JP2763054B2 - コリネ型細菌の遺伝子組換え方法 - Google Patents
コリネ型細菌の遺伝子組換え方法Info
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- JP2763054B2 JP2763054B2 JP7005223A JP522395A JP2763054B2 JP 2763054 B2 JP2763054 B2 JP 2763054B2 JP 7005223 A JP7005223 A JP 7005223A JP 522395 A JP522395 A JP 522395A JP 2763054 B2 JP2763054 B2 JP 2763054B2
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- JP
- Japan
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- gene
- chromosome
- plasmid
- dna fragment
- bacterium
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-
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アミノ酸などの有用物
質の発酵生産に用いられているコリネ型細菌の染色体遺
伝子を改変し、その遺伝的形質を変換する方法に関する
もので、アミノ酸などの発酵生産等に有用な微生物の育
種に利用可能なものである。
質の発酵生産に用いられているコリネ型細菌の染色体遺
伝子を改変し、その遺伝的形質を変換する方法に関する
もので、アミノ酸などの発酵生産等に有用な微生物の育
種に利用可能なものである。
【０００２】
【従来の技術】コリネ型細菌の遺伝的形質を遺伝子工学
的手法で改変し、アミノ酸など有用物質の発酵生産に利
用しようという試みは、数多くなされている。しかし、
それらは皆、コリネ型細菌内で自律増殖できるプラスミ
ドをベクターとして利用したものである。(特開昭58-19
2900,特開昭58-216199等がある)
的手法で改変し、アミノ酸など有用物質の発酵生産に利
用しようという試みは、数多くなされている。しかし、
それらは皆、コリネ型細菌内で自律増殖できるプラスミ
ドをベクターとして利用したものである。(特開昭58-19
2900,特開昭58-216199等がある)
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】プラスミドは染色体外
で増殖・機能するので、プラスミドDNAを用いて菌の遺
伝的性質を改変する場合、宿主である菌の染色体までそ
の改変を及ぼすことができない。とくに、欠失、変異
等、宿主菌のDNAの性質が問題となる場合には、計画的
な対策が立てられなかった。これまでは、変異処理剤な
どで宿主菌を処理し、ランダムに変異が入った菌から目
的通り改変された株を選択する方策が用いられていた
が、大きな労力と困難を伴っていた。また、プラスミド
DNAを用いた場合は、プラスミドが不安定で脱落し、十
分な発現が得られない、または、目的遺伝子を含むプラ
スミドが多コピー存在することにより、発現が過剰にな
り、菌の生育、物質生産に悪影響を与える、などの問題
点がしばしば生じていた。本発明は、染色体上の特定の
遺伝子を計画的に改変し、また、定まったコピー数の遺
伝子を安定に染色体上に固定することにより、これら問
題点を解決しようというものである。
で増殖・機能するので、プラスミドDNAを用いて菌の遺
伝的性質を改変する場合、宿主である菌の染色体までそ
の改変を及ぼすことができない。とくに、欠失、変異
等、宿主菌のDNAの性質が問題となる場合には、計画的
な対策が立てられなかった。これまでは、変異処理剤な
どで宿主菌を処理し、ランダムに変異が入った菌から目
的通り改変された株を選択する方策が用いられていた
が、大きな労力と困難を伴っていた。また、プラスミド
DNAを用いた場合は、プラスミドが不安定で脱落し、十
分な発現が得られない、または、目的遺伝子を含むプラ
スミドが多コピー存在することにより、発現が過剰にな
り、菌の生育、物質生産に悪影響を与える、などの問題
点がしばしば生じていた。本発明は、染色体上の特定の
遺伝子を計画的に改変し、また、定まったコピー数の遺
伝子を安定に染色体上に固定することにより、これら問
題点を解決しようというものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決すべく鋭意検討を行った結果、コリネ型細菌中で
自律増殖可能なプラスミドDNAの複製起点を、培養温度
を上昇させることにより複製不能になる、温度感受性変
異型の複製起点に改変した。この温度感受性複製起点を
もつプラスミドに目的遺伝子を接続し、コリネ型細菌に
導入し、プラスミドを保持した菌株を10〜27℃、好まし
くは20〜25℃にて培養後、31〜37℃、好ましくは33〜36
℃にて培養してプラスミドを除去し、染色体へ遺伝子が
組み込まれた株を選択する。この際、プラスミド上にあ
る薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が染色体上に組
み込まれ、プラスミドを保持しなくてもマーカー遺伝子
の発現により薬剤耐性などの形質を示すことで組み込み
株の選択ができる。この段階では、染色体上に、ベクタ
ープラスミドDNAと目的遺伝子が、同時に組み込まれて
いるが、組み込み株から薬剤耐性などのマーカー遺伝子
の形質の除去を指標にして、再び相同組換えを起こし
て、ベクター部分が染色体上から除去された株を選択す
ることができる。このとき、目的遺伝子と対応する宿主
の染色体遺伝子が同時に除去されプラスミドにて導入し
た遺伝子と置き変わる遺伝子置換を起こすことが出来
る。
を解決すべく鋭意検討を行った結果、コリネ型細菌中で
自律増殖可能なプラスミドDNAの複製起点を、培養温度
を上昇させることにより複製不能になる、温度感受性変
異型の複製起点に改変した。この温度感受性複製起点を
もつプラスミドに目的遺伝子を接続し、コリネ型細菌に
導入し、プラスミドを保持した菌株を10〜27℃、好まし
くは20〜25℃にて培養後、31〜37℃、好ましくは33〜36
℃にて培養してプラスミドを除去し、染色体へ遺伝子が
組み込まれた株を選択する。この際、プラスミド上にあ
る薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が染色体上に組
み込まれ、プラスミドを保持しなくてもマーカー遺伝子
の発現により薬剤耐性などの形質を示すことで組み込み
株の選択ができる。この段階では、染色体上に、ベクタ
ープラスミドDNAと目的遺伝子が、同時に組み込まれて
いるが、組み込み株から薬剤耐性などのマーカー遺伝子
の形質の除去を指標にして、再び相同組換えを起こし
て、ベクター部分が染色体上から除去された株を選択す
ることができる。このとき、目的遺伝子と対応する宿主
の染色体遺伝子が同時に除去されプラスミドにて導入し
た遺伝子と置き変わる遺伝子置換を起こすことが出来
る。
【０００５】尚、染色体への遺伝子組み込み方法として
は、ここに示した方法と並んで、複製できないDNAを導
入し、組換えを起こした株を選択する方法もあるが、温
度感受性プラスミドを用いる方法は、目的遺伝子をプラ
スミド状で菌体内で増殖させ、また、プラスミドを保持
した菌株をも増殖させうるので、複製できないDNAを導
入して組換えを起こさせる方法よりはるかに高頻度での
組換えが可能である。よって、宿主の形質転換頻度やDN
Aの分解の影響も、組換え体の出現頻度にはほとんど影
響せず、幅広い宿主で同様に遺伝子組換えが行える一般
性の高い方法である、という特徴がある。
は、ここに示した方法と並んで、複製できないDNAを導
入し、組換えを起こした株を選択する方法もあるが、温
度感受性プラスミドを用いる方法は、目的遺伝子をプラ
スミド状で菌体内で増殖させ、また、プラスミドを保持
した菌株をも増殖させうるので、複製できないDNAを導
入して組換えを起こさせる方法よりはるかに高頻度での
組換えが可能である。よって、宿主の形質転換頻度やDN
Aの分解の影響も、組換え体の出現頻度にはほとんど影
響せず、幅広い宿主で同様に遺伝子組換えが行える一般
性の高い方法である、という特徴がある。
【０００６】コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野生株
の例としては次のようなものがあげられるが、これ以外
にも、ここで構築した温度感受性複製起点が機能し、プ
ラスミドが複製可能な菌なら、全て宿主として利用でき
る。 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354
の例としては次のようなものがあげられるが、これ以外
にも、ここで構築した温度感受性複製起点が機能し、プ
ラスミドが複製可能な菌なら、全て宿主として利用でき
る。 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354
【０００７】
【実施例】以下、実施例に基づき、発明の内容を詳細に
説明する。
説明する。
【０００８】（実施例１ 温度感受性複製起点の取得
と、遺伝子組み込み用プラスミドベクターの構築）
と、遺伝子組み込み用プラスミドベクターの構築）
【０００９】＜pHK4の構築＞まず、温度感受性複製起点
の取得の材料として、エシェリシア・コリと、コリネ型
細菌の双方の菌体中で自律増殖可能なプラスミドベクタ
ー、pHK4を作成した。エシェリシア・コリとコリネ型細
菌中の双方で自律増殖可能なプラスミドベクターは、い
くつか報告がある。ここでは、pAJ1844(特開昭58-21619
9参照)と、pHSG298(S.Takeshita et al : Gene 61,63-7
4(1987)参照)から、新規のシャトルベクターpHK4を構築
した。pAJ1844を制限酵素Sau3AIで部分切断し、制限酵
素BamHIで完全切断したpHSG298と連結した。連結後のDN
Aをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036
(FERM-P7559)に形質転換した。形質転換の方法は、電気
パルス法(特開平2-207791参照)を用いた。形質転換体の
選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Gプレート
(グルコース5g、ポリペプトン10g、酵母エキス10g、NaCl5
g、DL-メチオニン0.2g、寒天15gを純水1lに含む。pH7.2)
にて行った。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、
大きさの最も小さいものを選択し、pHK4と命名した。こ
のプラスミドは、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌
中で自律増殖でき、宿主にカナマイシン耐性を付与す
る。
の取得の材料として、エシェリシア・コリと、コリネ型
細菌の双方の菌体中で自律増殖可能なプラスミドベクタ
ー、pHK4を作成した。エシェリシア・コリとコリネ型細
菌中の双方で自律増殖可能なプラスミドベクターは、い
くつか報告がある。ここでは、pAJ1844(特開昭58-21619
9参照)と、pHSG298(S.Takeshita et al : Gene 61,63-7
4(1987)参照)から、新規のシャトルベクターpHK4を構築
した。pAJ1844を制限酵素Sau3AIで部分切断し、制限酵
素BamHIで完全切断したpHSG298と連結した。連結後のDN
Aをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036
(FERM-P7559)に形質転換した。形質転換の方法は、電気
パルス法(特開平2-207791参照)を用いた。形質転換体の
選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Gプレート
(グルコース5g、ポリペプトン10g、酵母エキス10g、NaCl5
g、DL-メチオニン0.2g、寒天15gを純水1lに含む。pH7.2)
にて行った。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、
大きさの最も小さいものを選択し、pHK4と命名した。こ
のプラスミドは、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌
中で自律増殖でき、宿主にカナマイシン耐性を付与す
る。
【００１０】＜温度感受性複製起点をもつプラスミドの
取得と遺伝子組み込み用プラスミドベクターの構築＞pH
K4をin vitroでヒドロキシルアミン処理した。ヒドロキ
シルアミン処理は、公知の方法（G.O.Humpherys et al
:Molec.gen.Genet. 145, 101-108 (1976)などがある）
によった。処理後のDNAを回収し、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムAJ12036株を形質転換した。形
