JPH10165180A - Ｌ−リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コリネ型細菌のＬ−リジン生産能及び生育速
度を改善する。 【解決手段】 ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
をコードするＤＮＡ配列、及びジアミノピメリン酸デヒ
ドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列が増強されたコリ
ネ型細菌を、好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リ
ジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アミノ酸などの発
酵生産に用いられているコリネ型細菌に遺伝子操作の手
法を用いて改変を加え、該微生物を培養することによる
Ｌ−リジンの製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】飼料添加物として用いられているＬ−リ
ジンは通常、コリネ型細菌のＬ−リジン生産変異株を使
って発酵法により生産されている。現在知られている種
々のＬ−リジン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変
異により作られている。一方、コリネ型細菌において、
菌体内で自律増殖可能でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子
を有するベクタープラスミド（米国特許第4514502号参
照）、遺伝子の菌体への導入方法（特開平2-207791号
等）が開示されており、これらの技術を用いたＬ−スレ
オニンまたはＬ−イソロイシン生産菌育成の可能性が開
示されている（米国特許第4452890号、及び米国特許第4
442208号参照）。また、Ｌ−リジン生産菌育成に関して
も、ベクタープラスミドにＬ−リジン生合成に関与する
遺伝子を組み込み、菌体内で増幅させる技術（特開昭56
-160997号などがある）が知られている。

【０００３】Ｌ−リジン生合成遺伝子としては、例え
ば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（特開平
7-75578）やジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子（Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 391
7 (1987)）のように、Ｌ−リジン生合成に関与する遺伝
子をクローニングした例や、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-87788）、ジヒドロ
ジピコリン酸シンターゼ遺伝子（特公平6-55149）、ジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60
-62994）のように、遺伝子の増幅がＬ−リジン生産性に
影響を与える例が知られている。

【０００４】また、Ｌ−リジン生合成に関与する酵素の
うち、野生型ではフィードバック阻害を受ける酵素につ
いて、フィードバック阻害が解除された変異を有する酵
素遺伝子を導入してＬ−リジン生産性を向上させた例も
知られている。このような遺伝子として具体的には、ア
スパルトキナーゼ遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレ
ット）等が知られている。

【０００５】上記のように、Ｌ−リジン生合成遺伝子の
増幅、あるいは変異遺伝子の導入によって、一定の成果
が得られている。例えば、リジン及びスレオニンによる
協奏阻害が解除された変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
を保持するコリネ型細菌は、Ｌ−リジンを著量（約２５
ｇ／Ｌ）生産する。但し、該細菌は、変異型アスパルト
キナーゼ遺伝子を保持しない細菌と比較して生育速度が
低下する。また、変異型アスパルトキナーゼ遺伝子に加
え、さらにジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導
入することによってＬ−リジン生産性が向上するとの報
告（Applied and Environmental Microbiology 57(6),
1746-1752 (1991)）もある。但し、概細菌は、生育速度
が一層低下する。

【０００６】一方、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増強によ
り生育の改善が図られた例は報告されていない。また、
コリネ型細菌においては、Ｌ−リジン生合成遺伝子を複
数個組み合わせ、生育を抑制せずにＬ−リジン収率の大
幅な改善に成功した例は知られていないのが現状であ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、コリネ型細菌においてＬ-リジ
ン生合成遺伝子を複数個組み合わせて増強し、生育を抑
制せずにＬ−リジン収率を改善することを課題とする。
微生物を用いた物質の発酵生産を行なう場合、投入した
原料に対する目的物質の収率と並んで、生産速度は極め
て重要な因子であり、設備当りの生産速度を上げること
により目的物質を大幅に安価に製造することが出来る。
そのため、発酵収率と生産速度を両立させることは工業
的に極めて重要である。本発明は、コリネ型細菌を用い
たＬ−リジンの発酵生産を行なうに当たり、以上の様な
課題の解決方法を提示するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、コリネ
型細菌において、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる
協奏阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼをコ
ードするＤＮＡ配列と、ジアミノピメリン酸デカルボキ
シラーゼをコードするＤＮＡ配列とを併せて増強するこ
とにより、これらを単独で増強した場合と比べ、生育が
改善され、Ｌ−リジン生産速度を向上させることがで
き、更にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードするＤＮＡ配列を増強することにより、Ｌ−リジ
ン生産速度を一層向上できることにある。

【０００９】すなわち本発明は、Ｌ−リジン及びＬ−ス
レオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除され
たアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、及びジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮ
Ａ配列を含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組
換えＤＮＡである。また、上記各ＤＮＡ配列に加えてホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする
ＤＮＡ配列をさらに含む組換えＤＮＡを提供する。

【００１０】また、本発明は、Ｌ−リジン及びＬ−スレ
オニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された
アスパルトキナーゼを保持し、さらにジアミノピメリン
酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡが増強された
コリネ型細菌を提供する。さらに、このコリネ型細菌に
おいて、さらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼをコードするＤＮＡが増強されたコリネ型細菌を提
供する。

【００１１】さらに本発明は、上記のいずれかのコリネ
型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジン
を生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取する
ことを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供する。以
下、アスパルトキナーゼを「ＡＫ」、ＡＫをコードする
遺伝子を「lysC」、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによ
る協奏阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼを
「変異型ＡＫ」、変異型ＡＫをコードする遺伝子を「変
異型lysC」ともいう。また、ジアミノピメリン酸デカル
ボキシラーゼを「ＤＤＣ」、ＤＤＣをコードする遺伝子
をlysA、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
「ＰＥＰＣ」、ＰＥＰＣをコードする遺伝子を「ppc」
ともいう。

【００１２】尚、本発明においてコリネ型細菌とは、バ
ージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バ
クテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative B
acteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一
群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞
子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテリウム属
細菌、及び従来ブレビバクテリウム属に分類されていた
が現在コリネバクテリウム属菌として統合されたブレビ
バクテリウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌
と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 ＜１＞本発明に用いられるＬ−リジン生合成遺伝子の取
得 本発明に用いるＬ−リジン生合成遺伝子は、ＤＮＡ供与
体である細菌から染色体ＤＮＡを調製し、プラスミドベ
クター等を用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、
このライブラリーから所望の遺伝子を保持する株を選択
し、選択された株からその遺伝子が挿入された組換えＤ
ＮＡを回収することによって得られる。本発明に用いる
Ｌ−リジン生合成遺伝子のＤＮＡ供与体としては、所望
のＬ−リジン生合成遺伝子がコリネ型細菌細胞中で機能
する酵素タンパク質を発現するものであれば、特に制限
されないが、コリネ型細菌が好ましい。

【００１４】コリネ型細菌由来のlysC、lysA及びppc遺
伝子は、いずれも配列が知られているので、ポリメラー
ゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain
reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185
(1989)参照）によって増幅することにより取得すること
ができる。以下に、本発明に用いる各Ｌ−リジン生合成
遺伝子を取得する方法を例示する。

【００１５】（１）変異型lysCの取得 変異型lysCを含むＤＮＡ断片は、ＡＫ活性に対するＬ−
リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバッ
ク阻害が実質的に解除された変異株から調製することが
できる（WO94/25605国際公開パンフレット）。このよう
な変異株は、例えば、コリネ型細菌野生株に、通常の変
異処理法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異剤処理を
施し、変異処理した細胞群の中から取得することができ
る。ＡＫ活性の測定は、Miyajima,R et al;The Journal
of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方
法を用いることができる。このような変異株として、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacte
rium lactofermentum）野生株ATCC13869株（現在の名称
は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteri
um glutamicum)に変更されている）より変異処理により
誘導されたＬ−リジン生産菌AJ3445（FERM P-1944）が
最も好ましいものとして挙げられる。

【００１６】また、変異型lysCは、野生型lysCを含むプ
ラスミドＤＮＡをインビトロ変異処理することによって
も得られる。さらに、ＡＫのＬ−リジン及びＬ−スレオ
ニンによる相乗的なフィードバック阻害を解除する変異
が具体的に知られている（WO94/25605国際公開パンフレ
ット）ので、この情報に基づいて部位特異的変異法等に
より、野生型lysCから調製することもできる。

【００１７】コリネ型細菌からlysCを単離するには、例
えば、斎藤、三浦の方法（H.Saitoand K.Miura Bioche
m.Biophys.Acta, 72,619,(1963)）等により染色体ＤＮ
Ａを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（Ｐ
ＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al
;Trends Genet. 5,185(1989)参照）により、lysCを増
幅することによって行うことができる。

【００１８】ＤＮＡプライマーとしては、例えば、コリ
ネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となってい
る配列（Molecular Microbiology(1991),5(5),1197-120
4, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にし
て、lysCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配
列表配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有する
23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの
合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380
Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron
Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成でき
る。PCR反応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラー
PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者
により 指定された方法に従って行うことができる。

【００１９】ＰＣＲ法により増幅されたlysCは、E. col
i及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、
これをE. coli細胞に導入しておくと、後の操作がしや
すくなる。E. coli細胞内において自律複製可能なベク
ターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の
細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えば pUC1
9、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF10
10等が挙げられる。

