KR102269639B1

KR102269639B1 - L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법

Info

Publication number: KR102269639B1
Application number: KR1020200105435A
Authority: KR
Inventors: 이영주; 김봉기; 최민진; 박석현; 한재춘
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2021-06-25
Also published as: EP4105331A4; JP2023514216A; JP2024096439A; CN115135767A; WO2021162189A1; CN115135767B; US20230136217A1; EP4105331A1

Abstract

본 발명은 L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이의 제조 방법, 이를 이용한 L-글루탐산의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 유래 기계감각적 이온 채널 유전자가 도입됨으로써 글루탐산의 배출을 강화시켜 L-글루탐산의 생산 수율이 향상되므로, 상기 변이 균주를 이용하면 보다 효과적으로 L-글루탐산을 제조할 수 있다.

Description

L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 L-글루탐산의 생산 방법{Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-glutamic acid productivity and method for preparing L-glutamic acid using the same}

본 발명은 L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 L-글루탐산의 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주로부터 유래된 기계감각적 이온 채널 유전자가 도입되어 L-글루탐산의 생산능이 증가된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이의 제조 방법, 이를 이용한 L-글루탐산의 생산 방법에 관한 것이다.

L-글루탐산은 미생물 발효에 의해 생산되는 대표적인 아미노산으로, L-글루탐산 나트륨(monosodium L-glutamate, MSG)은 음식의 전체적인 맛에 균형과 조화를 이루도록 하여 고기, 생선, 닭, 야채, 소스, 수프, 양념 등 식품의 선호도를 높여주고 소금을 30%까지 줄인 저염 식품의 맛을 증진시켜줄 수 있어 가정용 및 가공식품 생산을 위한 조미료로 널리 이용되고 있다.

L-글루탐산의 발효경로를 간단하게 살펴보면, 포도당은 주로 해당경로(EMP)를 거치게 되나 일부는 6탄당 인산경로(HMP)를 거쳐서 2분자의 피루브산(pyruvic acid)으로 대사된다. 그 중 1분자는 CO₂를 고정하여 옥살로아세트산(oxaloacetic acid)으로 되고 다른 1분자는 피루브산으로부터 아세틸코에이(acetyl CoA)와 결합하여 구연산(citric acid)으로 된다. 다시 옥살로아세트산과 구연산은 시트르산 회로(TCA cycle)로 들어가 알파-케토글루타르산(α-ketoglutaric acid)이 된다. 여기서, 알파-케토글루타르산으로부터 호박산(succinic acid)으로 산화되는 산화대사 경로가 결여되어 있고 또 이소시트레이트 디히드로겐아제(isocitrate dehydrogenase)와 글루타메이트 디히드로겐아제(glutamate dehydrogenase)가 밀접하게 관여하기 때문에 알파-케토글루타르산의 환원적 아미노산화 반응이 능률적으로 진행되어 L-글루탐산이 생성된다.

L-글루탐산 생산 시, 통상적으로 브레비박테리움(Brevibacterium)이나 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주 및 그 변이주를 이용하여 발효를 통해 생산한다. 미생물 배양에 의한 L-글루탐산의 생산량을 증가시키기 위해서는 L-글루탐산 생합성에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 방법이 이용되어 왔다. 주로, 해당 유전자의 복사수를 증가시키거나 유전자의 프로모터를 변형시켜 생합성 경로 상의 효소 활성을 조절할 수 있다. 구체적으로, pyc 유전자나 fasR과 같은 특정 유전자의 증폭이나 (미국등록특허 제6,852,516호), gdh, gltA, icd, pdh 및 argG 유전자의 프로모터(promoter) 부위를 조작하여 (미국등록특허 제6,962,805호) L-글루탐산 생산량을 증가시킨 바 있다. 이와 같이 글루탐산의 생합성 경로에 관여하는 유전자에 대해서는 대부분이 이미 알려져 있어, 글루탐산의 생산량을 높일 수 있는 새로운 유전자를 발굴하고, 이를 반영한 새로운 글루탐산 생산 균주를 개발하는 것이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 L-글루탐산의 배출을 돕는 새로운 유전자를 발굴하고, 그 유전자를 L-글루탐산 생산 균주에 도입하여 변이주를 제작함으로써 변이주의 L-글루탐산 생산능이 향상된 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

미국등록특허 제6,852,516호 미국등록특허 제6,962,805호

본 발명은 코리네박테리움 속 균주 유래 기계감각적 이온 채널(mechanosensitive ion channel) 유전자를 포함하며, L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 코리네박테리움 속 균주 유래 기계감각적 이온 채널 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 i) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 L-글루탐산 생산 배지에서 배양하는 단계; 및 ii) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배양액으로부터 L-글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 L-글루탐산의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 코리네박테리움 속 균주 유래 기계감각적 이온 채널(mechanosensitive ion channel) 유전자를 포함하며, L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이주를 제공한다.