質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Gプレー
ト上で低温(20℃)にて選択した。出現した形質転換体
を、同様の選択プレートにレプリカし、高温(34℃)にて
培養した。高温でカナマイシンを含む選択プレート上で
生育できない株3株を取得した。この株から、プラスミ
ドを回収し、pHS4、pHS22、pHS23と命名した。pHS4をプラ
スミドとして保持するエシェリシア・コリAJ12570(FERM
-BP3523)及びpHS22、pHS23を各々保持するエシェリシア
・コリよりプラスミドを回収し、コリネ型細菌中での複
製起点であるpAJ1844由来の遺伝子断片を、制限酵素Bam
HIおよびKpnIで切り出し、エシェリシア・コリ用のベク
ターであるpHSG398(S.Takeshita et al : Gene 61,63-7
4(1987)参照)に接続した。この、pHS4由来の複製起点を
有するプラスミドをpHSC4、pHS22由来の複製起点を有す
るプラスミドをpHSC22、pHS23由来の複製起点を有する
プラスミドをpHSC23と命名した。また、同様な方法でpH
K4よりコリネ型細菌中での複製起点をpHSG398に移し、p
HS4を作製した。pHC4、pHSC4、pHSC22、pHSC23は、コリ
ネ型細菌、及びエシェリシア・コリ中で自律増殖して、
宿主にクロラムフェニコール耐性を付与する。また、pH
SC4、pHSC22、pHSC23のコリネ型細菌で機能する複製起
点が温度感受性変異型であることを確認した。pHSC4を
プラスミドとして保持するエシェリシア・コリAJ12571
(FERM-BP3524)、及びpHSC22をプラスミドとして保持す
るエシェリシア・コリAJ12615(FERM-BP3530)、pHSC23を
プラスミドとして保持するエシェリシア・コリAJ12616
(FERM-BP3531)、pHC4をプラスミドとして保持するエシ
ェリシア・コリAJ12617(FERM-BP3532)より、プラスミド
を調製し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ12036に導入し、非選択培地での高温(34℃)培養によ
るプラスミドの保持性の変化を観察した。pHSC4、pHSC2
2、pHSC23のAJ12036中での複製は、高温培養で、ほぼ完
全に阻止された。(図1-1,2,3,4)
取得と遺伝子組み込み用プラスミドベクターの構築＞pH
K4をin vitroでヒドロキシルアミン処理した。ヒドロキ
シルアミン処理は、公知の方法（G.O.Humpherys et al
:Molec.gen.Genet. 145, 101-108 (1976)などがある）
によった。処理後のDNAを回収し、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムAJ12036株を形質転換した。形
質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Gプレー
ト上で低温(20℃)にて選択した。出現した形質転換体
を、同様の選択プレートにレプリカし、高温(34℃)にて
培養した。高温でカナマイシンを含む選択プレート上で
生育できない株3株を取得した。この株から、プラスミ
ドを回収し、pHS4、pHS22、pHS23と命名した。pHS4をプラ
スミドとして保持するエシェリシア・コリAJ12570(FERM
-BP3523)及びpHS22、pHS23を各々保持するエシェリシア
・コリよりプラスミドを回収し、コリネ型細菌中での複
製起点であるpAJ1844由来の遺伝子断片を、制限酵素Bam
HIおよびKpnIで切り出し、エシェリシア・コリ用のベク
ターであるpHSG398(S.Takeshita et al : Gene 61,63-7
4(1987)参照)に接続した。この、pHS4由来の複製起点を
有するプラスミドをpHSC4、pHS22由来の複製起点を有す
るプラスミドをpHSC22、pHS23由来の複製起点を有する
プラスミドをpHSC23と命名した。また、同様な方法でpH
K4よりコリネ型細菌中での複製起点をpHSG398に移し、p
HS4を作製した。pHC4、pHSC4、pHSC22、pHSC23は、コリ
ネ型細菌、及びエシェリシア・コリ中で自律増殖して、
宿主にクロラムフェニコール耐性を付与する。また、pH
SC4、pHSC22、pHSC23のコリネ型細菌で機能する複製起
点が温度感受性変異型であることを確認した。pHSC4を
プラスミドとして保持するエシェリシア・コリAJ12571
(FERM-BP3524)、及びpHSC22をプラスミドとして保持す
るエシェリシア・コリAJ12615(FERM-BP3530)、pHSC23を
プラスミドとして保持するエシェリシア・コリAJ12616
(FERM-BP3531)、pHC4をプラスミドとして保持するエシ
ェリシア・コリAJ12617(FERM-BP3532)より、プラスミド
を調製し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ12036に導入し、非選択培地での高温(34℃)培養によ
るプラスミドの保持性の変化を観察した。pHSC4、pHSC2
2、pHSC23のAJ12036中での複製は、高温培養で、ほぼ完
全に阻止された。(図1-1,2,3,4)
【００１１】＜温度感受性複製起点の塩基配列の決定＞
野生型の複製起点をもつプラスミドpHC4、および温度感
受性型の複製起点をもつプラスミドpHSC4、pHSC22、pHS
C23のコリネ型細菌中での複製起点部分の塩基配列を決
定した。塩基配列決定の方法は、サンガーらの方法(F.S
anger et al :Proc.Natl.Acad.Sci. 74,5463(1977)など
がある)によった。その結果、野生型複製起点と、温度
感受性変異型複製起点の間には、2〜4個の塩基置換があ
ることが判明した。pHSC4に含まれるコリネ型細菌中で
機能する温度感受性複製起点部分の塩基配列を配列表１
に、pHSC22に含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感
受性複製起点部分の塩基配列を配列表２に、pHSC23に含
まれるコリネ型細菌中で機能する温度感受性複製起点部
分の塩基配列を配列表３に、pHC4に含まれるコリネ型細
菌中で機能する野生型の複製起点部分の塩基配列を配列
表４に示す。温度感受性複製起点部分の変異点しそれぞ
れ以下の通りである。pHSC4については、配列上の1542
番目のＧがＡに変異しており、1545番目のＧがＡに変異
している。pHSC22については、配列上の683番目のＣが
Ｔに変異しており、1172番目のＣがＴに変異しており、
1614番目のＣがＴに変異している。pHSC23については、
配列上の756番目のＧがＡに変異しており、1560番目の
ＧがＡに変異しており、1667番目のＣがＴに変異してお
り、1684番目のＣがＴに変異している。
野生型の複製起点をもつプラスミドpHC4、および温度感
受性型の複製起点をもつプラスミドpHSC4、pHSC22、pHS
C23のコリネ型細菌中での複製起点部分の塩基配列を決
定した。塩基配列決定の方法は、サンガーらの方法(F.S
anger et al :Proc.Natl.Acad.Sci. 74,5463(1977)など
がある)によった。その結果、野生型複製起点と、温度
感受性変異型複製起点の間には、2〜4個の塩基置換があ
ることが判明した。pHSC4に含まれるコリネ型細菌中で
機能する温度感受性複製起点部分の塩基配列を配列表１
に、pHSC22に含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感
受性複製起点部分の塩基配列を配列表２に、pHSC23に含
まれるコリネ型細菌中で機能する温度感受性複製起点部
分の塩基配列を配列表３に、pHC4に含まれるコリネ型細
菌中で機能する野生型の複製起点部分の塩基配列を配列
表４に示す。温度感受性複製起点部分の変異点しそれぞ
れ以下の通りである。pHSC4については、配列上の1542
番目のＧがＡに変異しており、1545番目のＧがＡに変異
している。pHSC22については、配列上の683番目のＣが
Ｔに変異しており、1172番目のＣがＴに変異しており、
1614番目のＣがＴに変異している。pHSC23については、
配列上の756番目のＧがＡに変異しており、1560番目の
ＧがＡに変異しており、1667番目のＣがＴに変異してお
り、1684番目のＣがＴに変異している。
【００１２】（実施例２ 遺伝子組み込み用プラスミド
ベクターを用いたブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム染色体遺伝子へのプラスミド上のDNAの組み込み
と、染色体上への遺伝子組み込み）チロシンおよびフェ
ニルアラニンによるフィードバック阻害が実質的に解除
されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの３
−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソネート−７−ホス
フェートシンターゼ遺伝子（以下、「ＤＳ遺伝子」と記
す）は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
野生型の株に、フェニルアラニンのアナログであるｍ−
フロロフェニルアラニンの耐性と、フェニルアラニンお
よびチロシンの生産能を付与することが知られている
（特開昭61-124375参照）。この性質を指標として、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型株の染
色体へのＤＳ遺伝子の相同組換えによる導入を行った。
ベクターを用いたブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム染色体遺伝子へのプラスミド上のDNAの組み込み
と、染色体上への遺伝子組み込み）チロシンおよびフェ
ニルアラニンによるフィードバック阻害が実質的に解除
されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの３
−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソネート−７−ホス
フェートシンターゼ遺伝子（以下、「ＤＳ遺伝子」と記
す）は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
野生型の株に、フェニルアラニンのアナログであるｍ−
フロロフェニルアラニンの耐性と、フェニルアラニンお
よびチロシンの生産能を付与することが知られている
（特開昭61-124375参照）。この性質を指標として、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型株の染
色体へのＤＳ遺伝子の相同組換えによる導入を行った。
【００１３】＜遺伝子組み込み用プラスミドの作製＞チ
ロシンおよびフェニルアラニンによるフィードバック阻
害が実質的に解除されたＤＳ遺伝子を含むプラスミドで
あるpAR-1（特開昭61-124375参照）をSau3AIにて部分分
解し、制限酵素BamHIで完全分解したpHK4と接続する。
これをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12
036株に電気パルス法にて導入した。500μg/mlのｍ−フ
ルオロフェニルアラニンを含む最少培地プレート(グル
コース20g、(NH4)2SO45g、尿素2g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O0.
5g、FeSO4・7H2O10mg、MnSO4・4H2O10mg、ビオチン50μg、サ
イアミン塩酸塩2000μg、寒天15gを水1lに含む。pH6.6)
上で形質転換体を選択した。形質転換体よりプラスミド
を調製し、大きさの最も小さいものを選択した。このプ
ラスミドを制限酵素BamHI及びSalIで切断し、ＤＳ遺伝
子を含む1.9キロベースの断片を回収した。この断片
を、BamHIおよびSalIで切断したpHSC4と接続した。作製
したプラスミドを、pHSC4Dと命名した。
ロシンおよびフェニルアラニンによるフィードバック阻
害が実質的に解除されたＤＳ遺伝子を含むプラスミドで
あるpAR-1（特開昭61-124375参照）をSau3AIにて部分分
解し、制限酵素BamHIで完全分解したpHK4と接続する。
これをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12
036株に電気パルス法にて導入した。500μg/mlのｍ−フ
ルオロフェニルアラニンを含む最少培地プレート(グル
コース20g、(NH4)2SO45g、尿素2g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O0.
