ES2214567T5 - Método para producir L-lisina - Google Patents

Description

imagen1

DESCRIPCIÓN

Método para producir L-lisina

Antecedentes de la invencion

La presente invención hace referencia a un método para producir L-lisina cultivando un microorganismo obtenido modificando una bacteria corineforme utilizada para la producción fermentativa de aminoácidos o similares por medio de una técnica basada en la ingeniería genética. La L-lisina, que se utiliza como aditivo para piensos, es producida normalmente mediante un método fermentativo utilizando una cepa mutante productora de L-lisina perteneciente a las bacterias corineformes. Como para las bacterias corineformes, se describe un plásmido vector que es autónomamente replicable en células bacterianas y tiene un gen marcador de resistencia a fármacos (ver la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.514.502), y un método para introducir un gen en células bacterianas (por ejemplo, Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 2-207791). También se describe la posibilidad de multiplicar una bacteria productora de L-treonina o L-isoleucina utilizando los mecanismos descritos antes (ver las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.452.890 y 4.442,208). En cuanto a la multiplicación de una bacteria productora de L-lisina, se conoce una técnica, en la cual se incorpora un gen que participa en la biosíntesis de L-lisina en un plásmido vector para amplificar el gen en células bacterianas (por ejemplo, Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 56160997). Entre los genes conocidos para biosíntesis de L-lisina se incluyen, por ejemplo, el gen de la dihidropicolinato reductasa (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 7-75578) y el gen de la diaminopimelato deshidrogenasa (Ishino, S. y col., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1.987)), que son genes clonados que participan en la biosíntesis de L-lisina, así como el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 60-87788), el gen de la dihidropicolinato sintasa (Publicación de Patente Japonesa Núm. 6-55149), y el gen de la diaminopimelato descarboxilasa (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 60-62994), cuya amplificación afecta a la productividad de L-lisina. Como se ha descrito antes, se han obtenido algunos resultados acertados para mejorar la productividad de la L-lisina por medio de la amplificación de genes para la biosíntesis de L-lisina. Sin embargo, la amplificación de algunos genes disminuye la velocidad de crecimiento de la bacteria aunque la amplificación mejora la productividad de L-lisina, dando como resultado un descenso de la velocidad de producción de L-lisina. No se ha informado de ningún caso en el que se pretenda mejorar el crecimiento intensificando también un gen para la producción de L-lisina. En las presentes circunstancias, no se conoce ningún caso para las bacterias corineformes, en el que se haya tenido éxito en la mejora notable del rendimiento de L-lisina sin moderar el crecimiento, combinando una pluralidad de genes para la biosíntesis de L-lisina.

Compendio de la invención

Un objeto de la presente invención es mejorar la capacidad productora de L-lisina sin disminuir la velocidad de crecimiento de una bacteria corineforme, intensificando una pluralidad de genes para la biosíntesis de L-lisina combinados en las bacterias corineformes. Cuando la sustancia objetivo es producida fermentativamente utilizando un microorganismo, la velocidad de producción, así como el rendimiento de la sustancia objetivo en relación con la sustancia introducida, es un factor extremadamente importante. La sustancia objetivo puede ser producida de manera relativamente poco costosa aumentando la velocidad de producción por unidad del equipo de fermentación. Por consiguiente, es extremadamente importante desde el punto de vista industrial que el rendimiento fermentativo y la velocidad de producción sean compatibles entre sí. La presente invención propone una solución para el problema descrito antes con el fin de producir fermentativamente L-lisina utilizando una bacteria corineforme. El principio de la presente invención tiene en cuenta el hecho de que se puede mejorar el crecimiento de una bacteria corineforme, y se puede mejorar la velocidad de producción de L-lisina de la misma intensificando tanto la secuencia de ADN que codifica la diaminopimelato descarboxilasa (la diaminopimelato descarboxilasa es referida en adelante como "DDC", y el gen que codifica la proteína DDC es referido en adelante como "lysA", si es necesario), como la secuencia que codifica la diaminopimelato deshidrogenasa (la diaminopimelato deshidrogenasa es referida en adelante como "DDH", y el gen que codifica la proteína DDH es referido en adelante como "ddh", si es necesario) en comparación con el caso en el que estas secuencias de ADN son intensificadas cada una individualmente. Concretamente, la presente invención se basa en una bacteria corineforme que tiene una secuencia de ADN que codifica una aspartoquinasa que se desensibiliza en inhibición de retroalimentación por L-lisina y L-treonina y en la que las actividades enzimáticas intracelulares de dihidrodipicolinato reductasa, dihidropicolinato sintasa, diaminopimelato descarboxilasa y diaminopimelato deshidrogenasa se elevan acumule L-lisina en el cultivo, y recoger la L-lisina del cultivo. Las bacterias corineformes referidas en la presente invención son un grupo de microorganismos definidos en Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, (8a ed., p. 599 (1.974), que son varillas resistentes al tratamiento con ácido, Gram positivas, aerobias que no tienen capacidad formadora de esporas. Entre las bacterias corineformes se incluyen bacterias pertenecientes al género Corynebacterium, bacterias pertenecientes al género Brevibacterum que se han clasificado hasta ahora en el género Brevibacterium pero se han unido como bacterias pertenecientes al género Corynebacterium en la actualidad, y bacterias pertenecientes al género Brevibacterium íntimamente relacionadas con el género Corynebacterium. Según la presente invención, la capacidad productora de L-lisina de las bacterias corineformes puede ser mejorada, y la velocidad de crecimiento también puede ser mejorada. La presente invención puede ser aplicada a bacterias productoras de L-lisina normales así como a cepas con una elevada productividad de L-lisina.