본 발명자들은 L-글루탐산의 생산능을 향상시킬 수 있는 새로운 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 개발하고자 노력한 결과, L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 코리네박테리움 속 균주(Corynebacterium species)에서 유래된 기계감각적 이온 채널 관련 유전자를 도입함으로써 L-글루탐산의 배출을 도와 변이주의 L-글루탐산 생산성이 현저하게 향상되는 것을 확인하였다.

본 발명에서, "코리네박테리움 속 균주"는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입하고자 하는 기계감각적 이온 채널 유전자의 유래 균주로, 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데저티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 수라나래에(Corynebacterium suranareeae), 코리네박테리움 루브리칸티스(Corynebacterium lubricantis), 코리네박테리움 두사넨세(Corynebacterium doosanense), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 우테레키(Corynebacterium uterequi), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 파캔세(Corynebacterium pacaense), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 휴미레듀센스(Corynebacterium humireducens), 코리네박테리움 마리눔(Corynebacterium marinum), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스페니스코룸(Corynebacterium spheniscorum), 코리네박테리움 프레이부르겐세(Corynebacterium freiburgense), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 카니스(Corynebacterium canis), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 레날레(Corynebacterium renale), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 카스피움(Corynebacterium caspium), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris), 코리네박테리움 슈도펠라지(Corynebacaterium pseudopelargi) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.

본 발명에서, “기계감각적 이온 채널”은 박테리아뿐만 아니라 진핵생물의 세포막에 존재하는 채널로, 삼투 항상성(osmotic homeostasis)에 관여한다. 이러한 기계감각적 이온 채널을 암호화하는 유전자는 코리네박테리움 속 균주에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 데저티(Corynebacterium deserti) 유래인 것인 서열번호 1의 염기서열, 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis) 유래인 것인 서열번호 2 또는 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae) 유래인 것인 서열번호 3의 염기서열일 수 있다. 이때, 서열번호 1 내지 3의 염기서열과 상동성이 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 "상동성이 % 이상"은 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다. 또한, 기계감각적 이온 채널을 암호화하는 유전자는 자연적으로 또는 비자연적으로 (예컨대, 유전자 조작, 방사능, 화학적 처리 등) 발생된 변이가 있을 수 있으며, 이러한 변이를 통해 유전자의 기능이 약화되거나 강화될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 기계감각적 이온 채널 유전자는 서열번호 1 내지 5의 염기서열 중 어느 하나로 암호화된 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열은 코리네박테리움 데저티 유래 기계감각적 이온 채널 유전자일 수 있고, 서열번호 2의 염기서열은 코리네박테리움 크루디락티스 유래 기계감각적 이온 채널 유전자일 수 있으며, 서열번호 3 내지 5의 염기서열은 코리네박테리움 칼루나에 유래 기계감각적 이온 채널 유전자일 수 있다. 여기서, 서열번호 4 및 5의 염기서열은 코리네박테리움 칼루나에 유래 기계감각적 이온 채널 유전자의 아미노산 서열 중 107번째 아미노산이 류신(LEU)에서 알라닌(ALA) 또는 발린(VAL)으로 치환된 것을 암호화하는 것일 수 있다.

본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰의 글루탐산 배출에 관여하는 기계감각적 이온 채널 유전자와 상동성이 70% 이상 (코리네박테리움 데저티 74%, 코리네박테리움 크루디락티스 72%, 코리네박테리움 칼루나에 70%)인 염기서열을 통해 동일한 글루탐산 배출 역할을 수행할 것으로 추정하였고, 다른 글루탐산 생산용 균주에 비해 본 발명에서의 기계감각적 이온 채널 유전자가 포함된 변이주의 글루탐산 생산성이 현저히 향상된 것을 확인하였다.

본 발명에서, "생산능이 향상된" 균주는 모균주에 비해 L-글루탐산의 생산성이 증가된 것을 의미한다. 상기 모균주는 변이의 대상이 되는 야생형 또는 변이주를 의미하며, 직접 변이의 대상이 되거나 재조합된 벡터 등으로 형질전환되는 대상을 포함한다. 본 발명에 있어서, 모균주는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 또는 야생형으로부터 변이된 균주일 수 있다. 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 모균주에 비해 L-글루탐산 생산량이 5% 이상, 구체적으로는 5 내지 20% 증가되어 균주 배양액 1 ℓ 당 36 ~ 50 g의 L-글루탐산을 생산할 수 있으며, 바람직하게는 38 ~ 45 g의 L-글루탐산을 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 코리네박테리움 속 균주 유래 기계감각적 이온 채널 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 제조 방법을 제공한다.