【００２０】また、これらのベクターにコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断
片を挿入すると、E. coli及びコリネ型細菌の両方で自
律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用する
ことができる。このようなシャトルベクターとしては、
以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保
持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に
示した。

【００２１】 pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532) pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム SR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム SR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140)

【００２２】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。

【００２３】E. coliにプラスミドを導入して形質転換
するには D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymolog
y, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウ
ムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. an
d Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行う
ことができる。上記のようにしてＡＫ野生株からlysCを
単離すれば野生型lysCが得られ、ＡＫ変異株からlysCを
単離すれば変異型lysCが得られる。

【００２４】野生型lysCを含むＤＮＡ断片の塩基配列の
一例を、配列表配列番号３に示す。この塩基配列より推
定される野生型ＡＫタンパク質のαサブユニットのアミ
ノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列表の配列番号４に、
アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。また、ＤＮＡ塩
基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のβサブユ
ニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同時に配列表の配列番
号６に、アミノ酸配列のみを配列番号７に示す。尚、各
サブユニットとも、開始コドンにＧＴＧが用いられてお
り、対応するアミノ酸をメチオニンと表記しているが、
これは、メチオニン、バリン、またはフォルミルメチオ
ニンを表すものである。

【００２５】本発明に用いる変異型lysCとしては、Ｌ−
リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバッ
ク阻害が解除されたＡＫをコードするものであれば特に
制限されないが、野生型ＡＫのアミノ酸配列において、
αサブユニットではＮ末端から２７９番目のアラニン残
基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基
に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がアラ
ニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化す
る変異が挙げられる。ここで、野生型ＡＫのアミノ酸配
列としては、具体的にはαサブユニットでは配列表配列
番号５に示すアミノ酸配列が、βサブユニットでは配列
表配列番号７に示すアミノ酸配列が挙げられる。

【００２６】また、上記のアラニン以外かつ酸性アミノ
酸以外のアミノ酸残基として好ましいものは、スレオニ
ン残基、アルギニン残基、システイン残基、フェニルア
ラニン残基、プロリン残基、セリン残基、チロシン残基
及びバリン残基が挙げられる。尚、置換されるアミノ酸
残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードす
るものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株
の違いにより保持する野生型ＡＫのアミノ酸配列がわず
かに相異するものがあると予想される。このような酵素
の活性に関与しない１又は２以上の位置での１又は２以
上のアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入等による変
異を有するＡＫも本発明に使用することができる。この
ような自然変異を有するＡＫをコードするＤＮＡは、Ａ
Ｋを保持する微生物細胞から、例えば配列表の配列番号
３に記載の塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
を単離することによって、取得され得る。ここでいう
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハ
イブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成
されない条件をいう。この条件を明確に数値化すること
は困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同
士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハ
イブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハ
イブリダイズしない条件、あるいは温度が完全にマッチ
したハイブリッドのＴｍ〜（Ｔｍ−３０）℃、好ましく
はＴｍ〜（Ｔｍ−２０）℃の範囲で、かつ１×ＳＳＣ、
好ましくは０．１×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリ
ダイズする条件が挙げられる。

【００２７】さらに、ＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ
−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除
に実質的に影響のない限り、他の１又は２以上のアミノ
酸の置換、欠失あるいは挿入等による人工変異を有する
ＡＫも使用できる。このような人工変異を有するＡＫを
コードするlysCは、例えば部位特異的変異法によって、
特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、あるいは挿入され
るように塩基配列を改変することによって得られる。ま
た、このような変異を有するlysCは、従来知られている
突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理と
しては、lysCを含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でイ
ンビトロ処理する方法、及びlysCを含むＤＮＡを保持す
る微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ
−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通
常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理す
る方法が挙げられる。変異処理した後、変異処理された
ＤＮＡ又は変異処理された微生物から、これらがコード
し又は産生するＡＫがＡＫ活性を保持し、かつ、ＡＫの
アミノ酸配列が変異したものを選択することによって、
変異を導入することができる位置、又は変異が生じた位
置を決定することができる。導入される変異の位置は、
ＡＫ活性及びフィードバック阻害の解除に実質的に影響
のない限り、特に制限されない。また、導入される変異
の数は、タンパク質の立体構造における変異されるアミ
ノ酸の位置や種類によっても異なり、ＡＫ活性及びフィ
ードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、特に
制限されないが、通常、１〜２０個、好ましくは１〜１
０個である。

【００２８】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム野生型株であるAJ12036株（FERMBP-734）に変異型lys
Cプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２
年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目
１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託され、１
９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、FERMBP-4999の受託番号で寄託されてい
る。

【００２９】（２）lysAの取得 lysAを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCR
により調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特
に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムATCC13869株が挙げられる。コリネ型細菌にお
いては、lysAはargS（アルギニル−tRNAシンターゼ遺伝
子）とともにオペロンを形成しており、argSの下流にly
sAが存在している。lysAの発現は、argSの上流にあるプ
ロモーターによって調節を受ける（Journal of Bacteri
ology Nov., 7356-7362 (1993)参照）。これらの遺伝子
の塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムにお
いて既知であり（Molecular Microbiology 4(11), 1819
-1830 (1990)、Molecular and General Genetics 212,
112-119 (1988)参照）、これを基にしてPCR用DNAプライ
マーを調製することができる。このようなDNAプライマ
ーとして具体的には、配列表の配列番号８（Molecular
Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)に記載されてい
る塩基配列において塩基番号１１〜３３に相当する）及
び配列番号９（Molecular and General Genetics 212,
112-119 (1988)に記載の塩基配列において塩基番号１３
７０〜１３９２に相当する）に示す塩基配列を有する各
々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反
応、得られたlysAを含むプラスミドの調製等は、前記の
lysCの場合と同様にして行うことができる。

【００３０】後記実施例では、lysAを増強するために、
プロモーター、argS及びlysAを含むＤＮＡ断片を用いた
が、argSは本発明に必須ではなく、lysAがプロモーター
の直下に連結されたＤＮＡ断片を用いてもよい。argS及
びlysAを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコー
ドすると予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号１０
に示す。また、argSがコードするアミノ酸配列の一例を
配列番号１１に、lysAがコードするアミノ酸配列の一例
を配列番号１２に示す。本発明には、このアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号１２に示すアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤ
Ｃ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上の位置
での１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入
等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
断片も同様に使用できる。このような自然変異又は人工
変異を有するlysAは、前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン
及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害
の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫをコード
するＤＮＡと同様にして取得することができる。

【００３１】（３）ppcの取得 ppcを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRに
より調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に
制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムATCC13869株が挙げられる。ppc遺伝子は、コリネ
バクテリウム グルタミカムにおいて既知であり（O'Re
gan, M., et al., Gene, 77, 237-251 (1989)）、これ
を基にしてPCR用プライマーを調製することができる。
このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の
配列番号１３及び１４に記載の塩基配列を有する各々23
merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得
られたppcを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの
場合と同様にして行うことができる。

【００３２】ppcを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの
配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１５に示
す。また、アミノ酸配列のみを配列番号１６に示す。本
発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の
他、配列番号１６に示すアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列、すなわちＰＥＰＣ活性に実質的に影響が
ない限り、１又は２以上の位置での１又は２以上のアミ
ノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用でき
る。このような自然変異又は人工変異を有するppcは、
前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンに
よる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響
のない変異を有するＡＫをコードするＤＮＡと同様にし
て取得することができる。

【００３３】コリネ型細菌由来のppcは、gap（グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）、pg
k（ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子）、及びtpi（ト
リオースリン酸イソメラーゼ遺伝子）とともにオペロン
を形成しており、tpiの下流にppcが存在している。ppc
の発現は、pgkの上流にあるプロモーターによって調節
を受ける（Schwinde, J.W. et al., J. Bacteriol., 17
5(12), 3905-3908 (1993)参照）。したがって、前記lys
Aと同様に、ppcをpgk、tpiとともにＰＣＲにより増幅
し、プロモーター、pgk、tpi及びppcを含むＤＮＡ断片
を用いることができる。また、後記実施例に示すよう
に、ＰＥＰＣのコード領域の上流に適当なプロモーター
を連結したものを使用することもできる。このようなプ
ロモーターとしては、lysCのプロモーター、E. coli由
来のtacプロモーター、trcプロモーター等が挙げられ
る。

【００３４】＜２＞本発明の組換えＤＮＡ及びコリネ型
細菌 本発明の組換えＤＮＡは、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニ
ンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアス
パルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、及びジアミノ
ピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列
を含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤ
ＮＡである。本発明のＤＮＡの好ましい態様は、上記各
ＤＮＡ配列に加えてホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼをコードするＤＮＡ配列をさらに含む組換えＤ
ＮＡである。