imagen2

Breve explicacion de los dibujos

La Fig. 1 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido p299LYSA que porta lysA. La Fig. 2 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pLYSAB que porta lysA y Brevi.-ori. La Fig. 3 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pPK4D que porta ddh y Brevi.-ori. La Fig. 4 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido p399DL que porta ddh y lysA. La Fig. 5 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pDL que porta ddh, lysA y Brevi.-ori. La Fig. 6 ilustra un procedimiento de construcción de los plásmidos p399AKYB y p399AK9B que portan cada uno lysC mutante. La Fig. 7 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pDPRB que porta dapB y Brevi.-ori. La Fig. 8 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pDPSB que porta dapA y Brevi.-ori. La Fig. 9 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCRCAB que porta lysC, dapB y Brevi.ori. La Fig. 10 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCB que porta lysC, dapB y Brevi.-ori. La Fig. 11 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pAB que porta dapA, dapB y Brevi.ori. La Fig. 12 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCAB que porta lysC mutante, dapA, dapB y Brevi.-ori. La Fig. 13 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCABL que porta lysC mutante, dapA, dapB, lysA, y Brevi.-ori. La Fig. 14 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCABDL que porta lysC mutante, dapA, dapB, ddh, lysA, y Brevi.-ori.

Desripcion detallada de la invención

La presente invención se explicara con detalle más abajo.

<1> Preparación de genes para la biosíntesis de L-lisina utilizados en la presente invención Los genes para la biosíntesis de L-lisina utilizados en la presente invención pueden ser obtenidos respectivamente preparando ADN cromosómico de una bacteria como donadora de ADN, construyendo una genoteca de ADN cromosómico utilizando un vector plasmídico o similar, seleccionando una cepa que albergue un gen deseado de la genoteca, y recuperando, a partir de la cepa seleccionada, el ADN recombinante en el cual se ha insertado el gen. El donador de ADN para el gen para la biosíntesis de Llisina utilizado en la presente invención no está específicamente limitado siempre que el gen deseado para la biosíntesis de L-lisina exprese una proteína enzimática que funcione en las células de la bacteria corineforme. Sin embargo, el donador de ADN es preferiblemente una bacteria corineforme. Ambos genes lysA y ddh originados a partir de bacterias corineformes tienen secuencias conocidas. Por consiguiente, pueden ser obtenidos realizando una amplificación según el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; ver White, T.J. y col., Trends Genet., 5, 185 (1.989)). Cada uno de los genes para la biosíntesis de L-lisina utilizados en la presente invención es obtenible según ciertos métodos ejemplificados más abajo.

(1)

Preparación de lysA mutante Se puede aislar lysA del cromosoma de una bacteria corineforme preparando ADN cromosómico, por ejemplo conforme al método de Saito y Miura (H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1.963)), y amplificando lysA conforme la método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; ver White, T.J. y col., Trends Genet., 5, 185 (1.989)). El donador de ADN no está específicamente limitado, no obstante, es ejemplificado por la cepa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. En las bacterias corineformes, lysA forma un operón junto con argS (gen de la arginil-tRNA sintasa), y lysA existe aguas abajo de argS. La expresión de lysA es regulada por un promotor que existe aguas arriba de argS (ver Journal of Bacteriology, Nov., 7356-7362 (1.993)). Las secuencias de ADN de estos