상기 단계는 기계감각적 이온 채널 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 모균주에 형질전환 시키는 과정이다.

본 발명에서, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 상기 "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 발명에 있어서, 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합 된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptⅡ계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서, "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, 형질전환 방법의 일례로는 전기 천공 방법 (van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999) 등일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 i) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 L-글루탐산 생산 배지에서 배양하는 단계; 및 ii) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배양액으로부터 L-글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 L-글루탐산의 생산 방법을 제공한다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 코리네박테리아 속 균주에 대한 배양 배지는 공지된 문헌 (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-글루탐산을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 L-글루탐산을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 글루탐산을 회수하는 단계는 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-글루탐산을 회수하는 단계는 L-글루탐산을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 코리네박테리움 속 균주 유래 기계감각적 이온 채널 유전자가 도입됨으로써 글루탐산의 배출을 강화시켜 L-글루탐산의 생산 수율이 향상되므로, 상기 변이 균주를 이용하면 보다 효과적으로 L-글루탐산을 제조할 수 있다.

도 1은 코리네박테리움 데저티(Corynebacterium deserti) 균주로부터 유래된 기계감각적 이온 채널 유전자를 포함하는 pKmscS1 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae) 균주로부터 유래되어 107번째 아미노산 잔기가 류신(LEU)에서 알라닌(ALA)으로 치환된 기계감각적 이온 채널 유전자를 포함하는 pKmscS3-L107A 벡터의 구조를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 제조

1-1. 코리네박테리움 데저티( C. deserti ) 유래 기계감각적 이온 채널 유전자가 도입된 벡터의 제조

기계감각적 이온 채널 유전자 mscS1를 도입하기 위해, 코리네박테리움 데저티(C. deserti GIMN1.010)로부터 염색체 DNA를 분리, 정제한 후 주형으로 사용하여 하기 표 1의 프라이머 3 및 4를 이용하여 PCR (95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 30회 반복)로 증폭하였다.

증폭된 유전자를 삽입하고자 하는 벡터의 위치를 인식하는 하기 표 1의 프라이머 1 및 2, 프라이머 5 및 6을 이용하여 PCR (95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 30회 반복)로 증폭하였다. PCR 산물은 전기영동으로 각각 약 1,500 bp, 1,600 bp, 1,500 bp의 밴드를 확인하였다.

정제된 각각의 PCR 산물 (mscS1 유전자 및 벡터)은 다시 크로스오버 중합효소연쇄반응(crossover polymerase chain reaction, PCR)을 위한 주형으로 사용하여 하기 표 1의 프라이머 1 및 6을 이용하여 크로스오버 PCR 기법(Bacteriol., 179: 6228-6237,1997)으로 다시 한 번 증폭시켰다. 이후, 4.6 kb의 PCR 산물은 정제한 뒤 BamHI 제한효소 (Takara, 일본)로 절단하였고, 동일한 제한효소로 절단한 pK19mobSacB 벡터 (Gene, 145: 69-73, 1994)에 클로닝하여 mscS1 유전자 도입용 pKmscS1 벡터를 제조하였다 (도 1).

프라이머	염기서열 (5' > 3')	서열번호
프라이머 1	CGCGGATCCTCTGCCTTGCTTGCCTTGGT	6
프라이머 2	CGGCAGTCCTAAAATCATGAGCCAAGATTAGCGCTG	7
프라이머 3	CAGCGCTAATCTTGGCTCATGATTTTAGGACTGCCG	8
프라이머 4	ACGTCTGTAATCAGCGTCTTATGGGATGGACGTTGG	9
프라이머 5	CCAACGTCCATCCCATAAGACGCTGATTACAGACGT	10
프라이머 6	CGCGGATCCCCGTTGCCTGGGAGAGAAAG	11
프라이머 7	GGTGGTGAGTTCCTGGTT	12
프라이머 8	GTCAACTTCGCCTTCCTG	13

1-2. 코리네박테리움 크루디락티스( C. crudilactis ) 유래 기계감각적 이온 채널 유전자가 도입된 벡터의 제조

상기 1-1의 코리네박테리움 데저티 대신 코리네박테리움 크루디락티스(C. crudilactis strain JZ16)를 사용하고, 하기 표 2의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 동일하게 제조하여 mscS2 유전자 도입용 pKmscS2 벡터를 제조하였다.