5g、FeSO4・7H2O10mg、MnSO4・4H2O10mg、ビオチン50μg、サ
イアミン塩酸塩2000μg、寒天15gを水1lに含む。pH6.6)
上で形質転換体を選択した。形質転換体よりプラスミド
を調製し、大きさの最も小さいものを選択した。このプ
ラスミドを制限酵素BamHI及びSalIで切断し、ＤＳ遺伝
子を含む1.9キロベースの断片を回収した。この断片
を、BamHIおよびSalIで切断したpHSC4と接続した。作製
したプラスミドを、pHSC4Dと命名した。
【００１４】＜組み込み用プラスミドのブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムへの導入と染色体への組み
込み株の選択＞pHSC4Dをプラスミドとして含むエシェリ
シア・コリAJ12572(FERM-BP3525)よりプラスミドpHSC4D
を調製し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ12036株に電気パルス法で導入した。形質転換体の選
択は、5μg/mlのクロラムフェニコールを含むM-CM2Gプ
レートで、20℃にて行った。導入後、得られた株をM-CM
2Gプレート培地にて培養した後、5μg/mlのクロラムフ
ェニコールを含むM-CM2Gプレートに、プレートあたり10
3〜105cfuとなるよう希釈し、塗布した。プレートを34
℃にて培養した。温度感受性プラスミドを保持した株
は、この温度ではプラスミドの複製が阻害されるため、
クロラムフェニコール感受性となり、コロニーを形成で
きないが、染色体にプラスミドDNAを組み込んだ株は、
コロニーを形成するため、選択することができた。相同
的な組換えにより、宿主染色体のＤＳ遺伝子の近傍に、
ベクタープラスミド由来の変異型ＤＳ遺伝子が組み込ま
れていることを、サザンハイブリダイゼーション、およ
び組み込み菌のｍ−フロロフェニルアラニンの耐性によ
り確認した。
ウム・ラクトファーメンタムへの導入と染色体への組み
込み株の選択＞pHSC4Dをプラスミドとして含むエシェリ
シア・コリAJ12572(FERM-BP3525)よりプラスミドpHSC4D
を調製し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ12036株に電気パルス法で導入した。形質転換体の選
択は、5μg/mlのクロラムフェニコールを含むM-CM2Gプ
レートで、20℃にて行った。導入後、得られた株をM-CM
2Gプレート培地にて培養した後、5μg/mlのクロラムフ
ェニコールを含むM-CM2Gプレートに、プレートあたり10
3〜105cfuとなるよう希釈し、塗布した。プレートを34
℃にて培養した。温度感受性プラスミドを保持した株
は、この温度ではプラスミドの複製が阻害されるため、
クロラムフェニコール感受性となり、コロニーを形成で
きないが、染色体にプラスミドDNAを組み込んだ株は、
コロニーを形成するため、選択することができた。相同
的な組換えにより、宿主染色体のＤＳ遺伝子の近傍に、
ベクタープラスミド由来の変異型ＤＳ遺伝子が組み込ま
れていることを、サザンハイブリダイゼーション、およ
び組み込み菌のｍ−フロロフェニルアラニンの耐性によ
り確認した。
【００１５】（実施例３ 染色体組み込み菌よりの、遺
伝子置換株の取得）相同的組換えにより、染色体上にＤ
Ｓ遺伝子を組み込んだAJ12573株(FERM-BP3526)より、ま
ず、クロラムフェニコール感受性株を取得した。組み込
み株をM-CM2Gプレートに希釈、塗布し、34℃で培養す
る。コロニー形成後、5μg/mlのクロラムフェニコール
を含むM-CM2Gプレートにレプリカし、34℃で培養する。
このとき、クロラムフェニコール感受性になった株を取
得した。クロラムフェニコール感受性になった株から、
クロラムフェニコール感受性かつｍ−フロロフェニルア
ラニンに耐性な株を選択した。クロラムフェニコール感
受性はベクタープラスミドが染色体上から組換えにより
脱落したことを、ｍ−フロロフェニルアラニン耐性はプ
ラスミドから導入した変異型のＤＳ遺伝子が染色体上に
なお残っていることを意味する。すなわち、相同的組換
えにより、染色体から遺伝子が脱落する際、プラスミド
により導入した変異型の遺伝子は染色体上に残り、元来
染色体上にあった野生型の遺伝子が、ベクタープラスミ
ドと共に脱落し、遺伝子置換が起こったことを意味す
る。
伝子置換株の取得）相同的組換えにより、染色体上にＤ
Ｓ遺伝子を組み込んだAJ12573株(FERM-BP3526)より、ま
ず、クロラムフェニコール感受性株を取得した。組み込
み株をM-CM2Gプレートに希釈、塗布し、34℃で培養す
る。コロニー形成後、5μg/mlのクロラムフェニコール
を含むM-CM2Gプレートにレプリカし、34℃で培養する。
このとき、クロラムフェニコール感受性になった株を取
得した。クロラムフェニコール感受性になった株から、
クロラムフェニコール感受性かつｍ−フロロフェニルア
ラニンに耐性な株を選択した。クロラムフェニコール感
受性はベクタープラスミドが染色体上から組換えにより
脱落したことを、ｍ−フロロフェニルアラニン耐性はプ
ラスミドから導入した変異型のＤＳ遺伝子が染色体上に
なお残っていることを意味する。すなわち、相同的組換
えにより、染色体から遺伝子が脱落する際、プラスミド
により導入した変異型の遺伝子は染色体上に残り、元来
染色体上にあった野生型の遺伝子が、ベクタープラスミ
ドと共に脱落し、遺伝子置換が起こったことを意味す
る。
【００１６】（実施例４ 染色体への変異型ＤＳ遺伝子
組み込み菌によるチロシンおよびフェニルアラニンの生
産）変異型ＤＳ遺伝子を、温度感受性ベクターを用いて
染色体へ組み込んだAJ12573株(FERM-BP3526)、及び遺伝
子置換により変異型ＤＳ遺伝子が染色体上に固定された
AJ12574株(FERM-BP3527)により、チロシン、およびフェ
ニルアラニンの生産を行った。各々の株を、M-CM2Gプレ
ート培地にてrefreshした後、フェニルアラニン生産培
地(グルコース130g、(NH4)2SO410g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O
1g、フマル酸12g、酢酸3ml、大豆蛋白酸加水分解物「味
液」50ml、FeSO4・7H2O10mg、MnSO4・4H2O 10mg、ビオチン50
μg、サイアミン塩酸塩2000μg及びCaCO350gを純水1lに
含む。pH7.0)に植菌し、31.5℃にて48時間培養した。培
養後の培養液中のチロシン、フェニルアラニン生成量は
表1に示す通りである。
組み込み菌によるチロシンおよびフェニルアラニンの生
産）変異型ＤＳ遺伝子を、温度感受性ベクターを用いて
染色体へ組み込んだAJ12573株(FERM-BP3526)、及び遺伝
子置換により変異型ＤＳ遺伝子が染色体上に固定された
AJ12574株(FERM-BP3527)により、チロシン、およびフェ
ニルアラニンの生産を行った。各々の株を、M-CM2Gプレ
ート培地にてrefreshした後、フェニルアラニン生産培
地(グルコース130g、(NH4)2SO410g、KH2PO41g、MgSO4・7H2O
1g、フマル酸12g、酢酸3ml、大豆蛋白酸加水分解物「味
液」50ml、FeSO4・7H2O10mg、MnSO4・4H2O 10mg、ビオチン50
μg、サイアミン塩酸塩2000μg及びCaCO350gを純水1lに
含む。pH7.0)に植菌し、31.5℃にて48時間培養した。培
養後の培養液中のチロシン、フェニルアラニン生成量は
表1に示す通りである。
【００１７】
【表１】
【００１８】（実施例５ ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム野生株染色体へのフィードバック阻害解
除型アスパルテートキナーゼ遺伝子の組み込みと組み込
み株を用いたリジン生産）
ファーメンタム野生株染色体へのフィードバック阻害解
除型アスパルテートキナーゼ遺伝子の組み込みと組み込
み株を用いたリジン生産）
【００１９】＜遺伝子組込み用プラスミドの作製＞リジ
ンおよびスレオニンによるフィードバック阻害が実質的
に解除したアスパルトキナーゼ遺伝子（以下「AK遺伝
子」と記す）をコリネバクテリウム・グルタミカム、リ
ジン生産菌AJ3463(FERM-P1987)より取得した。方法は、
AJ3463の染色体ＤＮＡを、制限酵素Sau3AIで部分分解
し、BamHIで完全分解したpHSC4と接続した。このＤＮＡ
を、AJ12036株に形質転換した。形質転換体の選択は、5
μg/mlのクロラムフェニコール、100mg/dlのＬ−スレオ
ニンと、3000μg/mlのＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−
システイン（以下「AEC」と記す）を含む最少培地に
て、20℃にて選択した。形質転換体よりプラスミドを調
製し、pHSC4AEと命名した。
ンおよびスレオニンによるフィードバック阻害が実質的
に解除したアスパルトキナーゼ遺伝子（以下「AK遺伝
子」と記す）をコリネバクテリウム・グルタミカム、リ
ジン生産菌AJ3463(FERM-P1987)より取得した。方法は、
AJ3463の染色体ＤＮＡを、制限酵素Sau3AIで部分分解
し、BamHIで完全分解したpHSC4と接続した。このＤＮＡ
を、AJ12036株に形質転換した。形質転換体の選択は、5
μg/mlのクロラムフェニコール、100mg/dlのＬ−スレオ
ニンと、3000μg/mlのＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−
システイン（以下「AEC」と記す）を含む最少培地に
て、20℃にて選択した。形質転換体よりプラスミドを調
製し、pHSC4AEと命名した。
【００２０】＜阻害解除型ＡＫ遺伝子のブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム染色体への組込みと遺伝子
置換株の取得＞プラスミドpHSC4AEにて、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869株を形質転換
した。形質転換体の選択は20℃にて行った。形質転換体
を、M-CM2Gプレートにプレート当り103〜105cfuとなる
よう滅菌水に希釈し、塗布した。34℃にて培養し、コロ
ニーを形成するものを、遺伝子組込み株として選択し
た。遺伝子組込み株より再度クロラムフェニコール感受
性株を取得し、その中よりクロラムフェニコール感受性
かつAEC耐性を示す株を遺伝子置換株として選択した。
ウム・ラクトファーメンタム染色体への組込みと遺伝子
置換株の取得＞プラスミドpHSC4AEにて、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869株を形質転換
した。形質転換体の選択は20℃にて行った。形質転換体
を、M-CM2Gプレートにプレート当り103〜105cfuとなる
よう滅菌水に希釈し、塗布した。34℃にて培養し、コロ
ニーを形成するものを、遺伝子組込み株として選択し
た。遺伝子組込み株より再度クロラムフェニコール感受
性株を取得し、その中よりクロラムフェニコール感受性
かつAEC耐性を示す株を遺伝子置換株として選択した。
【００２１】＜遺伝子置換株を用いたリジン生産＞染色
体上に阻害解除型のAK遺伝子を遺伝子置換により組み込
んだブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ1257
5株(FERM-BP3528)および、その親株であるATCC13869株
を、リジン生産培地(グルコース100g、(NH4)2SO455g、KH2
PO41g、MgSO4・7H2O1g、大豆蛋白酸加水分解物「豆濃」50m
l、FeSO4・7H2O10mg、MnSO4・4H2O 10mg、ニコチン酸アミド5
mg、及びCaCO350gを純水1lに含む。pH8.0 )に植菌し、3
1.5℃にて48時間培養した。培養後の培養液中のリジン
生成量は表2に示す通りである。
体上に阻害解除型のAK遺伝子を遺伝子置換により組み込
んだブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ1257
5株(FERM-BP3528)および、その親株であるATCC13869株
を、リジン生産培地(グルコース100g、(NH4)2SO455g、KH2
PO41g、MgSO4・7H2O1g、大豆蛋白酸加水分解物「豆濃」50m
l、FeSO4・7H2O10mg、MnSO4・4H2O 10mg、ニコチン酸アミド5
mg、及びCaCO350gを純水1lに含む。pH8.0 )に植菌し、3
1.5℃にて48時間培養した。培養後の培養液中のリジン
生成量は表2に示す通りである。
【００２２】
【表２】
【００２３】
【発明の効果】以上のように、この発明によれば、コリ
ネ型細菌中で自律増殖可能なプラスミドＤＮＡの複製起
点を培養温度を上昇させることにより複製不能にするこ
とで、染色体上の特定の遺伝子を計画的に改変し、また
定まったコピー数の遺伝子を安定に染色体上に固定する
という効果を得ることが出来る。
ネ型細菌中で自律増殖可能なプラスミドＤＮＡの複製起
点を培養温度を上昇させることにより複製不能にするこ
とで、染色体上の特定の遺伝子を計画的に改変し、また
定まったコピー数の遺伝子を安定に染色体上に固定する
という効果を得ることが出来る。
【００２４】
【配列表】配列番号：1 配列の長さ：2959 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：コリネハ゛クテリム ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutamic
um) 株名：ATCC 13058 配列 GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATGTTGCTCT GACGCACGCG CAGCACGCAG 1500 CCGTGCTTGT CCTGGACATT GATGTGCCGA GCCACCAGGC CAGCAGGAAA ATCGAGCACG 1560 TAAACCCCGA GGTCTACGCG ATTTTGGAGC GCTGGGCACG CCTGGAAAAA GCGCCAGCTT 1620 GGATCGGCGT GAATCCACTG AGCGGGAAAT GCCAGCTCAT CTGGCTCATT GATCCGGTGT 1680 ATGCCGCAGC AGGCATGAGC AGCCCGAATA TGCGCCTGCT GGCTGCAACG ACCGAGGAAA 1740 TGACCCGCGT TTTCGGCGCT GACCAGGCTT TTTCACATAG GCTGAGCCGG TGGCCACTGC 1800 ACGTCTCCGA CGATCCCACC GCGTACCGCT GGCATGCCCA GCACAATCGC GTGGATCGCC 1860 TAGCTGATCT TATGGAGGTT GCTCGCATGA TCTCAGGCAC AGAAAAACCT AAAAAACGCT 1920 ATGAGCAGGA GTTTTCTAGC GGACGGGCAC GTATCGAAGC GGCAAGAAAA GCCACTGCGG 1980 AAGCAAAAGC ACTTGCCACG CTTGAAGCAA GCCTGCCGAG CGCCGCTGAA GCGTCTGGAG 2040 AGCTGATCGA CGGCGTCCGT GTCCTCTGGA CTGCTCCAGG GCGTGCCGCC CGTGATGAGA 2100 CGGCTTTTCG CCACGCTTTG ACTGTGGGAT ACCAGTTAAA AGCGGCTGGT GAGCGCCTAA 2160 AAGACACCAA GATCATCGAC GCCTACGAGC GTGCCTACAC CGTCGCTCAG GCGGTCGGAG 2220 CAGACGGCCG TGAGCCTGAT CTGCCGCCGA TGCGTGACCG CCAGACGATG GCGCGACGTG 2280 TGCGCGGCTA CGTCGCTAAA GGCCAGCCAG TCGTCCCTGC TCGTCAGACA GAGACGCAGA 2340 GCAGCCGAGG GCGAAAAGCT CTGGCCACTA TGGGAAGACG TGGCGGTAAA AAGGCCGCAG 2400 AACGCTGGAA AGACCCAAAC AGTGAGTACG CCCGAGCACA GCGAGAAAAA CTAGCTAAGT 2460 CCAGTCAACG ACAAGCTAGG AAAGCTAAAG GAAATCGCTT GACCATTGCA GGTTGGTTTA 2520 TGACTGTTGA GGGAGAGACT GGCTCGTGGC CGACAATCAA TGAAGCTATG TCTGAATTTA 2580 GCGTGTCACG TCAGACCGTG AATAGAGCAC TTAAGTCTGC GGGCATTGAA CTTCCACGAG 2640 GACGCCGTAA AGCTTCCCAG TAAATGTGCC ATCTCGTAGG CAGAAAACGG TTCCCCCCGT 2700 AGGGGTCTCT CTCTTGGCCT CCTTTCTAGG TCGGGCTGAT TGCTCTTGAA GCTCTCTAGG 2760 GGGGCTCACA CCATAGGCAG ATAACGGTTC CCCACCGGCT CACCTCGTAA GCGCACAAGG 2820 ACTGCTCCCA AAGATCGCCT AGCTGATCTT ATGGAGGTTG CTCGCATGAT CCTTTTTGAT 2880 AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 2940 GAAAAGATCC CCGGGTACC 2959
um) 株名：ATCC 13058 配列 GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATGTTGCTCT GACGCACGCG CAGCACGCAG 1500 CCGTGCTTGT CCTGGACATT GATGTGCCGA GCCACCAGGC CAGCAGGAAA ATCGAGCACG 1560 TAAACCCCGA GGTCTACGCG ATTTTGGAGC GCTGGGCACG CCTGGAAAAA GCGCCAGCTT 1620 GGATCGGCGT GAATCCACTG AGCGGGAAAT GCCAGCTCAT CTGGCTCATT GATCCGGTGT 1680 ATGCCGCAGC AGGCATGAGC AGCCCGAATA TGCGCCTGCT GGCTGCAACG ACCGAGGAAA 1740 TGACCCGCGT TTTCGGCGCT GACCAGGCTT TTTCACATAG GCTGAGCCGG TGGCCACTGC 1800 ACGTCTCCGA CGATCCCACC GCGTACCGCT GGCATGCCCA GCACAATCGC GTGGATCGCC 1860 TAGCTGATCT TATGGAGGTT GCTCGCATGA TCTCAGGCAC AGAAAAACCT AAAAAACGCT 1920 ATGAGCAGGA GTTTTCTAGC GGACGGGCAC GTATCGAAGC GGCAAGAAAA GCCACTGCGG 1980 AAGCAAAAGC ACTTGCCACG CTTGAAGCAA GCCTGCCGAG CGCCGCTGAA GCGTCTGGAG 2040 AGCTGATCGA CGGCGTCCGT GTCCTCTGGA CTGCTCCAGG GCGTGCCGCC CGTGATGAGA 2100 CGGCTTTTCG CCACGCTTTG ACTGTGGGAT ACCAGTTAAA AGCGGCTGGT GAGCGCCTAA 2160 AAGACACCAA GATCATCGAC GCCTACGAGC GTGCCTACAC CGTCGCTCAG GCGGTCGGAG 2220 CAGACGGCCG TGAGCCTGAT CTGCCGCCGA TGCGTGACCG CCAGACGATG GCGCGACGTG 2280 TGCGCGGCTA CGTCGCTAAA GGCCAGCCAG TCGTCCCTGC TCGTCAGACA GAGACGCAGA 2340 GCAGCCGAGG GCGAAAAGCT CTGGCCACTA TGGGAAGACG TGGCGGTAAA AAGGCCGCAG 2400 AACGCTGGAA AGACCCAAAC AGTGAGTACG CCCGAGCACA GCGAGAAAAA CTAGCTAAGT 2460 CCAGTCAACG ACAAGCTAGG AAAGCTAAAG GAAATCGCTT GACCATTGCA GGTTGGTTTA 2520 TGACTGTTGA GGGAGAGACT GGCTCGTGGC CGACAATCAA TGAAGCTATG TCTGAATTTA 2580 GCGTGTCACG TCAGACCGTG AATAGAGCAC TTAAGTCTGC GGGCATTGAA CTTCCACGAG 2640 GACGCCGTAA AGCTTCCCAG TAAATGTGCC ATCTCGTAGG CAGAAAACGG TTCCCCCCGT 2700 AGGGGTCTCT CTCTTGGCCT CCTTTCTAGG TCGGGCTGAT TGCTCTTGAA GCTCTCTAGG 2760 GGGGCTCACA CCATAGGCAG ATAACGGTTC CCCACCGGCT CACCTCGTAA GCGCACAAGG 2820 ACTGCTCCCA AAGATCGCCT AGCTGATCTT ATGGAGGTTG CTCGCATGAT CCTTTTTGAT 2880 AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 2940 GAAAAGATCC CCGGGTACC 2959
【００２５】配列番号：2 配列の長さ：2959 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：コリネハ゛クテリム ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutamic
um) 株名：ATCC 13058 配列 GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGTAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ATCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATGTTGCTCT GACGCACGCG CAGCACGCAG 1500 CCGTGCTTGT CCTGGACATT GATGTGCCGA GCCACCAGGC CGGCGGGAAA ATCGAGCACG 1560 TAAACCCCGA GGTCTACGCG ATTTTGGAGC GCTGGGCACG CCTGGAAAAA GCGTCAGCTT 1620 GGATCGGCGT GAATCCACTG AGCGGGAAAT GCCAGCTCAT CTGGCTCATT GATCCGGTGT 1680 ATGCCGCAGC AGGCATGAGC AGCCCGAATA TGCGCCTGCT GGCTGCAACG ACCGAGGAAA 1740 TGACCCGCGT TTTCGGCGCT GACCAGGCTT TTTCACATAG GCTGAGCCGG TGGCCACTGC 1800 ACGTCTCCGA CGATCCCACC GCGTACCGCT GGCATGCCCA GCACAATCGC GTGGATCGCC 1860 TAGCTGATCT TATGGAGGTT GCTCGCATGA TCTCAGGCAC AGAAAAACCT AAAAAACGCT 1920 ATGAGCAGGA GTTTTCTAGC GGACGGGCAC GTATCGAAGC GGCAAGAAAA GCCACTGCGG 1980 AAGCAAAAGC ACTTGCCACG CTTGAAGCAA GCCTGCCGAG CGCCGCTGAA GCGTCTGGAG 2040 AGCTGATCGA CGGCGTCCGT GTCCTCTGGA CTGCTCCAGG GCGTGCCGCC CGTGATGAGA 2100 CGGCTTTTCG CCACGCTTTG ACTGTGGGAT ACCAGTTAAA AGCGGCTGGT GAGCGCCTAA 2160 AAGACACCAA GATCATCGAC GCCTACGAGC GTGCCTACAC CGTCGCTCAG GCGGTCGGAG 2220 CAGACGGCCG TGAGCCTGAT CTGCCGCCGA TGCGTGACCG CCAGACGATG GCGCGACGTG 2280 TGCGCGGCTA CGTCGCTAAA GGCCAGCCAG TCGTCCCTGC TCGTCAGACA GAGACGCAGA 2340 GCAGCCGAGG GCGAAAAGCT CTGGCCACTA TGGGAAGACG TGGCGGTAAA AAGGCCGCAG 2400 AACGCTGGAA AGACCCAAAC AGTGAGTACG CCCGAGCACA GCGAGAAAAA CTAGCTAAGT 2460 CCAGTCAACG ACAAGCTAGG AAAGCTAAAG GAAATCGCTT GACCATTGCA GGTTGGTTTA 2520 TGACTGTTGA GGGAGAGACT GGCTCGTGGC CGACAATCAA TGAAGCTATG TCTGAATTTA 2580 GCGTGTCACG TCAGACCGTG AATAGAGCAC TTAAGTCTGC GGGCATTGAA CTTCCACGAG 2640 GACGCCGTAA AGCTTCCCAG TAAATGTGCC ATCTCGTAGG CAGAAAACGG TTCCCCCCGT 2700 AGGGGTCTCT CTCTTGGCCT CCTTTCTAGG TCGGGCTGAT TGCTCTTGAA GCTCTCTAGG 2760 GGGGCTCACA CCATAGGCAG ATAACGGTTC CCCACCGGCT CACCTCGTAA GCGCACAAGG 2820 ACTGCTCCCA AAGATCGCCT AGCTGATCTT ATGGAGGTTG CTCGCATGAT CCTTTTTGAT 2880 AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 2940 GAAAAGATCC CCGGGTACC 2959
