggc ttc 2920
Arg Ala Phe Met Glu Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe 175 180 185 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 cgt cag gaa gtt tee cgt gag cag ggt ggc att ccg tee tac cct cac 2968
Arg Gin Glu Val Ser Arg Glu Gin Gly Gly He Pro Ser Tyr Pro His 190 195 200 cca cac ggt atg aag gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tee atg ggt 3016
Pro His Gly Met Lys Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly 205 210 215 ett ggc cca atg gat gee att tac cag gca cgt ttc aac ege tac etc -98- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格{ 210X297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247805 A7 B7 五、發明説明（） 3064
Leu Gly Pro Met Asp Ala lie Tyr Gin Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu 220 225 230 235 gaa aac cgt ggc ate aag gac acc tet gac cag cac gtc tgg gcc ttc 3112
Glu Asn Arg Gly He Lys Asp Thr Ser Asp Gin His Val Trp Ala Phe 240 245 250 ctt ggc gac ggc gaa atg gac gag cca gaa tea cgt ggt etc ate cag 3160
Leu Gly Asp Gly Glu Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu He Gin 255 260 265 cag get gca ctg aac aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc 3208
Gin Ala Ala Leu Asn Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys 270 275 280 aac ctg cag cgt etc gac gga cct gtc ege ggt aac acc aag ate ate 3256
Asn Leu Gin Arg Leu Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys lie He 285 290 295 cag gaa etc gag tee ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tet gtg ate aag 3304
Gin Glu Leu Glu Ser Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val He Lys 300 305 310 315 gtt gtt tgg ggt ege gag tgg gat gaa ett ctg gag aag gac cag gat 3352
Val Val Trp Gly Arg Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gin Asp 320 325 330 ggt gca ett gtt gag ate atg aac aac acc tee gat ggt gac tac cag 3400
Gly Ala Leu Val Glu He Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gin 335 340 345 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -99- I I I I n I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1247805 A7 B7 五、發明説明（） acc ttc aag get aac gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga 3448
Thr Phe Lys Ala Asn Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly 350 355 360 cgt gac cca ege acc gca aag etc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa 3496
Arg Asp Pro Arg Thr Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu 365 370 375 ate tgg aag ctg cca cgt ggc ggc cac gat tac ege aag gtt tac gca 3544
He Trp Lys Leu Pro Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala 380 385 390 395 gee tac aag ega get ctt gag acc aag gat ege cca acc gtc ate ett 3592
Ala Tyr Lys Arg Ala Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val He Leu 400 405 410 get cac acc att aag ggc tac gga etc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt 3640
Ala His Thr He Lys Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg 415 420 425 aac gca acc cac cag atg aag aag ctg aeg ett gat gat ctg aag ttg 3688
Asn Ala Thr His Gin Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu 430 435 440 ttc ege gac aag cag ggc ate cca ate acc gat gag cag ctg gag aag 3736
Phe Arg Asp Lys Gin Gly He Pro He Thr Asp Glu Gin Leu Glu Lys 445 450 455 gat cct tac ett cct cct tac tac cac cca ggt gaa gac get cct gaa 3784 裝 II 訂 I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -1〇〇 _ 1247805 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（）
Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu 460 465 470 475 ate aag tac atg aag gaa cgt ege gca geg etc ggt ggc tac ctg cca 3832 lie Lys Tyr Met Lys Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro 480 485 490 gag cgt cgt gag aac tac gat cca att cag gtt cca cca ctg gat aag 3880
Glu Arg Arg Glu Asn Tyr Asp Pro lie Gin Val Pro Pro Leu Asp Lys 495 500 505 ett ege tet gtc cgt aag ggc tee ggc aag cag cag ate get acc act 3928
Leu Arg Ser Val Arg Lys Gly Ser Gly Lys Gin Gin He Ala Thr Thr 510 515 520 atg geg act gtt cgt acc ttc aag gaa ctg atg ege gat aag ggc ttg 3976
Met Ala Thr Val Arg Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu 525 530 535 get gat ege ett gtc cca ate att cct gat gag gca cgt acc ttc ggt 4024
Ala Asp Arg Leu Val Pro He He Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly 540 545 550 555
Ctt gac tct tgg ttc cca acc ttg aag ate tac aac ccg cac ggt cag 4072
Leu Asp Ser Trp Phe Pro Thr Leu Lys lie Tyr Asn Pro His Gly Gin 560 565 570 aac tac cct gtt gac cac gac ctg atg etc tee tac cgt gag gca 4120
Asn Tyr Val pro vai ASp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala 575 580 585 ------IT----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1247805 A7 __ B7_ 五、發明説明（） cct gaa gga cag ate ctg cac gaa ggc ate aac gag get ggt tee gtg 4168
Pro Glu Gly Gin lie Leu His Glu Gly He Asn Glu Ala Gly Ser Val 590 595 600 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) gca teg ttc ate get geg ggt acc tee tac gee acc cac ggc aag gee 4216
Ala Ser Phe lie Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala 605 610 615 atg att ccg ctg tac ate ttc tac teg atg ttc gga ttc cag ege acc 4264
Met He Pro Leu Tyr He Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gin Arg Thr 620 625 630 635 ggt gac tee ate tgg gca gca gee gat cag atg gca cgt ggc ttc etc 4312
Gly Asp Ser He Trp Ala Ala Ala Asp Gin Met Ala Arg Gly Phe Leu 640 645 650 ttg ggc get acc gca ggt ege acc acc ctg acc ggt gaa ggc etc cag 4360
Leu Gly Ala Thr Ala Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gin 655 660 665 cac atg gat gga cac tee cct gtc ttg get tee acc aac gag ggt gtc 4408 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
His Met Asp Gly His Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val 670 675 680 gag acc tac gac cca tee ttt geg tac gag ate gca cac ctg gtt cac 4456
Glu Thr Tyr Asp Pro Ser Phe Ala Tyr Glu He Ala His Leu Val His 685 690 695 cgt ggc ate gac ege atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt ate 4504
Arg Gly He Asp Arg Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val lie -102- 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） 1247805 A7 B7 五、發明説明（） 700 705 710 715 tac tac ate acc ate tac aac gag cca acc cca cag cca get gag cca 4552 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Tyr Tyr lie Thr lie Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gin Pro Ala Glu Pro 720 725 730 gaa gga ctg gac gta gaa ggc ctg cac aag ggc ate tac etc tac tee 4600
Glu Gly Leu Asp Val Glu Gly Leu His Lys Gly He Tyr Leu Tyr Ser 735 740 745 ege ggt gaa ggc acc ggc cat gag gca aac ate ttg get tee ggt gtt 4648
Arg Gly Glu Gly Thr Gly His Glu Ala Asn He Leu Ala Ser Gly Val 750 755 760 ggt atg cag tgg get etc aag get gca tee ate ett gag get gac tac 4696
Gly Met Gin Trp Ala Leu Lys Ala Ala Ser He Leu Glu Ala Asp Tyr 765 770 775 gga gtt cgt gee aac att tac tee get act tet tgg gtt aac ttg get 4744