【００３５】また、本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジ
ン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質
的に解除されたアスパルトキナーゼ（変異型ＡＫ）を保
持し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコード
するＤＮＡ配列（lysA）が増強されたものである。本発
明のコリネ型細菌として好ましい態様は、さらに、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤ
ＮＡ配列（ppc）が増強されたコリネ型細菌である。こ
こでＤＮＡの「増強」とは、遺伝子のコピー数を高くす
る、プロモーターを強力なものを使用する、比活性の高
い酵素をコードする遺伝子を使用する、あるいはこれら
を組み合わせるなどして、そのＤＮＡによりコードされ
る酵素の細胞中の活性を高くすることをいう。

【００３６】変異型ＡＫを保持するコリネ型細菌として
は、突然変異によって変異型アスパルトキナーゼを産生
するようになったものでもよく、また、変異型lysCを導
入することによって形質転換されたものでもよい。上記
ＤＮＡを導入するコリネ型細菌の例としては、例えば次
のようなＬ−リジン生産性野生株が挙げられる。

【００３７】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14020 （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869 （コリネバクテリウム・リリウム） ATCC15990 （ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14067 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)

【００３８】また、上記菌株以外にも、これらの菌株か
ら誘導されたＬ−リジン生産能を有する変異株等も、宿
主として利用できる。この様な人工変異株としては次の
様なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイ
ン（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（N
RRL B-11470）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、
特公昭57-14157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474
号、特公昭58-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35
840号、特公昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5
-11958号、特公平7-112437号、特公平7-112438号参
照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要と
する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、A
ECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラ
ニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国
特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ
−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタ
ム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイ
ド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生
産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラー
ゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生
産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開
昭52-102498号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、
特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995
号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1
833号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジ
ン生産変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、
フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受
性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特
開昭53-86090号）、エチレングリコールに耐性を示し、
Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリ
ネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997
号）。

【００３９】上記のような宿主においてＬ−リジン生合
成遺伝子を増強するには、具体的な例としては、これら
の遺伝子をプラスミドベクター、トランスポゾン、ファ
ージベクター等を用いて宿主に導入する。その際、低コ
ピー型のベクターを用いてもある程度の増強は期待でき
るが、マルチコピー型のベクターを用いることが好まし
い。そのようなベクターとして、上記pAJ655、pAJ184
4、pAJ611、pAJ3148及びpAJ440等のプラスミドベクター
が挙げられる。また、コリネ型細菌由来のトランスポゾ
ンは、WO02/02627国際公開パンフレット、WO93/18151国
際公開パンフレット、欧州特許公開0445385号、特開平6
-46867号、Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 1
1, 739-746 (1994)、Bonamy, C., et al., Mol. Microb
iol., 14,571-581 (1994)、Vertes, A. A. et al., Mo
l. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)、Jagar, W. et
al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995)、
特開平7-107976号、特開平7-327680号等に記載されてい
る。

【００４０】尚、本発明において、変異型lysCは必ずし
も増強されている必要はなく、前記したように染色体Ｄ
ＮＡ上のlysCに変異を有するもの、あるいは変異型lysC
が染色体ＤＮＡに組み込まれたものでもよいが、プラス
ミドベクターを用いて導入されても差し支えない。一
方、lysA及びppcは、効率よくＬ−リジンを生産させる
ためには増強されていることが好ましい。

【００４１】lysC、lysA及びppcの各遺伝子の導入は、
それぞれ別個のベクターを用いて宿主に順次導入しても
よく、単一のベクターを用いて２種類又は３種類の遺伝
子を共に導入してもよい。別個のベクターを用いる場合
には、遺伝子の導入の順序は問わないが、宿主での安定
な分配保持機構を有し、互いに共存可能なベクターを用
いることが好ましい。

【００４２】変異型ＡＫを保持し、さらにlysAが増強さ
れたコリネ型細菌は、例えば、変異型lysC、及びlysAを
含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮ
Ａを宿主コリネ型細菌に導入することによって、得られ
る。また、変異型lysC及びlysAに加え、さらに、ppcが
増強されたコリネ型細菌は、例えば、変異型lysC、lysA
及びppcを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な
組換えＤＮＡを宿主コリネ型細菌に導入することによっ
て、得られる。また、変異型lysC、lysA及びppcが増強
されたコリネ型細菌は、変異型lysC及びlysAが増強され
たコリネ型細菌に、ppcを含みコリネ型細菌細胞中で自
律増殖可能な組換えＤＮＡを導入することによっても得
られる。

【００４３】上記のような組換えＤＮＡは、例えば、プ
ラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクター
等のベクターに、Ｌ−リジン生合成遺伝子の各々を挿入
することによって得られる。

【００４４】宿主への組換えＤＮＡの導入の方法は、プ
ラスミドの場合、電気パルス法（杉本ら、特開平2-2077
91号公報）によって行うことができる。トランスポゾン
を用いた遺伝子の増幅は、プラスミドにトランスポゾン
を搭載させて細胞内に導入し、トランスポゾンの転位を
誘導することにより行なうことができる。

【００４５】＜３＞Ｌ−リジンの製造法 上記のようにしてＬ−リジン生合成遺伝子が増強された
コリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−
リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採
取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造すること
ができる。使用する培地としては、炭素源、窒素源、無
機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通
常の培地が挙げられる。

【００４６】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの
糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を
用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機ア
ンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモ
ニアガス、アンモニア水等を用いることができる。

【００４７】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適
量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応
じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マ
ンガンイオン等が少量添加される。培養は好気的条件下
で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３
７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好まし
い。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいは
アルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用すること
ができる。培養物からのＬ−リジンの採取は通常のイオ
ン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせ
ることにより実施できる。

【００４８】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【実施例１】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム野生型lysC遺伝子の取得

【００４９】＜１＞野生型及び変異型lysCの取得、及び
それらを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
株、及びATCC13869株より変異処理により得られたＬ−
リジン生産性変異株AJ3445（FERM P-1944）を染色体Ｄ
ＮＡの供与体として用いた。AJ3445株は、変異によりly
sCがリジン及びスレオニンによる協奏阻害が実質的に解
除されている（Journal of Biochemistry68, 701-710
(1970)）。

【００５０】染色体DNAよりPCR法（polymerase chain r
eaction；White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(198
9)参照）によりlysCを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅
に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタ
ミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Micr
obiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)
224,317-324参照）を基にしてlysCをコードする約1643b
pの領域を増幅すべく、配列番号１及び配列番号２に示
す塩基配列を有する23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡを合
成した。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ
合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用
いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法
に従って合成した。

【００５１】PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマ
ルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを
用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅
を行なった。増幅された1643kbの遺伝子断片をアガロー
スゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した
該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造
（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断し
た。

【００５２】遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpH
SG399（Takeshita, S et al;Gene(1987),61,63-74参
照）を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）
製）及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅されたlysC断
片と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行
なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム染色体より増幅されたlysC断片が
接続されたプラスミドを作製した。野生株であるATCC13
869株由来のlysCを有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リ
ジン生産菌であるAJ3463由来のlysCを有するプラスミド
をp399AK9と命名した。

【００５３】p399AKYおよびp399AK9に、それぞれコリネ
バクテリウム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にす
る能力をもつＤＮＡ断片（以下「Brevi.-ori」と記す）
を導入し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能
なlysCを搭載したプラスミドを作製した。Brevi.-ori
は、これを含み、エシェリヒア・コリと、コリネバクテ
リウム属細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミ
ドベクターpHK4から調製した。pHK4は、pHC4をKpnI（宝
酒造（株）製）及びBamHI（宝酒造（株）製）で切断
し、Brevi.-ori断片を抽出し、同じくKpnI及びBamHIに
て切断したpHSG298に接続することによって構築される
（特開平5-7491号公報参照）。pHK4は、宿主にカナマイ
シン耐性を付与する。尚、pHK4を保持するエシェリヒア
・コリHB101は、エシェリヒア・コリ AJ13136と命名さ
れ、１９９５年８月１日に、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つ
くば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5186とし
て寄託されている。

【００５４】pHK4を、制限酵素KpnI及びBamHIにて切断
し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunti
ng kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて
行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー
（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分
のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される
様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生
じたBrevi.-ori ＤＮＡ断片を同じくBamHIにて切断した
p399AKY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウム属細菌
中で自律複製可能でかつlysC遺伝子を含むプラスミドを
作製した。

【００５５】p399AKY由来の野生型lysC遺伝子を含むプ
ラスミドをp399AKYBと命名し、p399AK9由来の変異型lys
C遺伝子を含むプラスミドをp399AK9Bと命名した。p399A
K9B、p399AKYB構築の過程を図１に示す。ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム野生株であるAJ12036株
（FERM BP-734）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導
入した株AJ12691は、１９９２年４月１０日に通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号F
ERM P-12918として寄託され、１９９５年２月１０日に
ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-
4999の受託番号で寄託されている。

【００５６】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの野生型lysC及び変異型lysCの塩基配列の決定 野生型lysCを含むプラスミドp399AKY及び変異型lysCを
含むプラ スミドp399AK9を各々の形質転換体から調製
し、野生型及び変異型lysCの塩基配列の決定を行なっ
た。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et
al :Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）に
よった。