프라이머	염기서열 (5' > 3')	서열번호
프라이머 1	CGCGGATCCTCTGCCTTGCTTGCCTTGGT	6
프라이머 2	GCGTTCACCTAAAATCATGAGCCAAGATTAGCGCTG	14
프라이머 3	CAGCGCTAATCTTGGCTCATGATTTTAGGTGAACGC	15
프라이머 4	ACGTCTGTAATCAGCGTCTTATGGGGTGGACATTGG	16
프라이머 5	CCAATGTCCACCCCATAAGACGCTGATTACAGACGT	17
프라이머 6	CGCGGATCCCCGTTGCCTGGGAGAGAAAG	11
프라이머 7	GGTGGTGAGTTCCTGGTT	12
프라이머 8	GTCAACTTCGCCTTCCTG	13

1-3. 코리네박테리움 칼루나에( C. callunae ) 유래 기계감각적 이온 채널 유전자가 도입된 벡터의 제조

상기 1-1의 코리네박테리움 데저티 대신 코리네박테리움 칼루나에(C. callunae DSM 20147)를 사용하고, 하기 표 3의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 동일하게 제조하여 mscS3 유전자 도입용 pKmscS3 벡터를 제조하였다.

프라이머	염기서열 (5' > 3')	서열번호
프라이머 1	CGCGGATCCTCTGCCTTGCTTGCCTTGGT	6
프라이머 2	ACCTCTCTATGACCTCTAGAGAGCCAAGATTAGCGCTGAA	18
프라이머 3	TTCAGCGCTAATCTTGGCTCTCTAGAGGTCATAGAGAGGT	19
프라이머 4	ACACGTCTGTAATCAGCGTCATCCCTACTGGGTGGACGTA	20
프라이머 5	TACGTCCACCCAGTAGGGATGACGCTGATTACAGACGTGT	21
프라이머 6	CGCGGATCCCCGTTGCCTGGGAGAGAAAG	11
프라이머 7	GGTGGTGAGTTCCTGGTT	12
프라이머 8	GTCAACTTCGCCTTCCTG	13

1-4. 코리네박테리움 칼루나에( C. callunae ) 유래 기계감각적 이온 채널 유전자의 아미노산 잔기 변이가 도입된 벡터의 제조

기계감각적 이온 채널 유전자 mscS3의 107번째 아미노산 잔기를 치환하여 도입하기 위해, 코리네박테리움 칼루나에(C. callunae DSM 20147)로부터 염색체 DNA를 분리, 정제한 후 주형으로 사용하여 하기 표 4의 프라이머 1 및 2, 프라이머 3 및 4를 이용하여 PCR (95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 30회 반복)로 증폭하였다.

정제된 각각의 PCR 산물 (mscS3 유전자 및 벡터)은 다시 크로스오버 중합효소연쇄반응(crossover polymerase chain reaction, PCR)을 위한 주형으로 사용하여 하기 표 4의 프라이머 1 및 4를 이용하여 크로스오버 PCR 기법 (Bacteriol., 179: 6228-6237,1997)으로 다시 한 번 증폭시켰다. 이후, 718 bp의 PCR 산물은 정제한 뒤 BamHI 제한효소 (Takara, 일본)로 절단하였고, 동일한 제한효소로 절단한 pK19mobSacB 벡터 (Gene, 145: 69-73, 1994)에 클로닝하여 mscS3 유전자의 107번째 류신 잔기를 알라닌으로 치환하는 변이 도입용 pKmscS3-L107A 벡터를 제조하였다 (도 2).

프라이머	염기서열 (5' > 3')	서열번호
프라이머 1	CGCGGATCCGGCAGCTCTCAAAGT	22
프라이머 2	GCGATGATGGATTGCGCGCCtgcACCAATGGCCGCAGAGGCAA	23
프라이머 3	TTGCCTCTGCGGCCATTGGTgcaGGCGCGCAATCCATCATCGC	24
프라이머 4	CGCGGATCCCAGCGATATCTTCTTGGGC	25
프라이머 5	GGTGGTGAGTTCCTGGTT	12
프라이머 6	GTCAACTTCGCCTTCCTG	13

1-5. 코리네박테리움 칼루나에( C. callunae ) 유래 기계감각적 이온 채널 유전자의 아미노산 잔기 변이가 도입된 벡터의 제조

상기 1-4의 프라이머 대신 하기 표 5의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 동일하게 제조하여 mscS3 유전자의 107번째 류신 잔기를 발린으로 치환하는 변이 도입용 pKmscS3-L107V 벡터를 제조하였다.

