BRPI9706058B1

BRPI9706058B1 - vetor recombinante replicável autonomamente em células de bactérias corineformes, bactéria corineforme, e, processo para produzir l-lisina

Info

Publication number: BRPI9706058B1
Application number: BRPI9706058A
Authority: BR
Inventors: Atsushi Hayakawa; Masakazu Sugimoto; Tsuyoshi Nakamatsu; Yasuhiko Yoshihara
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1996-12-05
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2015-11-03
Also published as: EP0857784B1; JP4075087B2; SK163597A3; EP0857784A2; US6221636B1; CN1161470C; DE69736699D1; DK0857784T3; HUP9702361A2; DE69736699T2; HU9702361D0; PL323545A1; JPH10165180A; EP0857784A3; SK285146B6; ES2273356T3; PL190206B1; CN1187539A; BR9706058A; HUP9702361A3

Abstract

"dna recombinante replicável autonomamente em células de bactérias corineformes, bactéria corineforme, e, processo para produzir l-lisina". um dna recombinante replicável autonomamente em células de bactéria corineforme, compreendendo uma sequência de dna codificando para uma aspartoquinase em que a inibição da retro-alimentação por l-lisina e l-treonina é substancialmente dessensibilizada, e uma sequência de dna codificando para uma descarboxilase diaminopimelato, uma bactéria corineforme abrigando uma aspartoquinase em que a inibição de retro-alimentação por l-lisina e l-treonina é substancialmente dessensibilizada, e compreendendo uma sequência de dna melhorada codificando para uma descarboxilase diaminopimelato, e um processo para produzir l-lisina compreendendo as etapas de cultivar a bactéria corineforme em um meio apropriado para permitir que a l-lisina seja produzida e acumulada em uma cultura da bactéria, e coletar a l-lisina da cultura.

Description

“VETOR RECOMBINANTE REPLICÁVEL AUTONOMAMENTE EM CÉLULAS DE BACTÉRIAS CORINEFORMES, BACTÉRIA CORINEFORME, E, PROCESSO PARA PRODUZIR L-LISINA”.

ANTECEDENTE DA INVENCÀO A presente invenção refere-se a um processo para produzir L-lisina pelo cultivo de um microorganismo obtido por modificação de uma bactéria corineforme usada para a produção fermentativa de aminoácido ou semelhante, por meio de uma técnica baseada em engenharia genética. L-lisina, que é usada como um aditivo para forragem, é usualmente produzida por um processo fermentativo por uso de uma cepa mutante produzindo a L-lisina pertencente a bactéria corineforme. Várias bactérias produzindo L-lisina conhecidas atualmente são as criadas por mutação artificial partindo de cepas de tipo selvagem pertencentes a bactéria corineforme.

Como para a bactéria corineforme, descreve-se um vetor plasmídeo que é autonomamente replicável nas células bacterianas e tem um gene criador de resistência a droga (ver Patente U.S. No 4.514.502), e um processo para introdução de um gene dentro das células bacterianas (por exemplo, Pedido Patente JP acessível ao público No. 2-207791). Há também uma possibilidade descrita para a criação de uma bactéria produzindo L-treonina- ou L-isoleucina usando as técnicas como descrita acima (ver Patente U.S. Nos. 4.452.890 e 4.442.208). Como para criação de uma bactéria produzindo a L-lisina, uma técnica é conhecida, em que um gene participando em biossíntese de lisina está incorporado dentro de um vetor de plasmídeo para ampliar o gene nas células bacterianas (por exemplo, Pedido Patente JP acessível ao público No. 56-160997).

Os genes conhecidos para biossíntese L-lisina incluem, por exemplo, um gene reductase di hidrodipicolinato (Pedido Patente JP acessível ao público No. 7-75578) e um gene desidrogenase diaminopimelato (Ishino, S. et al, Nucleic Acids Res. 15^3917, (1987), em que um gene participando na biossíntese de L-lisina é clonado, assim como um gene carboxilase fosfofenolpiruvato (Pedido Patente JP acessível ao público No. 60-87788), um gene de sintase di hidrodipirolinato (Publicação de Patente JP No. 6-55149), e um gene descarboxilase diaminopimelato (Pedido Patente JP acessível ao público No.60-62994) em que a amplificação de um gene afeta a produtividade de L-lisina.

Como para enzimas participando em biossíntese de L-lisina, um caso é conhecido para uma enzima que passa por uma inibição de retro-alimentação quando usado como um tipo selvagem. Neste caso, a produtividade de L-lisina é desenvolvida introduzindo um gene de enzima tendo tal mutação que a inibição de retro- alimentação é dessensibilizada. Os conhecidos como tal um gene especificamente incluem, por exemplo, um gene aspartoquinase (Panfleto de Publicação Internacional de WO 94/25605).

Como descrito acima, certos resultados bem sucedidos são obtidos por meio da amplificação de genes para o sistema de biossíntese de L-lisina, ou a introdução de genes mutantes. Por exemplo, bactéria corineforme, que abriga um gene aspartoquinase mutante com a inibição combinada dessensibilizada pela lisina e treonina, que produz uma quantidade considerável de L-lisina (cerca de 25 g/L). Entretanto, esta bactéria sofre uma diminuição da velocidade de crescimento como comparada com uma bactéria não abrigando mutante de gene aspartoquinase. É também relatado que a produtividade de L-lisina é aperfeiçoada ainda introduzindo um gene sintase di hidrodipicolinato, além de um gene aspartoquinase mutante (Applied and Environmental Microhiology, 57 (6). 1746-1752 (1991)). Entretanto, esta bactéria ainda sofre de diminuição na velocidade de crescimento.

Nenhum caso foi registrado em que o crescimento se destina a ser melhorado pela melhora do gene para biossíntese de L-lisina. Na presente circunstância, nenhum caso é conhecido para bactéria corineforme, em que nenhuma pessoa teve sucesso em aperfeiçoamento notável em rendimento de L-lisina sem limitar o crescimento por combinação de uma pluralidade de genes para biossíntese de L-lisina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objeto da presente invenção é melhorar o rendimento de L-lisina sem limitar o crescimento de uma bactéria corineforme, por melhora de uma pluralidade de genes para biossíntese de L-lisina em combinação na bactéria corineforme.

Quando uma substância objetiva é produzida de modo fermentativo por uso de um microorganismo, a velocidade de produção , assim como o rendimento de substância objetiva com relação ao material introduzido, é um fator extremamente importante. Uma substância objetiva pode ser produzida de modo marcadamente barato por aumento da velocidade de produção por uma unidade de equipamento de fermentação. Consequentemente, é industrialmente extremamente importante que o rendimento fermentativo e a velocidade de produção sejam compatíveis entre si. A presente invenção propõe uma solução para o problema como acima descrito, a fim de produzir de modo fermentativo L-lisina por uso de uma bactéria corineforme. O princípio da presente invenção é baseado no fato de que o crescimento de bactéria corineforme pode ser melhorado e a velocidade de produção de L-lisina do mesmo pode ser melhorada por aumento da sequência de DNA codificando para aspartoquinase em que a inibição de retro-alimentação por L-lisina e L-treonina é substancialmente dessensibilizada, e uma sequência de DNA codificando para uma descarboxilase diaminopimelato comparado com o caso em que estas sequências de DNA são cada melhoradas unicamente.

Em um primeiro aspecto da presente invenção, é provido um DNA recombinante replicável autonomamente em células de bactéria corineforme, compreendendo uma sequência de DNA codificando para aspartoquinase em que a inibição de retro-alimentação por L-lisina e L-treonina é substancialmente dessensibilizada e uma sequência de DNA codificando para uma descarboxilase diaminopimelato. O DNA recombinante ainda compreende uma sequência de DNA codificando para uma carboxilase fosfoenolpiruvato é também provido.

Em um segundo aspecto, a presente invenção é provida uma bactéria corineforme abrigando uma aspartoquinase em que a inibição de retro -alimentação por L-lisina ev L-treonina é substancialmente dessensibilizada, e compreendendo uma sequência de DNA melhorada codificando para uma descarboxilase diaminopimelato. A bactéria corineforme ainda compreendendo uma sequência de DNA codificando para uma carboxilase fosfoenolpiruvato é também provida.

Em um terceiro aspecto da presente invenção, é provido um processo para produzir L-lisina compreendendo as etapas de cultivar qualquer bactéria corineforme como descrito acima em um meio apropriado para permitir L-lisina a ser produzida e acumulada em uma cultura de bactéria, e coletando L-lisina da cultura. A seguir, aspartoquinase é referida como "AK' um gene codificando para AK é referido como "lysC". AK que é dessensibilizado em inibição de retro-alimentação por L-lisina e L-treonina é referido como "AK mutante" e um gene codificando para AK mutante é referido como " lvsC" mutante se necessário. Também uma descarboxilase diaminopimelato é referida como "DDC" um gene codificando para DDC é referido como "lvsA",. uma carboxilase fosfoenolpiruvato é referida como "PEPC", e um gene codificando para PEPC é referido como "ppc". se necessário.

As bactérias corineformes referidas na presente invenção são um grupo de microorganismos como definido em Bergev's Manual of Determinative Bacteriology. 8th ed., p. 599 (1974), que são bastões rápidos não ácidos, gram positivos, aeróbicos, não tendo capacidade de formação de esporos. A bactéria corineforme inclui a bactéria pertencente ao gênero Corybacterium. a bactéria pertencente ao gênero Brevibacterium tendo sido até agora classificado dentro do gênero Brevibacterium mas unido como bactéria pertencente ao gênero Corybacterium no presente, e a bactéria pertencente ao gênero Brevibacterium rigorosamente relativo a bactéria pertencente ao gênero Corybacterium.

De acordo com a presente invenção, a quantidade de produção e a velocidade de produção de L-lisina de bactéria corineforme podem ser melhoradas.

BREVE EXPLICAÇÃO DE DESENHOS

Fig. 1 ilustra um processo de construção de um plasmídeo p399AK9B e p399AKYB compreendendo lvsC mutante.

Fig. 2 ilustra um processo de construção de um plasmídeo p299LYSA compreendendo lvsA.

Fig. 3 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pLYSAB compreendendo lvsA e Brevi.-ori.

Fig. 4 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pAKPFds compreendendo um gene estrutural PEPC.

Fig. 5 ilustra um processo de construção de vetores de clonagem novos para bactéria corineforme, pVK6 e pVK7. A figura 6 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pPwm compreendendo um ppc de alta expressão de tipo selvagem.

Fig. 7 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCL compreendendo mutante lvsC, lvsA e Brevi--ori.

Fig. 8 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pDPSB compreendendo dapA,e Brevi.-ori.

Fig. 9 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pDPRB compreendendo dapB. e Brevi-ori.

Fig. 10 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pPK4D compreendendo ddh e Brevi-ori.

Fig. 11 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCRCAB compreendendo lvsC. dapA. e Brevi-ori.

Fig. 12 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCB compreendendo mutante lvsC. dapBf e Brevi.ori.

Fig. 13 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCD compreendendo mutante lysC e ddh.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO <1> Preparação de genes para biosíntese de L-lisina usada para a presente invenção Os genes para biossíntese L-lisina usados na presente invenção são obtidos respectivamente pela preparação de DNA cromossômico de uma bactéria como um doador DNA, construindo uma coleção DNA cromossômico usando um vetor plasmídeo ou outro, selecionando a cepa abrigando um gene desejado, e recuperando, dentre a cepa selecionada, o DNA recombinante em que o gene está sendo inserido. O doador de DNA para o gene para biossíntese L-lisina usada na presente invenção não está especificamente limitado provida de que o gene desejado para biossíntese L-lisina expressa uma proteína de enzima que as funções em células da bactéria corineforme. Entretanto, o doador de DNA é preferivelmente uma bactéria corineforme.

Todos os genes de lvsC. dapA, e ppç_ originariamente de bactéria corineforme tem sequências conhecidas. Consequentemente, os mesmos podem ser obtidos pela amplificação de desempenho de acordo com o processo de reação de cadeia polimerase (PCR; ver Whitee, T. J. et al., Trends Genet.. 5.185 (1989)).

Cada um dos genes para biossíntese L-lisina usada na presente invenção é obtenível de acordo com certos processos como exemplificado abaixo. (1) Preparação de lvsC mutante Um fragmento de DNA contendo lvsC mutante pode ser preparado de uma cepa mutante em que a inibição de retro-alimentação sinergística na atividade AK por L-lisina e L-treonina é substancialmente dessensibilizada (Panfleto de Publicação Internacional de WO 94/25605). Como uma cepa mutante pode ser obtida, por exemplo, de um grupo de células originando de uma cepa de tipo selvagem de uma bactéria corineforme submetido a um tratamento de mutação por aplicação de um tratamento de mutação comum tal como irradiação ultravioleta e tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). A atividade AK pode ser medida usando um processo descrito por Miyajima, R. et al. no The Journal of Biochemistry (1968), 63 (2). 139-148. A mais preferida tal como uma cepa mutante é representada por uma bactéria produzindo L-lisina AJ3445 (FERM P-1944) derivado por um tratamento de mutação de uma cepa tipo selvagem de Brevihacterim lactofermentum ATCC 13869 (tendo o nome presente trocado de Corynebacterium glutamicum).

Altemativamente, lvsC mutante é também obtenível por um tratamento de mutação in vitro de plasmídeo DNA contendo lvsC de tipo selvagem. Em outro aspecto, a informação é especificamente conhecida na mutação para dessensibilizar a inibição de retro-alimentação sinergística em AK por L-lisina e L-treonina (Panfleto de Publicação Internacional de WO 94/25605. Consequentemente, lvsC mutante também pode ser preparada de IvsC tipo selvagem na base da informação de acordo com, por exemplo, o processo de mutagênese dirigida ao sítio.

Um fragmento compreendendo IvsC pode ser isolado de uma bactéria corineforme para preparação de DNA cromossômico de acordo com, por exemplo, um processo de Saito e Miura (H. Saito and K. Miura, fíiocbem. Biophvs. Acta. 22,619 (1963), e ampliando IvsC de acordo com o processo de reação de cadeia polimerase (PCR, ver Branco, T. J. et al., Trends Genet.. 5, 185 (1989)).