(1.990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1.988)), basándose en los cuales se pueden preparar cebadores de ADN para la PCR. Tales cebadores de ADN están ejemplificados específicamente por los ADN de 23-meros que tienen respectivamente las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC ID NUM: 1 en el Listado de Secuencias (correspondiente a los nucleótidos números 11 a 33 de la secuencia de nucleótidos descrita en Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1.990)) y en la SEC ID NUM: 2 (correspondiente a los nucleótidos números 1370 a 1392 de la secuencia de nucleótidos descrita en Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1.988)). En el Ejemplo descrito más adelante, se utilizó un fragmento de ADN que contenía un promotor, argS y lysA con el fin de intensificar lysA. Sin embargo, argS no es esencial para la presente invención. Se permite utilizar un fragmento de ADN en el cual lysA está ligado inmediatamente aguas abajo de un promotor. En la SEC ID NUM: 3 se ejemplifican una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene argS y lysA, y una secuencia de aminoácidos que se ha deducido que es codificada por la secuencia de nucleótidos. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos codificada por argS se muestra en la SEC ID NUM: 4, y un ejemplo de una secuencia de aminoácidos codificada por lysA se muestra en la SEC ID NUM: 5. Además de los fragmentos de ADN que codifican estas secuencias de aminoácidos, en la presente invención se pueden utilizar equivalentemente fragmentos de ADN que codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 5, esto es secuencias de aminoácidos que tienen una mutación basada, por ejemplo en una sustitución, deleción,

o inserción de uno o más aminoácidos siempre que no haya una influencia sustancial sobre la actividad de DDC. El ADN puede ser sintetizado según el método habitual utilizando un sintetizador de ADN modelo 380B producido por Applied Biosistems y utilizando el método de la fosfoamidita (ver Tetrahedron Letters (1.981), 22, 1859). La PCR se puede realizar utilizando DNA Thermal Cycler Model PJ2000 producido por Takara Shuzo, y utilizando ADN polimerasa Taq según el método designado por el proveedor. Se prefiere ligar lysA amplificado mediante PCR al ADN vector autónomamente replicable en células de E. coli y/o bacterias corineformes para preparar ADN recombinante, e introducir el ADN recombinante en células de E. coli de antemano. Semejante provisión facilita las siguientes operaciones. El vector autónomamente replicable en células de E. coli es preferiblemente un vector plasmídico que es preferiblemente autónomamente replicable en las células de un huésped, incluyendo, por ejemplo, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, y RSF1010. Cuando se inserta un fragmento de ADN que tiene la capacidad de permitir que un plásmido sea autónomamente replicable en bacterias corineformes en estos vectores, éstos pueden ser utilizados como lo que se denomina un vector lanzadera autónomamente replicable tanto en E. coli como en bacterias corineformes. Entre tales vectores lanzadera se incluyen los siguientes. Los microorganismos que albergan cada uno de los vectores y los números de acceso de las autoridades de consigna internacionales se muestran entre paréntesis.

imagen3

pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532)

pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)

pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)

pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)

pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)

pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)

Estos vectores son obtenibles entre los microorganismos consignados como sigue. Las células recogidas en una fase de crecimiento logarítmico son sometidas a lisis utilizando lisozima y SDS, seguido de separación del producto lisado mediante centrifugación a 30.000 X g para obtener un sobrenadante. Se añade polietilenglicol al sobrenadante, seguido de fraccionamiento y purificación por medio de centrifugación con gradiente de densidad de cloruro de cesio-bromuro de etidio en equilibrio. Se puede transformar E. coli mediante la introducción de un plásmido, por ejemplo conforme al método de

D.M. Morrison (Methods in Enzimology, 68, 326 (1.979)) o el método en el que las células receptoras son tratadas con cloruro de calcio para incrementar la permeabilidad al ADN (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1.970)).

(2) Preparación de ddh Se puede preparar un fragmento de ADN que contiene ddh a partir del cromosoma de una bacteria corineforme por medio de la PCR. El donador de ADN no está específicamente limitado, sin embargo, se ejemplifica mediante la cepa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Se conoce un gen DDH para Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. y col., Nucleic Acids Res., 15, 3917 ejemplificados específicamente por los ADN de 20-meros que tienen respectivamente las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC ID NUMS: 6 y 7 del Listado de Secuencias. La síntesis de ADN, la PCR, y la preparación de un plásmido que porte el ddh obtenido pueden ser realizadas de la misma manera que las de lysA descritas antes. En la SEC ID NUM: 8 se ilustran una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene ddh y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos. En la Figura 9 sólo se muestra la secuencia de aminoácidos. Además de los fragmentos de ADN que codifican esta secuencia de aminoácidos, en la presente invención se pueden utilizar equivalentemente fragmentos de ADN que codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 9, esto es, secuencias de aminoácidos que tienen una mutación basada, por ejemplo, en la sustitución, deleción, o inserción de uno o más aminoácidos siempre que no haya una influencia sustancial sobre la actividad de DDH.