【００５７】p399AKYにコードされている野生型lysCの
塩基配列を配列表の配列番号３に示す。一方、p399AK9
にコードされている変異型lysCの塩基配列は野生型lysC
と比べ、配列番号３において１０５１番目のＧがＡに変
化しているという１塩基の変異のみを有していた。コリ
ネバクテリウム・グルタミカムのlysCは、同一のＤＮＡ
鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディング
フレームでコードされていることが知られているが（Ka
linowski,J et al;Molecular Microbiology(1991)5(5),
1197-1204参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一
のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリー
ディングフレームでコードされていると考えられる。

【００５８】ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫ
タンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配
列と同時に配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを
配列番号５に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定され
る野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配
列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配
列のみを配列番号７に示す。尚、各サブユニットとも、
開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ
酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニ
ン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すもので
ある。

【００５９】一方、変異型lysC配列上の変異は、野生型
ＡＫタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５、７）にお
いて、αサブユニットでは２７９番目のアラニン残基が
スレオニン残基に、βサブユニットでは３０番目のアラ
ニン残基がスレオニン残基にというアミノ酸残基置換を
起こしていることを意味する。

【００６０】

【実施例２】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムlysAの取得 ＜１＞lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC138
69株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロン
のプロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用
いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グ
ルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular
Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular an
d General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）を基に
してアルギニル−tRNAシンターゼ及びＤＤＣをコードす
る約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号８及
び９に記載の塩基配列を有する各々23merの合成ＤＮＡ
を用いた。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同
様にして行った。増幅された３５７９ｂｐの遺伝子断片
のクローン化用のベクターにはpHSG399を用いた。pHSG3
99を制限酵素SmaI（宝酒造(株)製）にて切断し、増幅さ
れたlysAを含むＤＮＡ断片と接続した。この様にして取
得したATCC13869由来のlysAを有するプラスミドをp399L
YSAと命名した。

【００６１】更に、p399LYSAをKpnI（宝酒造(株)製）と
BamHI（宝酒造(株)製）で切断することにより、lysAを
含むＤＮＡ断片を抽出した。このＤＮＡ断片を、pHSG29
9をKpnIとBamHIで切断したものと連結した。得られたプ
ラスミドをp299LYSAと命名した。p299LYSA構築の過程を
図２示す。得られたp299LYSAにBrevi.-oriを導入し、コ
リネ型細菌中で自律複製可能なlysAを搭載したプラスミ
ドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHIで切断
し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunti
ng kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて
行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー
（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分
のDNA断片をKpnIのみによる切断によって切り出される
様改変した。このプラスミドをKpnIにより切断し、生じ
たBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp299LYS
Aに接続し、コリネ型細菌中で自律複製可能でかつlysA
を含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpL
YSABと命名した。pLYSAB構築の過程を図３に示す。

【００６２】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムlysAの塩基配列の決定 p299LYSAのプラスミドDNAを調製し、実施例１と同様に
して塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及び
この配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列
番号１０に示す。また、この塩基配列のうち、argSがコ
ードするアミノ酸配列及びlysAがコードするアミノ酸配
列を、各々配列番号１１及び１２に示す。

【００６３】

【実施例３】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムppcの取得 ＜１＞ppcの取得 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC138
69株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRにより、ppcをＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用
いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グ
ルタミカムにおいて既知となっている配列（O'Regan,
M., et al., Gene, 77, 237-251 (1989)）を基にしてＰ
ＥＰＣをコードする約3.3kbの領域を増幅すべく、配列
表の配列番号１３及び１４に記載の塩基配列を有する各
々23merの合成ＤＮＡを用いた。ＤＮＡの合成及びPCR反
応は、実施例１と同様にして行った。

【００６４】増幅された約３３００ｂｐの遺伝子断片を
アガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切
り出した該断片を常法により精製し、制限酵素SalI（宝
酒造(株)製）にて切断した。ppc遺伝子のクローン化用
ベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399を制限酵素SalI
（宝酒造(株)製）にて切断し、増幅されたppcを含むＤ
ＮＡ断片と接続した。この様にして取得したATCC13869
由来のppcを有するプラスミドpPCFを得た。

【００６５】＜２＞ppc遺伝子とlysCプロモーターとの
連結 上記のようにして得られたpPCFを制限酵素DraI（宝酒造
(株)製）で切断し、ＰＥＰＣ構造遺伝子の上流約１５０
ｂｐのＤＮＡ断片を削除した後、自己連結して、プラス
ミドpPCFdsを得た。さらに、pPCFdsを制限酵素SalI（宝
酒造(株)製）で切断し、切断面を平滑末端化した。平滑
末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、
指定された方法にて行なった。

【００６６】一方、実施例１で得た野生型lysC遺伝子を
含むプラスミドp399AKYBを制限酵素ApaLI及びPstI（い
ずれも宝酒造(株)製）で切断し、前記と同様にして切断
面を平滑末端化した。得られる２つのＤＮＡ断片のうち
短い方の断片は、Brevi.-oriとlysCのプロモーター部分
を含んでいる。このＤＮＡ断片と上記のpPCFdsをSalIで
切断後平滑末端化した断片とを、ＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造（株）製）を用いて連結した。

【００６７】ライゲーション反応液中のＤＮＡを、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869に電
気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）にて導入
した。形質転換体の選択は、クロラムフェニコール５μ
ｇ／ｍｌを含む完全培地にて行なった。形質転換体より
プラスミドＤＮＡを回収し、EcoRIで切断し、lysCプロ
モーターとppc構造遺伝子が順方向に連結したプラスミ
ドを取得した。このプラスミドをpAKPFdsと命名した。p
AKPFds構築の過程を図４に示す。以下、このlysCプロモ
ーターが連結したppcを、「野生型高発現型ppc」とい
う。

【００６８】＜３＞野生型高発現型ppcのベクターへの
挿入 上記で得られた野生型高発現型ppcを、Brevi.-ori以外
のコリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な複製開始点を有
するベクターに挿入するために、PCR法によって増幅し
た。プライマーには、コリネバクテリウム・グルタミカ
ムにおいて既知となっているlysCの塩基配列（Molecula
r Microbiology(1991)5(5),1197-1204,Mol.Gen.Genet.
(1990)224,317-324参照）を基にして合成したlysCプロ
モーター部分に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号
１７）、及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおい
て既知となっているppcの配列（O'Regan, M., et al.,
Gene, 77, 237-251 (1989)）を基にして合成したppc部
分に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号１８）を用
いた。これらのプライマーは、野生型高発現型ppcを含
む約３１５０ｂｐの断片を増幅することができ、増幅さ
れたDNA断片の末端を制限酵素KpnIによって切断できる
ように設計されている。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、
実施例１と同様にして行った。

【００６９】野生型高発現型ppcをコリネ型細菌型細菌
に導入するためのベクターには、新規に構築したコリネ
型細菌用クローニングベクターpVK7を用いた。pVK7は、
以下のようにして、E. coli用ベクターであるpHSG299
（Km^r；Takeshita, S. et al.,Gene, 61, 63-74, (198
7)参照）にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
のクリプティックプラスミドであるpAM330を結合するこ
とによて構築した。pHSG299を一箇所切断酵素であるAva
II（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒造（株）
製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端
化したpAM330と接続した。pHSG299に対するpAM330の挿
入方向により、生成した２種類のプラスミドをpVK6、pV
K7と命名し、pVK7を以下の実験に用いた。pVK7は、E. c
oli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマ
ルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。
pVK6及びpVK7の構築の過程を図５に示す。

【００７０】前記のPCRによって増幅された野生型高発
現型ppcを含む約３１５０ｂｐの断片を、アガロースゲ
ル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断
片を常法により精製し、制限酵素KpnI（宝酒造(株)製）
にて切断した。このＤＮＡ断片を、制限酵素KpnIにて切
断したpVK7と接続した。このプラスミドをpPwmと命名し
た。pPwm構築の過程を図６に示す。

【００７１】

【実施例４】 変異型lysC及びlysAを併せ持つプラスミ
ドの作製変異型lysC及びBrevi.-oriを有するプラスミド
p399AK9Bと、lysAを有するプラスミドp299LYSAより、変
異型lysC、lysAおよびコリネ型細菌の複製起点を有する
プラスミドを作製した。p299LYSAを制限酵素BamHI（宝
酒造(株)製）とKpnI（宝酒造(株)製）で切断した後、平
滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造
（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この
ＤＮＡ断片を、p399AK9BをSalIで切断した後平滑末端化
したものと接続した。こうして、変異型lysC及びlysAを
有し、コリネ型細菌中で自律増殖可能なプラスミドを作
製し、pCLと命名した。pCLの作製過程を図７に示す。

【００７２】

【比較例１】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムdapA、dapB、ddhの取得 lysC、lysA及びppc以外のL−リジン生合成遺伝子とし
て、dapA（ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子）、
dapB（ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子）、dd
h（ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）を、
以下のようにして取得した。