Os iniciadores de DNA são exemplificados por DNA de filamento único de 23 meros e 21 meros tendo as sequências de nucleotídéo mostrado na SEQID NOs: 1 e 2 na Listagem de Sequência a fim de ampliar, por exemplo, uma região de cerca de 1.643 bp codificando para IvsC a base de uma sequência conhecida por Corynebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197-1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224. 317-324). O DNA pode ser sintetizado de acordo com um processo comum usando um sintetizador DNA modelo 380B produzido por Applied Biosystems e usando o processo fosfoamidito (ver Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). O PCR pode ser realizado usando Modelo de ciclador térmico de DNAPJ2000 produzido por Takara Shuzo, e usando a polimerase DNA Taq de acordo com um processo designado pelo fornecedor. O preferido é que IvsC ampliado por PCR é ligado com o vetor DNA independente replicável em células de L coli e/ou bactéria corineforme para preparar o DNA recombinante, e o DNA recombinante é introduzido dentro das células de K coli antecipadamente. Tais provisões feitas seguindo as operações fáceis. O vetor autonomamente replicável em células de K coli é preferivelmente um vetor plasmídeo que é preferivelmente autonomamente replicável em células de uma hospedeira, incluindo, por exemplo, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG398, e RSF1010.

Quando o fragmento de DNA tendo uma habilidade para permitir um plasmídeo a ser autonomamente replicável na bactéria corineforme é inserido dentro destes vetores, os próprios podem ser usados como um assim chamado vetor shuttle autonomamente replicável em ambas as bactérias de K coli e corineforme.

Este vetor shuttle inclui os seguintes.Os microorganismos abrigando cada dos vetores e números de acesso junto às autoridades de depósito internacional (em parênteses) são mostrados.

Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pA.TI 844: Escherichia coli AJ11883 (FERMBP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140) Estes vetores são obteníveis de microorganismos depositados como a seguir. As células coletadas um uma fase de crescimento logarítmica foram lisados usando lissozima e SDS, seguido pela separação de um lisado pela centrifugação a 30.000 x g para obter um sobrenadante. Para o sobrenadante, polietileno glicol é adicionado, seguido pela fracionamento e purificação por meios da centrifugação de gradiente de densidade de equilíbrio de cloreto de césio = brometo de etídio. K coli pode ser transformado introduzindo um plasmídeo de acordo com, por exemplo, um processo de D. M. Morrison ÍMethods in Enzymology. 68, 326 (1979) ou um processo em que as células recipientes são tratadas com cloreto de cálcio para aumentar a permeabilidade para o DNA (Mandei, M. and Higa, A., J. Mol. BioL 51,159 (1970)). lvsC tipo selvagem é obtido quando lysC é isolado de uma cepa tipo selvagem AK, enquanto lvsC mutante é obtido quando lysC é isolado de uma cepa mutante AK de acordo com o processo como descrito acima.

Um exemplo de uma sequência de nucleotídeo de um fragmento de DNA contendo lvsC tipo selvagem é mostrado na SEQID NO: 3 em Listagem de Sequência. Uma sequência de aminoácido de a-subunidade de uma proteína AK tipo selvagem é deduzida da sequência de nucleotídeo, e é mostrado na SEQ ID NO: 4 em Listagem de Sequência juntos com a sequência de DNA. Somente a sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 5. Uma sequência de aminoácido de β-subunidade de proteína AK tipo selvagem é deduzida da sequência de nucleotídeos de DNA, e é mostrado na SEQ ID NO: 6 em Listagem de Sequência juntos com a sequência de DNA. Somente a sequência de aminoácido é mostrado na SEQ ID NO: 7. Em cada das subunidades, GTG é usada como um códon de iniciação, e um aminoácido correspondente é representado por metionina.

Entretanto, esta representação refere-se a metionina, valina, ou formilmetionina. lvsC mutante usado na presente invenção não é especificamente limitado desde que ele codifica para AK em que a inibição de retro-alimentação sinergística por L-lisina e L-treonina é dessensibilizado. Entretanto, a lvsC mutante é exemplificada por uma mutação de inclusão em que um resíduo de aminoácido correspondendo a um resíduo alanina 279° como contado do N-término é trocado em outro resíduo de aminoácido do que alanina e outro do que o aminoácido ácido no α-subunidade, e o resíduo de aminoácido correspondendo a um resíduo alanina 30° de N-término é trocado em outro resíduo aminoácido do que alanina e outro do que o aminoácido ácido na β-subunidade na sequência de aminoácido de AK tipo selvagem. A sequência de aminoácido do AK tipo selvagem especificamente inclui a sequência de aminoácido mostrado na SEQ ID NO: 5 em Listagem de Sequência como α-subunidade, e a sequência de aminoácido mostrado na SEQ ID NO: 7 em Listagem de Sequência como a β-subunidade. O preferido como o outro resíduo de aminoácido diferente de alanina e diferente de aminoácido ácido incluem resíduos treonina, arginina, cisteina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina, e resíduos valina. O códon correspondendo a um resíduo de aminoácido a ser substituído não é especificamente limitado para este tipo provido que os códigos para o resíduo de aminoácido.. É predicado que a sequência de aminoácido de AK tipo selvagem ligeiramente difere dependendo da diferença nas espécies bacterianas e cepas bacterianas. De AK, que tem a mutação a base de, por exemplo, substituição, deleção, ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido a um ou mais posições irrelevantes para a atividade de enzima como descrito acima, pode ser também usada para a presente invenção. Um DNA codificando para AK tendo a mutação espontânea pode ser obtido pela isolamento de um DNA que é hidrolizável com, por exemplo, o DNA tendo uma parte da sequência de nucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 3 sob a condição estringente. Pela condição "condição estringente" refere-se aqui a uma significando uma condição em que um híbrido específico é formado, e o híbrido não específico não é formado. É difícil expressar claramente a condição com valores numéricos. Entretanto, a condição é exemplificada por uma condição sob que, o ácido nucleotídeo tendo homologia elevada, por exemplo, de DNA tendo a homologia de menos do que 90% são hibridizados com cada um, e os ácidos nucleotídeos tendo a homologia inferior do que o acima não são hibridizados com cada um, ou uma condição de uma temperatura de uma fusão fora de temperatura (Tm) de um híbrido completamente igualado para (Tm - 30)° C, preferivelmente de Tm a (Tm - 20)° C e uma concentração de sal correspondendo a IX SSC, preferivelmente 0,1 x SSC.

Outros AK, que tem mutação artificialmente baseado, por exemplo, em substituição, deleção, .ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido, podem ser também usados desde que nenhuma influência seja substancialmente exercida na atividade AK, e na dessensitização de inibição de retro-alimentação sinergística por L-lisina e L-treonina. Um DNA codificando para AK tendo a mutação artificial pode ser obtido conforme modificando a sequência de nucleotídeo para dar substituição, deleção ou inserção de um sítio especificado, por exemplo, mutagênese de sítio específico. Também, IvsC tendo a mutação pode ser obtida durante o conhecimento de tratamento mutagene. O tratamento por mutagene incluiu o tratamento in vitro de um DNA contendo IvsC com hidroxilamina ou outro, e o tratamento de microorganismo abrigando um DNA contendo IvsC com um mutagene tal como irradiação ultravioleta ou um agente mutagene usado para mutagênese artificial comum tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nítrico. Depois o tratamento mutagene, um sítio para que a mutação é introduzida ou em que a mutação ocorre a ser determinada conforme selecionando um DNA ou um microorganismo que codifica para ou produz AK que tem a atividade AK e de quem a sequência de aminoácido é mudada do DNA submetido ao tratamento de mutagene ou o microorganismo submetido ao tratamento de mutagene. Um sítio da mutação introduzido não é especificamente limitado desde que nenhuma influência seja substancialmente empregada na atividade AK e na dessensibilização de inibição de retro-alimentação. Um número de mutação introduzida varia dependendo do sítio ou um gênero do aminoácido mudado em uma estrutura estereo-química de uma proteína, e não especificamente restrita desde que nenhuma influência seja substancialmente mudada na atividade AK e na dessensibilização de inibição de retro-alimentação. O número é usualmente 1 a 20, preferivelmente 1 a 10.

Uma cepa AJ12691 obtida por introdução de um plasmídeo lvsC mutante p399AK9B em uma cepa AJ12036 (FERM BP-734) como uma cepa tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum foi depositado em 10 de Abril de 1992, sob número de acesso de FERM P-12918 no National Institute of Bioscience and Human Techology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japão), transferido ao depósito internacional baseado no Tratado de Budapeste em 10 de Fevereiro de 1995, e depositado sob um número de acesso de FERM BP-4999.

(2) Preparação de lysA

Um fragmento de DNA contendo lvsA pode ser preparado do cromossomo de uma bactéria corineforme por meio de PCR. O doador de DNA não está especificamente limitado, entretanto, está exemplificado por cepa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Na bactéria corineforme, lvsA forma um operon juntos com argS (gene de síntese ariginil-tRNA), e lvsA existe a jusante de argS. A expressão lvsA é regulada por um promotor existindo a montante de argS (ver Journal of Bacteriology. Nov.. 7356-7362 (1993)). As sequências de DNA destes genes são conhecidos para Corynebacterium glutamicum (ver MaleçulaiMiçrQbiolQgy, 4(11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics. 212. 112-119 (1988)), na base de que os iniciadores de DNA para PCR podem ser preparados. Tais iniciadores de DNA são especificamente exemplificados por DNA de 23 meros respectivamente tendo as sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequência (correspondendo aos números de nucleotídeos de 11 a 33 na sequência de nucleotídeo descrita no Molecular Microbiology. 4(1 D. 1819-1830 (1990)) e SEQ ID NO: 9 (correspondendo aos números nucleotídeos 1370 a 1392 na sequência de nucleotídeos descrita no Molecular and General Genetics. 212, 112-119 (1988)). As sínteses de DNA, PCR, e preparação de um plasmídeo contendo IvsA podem ser realizadas do mesmo modo que para lvsC descrito acima.

No Exemplo descrito abaixo em, um fragmento de DNA contendo um promotor, argS. e IvsA foi usado a fim de aumentar a IvsA. Entretanto, argS não é essencial para a presente invenção. É admissível usar um fragmento de DNA em que IvsA é ligado exatamente a jusante de um promotor.

Uma sequência de nucleotídeo de um fragmento de DNA contendo argS e IvsA. e uma sequência de aminoácido deduzida a ser codificado pela sequência de nucleotídeos são exemplificados na SEQ ID NO: 10. Um exemplo de uma sequência de aminoácido codificada por argS é mostrado na SEQ ID NO: 11, e no exemplo de uma sequência de aminoácido codificada por IvsA é mostrada na SEQ ID NO: 12. Além disso, aos fragmentos de DNA codificando para estas sequências de aminoácidos, a presente invenção pode usar equivalentemente os fragmentos de DNA codificando para as sequências de aminoácidos substancialmente iguais que a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ED NO: 12, isto é, as sequências de aminoácidos tendo a mutação a base de, por exemplo, substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos desde que não se tenha influência substancial na atividade DDC. A IvsA tendo mutação espontânea ou artificial pode ser obtida na mesma maneira como aqueles para o DNA codificando para AK tendo a mutação que não exerce influência na atividade AK e na dessensibilização da inibição de retro-alimentação sinergística por L-lisina e L-treonina. (3) Preparação de ppc Um fragmento de DNA contendo ppç pode ser preparado da partir do cromossomo de uma bactéria corineforme por meio de PCR. O doador de DNA não está especificamente limitado, entretanto, está exemplificado por cepa Brevihacterium lactofermentum ATCC 13869.

Uma sequência de DNA do gene ppc é conhecida para Brevihacterium glutamicum (ver 0'Regan M. et al, Gene, 77, 237-251(1989), na base de que iniciadores de DNA para PCR podem ser preparados. Tais iniciadores de DNA são especificamente exemplificados por DNA de 23 meros respectivamente tendo as sequências de nucleotídeos descritas na SEQ ID NOs: 13 e 14 na Listagem de Sequência. A síntese de DNA, PCR, e a preparação de um plasmídeo contendo ppc obtido podem ser realizados na mesma maneira como as para lvsC descrito acima.

Uma sequência de nucleotídeo de um fragmento de DNA contendo ppc e uma sequência de aminoácido deduziu de uma sequência de nucleotídeo são ilustrados na SEQ ID NO: 15. Somente a sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 16.

Além dos fragmentos de DNA codificando para esta sequência de aminoácido, a presente invenção pode equivalentemente usar os' fragmentos de DNA codificando as sequências de aminoácido substancialmente o mesmo como a sequência de aminoácido mostrado na SEQ ID NO: 16, isto é, as sequências de aminoácido tendo a mutação a,base de, por exemplo, substituição, deleção, ou inserção de um ou mais aminoácidos providos que não há influência substancial na atividade PEPC. O ppc tendo a mutação espontânea ou artificial pode ser obtida na mesma maneira como aqueles para o DNA codificando para AK tendo a mutação que não exerce influência na atividade AK e na dessensibilização da inibição de retro-alimentação sinergística por L-lisina e L-treonina. O ppc com a bactéria corineforme forma um operon junto com gap (gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), pgk (gene fosfoglicerato quinase) e Ipi (gene isomerase triose fosfato), e ppc existe a jusante de Ipi). A expressão de ppc é regulada por um promotor existente a montante de pgk (ver Schwinde, J.W. et al. J. Bacteriol. 175 (12), 3905-3908 (1993). Assim, como o lvsA acima mencionado, ppc pode ser ampliado junto com pgk e tpi por PCR para usar um fragmento de DNA contendo pgk, lpi e ppc. Como mostrado no exemplo abaixo, é deixado usar um fragmento de DNA em que um promotor apropriado é ligado logo a montante da região de codificação de PEPC. O promotor inclui um promotor de lvsC. promotor tac se originando de E. coli e promotor trc. <2> DNA recombinante e bactéria corineforme da presente invenção O DNA recombinante compreende uma sequência de DNA codificando para aspartoquinase em que a inibição de retro-alimentação por L-lisina e L-treonina é substancialmente dessensibilizada, e uma sequência de DNA codificando para descarboxilase diaminopimelato e é replicável autonomamente em células de bactéria corineforme. Em uma forma de realização preferida, o DNA recombinante ainda compreende uma sequência de DNA codificando para uma carboxilase fosfoenolpiruvato além de sequências de DNA acima. A bactéria corineforme da presente invenção abriga um aspartoquinase (mutante AK) em que a inibição retro-alimentação por L-lisina e L-treonina é substancialmente dessensibilizado, em que a sequência de DNA (lvsA) codificando para uma descarboxilase diaminopimelato é melhorada. Em uma forma de realização preferida, a bactéria corineforme da presente invenção é uma bactéria corineforme em que DNA (ppc) codificando para uma carboxilase fosfoenolpiruvato é ainda melhorada. O termo "melhora " aqui refere-se ao fato que a atividade intracelular de uma enzima codificada por DNA é levedado, por exemplo, aumentando o número de cópias de um gene, usando um promotor forte, usando um gene codificando por uma enzima tendo uma atividade específica elevada, ou combinando estes meios. A bactéria corineforme abrigando o mutante AK pode ser uma que produz aspartoquinase mutante como um resultado da mutação, ou a que é transformada por introdução de lvsC mutante.