imagen4

<2> ADN recombinante y bacteria corineforme de la presente invención La bacteria corineforme de la presente invención alberga una secuencia de ADN que codifica la diaminopimelato descarboxilasa (lysA) y una secuencia de ADN que codifica la diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) que están intensificadas. El término "secuencia de ADN intensificada" hace referencia aquí al hecho de que la actividad intracelular de una enzima codificada por la secuencia de ADN es elevada, por ejemplo incrementando el número de copias de un gen, utilizando un promotor fuerte

o combinando estos métodos. La bacteria corineforme para la que se han descrito antes las secuencias de ADN es una bacteria corineforme productora de L-lisina, entre cuyos ejemplos se incluyen las cepas de tipo salvaje y las cepas mutantes artificiales productoras de L-lisina y las bacterias corineformes con una productividad de L-lisina intensificada mediante ingeniería genética. Incluso si la bacteria tiene una productividad de L-lisina baja, la productividad de L-lisina puede ser mejorada intensificando lysA y ddh. Si la bacteria tiene una productividad de L-lisina elevada, se puede aumentar más la eficacia de la producción de L-lisina intensificando lysA y ddh.

(1)

Cepas productoras de L-lisina pertenecientes a las bacterias corineformes Entre los ejemplos de la bacteria corineforme utilizada para introducir lysA y ddh se incluyen, por ejemplo, las siguientes cepas productoras de lisina:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806; Corynebacterium callunae ATCC 15991; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032; (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020; (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869; (Corynebacterium lilium) ATCC 15990; (Brevibacterium flavum) ATCC 14067; Corynebacterium melassecola ATCC 17965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066; Brevibacterium immariophilum ATCC 14068; Brevibacterium roseum ATCC 13825; Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354; Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).

Entre otras cepas bacterianas distintas a las descritas antes, las utilizables como huésped en las cuales se van a intensificar lysA y ddh se incluyen, cepas mutantes que tienen la capacidad de producir L-lisina derivada de las cepas mencionadas antes. Entre tales cepas mutantes artificiales se incluyen las siguientes: cepas mutantes resistentes a S-(2-aminoetil)-cisteína (abreviada en adelante como "AEC") (Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-11470), Solicitudes de Patente Japonesas Núms. 561914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 511958, 7-112437, y 7-112438); cepas mutantes que requieren un aminoácido tal como L-homoserina para su crecimiento (Publicaciones de Patente Japonesa Núms. 48-28078 y 56-6499); cepas mutantes que manifiestan resistencia a AEC y requieren aminoácidos tales como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, Lserina, L-arginina, L-alanina, y L-valina (Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.708.395 y 3.825.472); cepas mutantes productoras de L-lisina que manifiestan resistencia a DL--amino-ε-caprolactama, amino-laurillactama, análogos de aspartato, fármacos sulfa, quinoides, y N-lauroilleucina; cepas mutantes productoras de L-lisina que manifiestan resistencia a los inhibidores de oxialoacetato-descarboxilasa o enzimas del sistema respiratorio (Solicitudes de Patentes Japonesas Abiertas a la Inspección Pública Núms. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 y 56-39778, y Publicaciones de Patentes Japonesas Núms. 53-43591 y 53-1833); cepas mutantes productoras de Llisina que requieren inositol o ácido acético (Solicitudes de Patentes Japonesas Abiertas a la Inspección Pública Núms. 55-9784 y 56-8692); cepas mutantes productoras de L-lisina que manifiestan sensibilidad

imagen5

a la Inspección Pública Núms. 55-9783 y 53-86090); y cepas mutantes de producción pertenecientes al género Brevibacterium o Corynebacterium que manifiestan resistencia al etilenglicol y producen L-lisina (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.411.997).

(2) Bacteria corineforme productora de L-lisina que tiene una productividad de L-lisina intensificada por recombinación genética La velocidad de producción de L-lisina puede ser mejorada adicionalmente intensificando lysA y ddh, si se ha intensificado la producción de L-lisina en la bacteria corineforme mediante ingeniería genética, por ejemplo, introduciendo un gen codificador de una enzima que tiene una mutación que ocasiona la desensibilización en la inhibición de la retroalimentación, cuya enzima de tipo salvaje es sometida a inhibición de la retroalimentación entre las enzimas que participan en la biosíntesis de la L-lisina, o intensificando un gen para la biosíntesis de la L-lisina distinta de lysA y ddh. Entre las bacterias corineformes con la productividad de L-lisina intensificada se incluye una bacteria corineforme que alberga una secuencia de ADN que codifica una aspartoquinasa que es desensibilizada en la inhibición de la retroalimentación por la L-lisina y la L-treonina (una aspartoquinasa es referida en adelante como "AK", un gen que codifica una proteína AK es referido en adelante como "lysC", y un gen que codifica una proteína AK que es desensibilizada en la inhibición de la retroalimentación por la L-lisina y la L-treonina, si es necesario), y una secuencia de ADN intensificada que codifica una dihidropicolato reductasa (una dihidropicolinato reductasa es referida en adelante como "DDPR", y un gen que codifica una proteína DDPR es referido en adelante como "dapB", si es necesario), y una bacteria corineforme que alberga adicionalmente una secuencia de ADN intensificada que codifica una dihidropicolinato sintasa (una dihidropicolinato sintasa es referida en adelante como "DDPS", y un gen que codifica una proteína DDPS es referido en adelante como "dapB", si es necesario). Cada uno de los genes para la biosíntesis de la L-lisina utilizado en la presente invención es obtenible según ciertos métodos ejemplificados más abajo.