【００７３】＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムdapAの取得及びそれを含有するプラスミドの作
製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC138
69株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRによりdapAを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅
に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタ
ミカムにおいて既知となっている配列（Nucleic Acids
Research 18(21), 6421 (1990)、EMBL accession No.X5
3993参照）を基にしてＤＤＰＳをコードする約1.5kbの
領域を増幅すべく、配列表の配列番号１９及び２０に記
載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡを合成した。
ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行
った。増幅された１４１１ｂｐの遺伝子断片のクローン
化用のベクターにはpCR1000（Invitrogen社製；Bio/Tec
hnology 9, 657-663 (1991)参照）を用い、増幅したdap
A断片と接続した。DNAの接続はDNAライゲーションキッ
ト（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行な
った。この様にしてpCR1000にブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム染色体より増幅されたdapA断片１４
１１ｂｐの接続されたプラスミドを作製した。この様に
して取得したATCC13869由来のdapAを有するプラスミド
をpCRDAPAと命名した。

【００７４】E. coliJM109株にpCRDAPAを導入して得ら
れた形質転換株AJ13106株は、１９９５年５月２６日よ
り通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便
番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）
に受託番号FERM BP-5113の受託番号で、ブダペスト条約
に基づき国際寄託されている。作製したpCRDAPAにBrev
i.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なdapA
を搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI
及びBamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平
滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造
（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑
末端化後、リン酸化済みSmaIリンカー（宝酒造（株）
製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をSma
Iのみによる切断によって切り出される様改変した。こ
のプラスミドをSmaIにより切断し、生じたBrevi.-oriDN
A断片を同じくSmaIにて切断したpCRDAPAに接続し、コリ
ネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapAを含むプラスミド
を作製した。このプラスミドをpDPSBと命名した。pDPSB
（Km^r）の構築過程を図８に示す。

【００７５】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムdapBの取得及びそれを含有するプラスミドの作
製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC
13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC138
69株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRによりdapBを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅
に用いたDNAプライマーはブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムにおいて既知となっている配列（Journa
l of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)参照）を
基にしてＤＤＰＲをコードする約2.0kbの領域を増幅す
べく、配列表の配列番号２１及び２２に記載の塩基配列
を有する各々23merのＤＮＡ断片を合成した。ＤＮＡの
合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増
幅された２００１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用ベク
ターにはpCR-Script（Invitrogen社製）を用い、増幅し
たdapB断片と接続した。この様にしてpCR-Scriptにブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅
されたdapB断片２００１ｂｐの接続されたプラスミドを
作製した。この様にして取得したATCC13869由来のdapB
を有するプラスミドをpCRDAPBと命名した。E. coliJM10
9株にpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107株
は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県
つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114の
受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されてい
る。

【００７６】更に、pCRDAPBをEcoRVとSphIで切断する事
により、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片を
抽出した。この断片を、pHSG399をHincIIおよびSphIに
て切断したものと連結したプラスミドを作成した。この
作成したプラスミドをp399DPRと命名した。

【００７７】作製したp399DPRにBrevi.-oriを導入し、
コリネ型細菌中で自律複製可能なdapBを搭載したプラス
ミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）
製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化
はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定さ
れた方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBa
mHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBre
vi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって
切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIによ
り切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくBamHIにて
切断したp399DPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖
可能でかつdapBを含むプラスミドを作製した。作製した
プラスミドをpDPRBと命名した。pDPRB構築の過程を図９
に示す。

【００７８】＜３＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムddhの取得及びそれを含有するプラスミドの作
製 ddh遺伝子は、コリネバクテリウム グルタミカム（Cor
ynebacterium glutamicum）のddh遺伝子の既知のヌクレ
オチド配列（Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res.,
15, 3917 (1987)）をもとに作成した２種のオリゴヌク
レオチドプライマー（配列番号２３、２４）を用いたＰ
ＣＲ法により、ブレビバクテリウム ラクトファーメン
タム ATCC13869 の染色体ＤＮＡからddh遺伝子を増幅す
ることによって得た。得られた増幅ＤＮＡ断片をEcoT22
IとAvaIで切断し、末端を平滑化した後、pMW119のSmaI
部位に挿入し、プラスミドpDDHを得た。

【００７９】次に、pDDHをSalIとEcoRIにて切断し、平
滑末端化した後、得られた断片をSmaIで切断したpUC18
と連結した。こうして得られたプラスミドをpUC18DDHと
命名した。pUC18DDHにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細
菌中で自律複製可能なddhを搭載したプラスミドを作製
した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHIで切断し、切断面
を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝
酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。
平滑末端化後、リン酸化済みPstIリンカー（宝酒造
（株）製）を接続し、pHSG299のPstI部位に挿入した。
このようにして作製したプラスミドをpPK4と命名した。
次に、pUC18DDHをXbaIとKpnIで切断し、生じたddh断片
をKpnIとXbaIで切断したpPK4に接続した。このようにし
て、コリネ型細菌中で自律複製可能で、かつ、ddhを含
むプラスミドを作製し、このプラスミドをpPK4Dと命名
した。pPK4D構築の過程を図１０に示す。

【００８０】

【比較例２】 変異型lysCと、dapA、dapB又はddhとを併
せ持つプラスミドの作製 ＜１＞変異型lysC及びdapAを併せ持つプラスミドの作製 dapAを有するプラスミドpCRDAPAと変異型lysC及びBrev
i.-oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lysC、
dapAおよびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミド
を作製した。p399AK9BをSalIにて完全分解した後、平滑
末端化し、EcoRIリンカーを接続する事によりSalI部位
をEcoRI部位に改変したプラスミドを作製した。得られ
たプラスミドをp399AK9BSEと命名した。p399AK9BSEをEc
oRIにて部分分解することよって変異型lysCとBrevi.−o
riを一つのフラグメントとして切り出した。このフラグ
メントをpCRDAPAをEcoRIにて切断したものと連結した。
得られたプラスミドをpCRCABと命名した。このプラスミ
ドはE. coliとコリネ型細菌中で自律増殖可能で、かつ
宿主にカナマイシン耐性を付与し、変異型lysCとdapAを
併せ保持しているプラスミドである。pCRCABの作製過程
を図１１に示す。

【００８１】＜２＞変異型lysC及びdapBを併せ持つプラ
スミドの作製 変異型lysCを有するプラスミドp399AK9とdapBを有する
プラスミドp399DPRより、変異型lysC、dapBを含むプラ
スミドを作製した。p399DPRをEcoRVとSphIで切断するこ
とにより、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片
を抽出した。この断片を、p399AK9をSalIで切断した後
平滑末端化し、更にSphIにて切断したものと結合し、変
異型lysCとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。この
プラスミドをp399AKDDPRと命名した。

【００８２】次に、得られたp399AKDPRにBrevi.-oriを
導入した。Brevi.-oriを含むプラスミドpHK4を制限酵素
KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端
化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）
製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化
後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を
接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみ
による切断によって切り出される様改変した。このプラ
スミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片
を同じくBamHIにて切断したp399AKDDPRに接続し、コリ
ネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysCおよびdapB
を含むプラスミドを作製し、pCBと命名した。pCBの構築
の過程を図１２に示す。

【００８３】＜３＞変異型lysC及びddhを併せ持つプラ
スミドの作製 ddhを含むプラスミドpUC18DDHと変異型lysC及びBrevi.-
oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lysC、ddh
およびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを作
製した。pUC18DDHを制限酵素EcoRI（宝酒造（株）製）
にて切断し、平滑末端化し、この末端にSalIポリリンカ
ーを接続し、EcoRI部位をSalI部位に改変した。このプ
ラスミドをSalIで切断し、ddhを含むＤＮＡ断片を取得
した。

【００８４】次に、p399AK9Bを制限酵素SalIで切断し、
上記ddhを含むＤＮＡ断片と接続した。こうして、変異
型lysC、ddh及びBrevi.-oriを有し、コリネ型細菌中で
自律増殖可能なプラスミドを作製し、pCDと命名した。p
CDの構築の過程を図１３に示す。

【００８５】

【実施例５】 Ｌ−リジン生合成遺伝子を含むプラスミ
ドのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リ
ジン生産菌への導入 上記のようにして作製されたＬ−リジン生合成遺伝子を
有するプラスミドp399AK9B（Cm^r）、pLYSAB（Cm^r）、pP
wm（Km^r）、pCRCAB（Km^r）、pCB（Cm^r）、pCD（Cm^r）、
pCL（Cm^r）をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムＬ−リジン生産菌であるＡＪ１１０８２（ＮＲＲＬ
Ｂ−１１４７０）に導入した。ＡＪ１１０８２株は、Ａ
ＥＣ耐性の性質を有する。プラスミドの導入の方法は、
電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっ
た。形質転換体の選択は各々のプラスミドが持つ薬剤耐
性マーカーによった。クロラムフェニコール耐性遺伝子
を有するプラスミドを導入した場合は５μg/mlのクロラ
ムフェニコールを含む完全培地にて、また、カナマイシ
ン耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合には２
５μg/mlのカナマイシンを含む完全培地にて形質転換体
の選択を行なった。