Exemplos de bactéria corineforme usada para introduzir o DNA descrito acima incluem, por exemplo, as seguintes cepas tipo selvagem produzindo lisina: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;

Corynebacterium callunae ATCC 15991;

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032; (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020; (Brevibacterium lactofermentuml ATCC 13869; (Corynebacterium lilium) ATCC 15990; (Brevibacterium flavum) ATCC 14067;

Corynebacterium melassecola ATCC 17965;

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;

Brevibacterium roseum ATCC 13825;

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP- 1539).

Diferente das cepas bacterianas descritas acima, as utilizáveis como hospedeiras incluem , por exemplo, cepas mutantes tendo uma habilidade para produzir L-lisina derivada das cepas acima mencionadas. Tais cepas mutantes artificiais incluem as seguintes: S-(2-aminoetil)-cisteina (abaixo abreviado como "AEC") cepas mutante resistente (por exemplo, Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147) Publicação de Patente JP Nos. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437, e 7- 112438); as cepas mutantes que requerem o aminoácido tal como L-homoserina para seu próprio crescimento (Publicação de Patente JP Nos. 48-28078 e 56-6499); as cepas mutantes que exibem resistência a AEC e requer os aminoácidos tais como L-leucina, L-hormoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina, e L-valina (Patente U. S. Nos. 3.708.395 e 3.825.472); e as cepas mutantes produzindo L-lisina que exibe a resistência a DL-a-amino-e-caprolactam, a-amino-laurilactamo, análogo aspartamo, droga sulfa, quinoide, e N-lauroilleucina, as cepas mutantes produzindo L-lisina que demonstram resistência a inibidores de descarboxilase oxialoaacetato ou enzimas de sistema respiratório (Pedido Patente JP acessível ao público Nos. 50-53588, 5031093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 e 56-39778, Publicação Patente JP Nos. 53-43591 e 53-1833); cepas mutantes produzindo L-lisina que requer inositol ou ácido acético (Pedido Patente JP acessível ao público Nos. 55-9784 e 56-8692);); cepas mutantes produzindo L-lisina que exibe a sensibilidade para o ácido fluoropirúvico ou a tèmperatura não menos do que 34° C (Pedido Patente JP acessível ao público Nos. 55-9783 e 53-86090); e produzindo cepas mutante pertencentes ao gênero Brevibacterium ou Corynebacterium que exibe a resistência ao etileno glicol e produz L-lisina (Patente U.S. No. 4.411.997).

Em uma forma de realização específica, a fim de melhorar os genes para biossíntese L-lisina no hospedeiro como descrito acima, os genes são introduzidos dentro do hospedeiro por uso de um vetor plasmídeo, vetor transposon ou fago ou outros. Quando da introdução, é esperado produzir de modo intensivo algumas extensões até mesmo usando um vetor de tipo de poucas cópias. Entretanto, o preferido é usar um vetor de tipo de cópias múltiplas. Tal um vetor inclui, por exemplo, os vetores plasmídeos, pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3248 e PAJ440 descrito acima. Além disso, transposons derivado da bactéria corineforme são descritas nos Panfletos de Publicação Internacional de WO 02/02627 e WO 93/18151, Publicação Patente Européia No. 445385, Pedido Patente JP acessível ao público No. 6-46867, Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994), Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994), Vertes, A. A. et al, Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994), Jagar, W. et al. al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995), Pedido Patente JP acessível ao público No. 7-327680 e outros.

Na presente invenção, não é indispensável que o IvsC mutante seja necessariamente melhorado. É admissível usar aqueles que tem a mutação na IvsC no DNA cromossômico, ou em que a IvsC mutante é incorporado dentro do DNA cromossômico. Altemativamente, a IvsC mutante pode ser introduzida conforme usando um vetor plasmídeo. Por outro lado, lvsA e ppc são preferivelmente melhorados a fim de produzir eficientemente L-lisina.

Cada dos genes de lyscC.. lvsA e ppc pode ser sucessivamente introduzido dentro do hospedeiro conforme usando a diférença de vetores respectivamente. Altemativamente, duas, três, quatro, ou cinco espécies de genes podem ser introduzidas juntas conforme usando um vetor único. Quando os vetores diferentes são usados, os genes podem ser introduzidas em alguma ordem, entretanto, o preferido é usar os vetores que tem uma compartilhar estável e abrigando o mecanismo no hospedeiro, e que são capazes de co-existirem um com o outro.

Uma bactéria corineforme abrigando o mutante AK e ainda compreendendo lvsA melhorado é obtida, por exemplo, pela introdução, em uma bactéria corineforme hospedeira, um DNA recombinante contendo o mutante lvsA e ppc autonomamente replicável em células de bactéria corineforme.

Uma bactéria corineforme ainda compreendendo ppc melhorado além de mutante IvsC e lvsA é obtida, por exemplo por introdução na bactéria corineforme hospedeira, de um DNA recombinante contendo mutante lysC. lvsA e ppc replicáveis de modo autônomo nas células de bactéria corineforme. Também uma bactéria corineforme compreendendo lvsA. lvsC e ppc é obtida por introdução, na bactéria corineforme, compreendendo o melhorado mutante lvsC e lvsA. um DNA recombinante contendo ppc replicável autonomamente em células de bactéria corineforme.

Os DNAs recombinados mencionados acima podem ser obtidos, por exemplo, pela inserção de genes participando na biossíntese L-lisina em um vetor tal como o vetor plasmídeo, vetor transposon ou fago como descrito acima.

No caso em que o plasmídeo é usado como um vetor, o DNA recombinante pode ser introduzido dentro do hospedeiro de acordo com um processo de pulso elétrico (Sigimoto et al., Pedido Patente JP acessível ao público No. 2-207791). A amplificação de um gene usando transposon pode ser realizado pela introdução um plasmídeo que carregando um transposon em uma célula hospedeira e induzindo a transposição do transposon. <3> Processo para produzir L-lisina A L-lisina pode ser produzida pelo cultivo, em um meio apropriado, da bactéria corineforme compreendendo os genes melhorados para biossíntese de L-lisina como descrito acima, para permitir a L-lisina para ser produzida e acumulada em uma cultura da bactéria, e coletando a L-lisina da cultura. O meio a ser usado é exemplificado por um meio comum contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos, e opcionalmente outros componentes orgânicos.

Como a fonte de carbono, é possível usar açúcares tais como glicose, frutose, sacarina, melaço, e hidrolisado de amido; e ácidos orgânicos, tais como, ácido fumárico, ácido cítrico, e ácido succínico.

Como a fonte de nitrogênio, é possível usar os sais de amônia inorgânica, tais como, sulfato de amônia, cloreto de amônia, e fosfato de amônia; nitrogênio orgânico, tais como, hidrolisado de soja; gás de amônia; e amônia gasosa.

Como as fontes de nutrientes de traço orgânico, é desejável conter as substancias requeridas tal como a vitamina e L-homoserina ou extrato de levedura ou outros nas quantidades apropriadas. Que não seja o acima, o fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íon de ferro, íon de manganês etc. são adicionados em quantidades pequenas, se necessário. O cultivo é preferivelmente realizado sob uma condição aeróbica de cerca de 30 a 90 horas. A temperatura de cultivo é preferivelmente controlada a 25° C a 37° C, e o pH é preferivelmente controlada de 5 a 8 de duração de cultivação. Inorgânico ou orgânico, substancias ácidas ou alcalina, ou gás de amônia e outros podem ser usados para o ajustamento do pH. A L-lisina pode ser coletada de uma cultura pela combinação um processo de resina de melhora de íon comum, um processo de precipitação, e outros processos conhecidos.

EXEMPLOS A presente invenção será mais especificamente explicado abaixo com referência aos Exemplos.

Exemplo 1: Preparação de um gene lys.Ciipo selvagem e o gene lvsC mutante de Brevibacterium lactofermentum <1> Preparação de um lvsC de tipo selvagem e mutante e preparação de plasmídeos contendo os mesmos Uma cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, e um cepa mutante produzindo L-lisina AJ3445 (FERM P-1944) obtido da cepa ATCC 13869 por um tratamento de mutação foram usados como doadores de DNA cromossômico. A cepa AJ3445 foi submetida a uma mutação como que lvsC foi mudada para envolver a dessensibilização substancial de inibição combinada por lisina e treonina (Journal of Biochemistry. 6S, 701-710 (1970)).

Um fragmento de DNA contendo lvsC foi ampliado de DNA cromossômico de acordo com o processo PCR (reação de cadeia polimerase; ver Whitee, T. J. et al., Trends Genet.. £, 185 (1989)). Como os iniciadores de DNA usados para amplificação, o filamento único de DNA de 23 meros e 21 meros tendo as sequências nucleotídeos mostradas na SEQID NOs: 1 e 2 foram sintetizados a fim de ampliar uma região de cerca 1.643 bp codificando para lvsC na base de uma sequência conhecida por Corynebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology (1991), 5(5). 1197-1204; and Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). O DNA foi sintetizado de acordo com um processo comum conforme usando um sintetizador DNA modelo 380B produzido por Applied Biosystems e usando o processo fosfoamidito (ver Tetrahedron Letters (1981), 22,1859). O gene foi ampliado por PCR usando o Modelo de ciclador térmico de DNAPJ2000 produzido por Takara Shuzo, e usando a polimerase DNA Taq de acordo com um processo designado pelo fornecedor. Um fragmento de gene ampliado de 1.643 kb foi confirmada por eletroforeses em gel agarose. Depois que, o fragmento eliminado do gel foi purificado de acordo com um processo comum, e foi digerido com enzimas de restrição NurI produzido por Takara Shuzo) e EcoRI (produzido por Takara Shuzo). pHSG399 (ver Takeshita, S. et al., Gene (1987), £1, 63-74) foi usado como um vetor de clonagem para o fragmento de gene. pHSG399 foi digerido com enzimas de restrição Saml (produzido por Takara Shuzo) e EçqRI, e foi ligado com um fragmento lvsC ampliado. O DNA foi ligado conforme usando o kit de ligação DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um processo designado. Assim, os plasmídeos foram preparados, em que os fragmentos lvsC ampliaram de cromossomos Brevibacterium lactofermentum foram ligados com pHSG399 respectivamente. Um plasmídeo compreendendo de lvsC de ATCC 13869 (cepa tipo selvagem) foi designado com p399AKY, e um plasmídeo compreendendo lvsC de AJ3463 (bactéria produzindo L-lisina) foi designada com p399AK9.

Um fragmento de DNA (abaixo referido como "Brevi.-ori") tendo uma habilidade para produzir um plasmídeo autonomamente replicável na bactéria pertencente ao gênero Corynebacterium foi introduzido dentro p399AKY e p399AK9 respectivamente para preparar os plasmídeos carregando lvsC autonomamente replicável na bactéria pertencendo ao gênero Corynebacterium. Brevi.-ori foi preparado de um vetor plasmídeo pHK4 contendo Brevi.-ori e autonomamente replicável em células de ambos Escherichia coli e a bactéria pertencente ao gênero Corynebacterium. pHK4 foi construído pela digestão pHC4 com Kpnl (produzido por Takara Shuzo) e BamHI (produzido por Takara Shuzo), extraindo um fragmento Brevi.-ori, e ligando com pHSG298 tendo também digerido com Kpnl e BamHI (ver Pedido Patente JP acessível ao público No. 5-7491). O pHK4 dá uma resistência canamicina a um hospedeiro. Escherichia coli abrigando pHK4 foi designado como Escherichia coli AJ13136, e depositado em 1 de Agosto de 1995 sob um número de acesso de FERM BP-5186 no National Institute of Biosciense and Human Techology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japão). pHK4 foi digerido com enzimas de restrição Kpnl e BamHI. e bordas clivadas foram de terminação obtusa. A formação da terminação obtusa foi realizada conforme usando um kit de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um processo designado. Depois a formação da terminação obtusa, um ligador BamHI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para produzir a modificação como que o fragmento de DNA correspondendo a uma porção Brevi.-ori podería ser exercida de pHK4 por digestão somente com Bamfíl. Este plasmídeo foi digerido com ÊâmHI, e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p399AKY e p399AK9 sendo também digerido com BamHI respectivamente para preparar cada plasmídeo contendo o gene lvsC autonomamente replicável na bactéria pertencente ao gênero Corynebacterium.

Um plasmídeo contendo o gene lvsC tipo selvagem originando de p399AKY foi designado com p399AKYB, e um plasmídeo contendo o gene mutante lvsC originando de p399AK9 foi designado como p399AK9B. O processo da construção de p399AK9B e p399AKYB é mostrado na Fig. 1. Uma cepa AJ12691 obtida conforme introduzindo o mutante lvsC plasmídeo p399AK9B em uma cepa tipo selvagem de Brevihacterium lactofermentum (cepa AJ12036, FERM BP-734) foi depositado em 10 de Abril de 1992, sob um número de acesso de FERM P-12918 no National Institute of Biosciense and Human Techology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japão), transferido ao depósito internacional baseado Tratado de Budapeste em 10 de Fevereiro de 1995, e depositado sob um número de acesso de FERM BP-4999. <2> Determinação das sequências nucleotídeos de lvsC tipo selvagem e mutante lvsC de Brevibacterium lactofermentum O plasmídeo p399AKY contendo a lvsC tipo selvagem e o plasmídeo p399AK9 contendo o mutante lvsC foram preparados dos transformantes respectivo para determinar as sequências nucleotídeos do tipo selvagem e mutante de lvsC. A determinação da sequência de nucleotídeos foi realizada de acordo com um processo de Sanger et al. (por exemplo, F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei.. IA, 5463 (1977)). A sequência de nucleotídeos de lvsC tipo selvagem codificada por p399AKY é mostrado na SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequência.