um) 株名：ATCC 13058 配列 GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGTAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ATCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATGTTGCTCT GACGCACGCG CAGCACGCAG 1500 CCGTGCTTGT CCTGGACATT GATGTGCCGA GCCACCAGGC CGGCGGGAAA ATCGAGCACG 1560 TAAACCCCGA GGTCTACGCG ATTTTGGAGC GCTGGGCACG CCTGGAAAAA GCGTCAGCTT 1620 GGATCGGCGT GAATCCACTG AGCGGGAAAT GCCAGCTCAT CTGGCTCATT GATCCGGTGT 1680 ATGCCGCAGC AGGCATGAGC AGCCCGAATA TGCGCCTGCT GGCTGCAACG ACCGAGGAAA 1740 TGACCCGCGT TTTCGGCGCT GACCAGGCTT TTTCACATAG GCTGAGCCGG TGGCCACTGC 1800 ACGTCTCCGA CGATCCCACC GCGTACCGCT GGCATGCCCA GCACAATCGC GTGGATCGCC 1860 TAGCTGATCT TATGGAGGTT GCTCGCATGA TCTCAGGCAC AGAAAAACCT AAAAAACGCT 1920 ATGAGCAGGA GTTTTCTAGC GGACGGGCAC GTATCGAAGC GGCAAGAAAA GCCACTGCGG 1980 AAGCAAAAGC ACTTGCCACG CTTGAAGCAA GCCTGCCGAG CGCCGCTGAA GCGTCTGGAG 2040 AGCTGATCGA CGGCGTCCGT GTCCTCTGGA CTGCTCCAGG GCGTGCCGCC CGTGATGAGA 2100 CGGCTTTTCG CCACGCTTTG ACTGTGGGAT ACCAGTTAAA AGCGGCTGGT GAGCGCCTAA 2160 AAGACACCAA GATCATCGAC GCCTACGAGC GTGCCTACAC CGTCGCTCAG GCGGTCGGAG 2220 CAGACGGCCG TGAGCCTGAT CTGCCGCCGA TGCGTGACCG CCAGACGATG GCGCGACGTG 2280 TGCGCGGCTA CGTCGCTAAA GGCCAGCCAG TCGTCCCTGC TCGTCAGACA GAGACGCAGA 2340 GCAGCCGAGG GCGAAAAGCT CTGGCCACTA TGGGAAGACG TGGCGGTAAA AAGGCCGCAG 2400 AACGCTGGAA AGACCCAAAC AGTGAGTACG CCCGAGCACA GCGAGAAAAA CTAGCTAAGT 2460 CCAGTCAACG ACAAGCTAGG AAAGCTAAAG GAAATCGCTT GACCATTGCA GGTTGGTTTA 2520 TGACTGTTGA GGGAGAGACT GGCTCGTGGC CGACAATCAA TGAAGCTATG TCTGAATTTA 2580 GCGTGTCACG TCAGACCGTG AATAGAGCAC TTAAGTCTGC GGGCATTGAA CTTCCACGAG 2640 GACGCCGTAA AGCTTCCCAG TAAATGTGCC ATCTCGTAGG CAGAAAACGG TTCCCCCCGT 2700 AGGGGTCTCT CTCTTGGCCT CCTTTCTAGG TCGGGCTGAT TGCTCTTGAA GCTCTCTAGG 2760 GGGGCTCACA CCATAGGCAG ATAACGGTTC CCCACCGGCT CACCTCGTAA GCGCACAAGG 2820 ACTGCTCCCA AAGATCGCCT AGCTGATCTT ATGGAGGTTG CTCGCATGAT CCTTTTTGAT 2880 AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 2940 GAAAAGATCC CCGGGTACC 2959
【００２６】配列番号：3 配列の長さ：2959 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：コリネハ゛クテリム ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutamic
um) 株名：ＡＴＣＣ １３０５８ 配列 ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧ ＴＡＴＧＣＣＧＣＡＧ ＣＡＧＧＣＡＴＧＡＧ ＣＡＧ
ＣＣＣＧＡＡＴ ＡＴＧＣＧＣＣＴＧＣ ＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣ ６０ ＧＡＣＣＧＡＧＧＡＡ ＡＴＧＡＣＣＣＧＣＧ ＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣ ＴＧＡ
ＣＣＡＧＧＣＴ ＴＴＴＴＣＡＣＡＴＡ ＧＧＣＴＧＡＧＣＣＧ １２０ ＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧ ＣＡＣＧＴＣＴＣＣＧ ＡＣＧＡＴＣＣＣＡＣ ＣＧＣ
ＧＴＡＣＣＧＣ ＴＧＧＣＡＴＧＣＣＣ ＡＧＣＡＣＡＡＴＣＧ １８０ ＣＧＴＧＧＡＴＣＧＣ ＣＴＡＧＣＴＧＡＴＣ ＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴ ＴＴＴ
ＴＧＣＣＴＴＴ ＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣ ＴＴＣＴＣＧＧＴＣＧ ２４０ ＣＣＣＣＧＣＡＡＡＴ ＴＴＴＣＧＡＴＴＣＣ ＡＧＡＴＴＴＴＴＴＡ ＡＡＡ
ＡＣＣＡＡＧＣ ＣＡＧＡＡＡＴＡＣＧ ＡＣＡＣＡＣＣＧＴＴ ３００ ＴＧＣＡＧＡＴＡＡＴ ＣＴＧＴＣＴＴＴＣＧ ＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡ ＧＴＧ
ＣＧＡＴＡＣＡ ＡＡＡＴＴＴＴＴＡＧ ＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣ ３６０ ＧＴＧＣＧＣＡＡＡＧ ＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧ ＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴ ＣＧＴ
ＧＣＣＧＣＧＴ ＧＡＴＴＴＴＣＣＧＣ ＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴ ４２０ ＡＡＣＧＡＡＣＧＴＴ ＣＧＴＴＡＴＡＡＴＧ ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＣ ＣＴＴ
ＣＡＣＧＡＣＧ ＡＡＧＴＡＣＣＡＡＡ ＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡ ４８０ ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴ ＡＴＧＧＡＴＣＴＣＴ ＣＴＧＡＴＧＴＣＧＣ ＧＣＴ
ＧＧＡＧＴＣＣ ＧＡＣＧＣＧＣＴＣＧ ＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴ ５４０ ＣＧＡＴＴＴＡＡＡＡ ＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧ ＧＡＴＴＴＴＴＣＣＧ ＡＧＣ
ＴＣＴＣＧＡＴ ＡＣＧＡＣＧＧＡＣＧ ＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣ ６００ ＡＣＧＡＧＡＣＴＧＧ ＧＣＣＡＧＴＧＣＣＧ ＣＧＡＧＣＧＡＣＣＴ ＡＧＡ
ＡＡＣＴＣＴＣ ＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣ ＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴ ６６０ ＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧ ＣＴＧＣＧＴＧＣＴＣ ＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡ ＧＧＡ
ＧＧＡＣＧＣＡ ＣＡＧＴＡＧＴＧＧＡ ＧＧＡＴＣＧＡＡＴＣ ７２０ ＡＧＴＴＧＣＧＣＣＴ ＡＣＴＧＣＧＧＴＧＧ ＣＣＴＧＡＴＴＣＣＴ ＣＣＣ
ＣＧＡＣＣＴＧ ＡＣＣＣＧＣＧＡＧＧ ＡＣＧＧＣＧＣＧＣＡ ７８０ ＡＡＡＴＡＴＴＧＣＴ ＣＡＧＡＴＧＣＧＴＧ ＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡ ＧＣＣ
ＡＧＣＣＧＣＧ ＡＧＣＧＣＧＣＣＡＡ ＣＡＡＡＣＧＣＣＡＣ ８４０ ＧＣＣＧＡＧＧＡＧＣ ＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣ ＴＡＧＧＴＣＧＣＡＡ ＡＴＧ
ＧＣＧＣＴＧＧ ＡＡＧＴＧＣＧＴＣＣ ＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡ ９００ ＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡ ＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣ ＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡ ＧＣＧ
ＧＣＡＧＣＧＡ ＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧ ＣＧＡＴＣＧＴＧＧＣ ９６０ ＧＣＧＧＴＧＣＣＣＧ ＣＡＧＧＣＡＴＧＡＣ ＡＡＡＣＡＴＣＧＴＡ ＡＡＴ
ＧＣＣＧＣＧＴ ＴＴＣＧＴＧＴＧＧＣ ＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣ １０２０ ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＴ ＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣ ＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡ ＣＣＧ
ＡＡＴＣＧＧＣ ＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧ ＣＧＣＧＴＣＧＡＡＡ １０８０ ＡＡＧＣＧＣＡＣＡＧ ＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡ ＧＣＧＡＴＡＡＧＣＴ ＧＣＡ
ＣＧＡＡＴＡＣ ＣＴＧＡＡＡＡＡＴＧ ＴＴＧＡＡＣＧＣＣＣ １１４０ ＣＧＴＧＡＧＣＧＧＴ ＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧ ＧＣＧＴＣＧＧＣＴＡ ＡＣＣ
ＣＣＣＡＧＴＣ ＣＡＡＡＣＣＴＧＧＧ ＡＧＡＡＡＧＣＧＣＴ １２００ ＣＡＡＡＡＡＴＧＡＣ ＴＣＴＡＧＣＧＧＡＴ ＴＣＡＣＧＡＧＡＣＡ ＴＴＧ
ＡＣＡＣＡＣＣ ＧＧＣＣＴＧＧＡＡＡ ＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧ １２６０ ＡＴＣＴＧＴＴＣＧＡ ＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣ ＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣ ＴＧＣ
ＧＡＴＣＡＣＧ ＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧ ＡＧＣＧＡＡＧＡＣＣ １３２０ ＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴ ＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣ ＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧ ＡＡＡ
ＡＴＴＴＣＣＡ ＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣＣＧＣＧＡＣＴ １３８０ ＴＣＧＣＣＡＧＣＧＣ ＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡ ＧＡＣＣＣＧＧＡＣＡ ＣＧＧ
ＧＡＧＡＡＡＣ ＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧ ＴＴＡＴＡＣＣＧＡＧ １４４０ ＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡ ＡＴＣＧＣＴＴＧＣＣ ＣＧＧＴＧＣＣＡＧＴ ＡＴＧ
ＴＴＧＣＴＣＴ ＧＡＣＧＣＡＣＧＣＧ ＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧ １５００ ＣＣＧＴＧＣＴＴＧＴ ＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴ ＧＡＴＧＴＧＣＣＧＡ ＧＣＣ
ＡＣＣＡＧＧＣ ＣＧＧＣＧＧＧＡＡＡ ＡＴＣＧＡＧＣＡＣＡ １５６０ ＴＡＡＡＣＣＣＣＧＡ ＧＧＴＣＴＡＣＧＣＧ ＡＴＴＴＴＧＧＡＧＣ ＧＣＴ
ＧＧＧＣＡＣＧ ＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡ ＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴ １６２０ ＧＧＡＴＣＧＧＣＧＴ ＧＡＡＴＣＣＡＣＴＧ ＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴ ＧＣＣ
ＡＧＣＴＣＡＴ ＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴ ＧＡＴＣＣＧＧＴＧＴ １６８０ ＡＴＧＴＣＧＣＡＧＣ ＡＧＧＣＡＴＧＡＧＣ ＡＧＣＣＣＧＡＡＴＡ ＴＧＣ
ＧＣＣＴＧＣＴ ＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧ ＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡ １７４０ ＴＧＡＣＣＣＧＣＧＴ ＴＴＴＣＧＧＣＧＣＴ ＧＡＣＣＡＧＧＣＴＴ ＴＴＴ