Gly Val Arg Ala Asn He Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala 780 785 790 795 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ege gat ggc get get cgt aac aag gca cag ctg ege aac cca ggt gca 4792
Arg Asp Gly Ala Ala Arg Asn Lys Ala Gin Leu Arg Asn Pro Gly Ala 800 805 810 gat get ggc gag gca ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tee ggc 4840
Asp Ala Gly Glu Ala Phe Val Thr Thr Gin Leu Lys Gin Thr Ser Gly 815 820 825 cca tac gtt gca gtg tet gac ttc tee act gat ctg cca aac cag ate 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -103- 1247805 A7 ___ B7 _ 五、發明説明（） 4888
Pro Tyr Val Ala Val Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gin lie 830 835 840 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) cgt gaa tgg gtc cca ggc gac tac acc gtt etc ggt gca gat ggc ttc 4936
Arg Glu Trp Val Pro Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe 845 850 855 ggt ttc tet gat acc ege cca get get cgt ege ttc ttc aac ate gac 4984
Gly Phe Ser Asp Thr Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn He Asp 860 865 870 875 get gag tee att gtt gtt gca gtg ctg aac tee ctg gca ege gaa ggc 5032
Ala Glu Ser He Val Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly 880 885 890 aag ate gac gtc tee gtt get get cag get get gag aag ttc aag ttg 5080
Lys He Asp Val Ser Val Ala Ala Gin Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu 895 900 905 gat gat cct aeg agt gtt tee gta gat cca aac get cct gag gaa taaat 5130 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Asp Asp Pro Thr Ser Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu 910 915 920 cacctcaagg gacagataaa tcccgccgcc agacgttagt ctggcggcgg gattegtegt 5190 aaagcaagct ctttttagcc gagaaaegee ttgtcagaca atgttgcgcc ettgatattg 5250 gcgaactcct gcagcaaatc gcgcacagtc aacttcgact tggtagcctg atctgcctgg 5310 tagacaatct ggccttcatg catcatgatc aggegattge ccaggcgaat tgcctgttcc 5370 atgttgtgcg tgaccataag egtagteaga gttccatctg ccacgatctt ttcggtcaag -104- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 B7 五、發明説明（） 5430 gtggtcacaa gctctgcacg ctgtggatca agcgctgcgg tgtgctcatc caacagcatg 5490 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) attttaggtt gagtaaaacc agccatcagc agggacaatg cctgacgctg accgccagag 5550 agcaaaccaa ctttggcagt gagcctgttt tccagaccca gctcaaggcg ctcaagttcc 5610 tgcttgaatt gctcacggcg cttcgaggtc agtgcaaagc ccaatccacg gcgcttgccg 5670 cgcagcaacg cgatggccag attctcttea atggtgagat teggegeggt gcctgccaaa 5730 ggatcctgaa aaacgcggcc gatgtagegg gcacgcttgt gctctgacat cttgtttacc 5790 ttgttgccgt cgatggaaat ctcgccggaa tcaacaagca aacggccaga aacagcgttg 5850 agcagggtgg atttacccgc accgttagaa ccgatgacgg tgacaaaatc gccctcagcc 5910 atategagtt tgagctgctg caacgcgcgg cgctcattea cagtgccggg gaagaaggtt 5970 ttggaaattc cgttgatgga taacatgtct taagcctcca ctgctactgg ttgettagge 6030 ttcggtgcct tggagaaett cgcacgccac ctcggcagca gcatggcgac aaccaccaag 6090 atcgcagaaa ttgccttcat atcgttgggg tcaaggccaa cgcgcagtgc tgcgaaaatg 6150 atcaggcggt aegegatgge accgacgatg acagccaaca cagccaacca cacgcgacgc 6210 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 tgaccgaaga tggcctggcc ccaaaataac egatgegaga ccgatcacga tgaggccaat 6270 acccatcgaa atatetgega agccctggta ctgagcgatg agtgcaccgg caagaccaac 6330 agaaccattg gacagggaga tggtgaggat tttggtgaaa teegttgaaa caccaaagga 6390 ctgcaccatc ggcccgttgt cgccggtgga tcgcagcgac agteegatat cagtgttgag 6450 