Por outro lado, a sequência de nucleotídeo do mutante lvsC codificado por p399AK9 tem somente a mutação de um nucleotídeo tal que 105 lst G foi melhorado em A na SEQID NO: 3 como comparado com lvsC tipo selvagem. É conhecido que lysC de Corynebacterium glutamicum tem duas subunidades (α, β) codificado em uma forma de leitura idêntica a uma filamento de DNA idêntico (ver Kalinowski, J. et al., Molecular Microhiology (1991) 5(5), 1197-1204). Julgando a partir da homologia, é assumido que o gene sequenciado aqui também tem duas subunidades (α, β) codificada em uma foram de leitura idêntica a um filamento de DNA idêntico.

Uma sequência de aminoácido de α-subunidade da proteína AK tipo selvagem deduziu dentre a sequência de nucleotídeos de DNA é mostrado na SEQ ID NO: 4 juntos com a sequência DNA. Somente a sequência de aminoácido é mostrado na SEQ ID NO: 5. Uma sequência de aminoácido de β-subunidade da proteína AK tipo selvagem deduzida dentre a sequência de nucleotídeo de DNA é mostrada na SEQ ID NO: 6 junto com a sequência de DNA. Somente a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ. ID. NO.: 7. Em cada das subunidades, GTG é usado como um códon de iniciação, e um aminoácido correspondente é representado por metionina. Entretanto, esta representação refere-se a metionina, valina, ou formilmetionina.

Por outro lado, a mutação na sequência de mutante l vsC significa a ocorrência da substituição do resíduo de aminoácido tal que um 279° resíduo alanina de α-subunidade é melhorada dentro do resíduo treonina, e um 30° resíduo de alanina de β-subunidade é melhorada em um resíduo treonina na sequência de aminoácido da proteína AK tipo selvagem (SEQ ID NOs: 5,7).

Exemplo 2: Preparação de lvsA de Brevibacterium lactofermentum <1> Preparação de lvsA e a construção de plasmídeo contendo lvsA

Uma cepa tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi usada como um doador DNA cromossômico. DNA cromossômico foi preparado da cepa ATCC 13869 de acordo com um processo comum. Um fragmento de DNA contendo argS, lvsA , e um promotor de um operon contendo os mesmos, foi ampliado do DNA cromossômico de acordo com PCR. Como para iniciadores DNA usado para amplificação, o DNA de 23 meros tendo sequências de nucleotídéo mostradas na SEQID NOs: 8 e 9 na Listagem de Sequência respectivamente foram sintetizado a fim de ampliar uma região de cerca de 3,6 kb codificando para arginil-tRNA sintase, e DDC, na base de uma sequência conhecida para Brevibacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology. 41(11). 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics. 212, 112-119 (1988)). A síntese de DNA e PCR foram realizadas na mesma maneira como descrito no Exemplo 1. pHSG399 foi usado como um vetor de clonagem para o fragmento de gene ampliado de 3,579 bp, pHSG399 foi digerido com uma enzima de restrição Smal (produzido por Takara Shuzo) que foi ligado com um fragmento de DNA contendo a lvsA ampliado. Um plasmídeo obtido foi descrito acima, que tinha a lvsA originando de ATCC 13869, foi designado como p399LYSA.

Um fragmento de DNA contendo lvsA foi extraído conforme digerindo p399LYSA com Kpnl (produzido por Takara Shuzo) e BamHI (produzido por Takara Shuzo). Este fragmento de DNA foi ligado com pHSG299 tendo digerido com Kpnl e BamHI. Um plasmídeo obtido foi designado como p299LYSA. O processo da construção de p299LYSA é mostrado na Fig. 2.

Brevi.-ori foi introduzido dentro do p299LYSA obtido para construir um plasmídeo carregando lvsA autonomamente replicável na bactéria corineforme. pHK4 foi digerido com enzimas de restrição Kpnl e BamHI (produzido por Takara Shuzo) e bordas clivadas foram de terminação obtusa. A formação da terminação obtusa foi realizada conforme usando um kit de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um processo designado. Depois a formação da terminação obtusa, um ligador Kpnl fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para produzir a modificação como que o fragmento de DNA correspondendo a uma porção Brevi.-ori podería ser exercida de pHK4 por digestão somente com Kpnl. Este plasmídeo foi digerido com Kpnl. e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p299LYSA sendo também digerida com Kpnl para preparar um plasmídeo contendo lvsA autonomamente replicável na bactéria corineforme. O plasmídeo preparado foi designado como pLYSAB. O processo da construção de pLYSAB é mostrado na Fig. 3. <2> Determinação da sequência de nucleotídeo de lvsA de Brévibacterium lactofermentum O plasmídeo DNA de p299LYSA foi preparado, e a sequência de nucleotídeo foi determinada na mesma maneira como descrito no Exemplo 1. Uma sequência de nucleotídeo determinada e uma sequência de aminoácido deduziu para ser codificado pela sequência de nucleotídeo são mostrados na SEQ ID NO: 10. A respeito da sequência de nucleotídeo, uma sequência de aminoácido codificada por argS e uma sequência de aminoácido codificada por lvsA são mostrados nas SEQ ID NO: 11 e 12 respectivamente.

Exemplo 3- Preparação de ppc a partir de Brevibacterium lactofermentum <1> Preparação de ppc Uma cepa tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi usada como um doador DNA cromossômico. DNA cromossômico foi preparado da cepa ATCC 13869 de acordo com um processo comum. Um fragmento de DNA contendo argS, lvsA , e um promotor de um operon contendo os mesmos, foi ampliado do DNA cromossômico de acordo com PCR. Como para iniciadores DNA usado para amplificação, o DNA de 23 meros tendo sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID NOs: 13 e 14 na Listagem de Sequência respectivamente foram sintetizado a fim de ampliar uma região de cerca de 3,3 kb codificando para PEPC, na base de uma sequência conhecida para Brevibacterium glutamicum (ver 0'Regan M. et al, Gene, 77, 237-251(1989). A síntese de DNA e PCR foi realizada como descrito rio exemplo 1. O fragmento de gene ampliado de cerca de 3.300 bp foi confirmado por eletroforese de gel agarose, e então o fragmento extraído do gel foi purificado por processo comum, e digerido com enzima de restrição Sall (produzido por Takara Shuzo) e ligado com fragmento DNA contendo ppc ampliado. Um plasmídeo obtido que tinha ppc se originando de ATCC 13869, foi designado como pPCF.

<2> Ligação de gene ppc com promotor lvsC O Ppcf obtido Como Acima Foi Digerido Com enzima de restrição Dral (produzido por Takara Shuzo). Após um fragmento de cerca de 150 bp a montante de gene estrutural PEPC ser removido, a auto-ligação foi feita para obter pia pPCFds. pPCFds foi digerido com enzima de restrição (produzido por Takara Shuzo) e bordas clivadas foram terminadas de modo obtuso. A formação de terminação obtusa foi feita usando kit de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com o processo projetado. p399AKYB contendo lvsC de tipo selvagem obtido no exemplo 1 foi digerido com enzima de restrição ApaLI _e_Pst I. (produzido por Takara Shuzo) e as bordas clivadas como acima. Um fragmento menor dentre os dois fragmentos de DNA obtidos contém Brevi-ori e um promotor de lvsC.

Este fragmento foi ligado com o fragmento acima obtido por digestão de pPCFds com Sall e terminado obtuso por uso de kit de ligação de DNA (produzido por Takara Shuzo).

Um DNA em uma solução de ligação foi introduzido no fírevibacteríum lactofermentum ATCC 13869 de acordo com processo de pulso elétrico (Sugimoto et al, Pedido Patente JP acessível ao público No. 2-207791). Os transformantes foram selecionados baseados em um marcador de resistência de droga possuído pelo plasmídeo. Os transformantes foram selecionados em um meio completo contendo 5 pg/ml de cloranfenicol. O DNA plasmídeo foi coletado dos transformantes, e digerido com EcoRI para obter um plasmídeo em que o promotor lvsC foi ligado com o gene estrutural ppc em orientação normal. O plasmídeo obtido foi designado como pAKPFds. O processo de construção de pAKPFds é mostrado na figura 4. O ppc ligado com o promotor lvsC é a seguir referido como "ppc de alta expressão de tipo selvagem. <3> Inserção de ppc de alta expressão de tipo selvagem em YSíor O ppc de alta expressão de tipo selvagem obtido acima foi ampliado por PCR para inserir o mesmo em um vetor tendo origem de replicação replicável autonomamente em bactéria corineforme além de Brevi.-ori. Como para iniciadores de DNA, um oligonucleotídeo correspondente a porção de promotor lvsC ()SEQ. ID. NO.:7) que foi sintetizado com base na sequência de lvsC conhecida para Corvnebacterium glutamicum ver Molecular Migrobiology (1991), 5(5), 1197-1204; MoL Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). e um oligonucleotídeos correspondendo à porção ppc (SEQ. ID. NO.: 8) que foi sintetizada na base da sequência de ppc conhecida para Corynebacterium glutamicum (ver 0'Regan M. et al, Gene, 77, 237-251 (1989). Estes iniciadores foram designados de modo que um fragmento de cerca de 3150 bp contendo o ppc de alta expressão de tipo selvagem pode ser ampliado e um terminal de fragmento de DNA ampliado pode ser digerido uma enzima de restrição Kpnl. A síntese de DNA e PCR foram realizadas como no exemplo 1.

Um vetor de clonagem, para bactéria corineforme,pVK7, que foi recentemente construído, foi usado como vetor para introdução de um ppc de tipo selvagem, alta expressão, em bactéria corineforme . pVK7 foi construído por ligação de pHSG299, um vetor para E. coli, (Km, Takeshita, S. et al, Gene, 61, 63-74 (1987) com pAM330, um plasmídeo críptico para Brevibacterium lactofermentum como abaixo descrito. pHSG299 foi digerido com enzima de restrição resultando de um sítio de divagem, Avall (produzido por Takara Shuzo), terminado obtuso usando polimerase de DNA T4 e ligado com pAM330 tendo digerido com Hind III (produzido por Takara Shuzo) e terminado obtuso por uso de polimerase DNA T4. Dependendo da orientação de pAM330 inserido em pHSG399, os dois plasmídeos obtidos foram pVK6 e pVK7, e pVK7 foi usado para as seguintes experiências. pVK7 é replicável autonomamente em E. coli e Brevibacterium lactofermentum e tem sítio de clonagem múltiplo originando de pHSG299 e lacZ'. O processo de construção de pVK6 e pVK7 é dado na figura 5.

Um fragmento de gene ampliado de cerca de 3 150 bp foi confirmado por eletroforese de gel agarose, e então o fragmento extraído do gel purificado por processo comum e digerido com enzima de restrição Kpnl (produzido por Takara Shuzo). O fragmento de DNA foi ligado com pVK7 tendo sido digerido com enzima de restrição Kpnl. O plasmídeo preparado foi designado como pPwm. O processo de construção de pPwm é dado na figura 6.

Exemplo 4- Preparação de plasmídeo compreendendo combinação de lvsC e lysA mutante Um plasmídeo contendo lvsC. lvsA mutante e uma origem de replicação para bactéria corineforme foi preparado de plasmídeo p399AK9B contendo mutante lysC e brevi-ori e plasmídeo p299LYSA contendo lvsA. p299LYSA foi digerido com enzima de restrição (produzido por Takara Shuzo) e terminado obtuso. A formação de terminação obtusa foi feita usando kit de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um processo designado. O fragmento de DNA obtido foi ligado com p399AK9B tendo sido digerido com MI e terminado. Assim, um plasmídeo contendo mutante lvsC e lvsA replicável autonomamente em bactéria corineforme foi preparado e designado como pCL. O processo de construção de pCL é dado na figura 7.

Exemplo comparativo 1 - preparação de dapA. dapB e ddh de Brevibacterium lactofermentum Como os genes se associam com biossíntese de L-lisina em vez de lvsC. lvsA e ppç, dap A_(gene de sintase di-hidrodipicolinato) dapB (gene reductase di-hidrodipicolinato) e ddh (gene desidrogenase diaminopimelato) foram obtidos. <1> preparação de dap A e construção de plasmídeo contendo dapA

Uma cepa de tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi usada como um doador de DNA cromossômico. DNA cromossômico foi preparado decepa ATCC 13869 de acordo com o processo comum. Um fragmento de DNA contendo dapA foi ampliado do DNA de acordo com PCR. Como para iniciadores de DNA usados para amplificação, DNA de 23 meros tendo sequências de nucleotídeo da SEQ. ID. NO.: 20 e 21 em Listagem da Sequência respectivamente foram sintetizados a fim de amplificar uma região de cerca de 1,5 kg codificando para DDPS na base de sequência conhecida para Corynebacterium glutamicum (ver Nucleic Acids Research, 18 (21), 6421 (1990), EMBL, no. X53993). A síntese de DNA e PCR foi realizada como descrito no exemplo 1. pCRIOOO (produzido por Invitrogen, ver fíio/Technologv 9, 657-663 (1991), foi usado como vetor de clonagem para o fragmento de gene ampliado de 1.411 bp e foi ligado com o fragmento de dapA ampliado. A ligação de DNA foi realizada usando kit de ligação de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com o processo designado. Assim, um plasmídeo foi construído, e que o fragmento dapA de 1.411 bp ampliado de cromossomo de Brevibacterium lactofermentum foi ligado em pCRIOOO. O plasmídeo obtido como acima, que tinha dapA se originando de ATCC 13869, foi designado como pCRDAPA.

Uma cepa transformante de AJ13106 obtida por introdução de pCRDAPA em cepa E. coli JM109 foi intemacionalmente depositado desde 16 de maio de 1995, sob um número de acesso de FERM BP-5113 no National Institute of Biosciense and Human Techology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japão), baseado no Tratado de Budapeste.