(i)Preparación de lysC mutante Un fragmento de ADN que contiene lysC mutante puede ser preparado a partir de una cepa mutante en la que la inhibición de retroalimentación sinérgica de la actividad AK por la L-lisina y la L-treonina es sustancialmente desensibilizada (Publicación Internacional Núm. WO 94/25605). Semejante cepa mutante puede ser obtenida, por ejemplo, a partir de un grupo de células que se originan a partir de una cepa de tipo salvaje de una bacteria corineforme sometida a un tratamiento de mutación tal como radiación ultravioleta y tratamiento con un agente mutante tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina. La actividad AK puede ser medida utilizando un método descrito por Miyajima, R. y col., The Journal of Biochemistry (1.986), 63(2), 139-148. La más preferida como cepa mutante es la representada por una bacteria productora de L-lisina AJ3445 (FERM P-1944) derivada mediante un tratamiento de mutación de una cepa de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (cuyo nombre actual cambiado es Corynebacterium glutamicum). Alternativamente, lysC mutante también es obtenible mediante tratamiento de mutación in vitro de ADN plasmídico que contiene lysC de tipo salvaje. En otro aspecto, se conoce específicamente información sobre la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación sinérgica sobre AK por la Lisina o la L-treonina (Publicación Internacional Núm. WO 94/25605). Por consiguiente, también se puede preparar lysC mutante a partir de lysC de tipo salvaje basándose en la información según el método de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo. Se puede preparar un fragmento de ADN que contiene lysC a partir del cromosoma de una bacteria corineforme por medio de la PCR. Los cebadores de ADN son ejemplificados por ADN de hebra sencilla de 23 meros y 21 meros que tienen las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID NUMS: 10 y 11 del Listado de Secuencias con el fin de amplificar, por ejemplo, una región de aproximadamente 1.643 pb que codifica lysC basándose en una secuencia conocida para Corynebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology (1.991), 5(5), 1197-1204; Mol. Gen. Genet. (1.990), 224, 317-324). La síntesis de ADN, la PCR, y la preparación de un plásmido que porta el lysC obtenido se pueden realizar de la misma manera que las de lysA descritas antes. Se obtiene lysC de tipo salvaje cuando se aísla lysC a partir de una cepa de tipo salvaje AK, mientras el lysC mutante se obtiene cuando se aísla lysC de una cepa mutante AK según el método descrito antes. Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene lysC de tipo salvaje se muestra en la SEC ID NUM: 12 del Listado de Secuencias. A partir de la secuencia de nucleótidos se deduce una secuencia de aminoácidos de la subunidad  de la proteína AK de tipo salvaje, y se muestra en la SEC ID NUM: 13 del Listado de Secuencias junto con la secuencia de ADN. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID NUM: 14. De la secuencia de nucleótidos del ADN se deduce una secuencia de aminoácidos de la subunidad  de la proteína AK de tipo salvaje, y se muestra en la SEC ID NUM: 15 del Listado de Secuencias junto con la secuencia de ADN. Sólo se muestra la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NUM: 16. En cada una de las subunidades, se utiliza GTG como codón de iniciación, y el correspondiente aminoácido es representado por metionina. Sin embargo, esta representación hace referencia a metionina, valina, o formilmetionina. El lysC mutante utilizado en la presente invención no está específicamente limitado siempre que codifique AK en el que la inhibición de retroalimentación sinérgica por L-lisina y L-treonina sea desensibilizada. Sin 279o contado desde el extremo N-terminal se cambia por un resto aminoácido distinto de alanina y otro resto aminoácido en la subunidad , y un resto alanina 30o se cambia por un resto aminoácido distinto de alanina y otro resto aminoácido en la subunidad  de la secuencia de aminoácidos de AK de tipo salvaje. La secuencia de aminoácidos de AK de tipo salvaje incluye específicamente la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 14 del Listado de Secuencias como subunidad , y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 16 del Listado de Secuencias como subunidad . Entre los preferidos como restos aminoácido distintos de alanina y otros distintos del aminoácido ácido se incluyen los restos treonina, arginina, cisteína, fenilalanina, prolina, serina, tirosina, y valina. El codón correspondiente al resto aminoácido que va a ser sustituido no está específicamente limitado por su tipo siempre que codifique el resto aminoácido. Se supone que la secuencia de aminoácidos de AK de tipo salvaje poseída puede diferir ligeramente dependiendo de la diferencia en las especies bacterianas y las cepas bacterianas. Las AK, que tienen mutaciones, basadas por ejemplo en sustituciones, deleciones,