프라이머	염기서열 (5' > 3')	서열번호
프라이머 1	CGCGGATCCGGCAGCTCTCAAAGT	22
프라이머 2	TTGCCTCTGCGGCCATTGGTgttGGCGCGCAATCCATCATCGC	26
프라이머 3	GCGATGATGGATTGCGCGCCaacACCAATGGCCGCAGAGGCAA	27
프라이머 4	CGCGGATCCCAGCGATATCTTCTTGGGC	25
프라이머 5	GGTGGTGAGTTCCTGGTT	12
프라이머 6	GTCAACTTCGCCTTCCTG	13

1-6. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC11558BP 균주의 형질전환 및 변이주 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주의 형질전환을 위한 방법으로 van der Rest 등의 방법을 기본으로 수식한 일렉트로컴피턴트 셀(electrocompetent cell) 제조법을 사용하였다.

먼저, 2% 포도당이 첨가된 2YT 배지 (트립톤 16 g/ℓ, 효모추출물 10 g/ℓ, 염화나트륨 5 g/ℓ) 100 ㎖에서 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주를 1차 배양하고, 포도당을 제외한 동일 배지에 1 mg/㎖ 농도의 이소니코틴산 히드라진(isonicotinic acid hydrazine) 및 2.5% 글라이신(glycine)을 첨가하였다. 그 다음, OD₆₁₀ 값이 0.3이 되도록 종배양액을 접종한 후, 18℃, 180 rpm으로 12 ~ 16시간 배양하여 OD₆₁₀ 값이 1.2 ~ 1.4가 되도록 하였다. 얼음에서 30분간 방치한 후, 4℃, 4000 rpm으로 15분간 원심분리하였다. 그 뒤 상등액을 버리고 침전된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주를 10% 글리세롤 용액으로 4회 세척하고, 최종적으로 10% 글리세롤 용액 0.5 ㎖에 재현탁하여 컴피턴트 셀(competent cell)을 준비하였다. 전기천공(Electroporation)은 바이오-라드(Bio-Rad)사의 전기천공기(electroporator)를 사용하였다. 전기천공 큐벳 (0.2 mm)에 준비된 컴피턴트 셀과 제조된 각각의 pKmscS1, pKmscS2, pKmscS3, pKmscS3-L107A, pKmscS3-L107V 벡터를 첨가한 후, 2.5 kV, 200 Ω 및 12.5 ㎌의 조건으로 전기충격을 가하였다. 전기충격이 끝난 즉시 재생(regeneration) 배지(Brain Heart infusion 18.5 g/ℓ 및 소비톨 0.5 M 함유) 1 ㎖을 첨가하고 46℃에서 6분간 열처리하였다. 그 후 실온에서 식힌 뒤 15 ㎖ 캡 튜브로 옮겨 30℃에서 2시간 배양하고 선별 배지 (트립톤 5 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, 효모추출물 2.5 g/ℓ, Brain Heart infusion powder 18.5 g/ℓ, 아가 15 g/ℓ, 소비톨 91 g/ℓ 및 카나마이신(kanamycine) 20 ㎍/ℓ 함유)에 도말하였다. 30℃에서 72시간 배양해 생성된 콜로니는 BHI 배지에서 정지기까지 배양하여 2차 재조합을 유도했으며 10^-5 ~ 10^-7까지 희석하여 항생제가 없는 평판 (10% sucrose 함유)에 도말하여 카나마이신 내성도가 없고 10% 수크로오스가 포함된 배지에서 성장성이 있는 균주를 선별하였다. 얻어진 콜로니를 상기 표 1 내지 3의 각 프라이머 7 및 8을 이용하여 mscS1, mscS2, mscS3 유전자가 각각 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (IS1, IS2, IS3)를 확인하였고, 상기 표 4 및 5의 각 프라이머 5 및 6을 이용하여 mscS3-L107A, mscS3-L107V 유전자가 각각 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (IS3-A, IS3-V)를 확인하였다.

실험예 1. 변이주의 L-글루탐산 생산성 비교

실시예 1에서 제조된 mscS1, mscS2, mscS3 유전자 도입 변이주 (IS1, IS2, IS3)와 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주에 대해 L-글루탐산 생산성을 비교하였다.

하기 표 6과 같은 조성을 갖는 활성 평판배지(pH 7.5)에 변이주와 모균주를 각각 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 이후, 100 mL 플라스크에 하기 표 7과 같은 조성을 갖는 플라스크 배지(pH 7.6) 10 mL를 넣고, 여기에 평판배지에서 배양된 균주를 각각 1 루프(loop) 접종하여 30℃, 200 rpm으로 48시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액 중에서 L-글루탐산의 양을 측정하였고, 그 결과는 하기 표 8과 같다.