Brevi.-ori foi introduzido no pCRDAPA preparado para construir u plasmídeo tendo dapA replicável autonomamente em bactéria corineforme. pHK4 foi digerido com enzima de restrição Κρη I e BamHI (produzido por Takara Shuzo) e bordas clivadas tomadas obtusas. A formação de terminação obtusa foi realizada usando kit de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com o processo designado. Após a formação de terminação obtusa, um ligador Smal fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para fazer modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente a porção Brevi-ori pode ser excisado de pHK4 por digestão com somente Smal. Este plasmídeo foi digerido com Smal. e o fragmento de DNA Brevi-ori gerado foi ligado com pCRDAPA tendo sido digerido com SmaT para preparar um plasmídeo contendo dapA replicável autonomamente em bactéria corineforme. Este plasmídeo foi designado como pDPSB. O processo de construção de pDPSB (Kmr) é dado na figura 8. <2> Preparação de dapB e construção de olasmídeo contendo dapB

Uma cepa tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi usada como doador de DNA cromossômico. O DNA foi preparado de ATCC 13869 de acordo com um processo comum. Um fragmento de DNA contendo dapB foi ampliado de DNA cromossômico de acordo com PCR. Para os iniciadores de DNA usados para amplificação, DNA de 23 meros tendo sequências de nucleotídeos da SEQ. ID. NO.: 19 e 20 na Listagem da Sequência respectivamente foram sintetizados a fim de ampliar uma região de cerca de 2,0 kb codificando para DDPR na base de uma sequência conhecida para Brevibacterium lactofermentum (ver Journal ofBacteriology. 175Í9L 2743-2749 (1993)). A síntese de DNA e PCR foram realizadas na mesma maneira como descrita no Exemplo l.pCR-Script (produzido por Invitrogen) foi usado como um vetor de clonagem para o fragmento de gene ampliado de 2.001 bp, e foi ligado com um fragmento dapB ampliado. Assim um plasmídeo foi construído, em que o fragmento dapB de 2.001 bp ampliado de cromossomo de Brevibacterium lactofermentum foi ligado com pCR-Script. O plasmídeo obtido foi descrito acima, que tinha dapB originando de ATCC 13869, foi designado como pCRDAPB. Uma cepa AJ13107 transformante obtida por introdução pCRDAPB dentro da cepa JM109 de E. çoli tem sido intemacionalmente depositada desde de 26 e Maio de 1995 sob um número de acesso FERM BP-5114 no National Institute of Bioscience and Human Techology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japão), baseado em Tratado de Budapeste.

Um fragmento de 1.101 bp contendo um gene estrutural de DDPR foi extraído conforme digerindo pCRDAPB com EcoRV e Sphl. Este fragmento foi ligado com pHSG399 sendo digerido com HincII e Sphl para preparar um plasmídeo. Um plasmídeo preparado foi designado como p399DPR.

Brevi.-ori foi introduzido dentre o p399DPR para construir um plasmídeo carregando dapB autonomamente replicável na bactéria corineforme. pHK4 foi digerido com uma enzima de restrição Kpnl (produzido por Takara Shuzo) e clivado nas bordas foram de terminação obtusa. A formação da terminação obtusa foi realizada conforme usando um kit de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um processo designado. Depois a formação da terminação obtusa, um ligador BamHI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para produzir a modificação como que o fragmento de DNA correspondendo a uma porção Brevi.-ori podería ser exercida de pHK4 por digestão somente com BamHI. Este plasmídeo foi digerido com BamHI. e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p399DPR sendo também digerido com BamHI para preparar um plasmídeo contendo dapB autonomamente replicável na bactéria corineforme. O plasmídeo preparado foi designado como pDPRB. O processo da construção de pDPRB é mostrado na Fig. 9 <3> Preparação de ddh e construção de plasmídeo contendo ddh Um gene ddh foi obtido por amplificação de gene ddh de DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 de acordo com o processo PCR por uso de dois iniciadores de oligonucleotídeos SEQ. ID. NO.: 23,24) preparados com bases na sequência de nucleotídeo conhecida de gene ddh de Corynebacterium glutamicum ((Ishino, S. et al, Nucleic Acids Res. 15r 3917. (1987), Um fragmento de DNA ampliado obtido foi digerido com EcoT22I e Aval, bordas clivadas tomadas obtusas. Após isto, o fragmento foi inserido em sítio Smal de pMWl 19 para obter um plasmídeo pDDH. A seguir pDDH foi digerido com Sall e EcqRI, seguido por formação de terminação obtusa. Após isto, um fragmento obtido foi ligado com pUC18 tendo sido digerido com Smal. Um plasmídeo assim obtido foi designado como pUC18DDH.

Brevi.-ori foi introduzido dentre o pUC18DDH para construir um plasmídeo carregando ddh autonomamente replicável na bactéria corineforme. pHK4 foi digerido com uma enzima de restrição Kpnl (produzido por Takara Shuzo) e clivado nas bordas foram de terminação obtusa. A formação da terminação obtusa foi realizada conforme usando um kit de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um processo designado. Depois a formação da terminação obtusa, um ligador PstI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado de modo que foi inserido no sítio Esll de pHSG299. O plasmídeo construído como acima foi designado como pPK4. A seguir, pUC18DDH foi digerido com Xbal e Kpnl, e um fragmento gerado foi ligado com pPK4 tendo sido digerido com Kpnl e Xbal. Assim, um plasmídeo contendo ddh replicável autonomamente em bactéria corineforme foi construído. Este plasmídeo foi designado como pPK4D. O processo de construção de pPK4D é mostrado na figura 10.

Exemplo comparativo 2 - construção de plasmídeo compreendendo combinação de mutante lvsC, e dapA. dapB ou ddh <1> construção de combinação de mutante lvsC e dapA Um plasmídeo compreendendo mutante lvsC. dapA e origem de replicação de bactéria corineforme foi construído a partir do plasmídeo pCRDAPA compreendendo dapA e o plasmídeo p399AK9B compreendendo mutante lvsC e Brevi.ori. p399AK9B foi completamente digerido com Sall, e então tomado obtuso. Um ligador EcoRi foi ligado para construir um plasmídeo em que o sítio Sall foi modificado em sítio EcoRI O plasmídeo obtido foi designado como p399AK9BSE. O mutante lysC e Brevi-ori foram excisados como um fragmento por parcial digestão de p399AK9BSE com EcoRI. Este fragmento foi ligado com pCRDPA tendo sido digerido com EcoRI. Um plasmídeo obtido foi designado como pCRCAB. Este plasmídeo é replicável autonomamente em E. coli e bactéria corineforme, e dá resistência a canamicina como um hospedeiro, o plasmídeo compreendendo uma combinação de mutante lysC e dapA. O processo de construção de pCRCAB é mostrado na figura 11.

<2> construção de plasmídeo compreendendo combinação de mutante lvsC e dapR

Um plasmídeo compreendendo mutante lvsC e dapB foi construído do plasmídeo p399AK9 tendo mutante lvsC e o plasmídeo p399DPR tendo dapB. Um fragmento de 1.101 bp contendo um gene estrutural de DDPR foi extraído por digestão de p399DPR com EcoRV e Sphl. Este fragmento foi ligado com p399AK9 tendo sido digerido com Sall e então terminado obtuso e ainda digerido com Sphl para construir um plasmídeo compreendendo uma combinação de mutante lvsC e dapB. Este plasmídeo foi designado como p399AKDDPR. A seguir, Brevi.-ori foi introduzido em p399AKDDPR obtido. O plasmídeo pHK4 contendo Brevi.-ori foi digerido com uma enzima de restrição KpnT (produzido por Takara Shuzo) e bordas clivadas foram de terminação obtusa. A formação da terminação obtusa foi realizada conforme usando um kit de DNA (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um processo designado. Depois a formação da terminação obtusa, um ligador BamHI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para produzir a modificação como que o fragmento de DNA correspondendo a uma porção Brevi.-ori podería ser excisado de pHK4 por digestão somente com BamHI. Este plasmídeo foi digerido com BamHI, e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p399AKDDPR sendo também digerido com BamHI para construir um plasmídeo contendo o mutante lvsC e dapb autonomamente replicável na bactéria. O plasmídeo construído foi designado como pCB. O processo da construção de pCB é mostrado na Fig. 12. <3> construção de plasmídeo compreendendo combinação de mutante lvsC e ddh Um plasmídeo contendo mutante lvsC. ddh e uma origem de replicação para bactéria corineforme foi preparado de plasmídeo pUCl 8DDH contendo ddh e plasmídeo p399AK9B contendo lvsC mutante e Brevi.ori. pUC18DDH foi digerido com enzima de restrição EcoRI (produzido por Takara Shuzo) terminado obtuso e ligado com poliligador Sall em um terminal do mesmo para mudar o sítio EcoRI para sítio Sall. O plasmídeo obtido foi digerido com Sall para obter um fragmento contendo ddh.

Então, p399AK9B foi digerido com enzima de restrição Sall e ligado com fragmento de DNA contendo ddh. Assim, um plasmídeo contendo mutante lvsC. ddh e brevi-ori replicável autonomamente em bactéria corineforme foi preparado, e designado como pCD. O processo de construção de pCD é mostrado na fig. 13.

Exemplo 5 - introdução de plasmídeos com genes para biosíntese de L-lisina em bactérias produzindo L-lisina de Brevibacterium lactofermentum Os plasmídeos compreendendo os genes para biossíntese de L-lisina construídos como acima, ou seja p399AK9B (Cmr), pLYSAB (Cmr), pPwm (Kmr), pCRCAB (Kmr), pCB (Cmr), pCD (Cmr) e pCL (Cmr) foram introduzidos em uma bactéria produzindo L-lisina Aj 11082 (NRRL B-11470) de Brevibacterium lactofermentum. respectivamente. Cepa AJ11082 tinha a propriedade de resistência a AEC. Os plasmídeos foram introduzidos de acordo com processo de pulso elétrico (Sugimoto et al., Pedido Patente JP acessível ao público No. 2-207791). Os transformantes foram selecionados baseados em um marcador de resistência de droga possuído pelo plasmídeo. Os transformantes foram selecionados em um meio completo contendo 5 pg/ml de cloranfenicol quando um plasmídeo compreendendo um gene de resistência a cloranfenicol foi introduzido, ou os transformantes foram selecionados em um meio completo contendo 25 pg/ml de canamicina quando um plasmídeo compreendendo um gene de resistência a canamicina foi introduzida. A uma cepa cujos mutantes lvsC e lvsA foram melhorados dentre os transformantes obtidos, pPwm (Km1) foi introduzido para obter uma cepa em que três de lvsC. lysA e ppc mutantes foram melhorados (AJ11082/ pCI(pPwm). Os transformantes foram selecionados em um meio completo contendo 5 pg/ml de cloranfenicol e 25 pg/ml de canamicina. Exemplo 6 - Produção de L-lisina Cada um dos transformantes obtido no Exemplo 5 foi cultivado no meio produzindo L-lisina para avaliar a produtividade de L-lisina. O meio produzindo L-lisina tinha a seguinte composição. [Meio produzindo L-lisina] Os seguintes componentes diferentes de carbonato de cálcio (em 1 L) foram dissolvidos, e o pH foi ajustado a 8,0 com KOH. O meio foi esterilizado a 115° C durante 15 minutos, e o carbonato de cálcio (50 g) sendo separadamente esterilizado em ar quente em um estado seco foi a seguir adicionado ao mesmo.

Glucose 100 g (NH4)2S04 55 g KH2P04 1 g MgS04.7H20 1 g Biotina 500 pg Tiamina 2000 pg FeS04.7H20 0,01 g MnS04.7H20 0,01 g Nicotinamida 5 mg Hidrolisato de proteína (Mamenou) 30 ml Carbonato de cálcio 50 g Cada dos vários tipos dos transformantes e a cepa originária foram inoculadas ao meio tendo a composição descrita acima para realizar o cultivo a 31,5° C com sacudimento alternativo. A quantidade de L-lisina produzida depois de 40 ou 72 horas de cultivação, são mostrados na Tabela 1, Na tabela, IvsC* representa o mutante lvsC. TABELA 1 Acúmulo de T -lisina após cultivacâo durante 40 a 72 h í^fa_Eacteriana Gene Introduzido Quantidade de L-lisina /Dlasmídeo produzida i&U após após 40 hrs 72 hrs AJ11082 210 29 8 AJ110S2/p399AK9B lvsC* 16.8 34.5 AJ11082/pLYSAB lysA 19.8 32.5 AJ11082/pPwm 22£ 20·7 289 AJ11082/pCRCAB lysCl dagA 19.7 36.5 AJ11082/pCB ]ys£l dapB 23.3 35.0 AJ11082/pCD lvsC*. ddh 15.0 27.0 AJ11082/pCL lys£!, jvsA 24.0 44.0 AJ11082/pCL/pPwm lysCl lysA, pgç 25.0 45.2 Como mostrado acima, quando mutante lvsC. lvsA ou ppc foram melhorados sozinhos, ou quando lysC mutante foi melhorado em combinação com dapA ou ddh, a quantidade de L-lisina produzida foi maior do que ou equivalente à produzida por cepa originária após 72 h de cultivo, no entanto, a quantidade de L-lisina produzida foi menor do que a produzida pela cepa originária após 40 h de cultivo. Ou seja, a velocidade produzida por L-lisina foi abaixada em cultivada por um período curto. Similarmente, quando lvsC e ddh mutante foram melhorados em combinação, a quantidade de L-lisina produzida foi menor do que aquela produzida pela cepa original depois de 40 horas e 72 horas de cultivo. Pelo contrário, no caso da cepa em que HapR foi realçado juntamente com lvsC mutante, o crescimento foi aperfeiçoado, a velocidade de produção de L-lisina foi bem sucedidamente rrestaurada no curto período de cultivo e a quantidade acumulada de L-lisina também foi aperfeiçoada no longo período de cultivo. No caso da cepa em que três dos mutantes lvsC. lysA e ppc foram simultaneamente realçados, a produtividade de L-lisina foi ainda mais aperfeiçoada.