imagen6

o inserciones de uno o más restos aminoácido en una o más posiciones irrelevantes para la actividad enzimática descritas antes, también pueden ser utilizadas para la presente invención. Otras AK, que tienen mutaciones basadas, por ejemplo, en sustituciones, deleciones, o inserciones de uno o más restos aminoácido distintos, también pueden ser utilizadas siempre que no se ejerza una influencia sustancial sobre la actividad AK, y sobre la desensibilización de la inhibición por retroalimentación sinérgica por Llisina y L-treonina. Una cepa AJ12691 obtenida introduciendo un plásmido p399AK9B con lysC mutante en una cepa AJ12036 (FERM BP-734) como cepa de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum ha sido consignada el 10 de Abril de 1.992 con el número de acceso FERM BP-12918 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón), transferido a una consigna internacional basándose en el Tratado de Budapest el 10 de Febrero de 1.995, y consignado con el número de acceso FERM BP-4999.

(ii)

Preparación de dapB Se puede preparar un fragmento de ADN que contenga dapB a partir del cromosoma de una bacteria corineforme por medio de la PCR. El donador de ADN no está específicamente limitado, sin embargo, es ejemplificado por la cepa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Se conoce una secuencia de ADN que codifica DDPR para Brevibacterium lactofermentum (Journal of Bacteriology, 175(9), 2743-2749 (1.993)), sobre cuya base se pueden preparar cebadores de ADN para la PCR. Tales cebadores de ADN son ejemplificados específicamente por ADN de 23-meros que tienen respectivamente las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID NUMS: 21 y 22 del Listado de Secuencias. La síntesis de ADN, la PCR, y la preparación de un plásmido que porta el dapB obtenido se pueden realizar de la misma manera que las de lysC descritas antes. En la SEC ID NUM: 23 se ilustran una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene dapB y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos. En la SEC ID NUM: 24 se muestra solamente la secuencia de aminoácidos. Además de los fragmentos de ADN que codifican esta secuencia de aminoácidos, en la presente invención se pueden utilizar equivalentemente fragmentos de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 24, esto es secuencias de aminoácidos que tienen mutaciones basadas, por ejemplo, en la sustitución, deleción, o inserción de uno o más aminoácidos siempre que no haya una influencia sustancial sobre la actividad DDPR. Una cepa AJ13107 transformante obtenida introduciendo un plásmido pCRDAPB que porta dapB obtenido en el Ejemplo descrito más adelante en una cepa JM109 de E. coli ha sido consignada internacionalmente desde el 26 de Mayo de 1.995 con el número de acceso FERM BP-5114 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón), basándose en el Tratado de Budapest.