ＣＡＣＡＴＡＧ ＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧ ＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣ １８００ ＡＣＧＴＣＴＣＣＧＡ ＣＧＡＴＣＣＣＡＣＣ ＧＣＧＴＡＣＣＧＣＴ ＧＧＣ
ＡＴＧＣＣＣＡ ＧＣＡＣＡＡＴＣＧＣ ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣ １８６０ ＴＡＧＣＴＧＡＴＣＴ ＴＡＴＧＧＡＧＧＴＴ ＧＣＴＣＧＣＡＴＧＡ ＴＣＴ
ＣＡＧＧＣＡＣ ＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴ ＡＡＡＡＡＡＣＧＣＴ １９２０ ＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡ ＧＴＴＴＴＣＴＡＧＣ ＧＧＡＣＧＧＧＣＡＣ ＧＴＡ
ＴＣＧＡＡＧＣ ＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡ ＧＣＣＡＣＴＧＣＧＧ １９８０ ＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣ ＡＣＴＴＧＣＣＡＣＧ ＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡ ＧＣＣ
ＴＧＣＣＧＡＧ ＣＧＣＣＧＣＴＧＡＡ ＧＣＧＴＣＴＧＧＡＧ ２０４０ ＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡ ＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴ ＧＴＣＣＴＣＴＧＧＡ ＣＴＧ
ＣＴＣＣＡＧＧ ＧＣＧＴＧＣＣＧＣＣ ＣＧＴＧＡＴＧＡＧＡ ２１００ ＣＧＧＣＴＴＴＴＣＧ ＣＣＡＣＧＣＴＴＴＧ ＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴ ＡＣＣ
ＡＧＴＴＡＡＡ ＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴ ＧＡＧＣＧＣＣＴＡＡ ２１６０ ＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡ ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＣ ＧＣＣＴＡＣＧＡＧＣ ＧＴＧ
ＣＣＴＡＣＡＣ ＣＧＴＣＧＣＴＣＡＧ ＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧ ２２２０ ＣＡＧＡＣＧＧＣＣＧ ＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴ ＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡ ＴＧＣ
ＧＴＧＡＣＣＧ ＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧ ＧＣＧＣＧＡＣＧＴＧ ２２８０ ＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡ ＣＧＴＣＧＣＴＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧ ＴＣＧ
ＴＣＣＣＴＧＣ ＴＣＧＴＣＡＧＡＣＡ ＧＡＧＡＣＧＣＡＧＡ ２３４０ ＧＣＡＧＣＣＧＡＧＧ ＧＣＧＡＡＡＡＧＣＴ ＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡ ＴＧＧ
ＧＡＡＧＡＣＧ ＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡ ＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧ ２４００ ＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡ ＡＧＡＣＣＣＡＡＡＣ ＡＧＴＧＡＧＴＡＣＧ ＣＣＣ
ＧＡＧＣＡＣＡ ＧＣＧＡＧＡＡＡＡＡ ＣＴＡＧＣＴＡＡＧＴ ２４６０ ＣＣＡＧＴＣＡＡＣＧ ＡＣＡＡＧＣＴＡＧＧ ＡＡＡＧＣＴＡＡＡＧ ＧＡＡ
ＡＴＣＧＣＴＴ ＧＡＣＣＡＴＴＧＣＡ ＧＧＴＴＧＧＴＴＴＡ ２５２０ ＴＧＡＣＴＧＴＴＧＡ ＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴ ＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣ ＣＧＡ
ＣＡＡＴＣＡＡ ＴＧＡＡＧＣＴＡＴＧ ＴＣＴＧＡＡＴＴＴＡ ２５８０ ＧＣＧＴＧＴＣＡＣＧ ＴＣＡＧＡＣＣＧＴＧ ＡＡＴＡＧＡＧＣＡＣ ＴＴＡ
ＡＧＴＣＴＧＣ ＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡ ＣＴＴＣＣＡＣＧＡＧ ２６４０ ＧＡＣＧＣＣＧＴＡＡ ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＧ ＴＡＡＡＴＧＴＧＣＣ ＡＴＣ
ＴＣＧＴＡＧＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＧ ＴＴＣＣＣＣＣＣＧＴ ２７００ ＡＧＧＧＧＴＣＴＣＴ ＣＴＣＴＴＧＧＣＣＴ ＣＣＴＴＴＣＴＡＧＧ ＴＣＧ
ＧＧＣＴＧＡＴ ＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡ ＧＣＴＣＴＣＴＡＧＧ ２７６０ ＧＧＧＧＣＴＣＡＣＡ ＣＣＡＴＡＧＧＣＡＧ ＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣ ＣＣＣ
ＡＣＣＧＧＣＴ ＣＡＣＣＴＣＧＴＡＡ ＧＣＧＣＡＣＡＡＧＧ ２８２０ ＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡ ＡＡＧＡＴＣＧＣＣＴ ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴ ＡＴＧ
ＧＡＧＧＴＴＧ ＣＴＣＧＣＡＴＧＡＴ ＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴ ２８８０ ＡＡＴＣＴＣＡＴＧＡ ＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣ ＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧ ＴＴＴ
ＴＣＧＴＴＣＣ ＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣ ＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡ ２９４０ ＧＡＡＡＡＧＡＴＣＣ ＣＣＧＧＧＴＡＣＣ
２９５９
um) 株名：ＡＴＣＣ １３０５８ 配列 ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧ ＴＡＴＧＣＣＧＣＡＧ ＣＡＧＧＣＡＴＧＡＧ ＣＡＧ
ＣＣＣＧＡＡＴ ＡＴＧＣＧＣＣＴＧＣ ＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣ ６０ ＧＡＣＣＧＡＧＧＡＡ ＡＴＧＡＣＣＣＧＣＧ ＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣ ＴＧＡ
ＣＣＡＧＧＣＴ ＴＴＴＴＣＡＣＡＴＡ ＧＧＣＴＧＡＧＣＣＧ １２０ ＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧ ＣＡＣＧＴＣＴＣＣＧ ＡＣＧＡＴＣＣＣＡＣ ＣＧＣ
ＧＴＡＣＣＧＣ ＴＧＧＣＡＴＧＣＣＣ ＡＧＣＡＣＡＡＴＣＧ １８０ ＣＧＴＧＧＡＴＣＧＣ ＣＴＡＧＣＴＧＡＴＣ ＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴ ＴＴＴ
ＴＧＣＣＴＴＴ ＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣ ＴＴＣＴＣＧＧＴＣＧ ２４０ ＣＣＣＣＧＣＡＡＡＴ ＴＴＴＣＧＡＴＴＣＣ ＡＧＡＴＴＴＴＴＴＡ ＡＡＡ
ＡＣＣＡＡＧＣ ＣＡＧＡＡＡＴＡＣＧ ＡＣＡＣＡＣＣＧＴＴ ３００ ＴＧＣＡＧＡＴＡＡＴ ＣＴＧＴＣＴＴＴＣＧ ＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡ ＧＴＧ
ＣＧＡＴＡＣＡ ＡＡＡＴＴＴＴＴＡＧ ＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣ ３６０ ＧＴＧＣＧＣＡＡＡＧ ＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧ ＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴ ＣＧＴ
ＧＣＣＧＣＧＴ ＧＡＴＴＴＴＣＣＧＣ ＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴ ４２０ ＡＡＣＧＡＡＣＧＴＴ ＣＧＴＴＡＴＡＡＴＧ ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＣ ＣＴＴ
ＣＡＣＧＡＣＧ ＡＡＧＴＡＣＣＡＡＡ ＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡ ４８０ ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴ ＡＴＧＧＡＴＣＴＣＴ ＣＴＧＡＴＧＴＣＧＣ ＧＣＴ
ＧＧＡＧＴＣＣ ＧＡＣＧＣＧＣＴＣＧ ＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴ ５４０ ＣＧＡＴＴＴＡＡＡＡ ＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧ ＧＡＴＴＴＴＴＣＣＧ ＡＧＣ
ＴＣＴＣＧＡＴ ＡＣＧＡＣＧＧＡＣＧ ＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣ ６００ ＡＣＧＡＧＡＣＴＧＧ ＧＣＣＡＧＴＧＣＣＧ ＣＧＡＧＣＧＡＣＣＴ ＡＧＡ
ＡＡＣＴＣＴＣ ＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣ ＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴ ６６０ ＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧ ＣＴＧＣＧＴＧＣＴＣ ＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡ ＧＧＡ
ＧＧＡＣＧＣＡ ＣＡＧＴＡＧＴＧＧＡ ＧＧＡＴＣＧＡＡＴＣ ７２０ ＡＧＴＴＧＣＧＣＣＴ ＡＣＴＧＣＧＧＴＧＧ ＣＣＴＧＡＴＴＣＣＴ ＣＣＣ
ＣＧＡＣＣＴＧ ＡＣＣＣＧＣＧＡＧＧ ＡＣＧＧＣＧＣＧＣＡ ７８０ ＡＡＡＴＡＴＴＧＣＴ ＣＡＧＡＴＧＣＧＴＧ ＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡ ＧＣＣ
ＡＧＣＣＧＣＧ ＡＧＣＧＣＧＣＣＡＡ ＣＡＡＡＣＧＣＣＡＣ ８４０ ＧＣＣＧＡＧＧＡＧＣ ＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣ ＴＡＧＧＴＣＧＣＡＡ ＡＴＧ
ＧＣＧＣＴＧＧ ＡＡＧＴＧＣＧＴＣＣ ＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡ ９００ ＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡ ＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣ ＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡ ＧＣＧ
ＧＣＡＧＣＧＡ ＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧ ＣＧＡＴＣＧＴＧＧＣ ９６０ ＧＣＧＧＴＧＣＣＣＧ ＣＡＧＧＣＡＴＧＡＣ ＡＡＡＣＡＴＣＧＴＡ ＡＡＴ
ＧＣＣＧＣＧＴ ＴＴＣＧＴＧＴＧＧＣ ＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣ １０２０ ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＴ ＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣ ＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡ ＣＣＧ
ＡＡＴＣＧＧＣ ＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧ ＣＧＣＧＴＣＧＡＡＡ １０８０ ＡＡＧＣＧＣＡＣＡＧ ＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡ ＧＣＧＡＴＡＡＧＣＴ ＧＣＡ
ＣＧＡＡＴＡＣ ＣＴＧＡＡＡＡＡＴＧ ＴＴＧＡＡＣＧＣＣＣ １１４０ ＣＧＴＧＡＧＣＧＧＴ ＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧ ＧＣＧＴＣＧＧＣＴＡ ＡＣＣ