조성	함량
포도당	5 g/L
효모추출물	10 g/L
요소(urea)	3 g/L
KH₂PO₄	1 g/L
비오틴(biotin)	2 ug/L
대두가수분해물	0.1% v/v
류신(leucine)	50 mg/L
아가(agar)	20 g/L

조성	함량
포도당	70 g/L
MgSO₄. 7H₂O	0.4 g/L
요소(urea)	2 g/L
KH₂PO₄	1 g/L
대두가수분해물	1.5% v/v
(NH₄)₂SO₄	5 g/L
FeSO₄. 7H₂O	10 mg/L
MnSO₄. 5H₂O	10 mg/L
티아민(thiamin)-HCl	200 ug/L
비오틴(biotin)	2 ug/L
탄산칼슘	50 g/L

	글루탐산 생산량 (g/L)
모균주 (KCTC 11558BP)	35.3
변이주 (IS1)	38.2
변이주 (IS2)	37.9
변이주 (IS3)	38.4

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 IS1, IS2, IS3는 코리네박테리움 데저티(C. deserti) 유래 mscS1, 코리네박테리움 크루디락티스(C. crudilactis) 유래 mscS2, 코리네박테리움 칼루나에(C. callunae) 유래 mscS3 유전자가 각각 도입되지 않은 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주에 비해 L-글루탐산의 생산성이 각각 약 8%, 7%, 9%씩 증가한 것으로 확인되었다.

실험예 2. 아미노산 잔기의 치환 여부에 따른 변이주의 L-글루탐산 생산성 비교

실시예 1에서 제조된 mscS3, mscS3-L107A, mscS3-L107V 유전자 도입 변이주 (IS3, IS3-A, IS3-V)와 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주에 대해 L-글루탐산 생산성을 비교하였다.

실험예 1과 동일한 방법으로 균주를 배양하여 L-글루탐산의 양을 측정하였고, 그 결과는 하기 표 9와 같다.

	글루탐산 생산량 (g/L)
모균주 (KCTC 11558BP)	35.3
변이주 (IS3)	38.4
변이주 (IS3-A)	39.7
변이주 (IS3-V)	36.8

상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 IS3, IS3-A, IS3-V는 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주에 비해 L-글루탐산의 생산성이 각각 약 9%, 12%, 4%씩 증가한 것으로 확인되었다.