(iii) Preparación de dapA Se puede preparar un fragmento de ADN que contenga dapA a partir del cromosoma de una bacteria corineforme por medio de la PCR. El donador de ADN no está específicamente limitado, sin embargo, es ejemplificado por la cepa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Se conoce una secuencia de ADN que codifica DDPS para Corynebacterium glutamicum (ver Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1.990)); Núm. de acceso EMBL X53993 sobre cuya base se pueden preparar cebadores de ADN para la PCR. Tales cebadores de ADN son ejemplificados específicamente por ADN de 23-meros que tienen respectivamente las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID NUMS: 17 y 18 del Listado de Secuencias. La síntesis de ADN, la PCR, y la preparación de un plásmido que porta el dapA obtenido se pueden realizar de la misma manera que las de lysC descritas antes. En la SEC ID NUM: 19 se ejemplifican una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene dapA y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos. En la SEC ID NUM: 20 se muestra solamente la secuencia de aminoácidos. Además de los fragmentos de ADN que codifican esta secuencia de aminoácidos, en la presente invención se pueden utilizar equivalentemente fragmentos de ADN que codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la misma secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 20, esto es secuencias de aminoácidos que tienen mutaciones basadas, por ejemplo, en la sustitución, deleción, o inserción de uno o más aminoácidos siempre que no haya una influencia sustancial sobre la actividad DDPS. Una cepa AJ13106 transformante obtenida introduciendo un plásmido pCRDAPA que porta dapA obtenido en el Ejemplo descrito más adelante en una cepa JM109 de E. coli ha sido consignada internacionalmente desde el 26 de Mayo de 1.995 con el número de acceso FERM BP-5113 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón), basándose en el Tratado de Budapest. En una realización especificada, con el fin de intensificar lysA y ddh en la bacteria corineforme productora de L-lisina descrita antes, los genes son introducidos en el huésped utilizando un vector plasmídico, un transposón o un vector de fago o similar. Tras la introducción, se espera realizar la intensificación hasta cierto punto utilizando un vector de tipo bajo número de copias. Sin embargo, se prefiere utilizar un vector de tipo múltiples copias. Entre semejantes vectores se incluyen, por ejemplo, vectores plasmídicos, pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148, y pAJ440 descritos antes. Además, se describen transposones derivados de bacterias corineformes en las Publicaciones Internacionales Núms. WO 92/02627 y WO 93/18151; Publicación de Patente Europea Núm. 445385; Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 6-46867; Vertes, A.A. y col., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1.994); Bonamy, C., y col., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1.994); Vertes, A.A. y col., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1.994); Jagar, W. y col., FERMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1.995); Solicitudes de Patente Japonesas Abiertas a la Inspección Pública Núms. 7-107976 y 7-327680 y similares. Una bacteria corineforme con lysA y ddh intensificados según la presente invención puede ser obtenida, por ejemplo, introduciendo, en una bacteria corineforme huésped, un ADN recombinante que contiene lysA y ddh y que es autónomamente replicable en células de bacterias corineformes. El ADN recombinante puede ser obtenido, por ejemplo, insertando lysA y ddh en un vector tal como un vector plasmídico, transposón o vector de fago como se ha descrito antes. Cada uno de los genes lysA y ddh pueden ser introducidos sucesivamente en el huésped utilizando diferentes vectores respectivamente. Por otra parte, se pueden introducir juntas dos especies de genes utilizando un único vector. Cuando se utilizan vectores diferentes, los genes pueden ser introducidos en cualquier orden, sin embargo, se prefiere utilizar vectores que tengan un mecanismo distribución y hospedaje estable en el huésped, y que sean capaces de co-existir entre sí. En el caso en el que se utiliza un plásmido como vector, el ADN recombinante puede ser introducido en el huésped conforme al método del pulso eléctrico (Sugimoto y col., Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 2-207791). La amplificación de un gen utilizando un transposón puede ser realizada introduciendo un plásmido que porte un transposón en la célula huésped e induciendo la transposición del transposón. Asimismo, cuando se introducen lysC mutante, dapA y dapB en una bacteria corineforme, cada uno de los genes y lysA y ddh pueden ser introducidos sucesivamente en el huésped utilizando diferentes vectores respectivamente o, alternativamente, dos o más especies de genes pueden ser introducidas juntas utilizando un único vector.

<3> Método para producir L-lisina Se puede producir eficazmente L-lisina cultivando, en un medio apropiado, la bacteria corineforme que comprende los genes intensificados para la biosíntesis de L-lisina descritos antes para permitir que se produzca L-lisina y se acumule en el cultivo, y recoger la L-lisina del cultivo. El medio que se va a utilizar está ejemplificado por un medio habitual que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y opcionalmente otros componentes orgánicos. En cuanto a la fuente de carbono, es posible utilizar azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas, y producto hidrolizado de almidón; y ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico, y ácido succínico. En cuanto a la fuente de nitrógeno, es posible utilizar sales de amonio inorgánicas tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, y fosfato de amonio; nitrógeno orgánico tal como producto hidrolizado de soja; gas amoníaco; y amoníaco acuoso. En cuanto a las fuentes de nutrientes vestigiales orgánicos, éstas contienen deseablemente sustancias tales como vitamina B1 y L-homoserina o extracto de levadura o similar en cantidades apropiadas. Si es necesario, se añaden en pequeñas cantidades, además de los anteriores, fosfato de potasio, sulfato de magnesio, ión hierro, ión manganeso etcétera. El cultivo se lleva preferiblemente a cabo en condiciones aerobias durante aproximadamente 30 a 90 horas. La temperatura de cultivo se controla preferiblemente de 25°C a 37°C, y el pH se controla preferiblemente de 5 a 8 durante el cultivo. Se pueden utilizar sustancias inorgánicas u orgánicas, ácidas

o alcalinas, o gas amoníaco o similares para el ajuste del pH. La L-lisina puede ser recogida del cultivo combinando un método de resina de intercambio iónico, un método de precipitación, y otros métodos conocidos.

EJEMPLOS

La presente invención se explicará más específicamente más abajo haciendo referencia a los Ejemplos.