ＣＣＣＡＧＴＣ ＣＡＡＡＣＣＴＧＧＧ ＡＧＡＡＡＧＣＧＣＴ １２００ ＣＡＡＡＡＡＴＧＡＣ ＴＣＴＡＧＣＧＧＡＴ ＴＣＡＣＧＡＧＡＣＡ ＴＴＧ
ＡＣＡＣＡＣＣ ＧＧＣＣＴＧＧＡＡＡ ＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧ １２６０ ＡＴＣＴＧＴＴＣＧＡ ＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣ ＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣ ＴＧＣ
ＧＡＴＣＡＣＧ ＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧ ＡＧＣＧＡＡＧＡＣＣ １３２０ ＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴ ＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣ ＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧ ＡＡＡ
ＡＴＴＴＣＣＡ ＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣＣＧＣＧＡＣＴ １３８０ ＴＣＧＣＣＡＧＣＧＣ ＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡ ＧＡＣＣＣＧＧＡＣＡ ＣＧＧ
ＧＡＧＡＡＡＣ ＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧ ＴＴＡＴＡＣＣＧＡＧ １４４０ ＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡ ＡＴＣＧＣＴＴＧＣＣ ＣＧＧＴＧＣＣＡＧＴ ＡＴＧ
ＴＴＧＣＴＣＴ ＧＡＣＧＣＡＣＧＣＧ ＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧ １５００ ＣＣＧＴＧＣＴＴＧＴ ＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴ ＧＡＴＧＴＧＣＣＧＡ ＧＣＣ
ＡＣＣＡＧＧＣ ＣＧＧＣＧＧＧＡＡＡ ＡＴＣＧＡＧＣＡＣＡ １５６０ ＴＡＡＡＣＣＣＣＧＡ ＧＧＴＣＴＡＣＧＣＧ ＡＴＴＴＴＧＧＡＧＣ ＧＣＴ
ＧＧＧＣＡＣＧ ＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡ ＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴ １６２０ ＧＧＡＴＣＧＧＣＧＴ ＧＡＡＴＣＣＡＣＴＧ ＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴ ＧＣＣ
ＡＧＣＴＣＡＴ ＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴ ＧＡＴＣＣＧＧＴＧＴ １６８０ ＡＴＧＴＣＧＣＡＧＣ ＡＧＧＣＡＴＧＡＧＣ ＡＧＣＣＣＧＡＡＴＡ ＴＧＣ
ＧＣＣＴＧＣＴ ＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧ ＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡ １７４０ ＴＧＡＣＣＣＧＣＧＴ ＴＴＴＣＧＧＣＧＣＴ ＧＡＣＣＡＧＧＣＴＴ ＴＴＴ
ＣＡＣＡＴＡＧ ＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧ ＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣ １８００ ＡＣＧＴＣＴＣＣＧＡ ＣＧＡＴＣＣＣＡＣＣ ＧＣＧＴＡＣＣＧＣＴ ＧＧＣ
ＡＴＧＣＣＣＡ ＧＣＡＣＡＡＴＣＧＣ ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣ １８６０ ＴＡＧＣＴＧＡＴＣＴ ＴＡＴＧＧＡＧＧＴＴ ＧＣＴＣＧＣＡＴＧＡ ＴＣＴ
ＣＡＧＧＣＡＣ ＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴ ＡＡＡＡＡＡＣＧＣＴ １９２０ ＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡ ＧＴＴＴＴＣＴＡＧＣ ＧＧＡＣＧＧＧＣＡＣ ＧＴＡ
ＴＣＧＡＡＧＣ ＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡ ＧＣＣＡＣＴＧＣＧＧ １９８０ ＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣ ＡＣＴＴＧＣＣＡＣＧ ＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡ ＧＣＣ
ＴＧＣＣＧＡＧ ＣＧＣＣＧＣＴＧＡＡ ＧＣＧＴＣＴＧＧＡＧ ２０４０ ＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡ ＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴ ＧＴＣＣＴＣＴＧＧＡ ＣＴＧ
ＣＴＣＣＡＧＧ ＧＣＧＴＧＣＣＧＣＣ ＣＧＴＧＡＴＧＡＧＡ ２１００ ＣＧＧＣＴＴＴＴＣＧ ＣＣＡＣＧＣＴＴＴＧ ＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴ ＡＣＣ
ＡＧＴＴＡＡＡ ＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴ ＧＡＧＣＧＣＣＴＡＡ ２１６０ ＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡ ＧＡＴＣＡＴＣＧＡＣ ＧＣＣＴＡＣＧＡＧＣ ＧＴＧ
ＣＣＴＡＣＡＣ ＣＧＴＣＧＣＴＣＡＧ ＧＣＧＧＴＣＧＧＡＧ ２２２０ ＣＡＧＡＣＧＧＣＣＧ ＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴ ＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡ ＴＧＣ
ＧＴＧＡＣＣＧ ＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧ ＧＣＧＣＧＡＣＧＴＧ ２２８０ ＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡ ＣＧＴＣＧＣＴＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧ ＴＣＧ
ＴＣＣＣＴＧＣ ＴＣＧＴＣＡＧＡＣＡ ＧＡＧＡＣＧＣＡＧＡ ２３４０ ＧＣＡＧＣＣＧＡＧＧ ＧＣＧＡＡＡＡＧＣＴ ＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡ ＴＧＧ
ＧＡＡＧＡＣＧ ＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡ ＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧ ２４００ ＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡ ＡＧＡＣＣＣＡＡＡＣ ＡＧＴＧＡＧＴＡＣＧ ＣＣＣ
ＧＡＧＣＡＣＡ ＧＣＧＡＧＡＡＡＡＡ ＣＴＡＧＣＴＡＡＧＴ ２４６０ ＣＣＡＧＴＣＡＡＣＧ ＡＣＡＡＧＣＴＡＧＧ ＡＡＡＧＣＴＡＡＡＧ ＧＡＡ
ＡＴＣＧＣＴＴ ＧＡＣＣＡＴＴＧＣＡ ＧＧＴＴＧＧＴＴＴＡ ２５２０ ＴＧＡＣＴＧＴＴＧＡ ＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴ ＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣ ＣＧＡ
ＣＡＡＴＣＡＡ ＴＧＡＡＧＣＴＡＴＧ ＴＣＴＧＡＡＴＴＴＡ ２５８０ ＧＣＧＴＧＴＣＡＣＧ ＴＣＡＧＡＣＣＧＴＧ ＡＡＴＡＧＡＧＣＡＣ ＴＴＡ
ＡＧＴＣＴＧＣ ＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡ ＣＴＴＣＣＡＣＧＡＧ ２６４０ ＧＡＣＧＣＣＧＴＡＡ ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＧ ＴＡＡＡＴＧＴＧＣＣ ＡＴＣ
ＴＣＧＴＡＧＧ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＧ ＴＴＣＣＣＣＣＣＧＴ ２７００ ＡＧＧＧＧＴＣＴＣＴ ＣＴＣＴＴＧＧＣＣＴ ＣＣＴＴＴＣＴＡＧＧ ＴＣＧ
ＧＧＣＴＧＡＴ ＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡ ＧＣＴＣＴＣＴＡＧＧ ２７６０ ＧＧＧＧＣＴＣＡＣＡ ＣＣＡＴＡＧＧＣＡＧ ＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣ ＣＣＣ
ＡＣＣＧＧＣＴ ＣＡＣＣＴＣＧＴＡＡ ＧＣＧＣＡＣＡＡＧＧ ２８２０ ＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡ ＡＡＧＡＴＣＧＣＣＴ ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＴ ＡＴＧ
ＧＡＧＧＴＴＧ ＣＴＣＧＣＡＴＧＡＴ ＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴ ２８８０ ＡＡＴＣＴＣＡＴＧＡ ＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣ ＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧ ＴＴＴ
ＴＣＧＴＴＣＣ ＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣ ＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡ ２９４０ ＧＡＡＡＡＧＡＴＣＣ ＣＣＧＧＧＴＡＣＣ
２９５９
【００２７】配列番号：4 配列の長さ：2959 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：コリネハ゛クテリム ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutamic
um) 株名：ATCC 13058 配列 GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGACCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATGTTGCTCT GACGCACGCG CAGCACGCAG 1500 CCGTGCTTGT CCTGGACATT GATGTGCCGA GCCACCAGGC CGGCGGGAAA ATCGAGCACA 1560 TAAACCCCGA GGTCTACGCG ATTTTGGAGC GCTGGGCACG CCTGGAAAAA GCGCCAGCTT 1620 GGATCGGCGT GAATCCACTG AGCGGGAAAT GCCAGCTCAT CTGGCTTATT GATCCGGTGT 1680 ATGTCGCAGC AGGCATGAGC AGCCCGAATA TGCGCCTGCT GGCTGCAACG ACCGAGGAAA 1740 TGACCCGCGT TTTCGGCGCT GACCAGGCTT TTTCACATAG GCTGAGCCGG TGGCCACTGC 1800 ACGTCTCCGA CGATCCCACC GCGTACCGCT GGCATGCCCA GCACAATCGC GTGGATCGCC 1860 TAGCTGATCT TATGGAGGTT GCTCGCATGA TCTCAGGCAC AGAAAAACCT AAAAAACGCT 1920 ATGAGCAGGA GTTTTCTAGC GGACGGGCAC GTATCGAAGC GGCAAGAAAA GCCACTGCGG 1980 AAGCAAAAGC ACTTGCCACG CTTGAAGCAA GCCTGCCGAG CGCCGCTGAA GCGTCTGGAG 2040 AGCTGATCGA CGGCGTCCGT GTCCTCTGGA CTGCTCCAGG GCGTGCCGCC CGTGATGAGA 2100 CGGCTTTTCG CCACGCTTTG ACTGTGGGAT ACCAGTTAAA AGCGGCTGGT GAGCGCCTAA 2160 AAGACACCAA GATCATCGAC GCCTACGAGC GTGCCTACAC CGTCGCTCAG GCGGTCGGAG 2220 CAGACGGCCG TGAGCCTGAT CTGCCGCCGA TGCGTGACCG CCAGACGATG GCGCGACGTG 2280 TGCGCGGCTA CGTCGCTAAA GGCCAGCCAG TCGTCCCTGC TCGTCAGACA GAGACGCAGA 2340 GCAGCCGAGG GCGAAAAGCT CTGGCCACTA TGGGAAGACG TGGCGGTAAA AAGGCCGCAG 2400 AACGCTGGAA AGACCCAAAC AGTGAGTACG CCCGAGCACA GCGAGAAAAA CTAGCTAAGT 2460 CCAGTCAACG ACAAGCTAGG AAAGCTAAAG GAAATCGCTT GACCATTGCA GGTTGGTTTA 2520 TGACTGTTGA GGGAGAGACT GGCTCGTGGC CGACAATCAA TGAAGCTATG TCTGAATTTA 2580 GCGTGTCACG TCAGACCGTG AATAGAGCAC TTAAGTCTGC GGGCATTGAA CTTCCACGAG 2640 GACGCCGTAA AGCTTCCCAG TAAATGTGCC ATCTCGTAGG CAGAAAACGG TTCCCCCCGT 2700 AGGGGTCTCT CTCTTGGCCT CCTTTCTAGG TCGGGCTGAT TGCTCTTGAA GCTCTCTAGG 2760 GGGGCTCACA CCATAGGCAG ATAACGGTTC CCCACCGGCT CACCTCGTAA GCGCACAAGG 2820 ACTGCTCCCA AAGATCGCCT AGCTGATCTT ATGGAGGTTG CTCGCATGAT CCTTTTTGAT 2880 AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 2940 GAAAAGATCC CCGGGTACC 2959