특히, 107번째 아미노산 잔기가 류신에서 알라닌으로 치환된 경우 (IS3-A)에는 아미노산 잔기가 치환되지 않은 경우 (IS3), 류신에서 발린으로 치환된 경우 (IS3-V)에 비해 L-글루탐산의 생산성이 증가한 것으로 나타나, 코리네박테리움 칼루나에(C. callunae) 유래 mscS3 유전자의 107번째 아미노산 잔기가 글루탐산 생산능에 관여하는 중요한 위치임을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-glutamic acid productivity and method for preparing L-glutamic acid using the same <130> PN190487-P1 <150> KR 10-2020-0017264 <151> 2020-02-12 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1635 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Corynebacterium deserti GIMN1.010 <400> 1 tgggatggac gttggcgcag ttgtctgcac attcgctgtt ggtgctgctg aggtcgttgt 60 ggcctgtgag gttgtagccg gcgtcgtctg aggtgtttga ggcgtctgct cggttggctc 120 ggaggtggca ccggcagtcg gcggggtgcc ggtttcctgg ttccaggttt caggctgcgt 180 atcgacgctt gactccgtcg gaatcacttc cggtgtgaaa ggttcaggcg tgggagtaaa 240 cgtctctaac ggggtggttg ttggtggaat ggtttccccg gttgtttgcg acgtcggcgc 300 aagccatccg ctggagccct gccagttgtc cccggtttcc actgtcatgc ctttaagtaa 360 cagcaagcta ccgaggacca ccaatagaag tgaggtgctc atgcgtacgc gaccgcccaa 420 agataaaatc ttttgccaac gcttggggta gtaatcagta cggaagaatg aacgcagaga 480 atgatctttg tcggattctt ccttcgctgg gtcatcctcg tcccgtactt cttgttccaa 540 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actagcagga agaacgcaac aatctgcacg atatagacac ccacgccagc 1440 aaaagccagc tggtttttcg acgtgtcagc atctgcgttt tcttccacgc gacgcttgat 1500 cactcgcatg gcgagcctgc cgattcgtgg gattaaaaag gctaaaacca ggataattgc 1560 gaggtcaagg ccagtctcga cgatccaatt ccacaatgaa tagagaatgt acctaaccgg 1620 cagtcctaaa atcat 1635 <210> 2 <211> 1566 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Corynebacterium crudilactis strain JZ16 <400> 2 atgattttag gtgaacgcat ctctttcctt ctttattcat tgtggaattg gattacaaat 60 acaggcattg accttgcaat catcctggtt cttggctttt taatccctcg tttcggccgg 120 attggcatgc ggattatcaa acgccgagtg gaatccaccg ccgatactga cacgaccaaa 180 aaccaactcg cctttgcggg cgtaggcctt tatatcgcac aaatcgtggc atttttcatg 240 cttgcaattg cagcgatgca gctctttggt ttctctctgg caggtgccgc catccccgcc 300 accattgctt ctgctgccat tggtctaggc gcgcaatcca tcgttgcgga tttcttggct 360 ggatttttca tcctgacgga aaaacaattt ggtgtaggtg actgggtgcg cttcgaaggc 420 aacggcatca tcgttgaagg cactgtcatt gaaatcacca tgcgtgccac aaaaatccgc 480 acgattgctc aacaaacggt 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540 aactggtcgc gcgcggtggt tgtcatcccg atcccaatgc tgggttccga gaatatttct 600 gaggttatta cccgctcgga gcaggcaact cgccgcgcat tggcccaaga agatatcgct 660 gcggaggtac ttggtgagct tgatgtacac ccggcaattg atgtcactcc ccccaccgtt 720 gttggtatgc catggatggt aaccatgcgt ttcttggtgc aggtcaccgc tggtaatcag 780 tggttggttg aacgcgccat ccgcacccaa attattgacg agttctgggc tgagtacggc 840 tctgccacca ccacgtcagg caccctgatt gattcactta acctcgagca tgaggacccc 900 tattataggg gtgtaaaaac cccgcttgtc gacgaaaaac tggagcgaac tggcacccaa 960 ccaaaagctg cagaagacgc cagcatcgta tcgatggcag caagttccaa agatgatcca 1020 gatcccgcca ctgaggtact aagtccaggg aatccagaga aatcccttga cttggaggtg 1080 ccacatgctg aactagaatc cgagaaaccg gcggaagaaa gagccgataa ggatcatttt 1140 atcggtggct ttttccgcac cgattattat ccaaagcgct ggcaaaaagt gttgtccatt 1200 ggtggtcgag tccgtatgac cacctccatc ctgttgctta tcctgggctt tttactgtta 1260 ctcaaaggtt taacggtaca aactagcccg gaatggcagg gctcaaatgg ttggttagct 1320 ccagatactg aaaccacaac tactcaaagc tccatggttg ctcccaccac atcagagtcc 1380 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atcagagtcc 1380 actacaacta ctccaccgca gcgttccagc gtcgaaacgc gctcttctac ctctattcct 1440 gagaccagca cttttagcac cttcgacgag gaaccggcgc ccgcggagca aagctctgca 1500 gcttccacaa ccagccagca gcaacagcaa cagaccacat ctgcgccgac tacacaggag 1560 agcacgccga cctcaacggc acagccacag gcaacagtta cgtccaccca gtag 1614 <210> 5 <211> 1614 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Corynebacterium callunae DSM 20147 - L107V <400> 5 atgcccattc ccgtgcttta tttactttca cagttttggt cctgggttgt tgaaaccgga 60 ctagatcttg cgctgatttt ggtattggca tttcttattc cccgcattgg tcgtttttct 120 atgcgggtta ttaagcaccg tattgaaaac aatgcagatg ccgataccac caaaaaccaa 180 ctagcctttg ccggcgttgg agtttatatc gcgcaaataa tcgccttttt tattcttatt 240 gtttcggccc tgcaacagct cgggttttca ctagccggcg cggcgattcc cgcgacagtt 300 gcctctgcgg ccattggtgt tggcgcgcaa tccatcatcg ccgatttcct cgccggattt 360 tttatcctca cggaaaaaca attcggcgtg ggtgactggg tgcgctttga aggcaatggc 420 atcgtggtgg aaggcaccgt tattgaaatc acgatgcgtg ccacgcgcat tcgaaccatt 480 agccaagaga cggtaataat cccgaattcc acggccaagg tctgcattaa caactccaat 540 aactggtcgc gcgcggtggt tgtcatcccg atcccaatgc tgggttccga gaatatttct 600 gaggttatta cccgctcgga gcaggcaact cgccgcgcat tggcccaaga agatatcgct 660 gcggaggtac ttggtgagct tgatgtacac ccggcaattg atgtcactcc ccccaccgtt 720 gttggtatgc catggatggt aaccatgcgt ttcttggtgc