【００８６】得られた形質転換体のうち、変異型lysC及
びlysAが増強された株（AJ11082/pCL）にpPwm（Km^r）を
導入して、変異型lysC、lysA及びppcの３者が増強され
た株（AJ11082/pCL/pPwm）を得た。形質転換体の選択
は、５μg/mlのクロラムフェニコールと２５μg/mlのカ
ナマイシンを含む完全培地にて行なった。

【００８７】

【実施例６】 Ｌ−リジンの製造 実施例５で取得した各形質転換体をＬ−リジン生産培地
にて培養し、そのＬ−リジン生産能を評価した。Ｌ−リ
ジン生産培地の組成は以下に示す通りである。

【００８８】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０
に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌
した炭酸カルシウムを５０ｇ加える。

【００８９】 グルコース 100 g （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ 55 g ＫＨ₂ＰＯ₄ 1 g ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g

【００９０】上記組成の培地に各種形質転換体及び親株
を植菌し、31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養４０
時間、７２時間後のＬ−リジン生成量を表に示す。表
中、lysC^*は変異型lysCを表す。

【００９１】

【表１】 表１ 培養時間４０、７２時間後のＬ−リジン蓄積 ─────────────────────────────── L-リシ゛ン生産量(g/L) 菌株／プラスミド 導入遺伝子 40時間後 72時間後 ─────────────────────────────── AJ11082 22.0 29.8 AJ11082／p399AK9B lysC^* 16.8 34.5 AJ11082／pLYSAB lysA 19.8 32.5 AJ11082／pPwm ppc 20.7 28.9 AJ11082／pCRCAB lysC^*,dapA 19.7 36.5 AJ11082／pCB lysC^*,dapB 23.3 35.0 AJ11082／pCD lysC^*,ddh 15.0 27.0 AJ11082／pCL lysC^*,lysA 24.0 44.0 AJ11082／pCL/pPwm lysC^*,lysA,ppc 25.0 45.2 ───────────────────────────────

【００９２】以上に示すように、変異型lysC、lysA又は
ppcを単独で増強した場合、及び変異型lysCと、dapA又
はddhのいずれかとを組み合わせて増強した場合には、
培養７２時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多い
か同程度であるが、４０時間後では親株よりも生産量が
少なく、すなわち短期間培養におけるＬ−リジン生産速
度は低下した。特に、変異型lysCとddhとを組み合わせ
て増強した場合には、培養４０時間後、７２時間後とも
に親株よりもＬ−リジン生産量が低下した。これに対
し、変異型lysCとともにdapBを増強した株では、生育が
改善され、短期間培養におけるＬ−リジン生産速度を回
復させることができ、長期間培養でのＬ−リジン蓄積量
も増加した。

【００９３】一方、lysC^*とlysAを組み合わせて増強し
た場合には、短期間培養におけるＬ−リジン生産速度が
親株に比べて向上した上、長期間培養でのＬ−リジン蓄
積量も飛躍的に向上した。さらに、変異型lysC、lysA及
びppcの３者が増強された株では、Ｌ−リジン生産性が
一層向上された。

【００９４】

【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジ
ン生産量及びＬ−リジン生産速度を向上させることがで
きる。

【００９５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23

【００９６】配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21

【００９７】配列番号：３ 配列の長さ：1643 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320 CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643

【００９８】配列番号：４ 配列の長さ：1643 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：217..1482 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234 Met Ala Leu Val Val Gln 1 5 AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val 10 15 20 GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val 25 30 35 GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala 40 45 50 GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu 55 60 65 70 ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu 75 80 85 TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val 90 95 100 CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro 105 110 115 GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala 120 125 130 GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly 135 140 145 150 CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn 155 160 165 GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala 170 175 180 GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe 185 190 195 GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu 200 205 210 CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg 215 220 225 230 TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu 235 240 245 GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys 250 255 260 TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050 Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu 265 270 275 GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp 280 285 290 ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile 295 300 305 310 ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194 Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu 315 320 325 AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp 330 335 340 CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290 Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro 345 350 355 GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn 360 365 370 ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg 375 380 385 390 GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln 395 400 405 CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 410 415 420 AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643

【００９９】配列番号：５ 配列の長さ：421 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420

【０１００】配列番号：６ 配列の長さ：1643 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：964..1482 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu 1 5 10 15 GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala 20 25 30 AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val 35 40 45 CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe 50 55 60 ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys 65 70 75 CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val 80 85 90 95 GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val 100 105 110 ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu 115 120 125 TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp 130 135 140 GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly 145 150 155 GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 160 165 170 AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643

【０１０１】配列番号：７ 配列の長さ：172 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala 1 5 10 15 Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys 20 25 30 Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu 35 40 45 Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr 50 55 60 Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80 Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly 85 90 95 Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr 100 105 110 Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu 115 120 125 Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp 130 135 140 Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly 145 150 155 160 Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 165 170

【０１０２】配列番号：８ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23

【０１０３】配列番号：９ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23

【０１０４】配列番号：10 配列の長さ：3579 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：533..2182 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：2188..3522 配列 GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60 TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA 120 GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT 180 GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC 240 GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC 300 AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC 360 CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA 420 CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA 480 AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG 535 Met 1 ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT 583 Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val 5 10 15 TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT 631 Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val 20 25 30 GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT 679 Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile 35 40 45 GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727 Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala 50 55 60 65 ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775 Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala 70 75 80 GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA 823 Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala 85 90 95 CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA 871 Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly 100 105 110 AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT 919 Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser 115 120 125 GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC 967 Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala 130 135 140 145 GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG 1015 Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val 150 155 160 ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC 1063 Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe 165 170 175 GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC 1111 Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp 180 185 190 GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA 1159 Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu 195 200 205 AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT 1207 Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu 210 215 220 225 TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC 1255 Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser 230 235 240 CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC 1303 Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser 245 250 255 CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC 1351 Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp 260 265 270 AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC 1399 Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr 275 280 285 GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC 1447 Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp 290 295 300 305 GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC 1495 Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser 310 315 320 CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT 1543 Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly 325 330 335 TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA 1591 Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro 340 345 350 GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639 Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg Asp 355 360 365 GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA 1687 Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu 370 375 380 385 GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG 1735 Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu 390 395 400 ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG 1783 Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp 405 410 415 GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC 1831 Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly His 420 425 430 GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC 1879 Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr 435 440 445 GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT 1927 Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp 450 455 460 465 CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT 1975 Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala 470 475 480 GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT 2023 Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala 485 490 495 GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT 2071 Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val 500 505 510 GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA 2119 Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala 515 520 525 GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167 Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser 530 535 540 545 GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214 Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu 550 1 5 CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262 Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly 10 15 20 25 GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310 Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr 30 35 40 GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358 Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys 45 50 55 CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406 Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala 60 65 70 TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454 Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu 75 80 85 GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502 Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu 90 95 100 105 GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550 Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys 110 115 120 GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598 Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val 125 130 135 GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646 Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala 140 145 150 GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694 Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile 155 160 165 GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742 Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys 170 175 180 185 TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790 Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala 190 195 200 GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT 2838 Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val 205 210 215 GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886 Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg 220 225 230 GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934 Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu 235 240 245 CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982 Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala 250 255 260 265 GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030 Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala 270 275 280 GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT 3078 Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu 285 290 295 GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126 Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr 300 305 310 GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174 Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg 315 320 325 CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA 3222 Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala 330 335 340 345 CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270 Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu 350 355 360 GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318 Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly 365 370 375 GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366 Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly 380 385 390 GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414 Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser 395 400 405 TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462 Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala 410 415 420 425 GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510 Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu 430 435 440 TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562 Ser Leu Glu Ala 445 GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579

【０１０５】配列番号：11 配列の長さ：550 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu 1 5 10 15 Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val 20 25 30 Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn 35 40 45 Ile Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu 50 55 60 Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser 65 70 75 80 Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe 100 105 110 Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val 115 120 125 Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala 130 135 140 Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys 145 150 155 160 Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg 165 170 175 Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu 180 185 190 Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val 195 200 205 Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu 210 215 220 Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser 225 230 235 240 Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn 245 250 255 Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys 260 265 270 Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser 275 280 285 Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly 290 295 300 Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe 305 310 315 320 Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His 325 330 335 Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys 340 345 350 Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg 355 360 365 Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr 370 375 380 Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser 385 390 395 400 Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu 405 410 415 Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly 420 425 430 His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val 435 440 445 Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly 450 455 460 Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala 465 470 475 480 Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu 485 490 495 Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys 500 505 510 Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala 515 520 525 Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val 530 535 540 Ser Ala Pro Glu Lys Met 545 550