LISTAGEM DA SEQUÊNCIA (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: AJINOMOTO CO., LTD.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PROCESSO PARA PRODUZIR L-LISINA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 24 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇADO: (B) RUA: (C) CIDADE: (E) PAÍS: (F) CÓDIGO POSTAL: (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: disco floppy (B) COMPUTADOR: compatível PCIBM

(C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão #1.30 (vi) DADOS PEDIDO ATUAL: (A) NÚMERO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DATA PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: JP 8-325658 (B) DATA DE DEPÓSITO: 05-DEZ-1996 (viii) INFORMAÇÃO ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: (B) NÚMERO DO REGISTRO: (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (B) TELEFAX: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 1: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "DNA sintético" (iv) ANTI-SENTIDO: não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "DNA sintético" (iv) ANTI-SENTIDO: sim (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1643 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: DNA genômico (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum (B) CEPA: ATCC 13869 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 3: TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC ΑΑΑΪΑΤΤΑΑΑ TCGAA7A7CA A7A7ACGG7C 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG AÇGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCC7G7 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAG77? ATAAAGG7AG AG77GAGCGG 150 G7AACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCC7GG77G7 A.CAGAAA7AT 24 0 GGCGGTTCC7 CGC7TGAGAG TGCGGAACGC AT7AGAAACG TCGC7G.AACG GA7CG77GCC 3C0 ACC.AAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGG.-.T 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCG7TCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCC77 430 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGC7TC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGT7CAT GGAAGCTCTG 1320 CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CccttttGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCC- TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1643 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: DNA genômico (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum (B) CEPA: ATCC 13869 (ix) ASPECTO: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAL: 217.. 1482 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 4: TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC ÍC TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACÁCAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 130 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACÁAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 2 34 Met Ala Leu Vai Vai Gin 1 = Lvs Tvr Giy Giy Ser Ser Leu Glu Ser .-.1= Glu Arg Lie Arg Asr. Va_ 10 '-5 2C GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GG.A AAT GA7 GTL GTG G7T '2 0 Ala Glu Arg Ile Vai Ala Thr Lys Lvs Ala Giy Asn As? Vai Vai Vai 25 30 . 35 GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACC- GA7 GAA CTT C7A GAA C77 GCA 276 Vai Cys Ser Ala Met Giy As? Thr Thr As? Glu Leu Leu Glu Leu Ala 40 45 50 GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Vai As π Pro Vai Pro Pro Ala -Arg Glu Meu A.s? Meu Leu Leu 55.. 60 65 70 ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 4'4 Thr Ala Giy Glu Arg lie Ser Asn Ala Leu Vai Ala Meu Ala Lie Glu 75 80 85 TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Giy Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr Giy Ser Gin Ala Giy Vai 90 95 100 CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Giy Asn Ala Arg Ile Vai As? Vai Thr Pro 105 110 115 GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Giy Arg Vai Arg Glu Ala Leu As? Glu Giy Lys Ile Cys Ile Vai Ala 120 125 130 GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Giy Phe Gin Giy Vai Asn Lys Glu Thr Arg As? Vai Thr Thr Leu Giy 135 140 145 150 CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Ar'g Giy Giy Ser Asp Thr Thr Ala Vai Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn 155 160 165 GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 7 62 Ala Aso Vai Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Vai Asp Giy Vai Tyr Thr Ala 170 175 180 GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg Ile Vai Pro Asn Ala Gin Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe 185 190 195 GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Vai Giy Ser Lys Ile Leu Vai Leu 200 205 210 CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Vai Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Vai Pro Leu Arg Vai Arg 215 220 · 225 230 TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Giy Thr Leu Ile Ala Giy Ser Met Glu 235 240 245 GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp Ile Pro Vai Glu Glu Ala Vai Leu Thr Giy Vai Ala Thr Asp Lys 250 255 260 TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG· 1050 Ser Glu Ala Lys Vai Thr Vai Leu Giy Ile Ser Asp Lys Pro Giy Glu 265 270 275 GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Ala Ala Lys Vai Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp 280 235 290 ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Vai Leu Gin Asn Vai Ser Ser Vai Glu Asp Giy Thr Thr Asp Ile 295 300 305 310 Thr Phe Thr Cys Pro Ar? Ala As? Gly Ar? Ar? Ais Mer C-lu Tis Leu ^ - 11 ^ 11 z. J-3 ~“~ r--.G AAG CTT CAG GTT C.nG - ---“-C - ^ °^ w * * *■“*“ 1 ---- Lvs Lys Leu Glr. Vai Gir. Gly Asr. Tr? Thr Asr. Vai Leu Tyr As? As? 330 . _ 335 ^ ^ _ 343 ^.........._ CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG PAG TCT CA- CCA *--'«· Gin Vai Gly Lys Vai Ser Leu Vai Gly Ala Gly Met Lys Ser tirs Pro 345 350 355 GGT GTT ACC GCA G.AG TTC ATG GAA GCT.CTG CGC GAT GTC AAC GTG AA- -j3s Glv Vai Thr Ála Glu Phe Mer Glu Ala Leu Arg Asp Vai Asn Vai Asr* 360 3 S5 370 .-.TC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTC- ATC CGT ujSu Ile Glu Leu lie Ser Thr Ser Glu lie Arg Ile Ser Vai Leu lie Ar?

375 380 385 3 SC GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gun 395 400 405 CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 .

Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Vai Vai Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 410 415 420 AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ Π) NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 421 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: Mee Ala Leu Vai Vai Gin Lys Tyr Giy Gly Ser Ser Leu C-lu Ser Ala 1 5 10 *' Glu A.ro lie Arg Asn Vai Ala Glu Arg lie Vai Ala Thr _ys -ys A_a - * n - -20 2 = Gly Asn Aso Vai Vai Vai Vai Cys Ser Ala Met Giy As? Thr Thr As? 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala-Vai Asn Pro Vai Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu A.rg Ile Ser Asn Ala Leu 65 ' 70 75 20 Va1 Ala Met Ala lie Glu Ser Leu Giy Ala Glu Ala Gir. Ser Fhe Thr 85 ’ 90 95 Giy Ser Gin Ala Gly Vai Leu Thr Thr Glu Arg Kis Giy Asn Ala Arg 100 105 '-10 Ile Vai Asp Vai Thr Pro Giy Arg Vai Arg Glu Ala Leu Asp Glu Giy 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Vai Ala Gly Phe Gin Gly Vai Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Vai Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Vai Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Vai Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Vai 165 170 175 Asp Gly Vai Tyr Thr Ala Asd Pro Arg Ile Vai Pro Asn Ala Gin Lys 180 1S5 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Vai Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Vai Leu Arg Ser Vau Glu Tyr Ala Arg A^a Phe Asn 210 215 220 Vai Pro Leu Arg Vai Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Giy Thr Leu 225 230 235 ^ _ 240 Iie &ia g<v Se~ Met Glu Aso Ile Pro Vai Glu Glu Ala Vai Leu Thr 245 " 250 255 Gly Vai Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Vai Thr Vai Leu Gly Ile 260 265 270 S“- As? Lys Prc Gly C-lu Ala Ala Lys Vai Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 . 230 235 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Vai Leu Gin Asn Vai Ser Ser Vai Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala As? Gly Arg 305 310 315 320 A.rg Aia Met Glu Ile Leu Lvs Lys Leu Gin Vai Gin Gly Asn Trp Thr 325·' 330 335 Asn Vai Leu Tyr Asp Asp Gin Vai Gly Lys Vai Ser Leu vd Gly Ala 340 345 350 Glv Met Lys Ser His Pro Gly Vai Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Vai Asn Vai Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 3B0 Ile Ser Vai Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Vai Vai Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1643 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: DNA genômico (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum (B) CEPA: ATCC 13869 (ix) ASPECTO: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAL: 964..1482 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAÈAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTT.ATAGTAA TGATCCCGC-C AC77TGATTG 'CCGGC7CTAT^GGAGGATATT - CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA AG3 GAG AAC- GGG GAA - - -: Met Giu Giu Ala Vai Leu Tr.r G.y «=. .-..a .r.r .-.sp _ys ser j.u 1 5 11 1u C-CG AAA G7A ACG GTG CTG GGG ATT TGG G-AT AAG CGA GGG GAG G-GG GGG 115Í pia Lys Vai Tr.r Vai Leu Giv Gle Ser Asc Lys Pro Gly Glu Ala .Ala 20 25. 31 AAG GTT TTG CGT GCG TTG GCT C-AT GCA GAA -ATC AAC -ATT GAG AGG GGG 1114 Lys Vai Phe Arg Ala Leu Ala As? Ala Giu Gle Asn Gle As? Mar Vai 35 40- 45 CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gin Asr. Vai Ser Ser Vai Glu As? Gly Thr Thr As? Gle Tr.r Phe 50 =5 £C

ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATC- GAG ATC TTG AAG .AAG 12CC

Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg .Ala Mer Giu Gle Leu Lys Lys 65 70 75 CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC C.AG GTC 12 4 S

Leu Gin Vai Gin Gly Asn Trp Thr Asn Vai Leu Tyr Asp Asp Gin Vai 80 B5 90 95 GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Vai Ser Leu Vai Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Vai 100 105 110 ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Vai Asn vai Asn Ile Giu 115 120 125 TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Vai Leu Ile Arg Glu Asp 130 135 140 GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG. CTG GGC 1440 Asd Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly 145 150 155 GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 14 90 Gly. Glu Asp Glu Ala Vai Vai Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 160 165 170 AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 172 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: Met Giu Giu Aia Vai Leu Thr Giy Vai Ala Tr.r As? Lys Ser Giu Ala Lys Vai Thr Vai Leu Giv lie Ser As? Lys ?rc Giv Giu Ala Ala Lys 20 ' 25 30 Vai Phe Arg Aia Leu Aia As? Aia Giu lie Asr. ile As? Met Vai Leu 35 40 -.5 Gin Asr. Vai Ser Ser Vai Giu As? Giy Thr Thr As? Tle Thr Phe Thr 50 55 50 Cys Pro Arg Ala As? Giy Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu 65 70 75 90 Gin Vai Gin Giy Asn Trp Thr Asr Vai Leu Tyr As? As? Gin Vai Giy 85 90 95 Lvs Vai Ser Leu Vai Giv Aia Giy Met Lys Ser Kis Pro Giy Vai Tr.r 100 ' 105 11C

Aia Glu Phe Met Giu Aia Leu Arg As? Vai Asr. Vai Asr. lie Glu Leu 115 120 125 Ile Ser Thr Ser Giu Ile Arg Ile Ser Vai Leu lie Arg Giu As? As? 130 135 140 Leu As? Ala Ala Ala Arg Aia Leu Kis Glu Gin Phe Gin Leu Giy Giy 145 * 150 155 160* Glu Asa Glu Ala Vai Vai Tyr Ala Giy Thr Giy Ara 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 8: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (Ç) FILAMENTOS: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "DNA sintético" (iv) ANTI-SENTIDO: não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "DNA sintético" (iv) ANTI-SENTIDO: sim (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 9: CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3579 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: DNA genômico (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum (B) CEPA: ATCC 13869 (ix) ASPECTO: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAL: 533...2182 ix) ASPECTO: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAL: 2188...3522 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60 TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA 120 GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT 180 GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC 240 GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC 300 AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGC-CTAAG CGGAGTCGAG GGGGG.AAGAA -TGCTA-~.l~ CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG T7TGTT7TC7 iV "GI CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATSA? TTTTCATTAA A-.AGGCAGGG ATTGGTTA..-. ■? = ·- AG^GGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA C-AATTTCTCC CG ATG --- Mg- ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG A??" AAA GAG ACC GCG C-TA GAG GTT 5=3 Thr Pro Ai a Aso Leu Aia Thr Leu lie Lys Giu Thr Aia Vai Giu Vai 1 O “ «.

D TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG G7A GTT 6=.

Leu Thr Ser Árç Glu Leu As? Thr Ser Vai Leu Pro G.u Gj.r. Va. va_ 20 25 30 GTC- GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC C-CC ACC AAC ATT 57 5 Vai Glu Arç Pro Arg Asn Pro Giu His C-ly Asp Tyr Aia Thr Asr. lie 35 40 45 GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727 Ala Leu Gin Vai Ala Lys Lys Vai Gly Gin Asn Pro Arg As? Leu Ala 50 55 60 65 ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775 Th' Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala 70 75 80 GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA 823 Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala 85 90 95 CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA 871 Gin Gly Glu Ile Vai Ala Lys Ile Leu Ala Gin Gly Glu Thr Phe Gly 100 105 110 AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT 919 Asn 'Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Vai Asn Leu Glu Phe Vai Ser 115 120 125 GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC 967 Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala 130 135 140 145 GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG 1015 Vai Gly Asp Ser Leu Gly Arg Vai Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Vai 150 155 160 ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC 1063 Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin Ile Asp Arg Phe 165 170 175 GCT TTG TCC CTT CTT GCA. GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC 1111 Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp 180 ' 135 190 GGT TAT GGC GGC GAA. TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA 1159 Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu A.la Ile Vai Glu 195 200 205 AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT 1207 Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gin Glu Leu 210 215 220 225 TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC 1255 Phe Arg Ala Glu Gly Vai Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser 230 235 240 CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC 1303 Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Vai Tyr Tyr His Glu Asn Ser 245 250 255 CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC 1351 Leu Phe Glu Ser Gly Ala Vai Asp Lys Ala Vai Gin Vai Leu Lys Asp 260 265 270 AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGC- TC-G CTC CGT TCC ACC ? - Asr. Glv Asn Leu Tyr Glu Asr. Glu Giy A_a Trp Cr? -eu Arg b = r .nr 275 280 285 ................... GAA TTC GGC GAT GAC AAA C-AC CGC GTG GTG ACC AAG CGT GAG GGC GAG 14 4' Glu Phe Gly Asp Asp Lys As? Arg Vai Vai Cie Lys Ser As? Gly As? 290 295 300 305 GCA GCC TAC ATC'GCT GGC GAC ACC GCG TAC GTG GCC GAC AAG CCC CCC 14 95 Ala A.la Tvr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Vai -A_a .Asp Lys Phe Ser 310 315 321 CGC GGA CAC AAC CTA AAC ACC CAC ACG CCC- GGC GCC GAC CAC CAC GGC 154 3 Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Giy A_a .Asp r.us Ais C-iy 325 330 355 T.AC A.TC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA. CCC GGC C.AC AAG CCA 1 = 51 Tyr Ile Ala Arg Leu Lys A.la .Ala A.la Ala A.la Leu Gly Tyr i.ys Pro 340 345 350 GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639 Glu Gly Vai Glu Vai Leu Ile Gly Gin Met Vai Asn Leu Leu Arg Asp 355 360 365 GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA 1587 Gly Lys Ala Vai Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Vai Vai Thr Leu 370 375 380 385 GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGC TAC TCC CTG 1735 As? Asp Leu Vai Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu 390 395 400 ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG 1783 Ile Arg Ser Ser Vai Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp 405 410 415 GAA TÇC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC 1831 Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Vai Tyr Tyr Vai Gin Tyr Gly His 420 425 430 GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC 1879 Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Vai Thr 435 440 445 GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT 1927 Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp 450 455 460 465 CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT 1975 Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Vai Vai Lys Ala Ala Ala 470 475 480 GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT 2023 Asp Leu Arg Glu Pro His Arg^lie Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala 485 490 495 GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT 2071 Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Vai 500 505 510 GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA 2119 Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala 515 520 525 GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167 Ala Thr Arg Gin Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Vai Gly Vai Ser 530 535 540 545 GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214 Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Vai Glu Asn Phe Asn Glu 550 1 5 • CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262 Leu Pro Ala His Vai Trp Pro Arg Asn Ala Vai Arg Gin Glu Asp Gly 10 15 20 25 GTT GTC ACC GTC GCT C-GT GTG CGT CTG CGT GAC CTC GCT GAA. GAA TAC 22 li Va· Vai Thr Vai Aia C-iv Vai Pro Lev Pro As? leu Ala Glu Glu Tyr 30 35 42 GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 235: Glv Th: Pro Leu Phe Vai Vai As? Giu As? A.s? Phe Arg Ser A.rg Cvs 45 50 ' o5 CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406 Ar" As? Met Ala Thr Aia Phe Gly Giy Pro Giy Asr. Vai His Tyr Aia 60 6 o TCT AAA GCG TTC CTG ACC A-AG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2 4 54 Se- Lys Aia Phe Leu Thr Lvs Thr Ile Ala Arg Tr? Vai .As? Giu Giu 75 80 85 GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502 Gly Leu Ala Leu Asp lie Ala Ser Ile Asr. Giu Leu Giy lie Ala Leu 90 95 100 105 GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550 Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala Kis Giy Asn Asn Lys 110 115 120 GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598 Gly Vai Glu Phe Leu Arg Ala Leu Vai Gin Asn Gly Vai Giy His Vai 125 130 135 GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 264 6 Vai Leu Asp Ser Ala Gin Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Vai Ala Ala 140 145 150 GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694 Gly Glu Gly Lys Ile Gin Asp Vai Leu Ile Arg Vai Lys Pro Gly Ile 155 160 165 GAA G.CA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742 Glu'Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gin Lys 170 175 180 185 TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790 Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala 190 195 200 GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT 2838 Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Vai Gly Leu Kis Cys His Vai 205 210 215 GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886 Gly Ser Gin Vai Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg 220 225 230 GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934 Vai Leu Gly Leu Tyr Ser Gin 'Ile His Ser Glu Leu Giy Vai Ala Leu 235 240 245 CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982 Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala 250 255 260 265 GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030 Glu Glu Pro Leu Asn Vai Ala Glu Vai Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala 270 275 280 GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT 3078 Vai Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Vai Leu' 285 290 295 GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126 Vai Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Vai Thr Ile Tyr 300 305 310 GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174 Glu Vai Gly Thr Thr Lys Asp Vai His Vai Asp Asp Asp Lys Thr Arg 315 320 325 CGT TAC ATC GCC STG GAC C-GA GGC ATG TGG GAC AAC ATC CGC CGA GCA 2ZZZ