gaaccagatg aegatgagte ccaaaaatcc cactgcaacg gegaggateg ccgggcctgc 6510 ccatgtgccg aggaggeegg egtegegaag cggggtgaag aggttatcgg tgcgcaacaa 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^〇5- 1247805 A7 B7 五、發明説明（） 6570 tggcacgttc gcgccaccca tgatgcgcaa gttaaccgac cacaacgcaa tcatggtcaa 6630 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) aatacctgcg agcaaaccat cgatcttgcc cttggtgtgc agcaaaccgg tgatcatgcc 6690 agcgataaag ccagtaacga aaccagcggc agtagccata agaggaggcc agccagacat 6750 aagagctgtc gcagctgttg ccgcgccagt ggtcaggctg ccgtcaacgg tgaggtcggg 6810 aaagttgagc acacggaacg tcaaatagac gcccaatgcg acaactccgt acaacaatcc 6870 gaactcaaaa gcgccgatca tacgcgtteg gccttatcca aaatetettg agggatctcc 6930 acgccctggc gctctgctgc atettegttg atcacgtagg tgaactcagt tgcagtctcc 6990 acaggcatgg ttgctgggtc ttcgccgtcc tgcagaatac gcagagccat ctcgccagtc 7050 tggcggccaa gctcggtgta atcgataccc agggttgcca gtgcgccacc ctcaacagtg 7110 ccggactcag caccgatcac agggatctgc ttctgctcag caacctgaac cagagaagaa 7170 ataccggaaa caaccatgtt gtcagttgga aegtagatga catcaacatc geegagaget 7230 tcaacagcct gctgaatctc gttcacggta gtgacagtct gagtattaac ggacagcccc 7290 agtggctcag cagccttggt gacctcatcg acctgcacct gagagttgac ctcaccagac 7350 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 gegtagaega tgccgatgga etttgegtea ggaaccagct gctgcaaaag ctccaactgc 7410 tgctcaatcg gtgegatate agaagtaccg gtgacgtttc cgccaggtgc ttcattagaa 7470 tccaccagct ctgccgacac tgcatcggta actgcggtga acaggactgg gatatcagtg 7530 atattctgcg cagttgcctg tgctgctgga gttgcaacag ccaacacgag atccaaattg 7590 teagaagega actgctgaga aatagtcagt gcagtgccct gctcgccgtt agcgttttgc 7650 tcatcaaagg tgacgtcaac gcctgcctct tcaaaagctt ccttgaaacc agtggtcgct 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 1〇6 _ 1247805 A7 B7 五、發明説明（） 7710 gcatcaagtg cagggtgctg aacaagctgg ttgatgccaa ctcggtaaga gtcgccacct 7770 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) gcagcatcag tggaggtgga gctgtcactg gaatcgcttg agcacgaagc caacgccaag 7830 gcgccaacag taaagatgct tgcgagtacc ttcgaacggg aagaaaacat agcacatctc 7890 cttaaagtgt tattttcaaa aaggggcaga cagcgtcaac acatgtctcg gataaagaac 7950 catatgtgaa atgtctcatg atttaaacta cttgttctac cagtcatatg cgcaattccc 8010 cctggatatc ccgcaggaca tggacaaaat gggtggatag cgggtgcacc aattcaatct 8070 tttaaaggcc ctagacaccg cgatttcctt aatcgatcat taaagaggga tcctctcccc 8130 taacaaacct ccaaagacta gagtggggaa caccatgaac gtttcctcaa ataaacccag 8190 tgactctgac cgcgaatatc ttcaatcaga actcacccgg ctcgttggcc aggggcgact 8250 cgatctagat acttaccaag acgtggttga taccgtttgg tctactgatg atctaggcga 8310 gttgatgagg atccgtgccc gcttcctggg agggccgcag gtttcgcagc agcggcccca 8370 gcagccgcag caaccacatc agcggccgca acagcaaccg ccacagcatt atggacaacc 8430 cggctacggc caatcacctc aatatccacc gcagcagcct ccgcataatc agcccggcta 8490 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ttaccccgat cccggccctg gccagcagca accaccgatg caccagccac caacgcgtcc 8550 aaatca <210〉 33 <211〉 20 <212>核酸 <220>用於構築乳酸醱酵短桿菌P d h A基因L A增幅質體的引子 <400> 33 aat gcc agg agt caa cac cc 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -1 〇7 _ 1247805 A7 B7 五、發明説明（） <210> 34 <211〉 20 <212>核酸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <220>用於構築乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A增幅質體的引子 <400> 34 aca tgg aac agg caa ttc gc <210〉 35 <211> 28 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400> 35 cgt ccc ggg ctg taa aac aaa tct teg g <210> 36 <211〉 27 