aggtcaccgc tggtaatcag 780 tggttggttg aacgcgccat ccgcacccaa attattgacg agttctgggc tgagtacggc 840 tctgccacca ccacgtcagg caccctgatt gattcactta acctcgagca tgaggacccc 900 tattataggg gtgtaaaaac cccgcttgtc gacgaaaaac tggagcgaac tggcacccaa 960 ccaaaagctg cagaagacgc cagcatcgta tcgatggcag caagttccaa agatgatcca 1020 gatcccgcca ctgaggtact aagtccaggg aatccagaga aatcccttga cttggaggtg 1080 ccacatgctg aactagaatc cgagaaaccg gcggaagaaa gagccgataa ggatcatttt 1140 atcggtggct ttttccgcac cgattattat ccaaagcgct ggcaaaaagt gttgtccatt 1200 ggtggtcgag tccgtatgac cacctccatc ctgttgctta tcctgggctt tttactgtta 1260 ctcaaaggtt taacggtaca aactagcccg gaatggcagg gctcaaatgg ttggttagct 1320 ccagatactg aaaccacaac tactcaaagc tccatggttg ctcccaccac atcagagtcc 1380 actacaacta ctccaccgca gcgttccagc gtcgaaacgc gctcttctac ctctattcct 1440 gagaccagca cttttagcac cttcgacgag gaaccggcgc ccgcggagca aagctctgca 1500 gcttccacaa ccagccagca gcaacagcaa cagaccacat ctgcgccgac tacacaggag 1560 agcacgccga cctcaacggc acagccacag gcaacagtta cgtccaccca gtag 1614 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 (table 1) <400> 6 cgcggatcct ctgccttgct tgccttggt 29 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 (table 1) <400> 7 cggcagtcct aaaatcatga gccaagatta gcgctg 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 (table 1) <400> 8 cagcgctaat cttggctcat gattttagga ctgccg 36 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 (table 1) <400> 9 acgtctgtaa tcagcgtctt atgggatgga cgttgg 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 (table 1) <400> 10 ccaacgtcca tcccataaga cgctgattac agacgt 36 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 (table 1) <400> 11 cgcggatccc cgttgcctgg gagagaaag 29 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 (table 1) <400> 12 ggtggtgagt tcctggtt 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 (table 1) <400> 13 gtcaacttcg ccttcctg 18 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 (table 2) <400> 14 gcgttcacct aaaatcatga gccaagatta gcgctg 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 (table 2) <400> 15 cagcgctaat cttggctcat gattttaggt gaacgc 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 (table 2) <400> 16 acgtctgtaa tcagcgtctt atggggtgga cattgg 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 (table 2) <400> 17 ccaatgtcca ccccataaga cgctgattac agacgt 36 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 (table 3) <400> 18 acctctctat gacctctaga gagccaagat tagcgctgaa 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 (table 3) <400> 19 ttcagcgcta atcttggctc tctagaggtc atagagaggt 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 (table 3) <400> 20 acacgtctgt aatcagcgtc atccctactg ggtggacgta 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 (table 3) <400> 21 tacgtccacc cagtagggat gacgctgatt acagacgtgt 40 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 (table 4) <400> 22 cgcggatccg gcagctctca aagt 24 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 (table 4) <400> 23 gcgatgatgg attgcgcgcc tgcaccaatg gccgcagagg caa 43 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 (table 4) <400> 24 ttgcctctgc ggccattggt gcaggcgcgc aatccatcat cgc 43 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 (table 4) <400> 25 cgcggatccc agcgatatct tcttgggc 28 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 (table 5) <400> 26 ttgcctctgc ggccattggt gttggcgcgc aatccatcat cgc 43 <210> 27 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 (table 5) <400> 27 gcgatgatgg attgcgcgcc aacaccaatg gccgcagagg caa 43

Claims

L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이주로서,
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 코리네박테리움 데저티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis) 및 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae)로 이루어진 군에서 선택된 1종의 균주에서 유래한 기계감각적 이온 채널 유전자(mechanosensitive ion channel)를 포함하는 것이고,
상기 기계감각적 이온 채널 유전자는 서열번호 1 내지 5의 염기서열 중 하나로 암호화된 것인,
코리네박테리움 글루타미쿰 변이주.
삭제
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청구항 1의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 제조 방법으로서,
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 제조 방법은 코리네박테리움 데저티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis) 및 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae)로 이루어진 군에서 선택된 1종의 균주에서 유래한 기계감각적 이온 채널 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 것이고,
상기 기계감각적 이온 채널 유전자는 서열번호 1 내지 5의 염기서열 중 하나로 암호화된 것인,
코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 제조 방법.
i) 청구항 1의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 L-글루탐산 생산 배지에서 배양하는 단계; 및
ii) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배양액으로부터 L-글루탐산을 회수하는 단계
를 포함하는 L-글루탐산의 생산 방법.