um) 株名：ATCC 13058 配列 GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGACCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATGTTGCTCT GACGCACGCG CAGCACGCAG 1500 CCGTGCTTGT CCTGGACATT GATGTGCCGA GCCACCAGGC CGGCGGGAAA ATCGAGCACA 1560 TAAACCCCGA GGTCTACGCG ATTTTGGAGC GCTGGGCACG CCTGGAAAAA GCGCCAGCTT 1620 GGATCGGCGT GAATCCACTG AGCGGGAAAT GCCAGCTCAT CTGGCTTATT GATCCGGTGT 1680 ATGTCGCAGC AGGCATGAGC AGCCCGAATA TGCGCCTGCT GGCTGCAACG ACCGAGGAAA 1740 TGACCCGCGT TTTCGGCGCT GACCAGGCTT TTTCACATAG GCTGAGCCGG TGGCCACTGC 1800 ACGTCTCCGA CGATCCCACC GCGTACCGCT GGCATGCCCA GCACAATCGC GTGGATCGCC 1860 TAGCTGATCT TATGGAGGTT GCTCGCATGA TCTCAGGCAC AGAAAAACCT AAAAAACGCT 1920 ATGAGCAGGA GTTTTCTAGC GGACGGGCAC GTATCGAAGC GGCAAGAAAA GCCACTGCGG 1980 AAGCAAAAGC ACTTGCCACG CTTGAAGCAA GCCTGCCGAG CGCCGCTGAA GCGTCTGGAG 2040 AGCTGATCGA CGGCGTCCGT GTCCTCTGGA CTGCTCCAGG GCGTGCCGCC CGTGATGAGA 2100 CGGCTTTTCG CCACGCTTTG ACTGTGGGAT ACCAGTTAAA AGCGGCTGGT GAGCGCCTAA 2160 AAGACACCAA GATCATCGAC GCCTACGAGC GTGCCTACAC CGTCGCTCAG GCGGTCGGAG 2220 CAGACGGCCG TGAGCCTGAT CTGCCGCCGA TGCGTGACCG CCAGACGATG GCGCGACGTG 2280 TGCGCGGCTA CGTCGCTAAA GGCCAGCCAG TCGTCCCTGC TCGTCAGACA GAGACGCAGA 2340 GCAGCCGAGG GCGAAAAGCT CTGGCCACTA TGGGAAGACG TGGCGGTAAA AAGGCCGCAG 2400 AACGCTGGAA AGACCCAAAC AGTGAGTACG CCCGAGCACA GCGAGAAAAA CTAGCTAAGT 2460 CCAGTCAACG ACAAGCTAGG AAAGCTAAAG GAAATCGCTT GACCATTGCA GGTTGGTTTA 2520 TGACTGTTGA GGGAGAGACT GGCTCGTGGC CGACAATCAA TGAAGCTATG TCTGAATTTA 2580 GCGTGTCACG TCAGACCGTG AATAGAGCAC TTAAGTCTGC GGGCATTGAA CTTCCACGAG 2640 GACGCCGTAA AGCTTCCCAG TAAATGTGCC ATCTCGTAGG CAGAAAACGG TTCCCCCCGT 2700 AGGGGTCTCT CTCTTGGCCT CCTTTCTAGG TCGGGCTGAT TGCTCTTGAA GCTCTCTAGG 2760 GGGGCTCACA CCATAGGCAG ATAACGGTTC CCCACCGGCT CACCTCGTAA GCGCACAAGG 2820 ACTGCTCCCA AAGATCGCCT AGCTGATCTT ATGGAGGTTG CTCGCATGAT CCTTTTTGAT 2880 AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 2940 GAAAAGATCC CCGGGTACC 2959
【図１】薬剤を含まないM-CM2G液体培地にて、高温(34
℃)にて培養した場合の、野生型複製起点と、温度感受
性変異型複製起点を持つAJ12036株のプラスミドpHSC4保
持性の推移を比較したものである。プラスミド保持性
は、液体培養を希釈後、クロラムフェニコールを含むM-
CM2Gプレートと、薬剤を含まないM-CM2Gプレートに塗布
し、低温(20℃)にて形成したコロニー数より、プラスミ
ド保持菌と、生菌数を計測、比較することにより測定し
た。
℃)にて培養した場合の、野生型複製起点と、温度感受
性変異型複製起点を持つAJ12036株のプラスミドpHSC4保
持性の推移を比較したものである。プラスミド保持性
は、液体培養を希釈後、クロラムフェニコールを含むM-
CM2Gプレートと、薬剤を含まないM-CM2Gプレートに塗布
し、低温(20℃)にて形成したコロニー数より、プラスミ
ド保持菌と、生菌数を計測、比較することにより測定し
た。
【図２】図１同様、薬剤を含まないM-CM2G液体培地に
て、高温(34℃)にて培養した場合の、野生型複製起点
と、温度感受性変異型複製起点を持つAJ12036株のプラ
スミドpHSC22保持性の推移を比較したものである。
て、高温(34℃)にて培養した場合の、野生型複製起点
と、温度感受性変異型複製起点を持つAJ12036株のプラ
スミドpHSC22保持性の推移を比較したものである。
【図３】図１同様、薬剤を含まないM-CM2G液体培地に
て、高温(34℃)にて培養した場合の、野生型複製起点
と、温度感受性変異型複製起点を持つAJ12036株のプラ
スミドpHSC23保持性の推移を比較したものである。
て、高温(34℃)にて培養した場合の、野生型複製起点
と、温度感受性変異型複製起点を持つAJ12036株のプラ
スミドpHSC23保持性の推移を比較したものである。
【図４】薬剤を含まないM-CM2G液体培地にて、高温(34
℃)にて培養した場合の、野生型複製起点を持つAJ12036
株のプラスミドpHC4保持性の推移を比較したものであ
る。
℃)にて培養した場合の、野生型複製起点を持つAJ12036
株のプラスミドpHC4保持性の推移を比較したものであ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/12 9/12 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:13） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−３５３１ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−３５３２ (72)発明者 佐藤 勝明 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 中央研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 中央研究所内 審査官 斎藤 真由美 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 1/21 C12N 15/00 - 15/90 C12P 13/00 - 13/24 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 （ａ）配列表の配列番号４に示される塩
基配列を有する野生型の複製起点部分に変異を有し、培
養温度が３１℃より低い温度においてコリネ型細菌細胞
内で自律複製できるが同温度が３１℃以上の温度では同
細胞内で自律複製ができないプラスミドに、コリネ型細
菌の染色体上に存在する遺伝子と相同な配列を有するＤ
ＮＡ断片を連結して組換えプラスミドを得、（ｂ）同組
換えプラスミドをコリネ型細菌細胞に導入し、（ｃ）同
細菌を３１℃以上の温度で培養し、（ｄ）同ＤＮＡ断片
と、同ＤＮＡ断片と相同な配列を有するコリネ型細菌の
染色体上に存在する遺伝子との間に相同組換えを生じせ
しめ、（ｅ）同ＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれたコ
リネ型細菌を選択することを特徴とする、ＤＮＡ断片が
染色体上に組み込まれたコリネ型細菌の調製方法。 - 【請求項２】請求項１記載のＤＮＡ断片が染色体上に組
み込まれたコリネ型細菌の調製方法において、同ＤＮＡ
断片が染色体上に組み込まれたコリネ型細菌を選択した
後で、さらに、（ａ）同ＤＮＡ断片と、同ＤＮＡ断片と
相同な配列を有するコリネ型細菌の染色体上に存在する
遺伝子との間に相同組換えを生じせしめ、（ｂ）コリネ
型細菌の染色体上に元来存在する同ＤＮＡ断片と相同な
配列を有する遺伝子、及び、同細菌の染色体上に組み込
まれた、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有す
る野生型の複製起点部分に変異を有し、培養温度が３１
℃より低い温度においてコリネ型細菌細胞内で自律複製
できるが同温度が３１℃以上の温度では同細胞内で自律
複製できないプラスミドに由来するＤＡＮを脱落させ、
（ｃ）同ＤＮＡ断片が、同ＤＮＡ断片と相同な配列を有
するコリネ型細菌の染色体上に存在する遺伝子に置き代
わったコリネ型細菌を選択することを特徴とする、ＤＮ
Ａ断片が染色体上に組み込まれたコリネ型細菌の調製方
法。 - 【請求項３】 プラスミドの複製起点部分が配列表の配
列番号１ないし３に示される塩基配列を有する請求項１
又は２記載の方法。 - 【請求項４】 遺伝子がブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム由来のチロシン及びフェニルアラニンによ
るフィードバック阻害が解除された３−デオキシ−Ｄ−
アラビノヘプツロソネート−７−ホスフェートシンター
ゼ遺伝子である請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項５】 遺伝子がブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム由来のリジン及びスレオニンによるフィー
ドバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼ遺伝子で
ある請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項６】 請求項４又は５記載の方法によって調製
されるコリネ型細菌。 - 【請求項７】 請求項６記載の細菌を培地に培養し、培
地中にチロシン、フェニルアラニン、又はリジンを生成
蓄積させ、これを採取することを特徴とする、発酵法に
よるチロシン、フェニルアラニン、又はリジンの製造
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-273348 | 1990-10-15 | ||
| JP27334890 | 1990-10-15 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3245291A Division JPH07108228B2 (ja) | 1990-10-15 | 1991-06-19 | 温度感受性プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07203977A JPH07203977A (ja) | 1995-08-08 |
| JP2763054B2 true JP2763054B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=17526647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7005223A Expired - Lifetime JP2763054B2 (ja) | 1990-10-15 | 1995-01-17 | コリネ型細菌の遺伝子組換え方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2763054B2 (ja) |
-
1995
- 1995-01-17 JP JP7005223A patent/JP2763054B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07203977A (ja) | 1995-08-08 |
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