Arg Tyr Cie Ala Vai As? Gly Gly Mea Ser As? Asr. C_e Arg Pro A_a 330 335 3-í Z 3 4 5 CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC C-AA 3Z'Z

Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr As? Ala Arg vai Vai ser Arg Pr.e Ala Glu 35C 2" 2cC GGA GAC CwA GTA A.GC A.*-— ....... uo.. -«C C.-.w - -ο."--* ->— a - Gly Asp Pro Vai Ser Thr Arg Cie Vai Giv Ser Kis Cys Glu Ser Gly 365 3/0 ii3 GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC C.CA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 23cc Asd Ile Leu ile Asn Asp Glu lie Tyr .pro Ser Asp Zie Tr.r Ser Gly 380 385 390 GA.C TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATC- AGC 3 414 Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Tr.r Gly A.la Tyr Cys Tyr .Ala Mea Ser 395 400 405 TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 34cZ

Ser A.rg Tyr Asa Ala Phe Thr Arg Pro Ala Vai Vai Ser Vai .Arg .Ala 410 415 420 425 GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510 Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp -Asp Ile Leu 430 435 440 TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562' Ser Leu Glu Ala 445 GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 550 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: Met Thr Pro Ala As? Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ale Vai Glu 1 5 1C -5 Vai Leu Thr Ser Arg Glu Leu As? Thr Ser Vai Leu Pro Glu Glr. Vai 20 25 21 Vai Vai Glu Arg Pro Arg Asr. Pro Glu His Glv Asr Tvr Ala Thr Asr. 35 4C ’ ' Ile Ala Leu Glr. Vai Ala Lys Lys Vai Gly Glr. Asr Pro Arg As? Leu 50 55 60 Ala Thr Tr? Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Aso As? Ala He' Aso S=-65 70 75 ' S0 Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe. Leu Asr Ile A.rg Leu .Ala Ala .Ala 85 90 55 Ala Glr. Gly Glu Ile Vai Ala Lys Ile Leu Ala Glr Glv Glu Thr Phe 100 105 110 Gly Asn Ser As? His Leu Ser His Leu Asd Vai Asr Leu Glu Phe Va' 115 120 ‘ 125 Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trr Ala- 130 135 140 Ala Vai Gly Asp Ser Leu Gly Arg Vai Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys 145 150 155 160 Vai Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin Ile Asp Arg 165 170 175 Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu 180 135 190 Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Vai 195 200 205 Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro 'Ala Ala Thr Gin Glu 210 215 220 Leu Phe A.rg Ala Gru Gly Var Giu Meo Meo Phe Glu His - lie Lys Ser 225 230 235 240 Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Vai Tvr Tyr His Glu Asn 245 250 ' 255 ,'Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Vai As? Lys Ala Vai Gin Vai Leu Lys 260 265 270 As? Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn C-iu Gly Ala Trp Tr? Leu Arg Ser 275 280 265 Thr Glu Phe Gly As? Asp Lys As? Arg Vai Vai Ile Lvs Ser Aso Glv 290 295 300 A.sp Aia Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Vai Ala Aso Lys Phe 205 310 315 220 Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His 225 330 335 Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glv Tyr Lys 340 345 350 Pro Glu Gly Vai Glu Vai- Leu Ile Gly Gin Meo Vai Asn Leu Leu Arq 255 360 365 Asp Gly Lys Ala Vai Arg Meo Ser Lvs Arg Ala Gly Thr Vai Vai Thr 370 375 380 Leu Asp Asp Leu Vai Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser 385 390 395 400 Leu Ile Arg Ser Ser Vai Asp Ser Ser Leu Asp Ile Aso Leu Gly Leu 405 410 415 Trp Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Vai Tyr Tyr Vai Gin Tyr Gly 420 425 430 tu» Ale Ar, Leu Cys Ser Ile Arg Lys AU Glu Thr ieu Giy Vai Thr Glu Glu Gly Al» A»p Leu sêr Leu Leu Thr Hi» líp Ar, Glu Gly 455 460 Asp Leu Ile Arg Thr Leu Giy Giu Phe Prc Ale Vel Vai Lys Ala Ala 465 470 475 ’ 480 Ala Asp Leu Arg Glu Prc His Arg lie Ala Arg Tvr A.la Giu Giu Leu 485 " 490 * 495 Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr A.sp Ser Cys His Lie Leu Pro Lys 500 505 5i0 Vai Asp Giu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala 515 ’ 520 525 Ala Ala Thr Arg Gin Thr Leu Ala Asn .Ala Leu Kis Leu Vai Giv Vai 530 535 540 Ser Ala Pro Glu Lys Met 545 550 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 445 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: Met Ala Thr Vai Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Vai Trp Pro 1 5 10 is Arg Asn Ala Vai Arg Gin Glu Asp Gly Vai Vai Thr Vai Ala Gly Vai 20 25 30 Pro Leu Pro Asp Leu Ala Giu Glu Tyr Gly Tr.r Pr: Leu Pr.e Vai Vai 35 -.3 4 5 Asp Giu As? As? Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Tr.r Ala Pr.e 50 =5 óC

Glv Gly Pro Gly Asn Vai His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 30 Thr Ile Ala Arg Trp Vai As? Glu Glu C-iy Leu Ala Leu Asp Ile Ala 85 ’ ■ 90 95 Ser Ile Asr. Glu Leu Gly Ile Ala Leu A.la Ala Gly Phe Prc Ala Ser ICC 105 11' Aro lie Thr Ala His Gly .Asr. Asr. Lys Gly Vai Glu Pr.e Leu Arg Ala 115 * 12 C 125 Leu Vai Gir. Asr. Gly Vai Gly His Vai Vai Leu .Asp Ser Ala Glr. Glu 130 * 135 14 C

Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Vai Ala Ala Gly Giu Gly Lys Ile Gir. Asp 145 150 155 160 Vai Leu Ile Arg Vai Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Giu Phe 165 170 175 Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gin Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Giu Asn Leu 195 200 205 Asn Leu Vai Gly Leu His Cys His Vai Gly Ser Gin Vai Phe Asp Ala 210 215 220 Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Vai Leu Gly Leu Tyr Ser Gin 225 230 235 240 Ile His Ser Glu Leu Gly Vai Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly 245 250 255 Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Vai Ala 260 265 270 Glu Vai Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Vai Gly Lys Met Ala Ala Glu 275 280 285 Leu Gly Ile Asd Ala Pro Thr Vai Leu Vai Glu Pro Gly Arg Ala Ile 290 * 295 300 Ala Gly Pro Ser Thr Vai Thr Ile Tyr Giu Vai Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320 Vai His Vai Asp Asd Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Vai Asp Gly 32*5 330 335 Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345 350 Ala Arg Vai Vai Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Vai Ser Thr Arg 355 360 * 365 Ile Vai Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asd Ile Leu Ile Asn Asp Glu 370 375 380 Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410 415 Arg Pro Ala Vai Vai Ser Vai Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425 430 Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 13: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "DNA sintético" (iv) ANTI-SENTIDO: não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: TCGTCGGTCA GCCTGACGTC GAC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: DNA sintético (iv) ANTI-SENTIDO: sim (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: TCTTGGTGTCGAAAGTGCACACC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3533 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: DNA genômico (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Breabacterium lactafermentam (B) CEPA: ATCC 13869 (ix) ASPECTO: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAL 321..3077 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 15: GGTGGTTCTG TTAAGGCAGA AACCGTCGCT GAGATCGTCG GTCAGCCTGA CGTCGACGGC 60 GGACTTGTCG GTGGCGCTTC CCTCGACGGT GAAGCA.TTCG CCAAGCTGGC TGCCAACGCT 120 GCGAGCGTTG CTTAAAGTAC AGAGCTTTAA AGCACAGCCT TAAAGC.ACAG CCTTAAAGCA 180 CAAGCACTGT AGAAGTGCGG TTTTGATGAG CCCATGAAAG CCATCGAAAT CAATCGCCCA 240 ■ GCTAAACACC TGTTTTGCTG GGTGATTTTT TATCTCATGC ACGCCAACAC CCTCAATGTG 300 AAAGAGTGTT TAAAGTAGTT ATG ACT GAT TTT TTA CGC GAT GAC ATC AGG 35Ό Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Aso Ile Arg 1 5 10 TTC CTC GGT CAA ATC CTC GGT GAG GTA ATT GCG GAA CAA GAA GGC CAG 398 Phe Leu Gly Gin Ile Leu Gly Glu Vai Ile Ala Glu C-ln Glu Gly Gin 15 20 25 GAG GTT TAT GAA CTG GTC GAA CAA GCG CGC CTG ACT TCT TTT GAT ATC 44 6 Glu Vai Tyr Glu Leu Vai Glu Gin Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile 30 35 40. GCC AAG GGC AAC GCC GAA ATG GAT AGC CTG GTT CAG GTT TTC GAC GGC 4 94 Ala Lys Gly Asn Ala Glu Met Asp Ser Leu Vai Gin Vai Phe Asp Gly 45 50 55 ATT. ACT CCA GCC AAG GCA ACA CCG ATT GCT CGC GCA TTT TCC CAC TTC 54 2 Ile Thr Pro Ala Lys Ala Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe 60 65 70 GCT CTG CTG GCT AAC CTG GCG GAA GAC CTC TAC GAT GAA GAG CTT CGT 590 Ala Leu Leu Ala Asn Leu Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg 75 80 85 90 GAA CAG GCT CTC GAT GCA GGC GAC ACC CGT CCG GAC AGC ATT CTT GAT 63: Glu Gin Ais Leu Asp Ais C-iy As? Thr Pro Pro As? Ser Thr leu As? 95 i.Ou -cr GCC ACC TGG CTG AAA CTC AAT GAG GGC AAT GTT GGC GCA. GAA GCT GTG 68 6 Aia Thr Ttd Leu Lvs Leu Asn Glu Giy Asn Vai Giv Ala Giu A.ia Vai 110 ' 115·· 120 GCC GAT GTG CTG CGC AAT GCT GAG GTG GCG CCG GTT CTG ACT GCG CAC 7 3-í Ala A.sd Vai Leu Arg Asn A.la Giu Vai A.ra Pro Va_ _eu Tr.r A_a His 125 13C 135 CCA ACT GA.G ACT CGC CGC CGC A.CT GTT TTT GA.T GCG CA_A AAG TGG A.TC / 82 Pro Thr Glu Thr .Arç A.rg A.rg Thr Vai Phe As? -Aia Glr. Lys Tr? lie 140 145 150 ACC ACC CAC ATG CGT GAA CGC CAC GCT TTG CAG TCT GCG GAG CCT A.CC 230 Thr Thr His Met Arg Glu Arg His A.la Leu Glr. Ser Aia Glu Pro Thr 155 160 165 170 GCT CGT ACG CAA AGC AAG TTG GAT GAG ATC GAG AAG AAC ATC CGC CGT 878.