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400> 36 ate ccc ggg ctt acc acc aag ttt tgc 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 37 <211> 30 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400> 37 ctt atg cgt tgc cac att cgt gca ctt egg <210> 38 <211> 40 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 -108- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1247805 A7 __ B7 五、發明説明（） <400〉 38 gcg ttg acc cat teg tgc act teg gtg tgc tat aat tag g (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 39 <211〉 40 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400> 39 gcg ttg cca cat teg tgc act teg gtg tgc tat aat tag g <210> 40 <211〉 38 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400〉 40 ttt taa aac gtt ctg gag aag act cct gga gta ate eg <210〉 41 <211〉 20 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400〉 41 ega tet tgc ett ege gtg cc 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 42 <211〉 30 <212>核酸 <400> 42 agaccgccgg agtatgcaag aaegatgegg <210> 43 <211〉 30 <212>核酸 -109- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1247805 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） <400> 43 gacttcacca tcaatcatct tcttcaggta <210〉 44 <211〉 30 <212>核酸 <400> 44 accttcgacc agaccctggc taagggcttt <210> 45 <211〉 30 <212>核酸 <400〉 45 gctaacaagc 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<212>核酸 <400> 56 gcgttaccca gagctggatc ctcgg <210> 57 <211〉 16 <212>核酸 <400> 57 cagttgtggc tgatcg <210> 58 <211〉 17 <212>核酸 <400> 58 ctttcccaga ctctggc <210> 59 <211〉 21 <212>核酸 <400〉 59 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -112- 1247805 A7 B7 五、發明説明（） gctataattt gacgtgagca t <210〉 60 <211〉 25 <212>核酸 <400> 60 gctcacgtca aattatagca gtgtc <210> 61 <211〉 54 <212>核酸 <400> 61 ttgttgtcat tctgtgcgac actgctataa tttgaacgtg agcagttaac agcc <210> 62 <211〉 63 <212>核酸 <400〉 62 gttaactgct cacgttcaaa ttatagcaft gtcgcacaga atgacaacaa agaattaaaa ttg <210〉 63 <211〉 25 <212>核酸 <400〉 63 gctagcctcg ggagctctct aggag <210> 64 <211〉 25 <212>核酸 <400> 64 gatctttccc agactctggc cacgc 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝一-I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ，寶 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 113

Claims (1)

  1. 年月 A8 BB C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍1 附件（A): 第88 1 1 6544號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國94年8月15日修正 1· 一種藉由醱酵產製麩胺酸之方法，其包含下述之步 驟： a) 藉由基因重組於棒狀桿菌之染色體上的麩胺酸脫氫 酶（GDH )基因之啓動子序列中導入突變以使該啓動子序 列接近一致序列’以得到具有改良之胺基酸生產力之棒狀 桿菌； b) 於培養基中培養所得到之棒狀桿菌並因此於該培養 基中累積胺基酸；及 c) 自該培養基中收集該胺基酸， 其中該細菌之GDH基因的突變之啓動子序列具有至少 1個選自下述之序列： i ) 選自位於-35 區域之 TTGTCA、TTGACA 或 TTGCCA序歹ij以替代野生型序歹ij TGGTCA ; ii) 位於-10區域之TATAAT序列以替代野生型序列 CATAAT； iii) 位於-35區域之TGGTCA序列以替代野生型序列 丁GG丁CA和位方令一 10區域之丁ATAAT序歹丨J以替代野生型序 歹 1J CATAAT ;及 i v ) i )和i i )之組合。 2. 一種源自棒狀桿菌的經分離之麩胺酸脫氫酶 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-1 - (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 訂 41 1247805 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍2 (GDH )基因，其具有啓動子，該啓動子含有至少1個選 自下述之序列： i )選自位於一35 區域之 TTGTCA 、 TTGACA或 TTGCCA序歹!]以替代野生型序歹！] TGGTCA ; ii) 位於-10區域之TATAAT序歹!]以替代野生型序歹[] CATAAT； iii) 位於—35區域之TGGTCA序歹IJ以替代野生型序歹!J TGGTCA和位於-10區域之TATAAT序歹[J以替代野生型序 列 CATAAT ;及 i v ) i )和i i )之組合。 -----1--------丁 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) LP 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐）-2 -
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