【０１０６】配列番号：12 配列の長さ：445 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro 1 5 10 15 Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val 20 25 30 Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val 35 40 45 Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe 50 55 60 Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 80 Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala 85 90 95 Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala 115 120 125 Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu 130 135 140 Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp 145 150 155 160 Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe 165 170 175 Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu 195 200 205 Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala 210 215 220 Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln 225 230 235 240 Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly 245 250 255 Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala 260 265 270 Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu 275 280 285 Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile 290 295 300 Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320 Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly 325 330 335 Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345 350 Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg 355 360 365 Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu 370 375 380 Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410 415 Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425 430 Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445

【０１０７】配列番号：13 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 TCGTCGGTCA GCCTGACGTC GAC 23

【０１０８】配列番号：14 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 TCTTGGTGTCGAAAGTGCACACC 23

【０１０９】配列番号：15 配列の長さ：3533 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium la
ctofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：321..3077 配列 GGTGGTTCTG TTAAGGCAGA AACCGTCGCT GAGATCGTCG GTCAGCCTGA CGTCGACGGC 60 GGACTTGTCG GTGGCGCTTC CCTCGACGGT GAAGCATTCG CCAAGCTGGC TGCCAACGCT 120 GCGAGCGTTG CTTAAAGTAC AGAGCTTTAA AGCACAGCCT TAAAGCACAG CCTTAAAGCA 180 CAAGCACTGT AGAAGTGCGG TTTTGATGAG CCCATGAAAG CCATCGAAAT CAATCGCCCA 240 GCTAAACACC TGTTTTGCTG GGTGATTTTT TATCTCATGC ACGCCAACAC CCTCAATGTG 300 AAAGAGTGTT TAAAGTAGTT ATG ACT GAT TTT TTA CGC GAT GAC ATC AGG 350 Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg 1 5 10 TTC CTC GGT CAA ATC CTC GGT GAG GTA ATT GCG GAA CAA GAA GGC CAG 398 Phe Leu Gly Gln Ile Leu Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln 15 20 25 GAG GTT TAT GAA CTG GTC GAA CAA GCG CGC CTG ACT TCT TTT GAT ATC 446 Glu Val Tyr Glu Leu Val Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile 30 35 40 GCC AAG GGC AAC GCC GAA ATG GAT AGC CTG GTT CAG GTT TTC GAC GGC 494 Ala Lys Gly Asn Ala Glu Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly 45 50 55 ATT ACT CCA GCC AAG GCA ACA CCG ATT GCT CGC GCA TTT TCC CAC TTC 542 Ile Thr Pro Ala Lys Ala Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe 60 65 70 GCT CTG CTG GCT AAC CTG GCG GAA GAC CTC TAC GAT GAA GAG CTT CGT 590 Ala Leu Leu Ala Asn Leu Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg 75 80 85 90 GAA CAG GCT CTC GAT GCA GGC GAC ACC CCT CCG GAC AGC ACT CTT GAT 638 Glu Gln Ala Leu Asp Ala Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp 95 100 105 GCC ACC TGG CTG AAA CTC AAT GAG GGC AAT GTT GGC GCA GAA GCT GTG 686 Ala Thr Trp Leu Lys Leu Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val 110 115 120 GCC GAT GTG CTG CGC AAT GCT GAG GTG GCG CCG GTT CTG ACT GCG CAC 734 Ala Asp Val Leu Arg Asn Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His 125 130 135 CCA ACT GAG ACT CGC CGC CGC ACT GTT TTT GAT GCG CAA AAG TGG ATC 782 Pro Thr Glu Thr Arg Arg Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile 140 145 150 ACC ACC CAC ATG CGT GAA CGC CAC GCT TTG CAG TCT GCG GAG CCT ACC 830 Thr Thr His Met Arg Glu Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr 155 160 165 170 GCT CGT ACG CAA AGC AAG TTG GAT GAG ATC GAG AAG AAC ATC CGC CGT 878 Ala Arg Thr Gln Ser Lys Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg 175 180 185 CGC ATC ACC ATT TTG TGG CAG ACC GCG TTG ATT CGT GTG GCC CGC CCA 926 Arg Ile Thr Ile Leu Trp Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro 190 195 200 CGT ATC GAG GAC GAG ATC GAA GTA GGG CTG CGC TAC TAC AAG CTG AGC 974 Arg Ile Glu Asp Glu Ile Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser 205 210 215 CTT TTG GAA GAG ATT CCA CGT ATC AAC CGT GAT GTG GCT GTT GAG CTT 1022 Leu Leu Glu Glu Ile Pro Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu 220 225 230 CGT GAG CGT TTC GGC GAG GAT GTT CCT TTG AAG CCC GTG GTC AAG CCA 1070 Arg Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro 235 240 245 250 GGT TCC TGG ATT GGT GGA GAC CAC GAC GGT AAC CCT TAT GTC ACC GCG 1118 Gly Ser Trp Ile Gly Gly Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala 255 260 265 GAA ACA GTT GAG TAT TCC ACT CAC CGC GCT GCG GAA ACC GTG CTC AAG 1166 Glu Thr Val Glu Tyr Ser Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys 270 275 280 TAC TAT GCA CGC CAG CTG CAT TCC CTC GAG CAT GAG CTC AGC CTG TCG 1214 Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser 285 290 295 GAC CGC ATG AAT AAG GTC ACC CCG CAG CTG CTT GCG CTG GCA GAT GCC 1262 Asp Arg Met Asn Lys Val Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala 300 305 310 GGG CAC AAC GAC GTG CCA AGC CGC GTG GAT GAG CCT TAT CGA CGC GCC 1310 Gly His Asn Asp Val Pro Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala 315 320 325 330 GTC CAT GGC GTT CGC GGA CGT ATC CTC GCG ACG ACG GCC GAG CTG ATC 1358 Val His Gly Val Arg Gly Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile 335 340 345 GGC GAG GAC GCC GTT GAG GGC GTG TGG TTC AAG GTC TTT ACT CCA TAC 1406 Gly Glu Asp Ala Val Glu Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr 350 355 360 GCA TCT CCG GAA GAA TTC TTA AAC GAT GCG TTG ACC ATT GAT CAT TCT 1454 Ala Ser Pro Glu Glu Phe Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser 365 370 375 CTG CGT GAA TCC AAT GAC GTT CTC ATT GCC GAT GAT CGT TTG TCT GTG 1502 Leu Arg Glu Ser Asn Asp Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val 380 385 390 CTG ATT TCT GCC ATC GAG AGC TTT GGA TTC AAC CTT TAC GCA CTG GAT 1550 Leu Ile Ser Ala Ile Glu Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp 395 400 405 410 CTG CGC CAA AAC TCC GAA AGC TAC GAG GAC GTC CTC ACC GAG CTT TTC 1598 Leu Arg Gln Asn Ser Glu Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe 415 420 425 GAA CGC GCC CAA GTC ACC GCA AAC TAC CGC GAG CTG TCT GAA GCA GAG 1646 Glu Arg Ala Gln Val Thr Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu 430 435 440 AAG CTT GAG GTG CTG CTG AAG GAA CTG CGC AGC CCT CGT CCG CTG ATC 1694 Lys Leu Glu Val Leu Leu Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile 445 450 455 CCG CAC GGT TCA GAT GAA TAC AGC GAG GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGC 1742 Pro His Gly Ser Asp Glu Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly 460 465 470 ATC TTC CGC ACC GCG TCG GAG GCT GTT AAG AAA TTC GGG CCA CGG ATG 1790 Ile Phe Arg Thr Ala Ser Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met 475 480 485 490 GTG CCT CAC TGC ATC ATC TCC ATG GCA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC 1838 Val Pro His Cys Ile Ile Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu 495 500 505 GAG CCG ATG GTA TTG CTC AAG GAA TTC GGC CTC ATT GCA GCC AAC GGC 1886 Glu Pro Met Val Leu Leu Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly 510 515 520 GAC AAC CCA CGC GGC ACC GTC GAT GTC ATC CCA CTG TTC GAA ACC ATC 1934 Asp Asn Pro Arg Gly Thr Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile 525 530 535 GAA GAT CTC CAG GCC GGC GCC GGA ATC CTC GAC GAA CTG TGG AAA ATT 1982 Glu Asp Leu Gln Ala Gly Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile 540 545 550 GAT CTT TAC CGC AAC TAC CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC 2030 Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val 555 560 565 570 ATG CTC GGT TAC TCC GAT TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA 2078 Met Leu Gly Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala 575 580 585 AAC TGG GCG CTT TAC GAC GCG GAA CTG CAG CTC GTC GAA CTA TGC CGA 2126 Asn Trp Ala Leu Tyr Asp Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg 590 595 600 TCA GCC GGG GTC AAG CTT CGC CTG TTC CAC GGC CGT GGT GGC ACC GTC 2174 Ser Ala Gly Val Lys Leu Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val 605 610 615 GGC CGC GGT GGC GGA CCT TCC TAC GAC GCG ATT CTT GCC CAG CCC AGG 2222 Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg 620 625 630 GGG GCT GTC CAA GGT TCC GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAG ATC ATC 2270 Gly Ala Val Gln Gly Ser Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile 635 640 645 650 TCC GCT AAG TAC GGC AAC CCC GAA ACC GCG CGC CGA AAC CTC GAA GCT 2318 Ser Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala 655 660 665 CTG GTC TCA GCA ACG CTT GAG GCA TCG CTT CTC GAC GTC TCC GAA CTC 2366 Leu Val Ser Ala Thr Leu Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu 670 675 680 ACC GAT CAC CAA CGC GCG TAC GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC 2414 Thr Asp His Gln Arg Ala Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu 685 690 695 AGC TTG AAG AAG TAC GCC TCC TTG GTG CAC GAG GAT CAA GGC TTC ATC 2462 Ser Leu Lys Lys Tyr Ala Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile 700 705 710 GAT TAC TTC ACC CAG TCC ACG CCG CTG CAG GAG ATT GGA TCC CTC AAC 2510 Asp Tyr Phe Thr Gln Ser Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn 715 720 725 730 ATC GGA TCC AGG CCT TCC TCA CGC AAG CAG ACC TCC TCG GTG GAA GAT 2558 Ile Gly Ser Arg Pro Ser Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp 735 740 745 TTG CGA GCA ATC CCG TGG GTG CTC AGT TGG TCC CAG TCT CGT GTC ATG 2606 Leu Arg Ala Ile Pro Trp Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met 750 755 760 CTG CCG GGC TGG TTT GGT GTC GGC ACC GCA CTT GAG CAA TGG ATT GGC 2654 Leu Pro Gly Trp Phe Gly Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly 765 770 775 GAA GGG GAG CAG GCC ACC CAG CGC ATT GCC GAG CTA CAA ACA CTC AAC 2702 Glu Gly Glu Gln Ala Thr Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn 780 785 790 GAG TCC TGG CCA TTT TTC ACC TCA GTG TTG GAT AAC ATG GCT CAG GTG 2750 Glu Ser Trp Pro Phe Phe Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val 795 800 805 810 ATG TCC AAG GCA GAG CTG CGT TTG GCA AAG CTC TAC GCA GAC CTG ATC 2798 Met Ser Lys Ala Glu Leu Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile 815 820 825 CCA GAT AGG GAA GTA GCT GAG CGC GTT TAT GCC GTC ATC CGC GAG GAA 2846 Pro Asp Arg Glu Val Ala Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu 830 835 840 TAC TTC CTG ACC AAG AAG ATG TTC TGC GTA ATC ACC GGT TCT GAT GAT 2894 Tyr Phe Leu Thr Lys Lys Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp 845 850 855 CTG CTT GAT GAC AAC CCG CTT CTC GCA CGA TCC GTC CAG CGC CGA TAC 2942 Leu Leu Asp Asp Asn Pro Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr 860 865 870 CCC TAC CTG CTT CCA CTC AAC GTG ATC CAG GTA GAG ATG ATG CGA CGC 2990 Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg 875 880 885 890 TAC CGA AAA GGC GAC CAA AGC GAG CAA GTA TCC CGC AAC ATC CAG CTG 3038 Tyr Arg Lys Gly Asp Gln Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu 895 900 905 ACC ATG AAC GGT CTT TCC ACT GCA CTG CGC AAC TCT GGC TAGTCCTGCT 3087 Thr Met Asn Gly Leu Ser Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly 910 915 GGGTAGGTAG TACTCGTGTA TACTGTCTAA AGTTATTCGA AATCAGGTGG GAATAAGGTT 3147 CACCTGGGTT CTCAAACGGC AAAGGAACAT TTTCCACATG GCATTGACGC TTCAAATCAT 3207 CCTCGTCGTC GCCAGCCTGC TCATGACGGT TTTCGTCTTG CTGCACAAGG GCAAAGGCGG 3267 CGGACTCTCC AGCCTCTTCG GTGGCGGTGT GCAGTCCAAT CTTTCGGGCT CCACTGTTGT 3327 TGAAAAGAAC CTGGATCGCG TCACCATTTT GGTTGCCGTT ATCTGGATTG TGTGCATTGT 3387 CGCACTCAAC CTCATCCAGA CTTATTCATA AGACACGAGC TTAAAAAGAG CGGTTCCCTT 3447 TTCATAGGGG AGCCGCTTTT TTGGGTTTTG TCGACCTGTT GTCTCCCCAC TGTTCCTCGG 3507 TGTGCACTTT CGACACCAAG ATTTCG 3533