Ala Arg Thr Gin Ser Lys Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arç Arg 175 180 185 CGC ATC ACC ATT TTG TGG CAG ACC GCG TTG ATT CGT GTG GCC CGC .CCA 926 Arg Ile Thr Ile Leu Trp Gin Thr Ala Leu Ile Arg Vai Ala Arg Pro 190 195 200 CGT ATC GAG GAC GAG ATC GAA GTA GGG CTG CGC TAC TAC AAG CTG AGC 974 Arg Ile Glu Asp Glu Ile Glu Vai Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser 205 210 215 CTT TTG GAA GAG ATT CCA CGT ATC AAC CGT GAT GTG GCT GTT GAG CTT 1022 Leu Leu Glu Glu Ile Pro Arg Ile Asn Arg A.sp Vai Ala Vai Glu Leu 220 225 230 CGT GAG CGT TTC GGC GAG GAT GTT CCT TTG AAG CCC GTG GTC AAG CCA 1070 Arg Glu Arg Phe Gly Glu Asp Vai Pro Leu Lys Pro Vai Vai Lys Pro 235 240 245 250 GGT TCC TGG ATT GGT GGA GAC CAC GAC GGT AAC CCT TAT GTC ACC GCG 1118 Gly Ser Trp Ile Gly Gly Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Vai Thr Aia 255 " 260 265 GAA ACA GTT GAG TAT TCC ACT CAC CGC GCT GCG GAA ACC GTG CTC AAG 1166 Glu Thr'Vai Glu Tyr Ser Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Vai Leu Lys 270 275 280 TAC TAT GCA CGC CAG CTG CAT TCC CTC GAG CAT GAG CTC AGC CTG TCG 1214 Tyr Tyr Ala Arg Gin Leu His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser 285 290 295 GAC CGC ATG AAT AAG GTC ACC CCG CAG CTG CTT GCG CTG GCA GAT GCC 1262 Asp Arg Met Asn Lys Vai Thr Pro Gin Leu Leu Ala Leu Ala A.sp Ala 300 305' 310 GGG CAC AAC GAC GTG CCA AGC CGC GTG GAT GAG CCT TAT CGA CGC GCC 1310 Gly His Asn Asp Vai Pro Ser Arg Vai Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala 315 320 325 330 GTC CAT GGC GTT CGC GGA CGT ATC CTC GCG ACG ACG GCC GAG CTG ATC 1358 Vai His Gly Vai Arg Gly Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile 335 340 345 GGC GAG GAC GCC GTT GAG GGC GTG TGG TTC AAG GTC TTT ACT CCA TAC 1406 Gly Glu Asp Ala Vai Glu Gly Vai Trp Phe Lys Vai Phe Thr Pro Tyr' 350 355 360 GCA TCT CCG GAA GAA TTC TTA AAC GAT GCG TTG ACC ATT GAT CAT TCT 1454 Ala Ser Pro Glu Glu Phe Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser 365 370 375 CTG CGT GAA TCC AAT GAC GTT CTC ATT GCC GAT GAT CGT TTG TCT GTG 1502 Leu Arg Glu Ser Asn Asp Vai Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Vai 380 385 390 --.«τ' /--·/- «ι - -mt'·"' *»«■* íww./- ' ' i*·'*'**' “2"* " w*'j λ. - i w - Uk.. n.v b^.u í*.vj'w - - _ uu.“. - - r» .w w - - - · — \-w.. >- - - - - - v Leu Ile Ser Ala lie Glu Ser Phe Gly Phe Asr. Leu Tyr Ala Leu As? 355 400 4C5 410 CTG CGC CAA AAC TGC GAA AC-C TAC GAG GAC GTC CTC ACG GAG CTT TTC 155 = Leu Arg Gin Asr. Ser Glu Ser Tyr Glu As? Vai Leu Thr Glu Leu Phe 415 ' .420 425 GAA CGC GCC CAA GTC A.CC GC.A AAC TAC1· CGC GAG CTG TCT GAA GCA GAG 154 6 Glu Arg Ala Gin Vai Thr Ala Asr. Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu 430 4 uo 440 pjug CTT GAG GTG CTG CTu AAc G.--r. .-wu Cv- Cc.

Lys Leu Glu Vai Leu Leu Lys Glu Leu Arg Ser ?ro Arg Pro Leu Ile 445 450 455 CCG CAC GGT TCA GAT GAA TAC AGC GAG GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGC 1'42 ?ro His Gly Ser Asp Glu Tyr Ser Glu Vai Thr As? Arg Glu Leu Glv 460 " 465 470 ATC TTC CGC ACC GCG TCG GAG GCT GTT AAG AAA TTC GGG CCA CGG ATG 1790 Ile Phe Arg Thr Ala Ser Glu Ala Vai Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met 475 480 485 490 GTG CCT CAC TGC ATC ATC TCC ATG GCA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC 1338 Vai Pro His Cys Ile Ile Ser Met Ala Ser Ser Vai Thr Asp Vai Leu 495 500 505 GAG CCG ATG GTA TTG CTC AAG GAA TTC GGC CTC ATT GCA GCC AAC GGC 1886 Glu Pro Met Vai Leu Leu Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly 510 515 520 GAC AAC CCA CGC GGC ACC GTC GAT GTC ATC CCA CTG TTC GAA ACC ATC 1934 Aso Asn Pro Arg Gly Thr Vai Asd Vai Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile 525 530 535 GAA GAT CTC CAG GCC GGC GCC GGA ATC CTC GAC GAA CTG TGG AAA ATT 1982 Glu Asp Leu Gin Ala Gly Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile 540 545 550 GAT CTT TAC CGC AAC TAC CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC 2030 Aso Leu Tyr Arg A.sn Tyr Leu Leu Gin Arg Asp Asn Vai Gin Glu Vai 555 560 565 570 ATG CTC GGT TAC TCC GAT TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA 2078 Met Leu Gly Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala 575 580 585 AAC TGG GCG CTT TAC GAC GCG GAA CTG CAG CTC GTC GAA CTA TGC CGA 2126 Asn Trp Ala Leu Tyr Asp Ala Glu Leu Gin Leu Vai Glu Leu Cys Arg 590 595 600 TCA GCC GGG GTC AAG CTT CGC CTG TTC CAC GGC CGT GGT GGC ACC GTC 2174 Ser Ala Gly Vai LyS Leu Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Vai 605 ’ 610 615 GGC CGC GGT GGC GGA CCT TCC TAC GAC GCG ATT CTT GCC CAG CCC AGG 2222 Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gin Pro Arg 620 625 630 GGG GCT GTC CAA GGT TCC GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAG ATC ATC 2270 Gly Ala Vai Gin Gly Ser Vai Arg Ile Thr Glu Gin Gly Glu Ile Ile 635 640 645 650 TCC GCT AAG TAC GGC AAC CCC GAA ACC GCG CGC CGA AAC CTC GAA GCT 2318 Ser Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala· 655 660 665 CTG GTC TCA GCA ACG CTT GAG GCA TCG CTT CTC' GAC GTC TCC GAA CTC 2366 Leu Vai Ser Ala Thr Leu Glu Ala Ser Leu Leu Asp Vai Ser Glu Leu 670 675 680 ACC GAT CAC CAA CGC GCG TAC GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC 2414 Thr Asp His Gin Arg Ala Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu 685 690 695 AGC TTG AAG AAG TAC GCC TCC TTC- GCC GAC C-AG GAT GAA GCC TTC A. - Ser Leu Lys Lys Tyr Ala Ser Leu Va. Kis Glu As? G.r. --= -- = 70C 705 ll: GAT TAC TTC ACC CAG TCC ACG CCG CTG CAG C-AG ATT GGA TCC CTC AAC 2:2 2 As? Tvr Phe Thr Gin Ser Thr ?ro Leu Glr. Glu lie Gly Ser Leu Asr. 715 ' 720 725 ATC GGA TCC AGG CCT TCC TC A CC-C AAG CAG ACC TCC TCC- GTG GAA GAT 2555 jig Gly Ser A.rg Pro Ser Ser Ar; uys Gin Thr Ser Ser va. u.u .-.s? 735 740 745 TTG CGA GCA ATC CCG TGG GTG CTC AGT TGG TCC CAG TCT CGT GTC ATS 260c Leu Arg Ala Ile Pro Tr? Vai Leu Ser Tr? Ser Glr. Ser Arg Vai Me: 750 755 762 CTG CCG GGC TGG TTT GGT GTC GGC ACC GCA CTT GAC- CAA TGG ATT GGC 2654 Leu Pro Gly Trp Phe Gly Vai Gly Thr Ala Leu Glu Glr Tr? 21e Gly 765 770 775 GAA GGG GAG CAG GCC ACC CAG CGC ATT GCC GAG CTA CAA ACA CTC AAC 2702 Glu Gly Glu Gin Ala Thr Gin Arg Ile Ala Glu Leu Glr Thr Leu Asr 780 785 790 GAG TCC TGG CCA TTT TTC ACC TCA GTG TTG GAT AAC ATG C-CT CAG GTG 2750 Glu Ser Trp Pro Phe Phe Thr Ser Vai Leu Asp Asn Mer Ala Glr Vai 795 800 805 810 ATG TCC AAG GCA GAG CTG CGT TTG GCA AAG CTC TAC GCA C-AC CTG ATC 2798 Met Ser Lys Ala Glu Leu Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile 815 820 825 CCA GAT AGG GAA GTA GCT GAG CGC GTT TAT GCC GTC ATC CGC GAG GAA 2846 Pro Asp Arg Glu Vai Ala Glu Arg Vai Tyr Ala Vai Ile Arg Glu Glu 830 835 840 TAC TTC CTG ACC AAG AAG ATG TTC TGC GTA ATC ACC GGT TCT GAT GAT 2894 Tyr Phe Leu Thr Lys Lys Met Phe Cys Vai Ile Thr Gly Ser Asp Asp 845 850 855 CTG CTT GAT GAC AAC CCG CTT CTC GCA CGA TCC GTC CAG CGC CGA TAC 2942 Leu Leu Asp Asp Asn Pro Leu Leu Ala Arg Ser Vai Gin Arg Arg Tyr 860 865 870 CCC TAC CTG CTT CCA CTC AAC GTG ATC CAG GTA GAG ATG 'ATG CGA CGC 2990 Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Asn Vai Ile Gin Vai Glu Met Met Arg Arg 875 880 885’ 890 TAC CGA AAA GGC GAC CAA AGC GAG CAA GTA TCC CGC AAC ATC CAG CTG 3038 Tyr Arg Lys Gly Asp Gin Ser Glu Gin Vai Ser Arg Asn Ile Gin Leu 895 900 905 ACC ATG AAC GGT CTT TCC ACT GCA CTG CGC AAC TCT GGC TAGTCCTGCT 3087 Thr Met Asn Gly Leu Ser Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly 910 915 GGGTAGGTAG TACTCGTGTA TA.CTGTCTAA AGTTATTCGA AATCAGC-TGG GAATAAGGTT 3147 CACCTGGGTT CTCAAACGGC AAAGGAACAT TTTCCACATG GCATTGACGC TTCAAATCAT 3207 CCTCGTCGTC GCCAGCCTGC TCATGACGGT TTTCGTCTTG CTGCACAAGG GCAAAGGCGG 3267 CGGACTCTCC AGCCTCTTCG GTGGCGGTGT GCAGTCCAAT CTTTCGGGCT CCACTGTTGT 3327 TGAAAAGAAC CTGGATCGCG TCACCATTTT GGTTGCCGTT ATCTGGATTG TGTGCATTGT 3387 CGCACTCAAC CTCATCCAGA CTTATTCATA AGACACGAGC TTAAAAAGAG CGGTTCCCTT 3447 TTCATAGGGG AGCCGCTTTT TTGGGTTTTG TCGACCTGTT GTCTCCCCAC TGTTCCTCGG 3507 TGTGCACTTT CGACACCAAG ATTTCG 3533 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 919 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: Me: Thr Asp Phe Leu Arg As? As? lie Arg ?he Leu Glv Glr. Ile Leu i 5 ic Gly Guu Ve. uie A.ia Giu G-Γ. G-u Giy Gi" Glu Vai Tvr Glu Leu Vã' 2C 25 " Glu Glr. Ala Arg Leu Thr Ser ?ne A.sp Ile Ala Lys Glv Asr. Ale G‘u 35 40 45 Me* Asp Ser Leu Vai Glr. Vai Phe Asp Gly Ile Thr Pro .Ala Lvs o' = 50 55 .. 60 Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asr. Leu 65 70 75 A-Ia Glu Asp Leu Tyr As? Glu Glu Leu Arg Glu Gin Ala Leu Asr Ala 85 90 95 ' Gly Asp Thr Pro Pro As? Ser Thr Leu Asr Ala Thr Trr Leu Lyí Leu 100 105 ‘ ‘ no Asr. Glu Gly Asn Vai Gly Ala Glu Ala Vai Ala Asr Vai Leu Arr Asilo 120 125 Ala Glu Vai Ala Pro Vai Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Th- A-σ A— 130 135 140 Arg Thr Vai Phe Asp Ala Gin Lys. Trp Ile Thr Thr His Mer Arg Glu 145 . 150 155 160 Arg His Ala Leu Gin Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gin Ser Lys 165 170 175 Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu TrD 180 185 190 Gin Thr Ala Leu Ile Arg Vai Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile 195 200 205 Glu Vai Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro 210 215 220 Arg Ile Asn Arg Asp Vai Ala Vai Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu 225 230 235 240 ■ Asp Vai Pro Leu Lys Pro Vai Vai Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly 245 ·" 250 255 Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Vai Thr Ala Glu Thr Vai Glu Tyr Ser 260 265 270 Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Vai Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gin Leu 275 .. 280 285 His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Hec Asn Lys Vai 290 295 300 Thr Pro Gin Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Vai Pro 305 3io 3i5 320 Ser Arg Vai Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Vai His Gly Vai Arg Gly 325 330 335 Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Vai Glu 340 345 350 Gly Vai Trp Phe Lys Vai Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe 355 360 365 Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp 330 375 380 Vai Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Vai Leu Ile Ser Ala Ile Glu 585 390 395 4 Q Q.

Claims

1. Vetor recombinante replicável autonomamente em células de bactérias corineformes, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de DNA codificando para aspartoquinase em que a inibição de retro-alimentação por L-lisina e L-treonina é substancialmente dessensibilizada, uma seqüência de DNA codificando para uma descarboxilase diaminopimelato e uma seqüência de DNA codificando para uma carboxilase fosfoenolpiruvato, em que referido DNA codificando para a aspartoquinase na qual a inibição da retro-alimentação por L-lisina e L-treonina é substancialmente dessensibilizada compreende nucleotídeos de número de nucleotídeo 217 a 1482 de SEQ ID NO:4 em que G do número de nucleotídeo 1051 é modificado para A, e nucleotídeos de número de nucleotídeo 964 a 1482 da SEQ ID NO:6 em que G do número de nucleotídeo 1051 é modificado para A, em que referida seqüência de DNA codificando para a descarboxilase diaminopimelato compreende nucleotídeos de número de nucleotídeo 2188 a 3522 da SEQ ID NO: 10, e em que referida sequência de DNA codificando para uma carboxilase fosfoenolpiruvato compreende nucleotídeos de número de nucleotídeo 321 a3077 de SEQ ID NO: 15.

2. Bactéria corineforme, caracterizada pelo fato de ser transformada por introdução de vetor recombinante como definido na reivindicação 1.

3. Processo para produzir L-lisina, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de cultivar referida bactéria corineforme como definida na reivindicação 2, em um meio apropriado para permitir que a L-lisina seja produzida e acumulada em uma cultura de bactéria, e coletar a L-lisina da cultura.