【０１１０】配列番号：16 配列の長さ：919 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Gln Ile Leu 1 5 10 15 Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val 20 25 30 Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu 35 40 45 Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala 50 55 60 Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala 85 90 95 Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu 100 105 110 Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn 115 120 125 Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg 130 135 140 Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu 145 150 155 160 Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys 165 170 175 Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp 180 185 190 Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile 195 200 205 Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro 210 215 220 Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu 225 230 235 240 Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly 245 250 255 Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser 260 265 270 Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu 275 280 285 His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val 290 295 300 Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro 305 310 315 320 Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly 325 330 335 Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu 340 345 350 Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe 355 360 365 Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp 370 375 380 Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu 385 390 395 400 Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu 405 410 415 Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr 420 425 430 Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu 435 440 445 Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu 450 455 460 Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser 465 470 475 480 Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile 485 490 495 Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu 500 505 510 Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr 515 520 525 Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gln Ala Gly 530 535 540 Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr 545 550 555 560 Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp 565 570 575 Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp 580 585 590 Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu 595 600 605 Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro 610 615 620 Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly Ala Val Gln Gly Ser 625 630 635 640 Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn 645 650 655 Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu 660 665 670 Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala 675 680 685 Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala 690 695 700 Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser 705 710 715 720 Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser 725 730 735 Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp 740 745 750 Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly 755 760 765 Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr 770 775 780 Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe 785 790 795 800 Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu 805 810 815 Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala 820 825 830 Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys 835 840 845 Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro 850 855 860 Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu 865 870 875 880 Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln 885 890 895 Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser 900 905 910 Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly 915

【０１１１】配列番号：17 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 CGCGAGGTAC CACCTGTCAC 20

【０１１２】配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES CAATCCAGGT ACCGGCAACC 20

【０１１３】配列番号：19 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23

【０１１４】配列番号：20 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23

【０１１５】配列番号：21 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23

【０１１６】配列番号：22 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23

【０１１７】配列番号：23 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20

【０１１８】配列番号：24 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20

【図面の簡単な説明】

【図１】 変異型lysCを有するプラスミドp399AK9B及び
p399AKYB構築の過程を示す図。

【図２】 lysAを有するプラスミドp299LYSAの構築の過
程を示す図。

【図３】 lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpLYS
ABの構築の過程を示す図。

【図４】 ＰＥＰＣ構造遺伝子を含むプラスミドpAKPFd
sの構築の過程を示す図。

【図５】 新規なコリネ型細菌用クローニングベクター
pVK6及びpVK7の構築の過程を示す図。

【図６】 野生型高発現型ppcを含むプラスミドpPwmの
構築の過程を示す図。

【図７】 変異型lysC、lysA及びBrevi.-oriを有するプ
ラスミドpCLの構築の過程を示す図。

【図８】 dapA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPS
Bの構築の過程を示す図。

【図９】 dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPR
Bの構築の過程を示す図。

【図１０】 ddh及びBrevi.ori-を有するプラスミドpPK
4Dの構築の過程を示す図。

【図１１】 lysC、dapB及びBrevi.-oriを有するプラス
ミドpCRCABの構築の過程を示す図。

【図１２】 変異型lysC、dapB及びBrevi.-oriを有する
プラスミドpCBの構築の過程を示す図。

【図１３】 変異型lysC及びddhを有するプラスミドpCD
の構築の過程を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社生産技術研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフ
   ィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナ
   ーゼをコードするＤＮＡ配列と、ジアミノピメリン酸デ
   カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列とを含み、コ
   リネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡ。
2. 【請求項２】 前記Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによ
   るフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルト
   キナーゼが、コリネ型細菌由来のアスパルトキナーゼで
   あり、αサブユニットではＮ末端から２７９番目のアラ
   ニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ
   酸残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基
   がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に
   変化した変異型アスパルトキナーゼである請求項１記載
   の組換えＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
   をコードするＤＮＡ配列が、配列表配列番号１２に示す
   アミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列を
   コードする請求項１記載の組換えＤＮＡ。
4. 【請求項４】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼをコードするＤＮＡ配列をさらに含む請求項１記載
   の組換えＤＮＡ。
5. 【請求項５】 L−リジン及びＬ−スレオニンによるフ
   ィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナ
   ーゼを保持し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
   をコードするＤＮＡ配列が増強されたコリネ型細菌。
6. 【請求項６】 請求項１記載の組換えＤＮＡが導入され
   たことにより形質転換された請求項５記載のコリネ型細
   菌。
7. 【請求項７】 さらに、ホスホエノールピルビン酸カル
   ボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列が増強された請求
   項５記載のコリネ型細菌。
8. 【請求項８】 請求項４記載の組換えＤＮＡが導入され
   たことにより形質転換された請求項７記載のコリネ型細
   菌。
9. 【請求項９】 請求項６〜８のいずれか一項に記載のコ
   リネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リ
   ジンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取
   することを特徴とするＬ−リジンの製造法。