Ejemplo 1: Preparación de lysA a partir de Brevibacterium lactofermentum

5 <1> Preparación de lysA y construcción del plásmido que porta lysA Se utilizó una cepa de tipo salvaje ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum como donador de ADN cromosómico. El ADN cromosómico fue preparado a partir de la cepa ATCC 13869 con un método habitual. Un fragmento de ADN que contenía argS, lysA, y un promotor de un operón que los contenía fue amplificado a partir del ADN cromosómico según la PCR. Como cebadores de ADN utilizados para la amplificación, se emplearon ADN sintéticos de 23-meros que tenían secuencias de nucleótidos conocidas mostradas en las SEC ID NUMS: 1 y 2 del Listado de Secuencias respectivamente con el fin de amplificar una región de aproximadamente 3,6 kb que codificaba la arginil-tRNA sintasa y DDC basándose en la secuencia conocida para Corynebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1.990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1.988)).

15 Se sintetizó ADN según un método habitual utilizando un sintetizador de ADN modelo 380B producido por Applied Biosistems y utilizando el método de la fosfoamidita (ver Tetrahedron Letters (1.981), 22, 1859). El gen fue amplificado mediante PCR utilizando DNA Thermal Cycler Model PJ2000 producido por Takara Shuzo, y utilizando ADN polimerasa de Taq según el método designado por el proveedor. Se utilizó pHSG399 como vector de clonación para el fragmento génico amplificado de 3.579 pb. pHSG399 fue digerido con una enzima de restricción SmaI (producida por Takara Shuzo), y fue ligado con el fragmento de ADN que contenía lysA amplificado. El plásmido obtenido como se ha descrito antes, que tenía lysA originado a partir de ATCC 13869, fue denominado p399LYSA. Se extrajo un fragmento de ADN que contenía lysA sometiendo a digestión p399LYSA con KpnI (producida por Takara Shuzo) y BamHI (producida por Takara Shuzo). Este fragmento de ADN fue ligado

25 con pHSG299 que había sido digerido con KpnI y BamHI. El plásmido obtenido fue denominado p299LYSA. El procedimiento de construcción de p299LYSA se muestra en la Fig. 1. Un fragmento de ADN (referido en adelante como "Brevi.-ori") que tenía la capacidad de hacer un plásmido autónomamente replicable en bacterias pertenecientes al género Corynebacterium fue introducido en p299LYSA para preparar plásmidos que portaban lysA autónomamente replicable en bacterias pertenecientes al género Corynebacterium. Brevi.-ori fue preparado a partir de un vector plasmídico pHK4 que contenía Brevi.-ori y autónomamente replicable en células tanto de E. coli como en bacterias pertenecientes al género Corynebacterium. Se construyó pHK4 mediante digestión de pHC4 con KpnI (producida por Takara Shuzo) y BamHI (producida por Takara Shuzo), extrayendo un fragmento Brevi.-ori, y ligándolo con pHSG298 que también había sido digerido con KpnI y BamHI (ver la Solicitud de

35 Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 5-7491). pHK4 confiere resistencia a la kanamicina al huésped. La Escherichia coli HB101 que albergaba PHK4 fue denominada Escherichia coli AJ13136, y depositada el 1 de Agosto de 1.995 con el número de acceso FERM BP-5186 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón). pHK4 fue digerido con una enzima de restricción BamHI, y los extremos escindidos se volvieron romos. La formación de extremos romos se realizó utilizando un estuche DNA Blunting (producido por Takara Shuzo) según el método designado. Tras la formación de extremos romos, se ligó un conector KpnI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar una modificación de manera que el fragmento de ADN

45 correspondiente a la porción Brevi.-ori pudiera ser escindido de pHK4 mediante digestión con KpnI solo. Este plásmido fue digerido con KpnI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado fue ligado con p299LYSA que había sido digerido solo con KpnI para preparar un plásmido que portaba lysA autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido preparado fue denominado pLYSAB. El procedimiento de producción de pLYSAB se muestra en la Fig. 2.

<2> Determinación de la secuencia de nucleótidos de lysA de Brevibacterium lactofermentum Se preparó ADN plasmídico de p299LYSA, y se realizó la determinación de la secuencia de nucleótidos según el método de Sanger y col. (por ejemplo, F. Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1.977)). En la SEC ID NUM: 3 se muestran la secuencia de nucleótidos determinada y la secuencia de

55 aminoácidos que se ha deducido que es codificada por la secuencia de nucleótidos. En relación con la secuencia de nucleótidos, se muestran en las SEC ID NUMS: 4 y 5, respectivamente, una secuencia de aminoácidos codificada por argS y una secuencia de aminoácidos codificada por lysA.

Ejemplo 2: Preparación de ddh a partir de Brevibacterium lactofermentum

Se obtuvo un gen ddh amplificando el gen ddh del ADN cromosómico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 según el método de la PCR utilizando dos cebadores oligonucleotídicos (SEC ID NUMS: 6, 7) preparados basándose en una secuencia de nucleótidos conocida de un gen ddh de Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. y col., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1.987)). El fragmento de ADN amplificado

65 obtenido fue sometido a digestión con EcoT22I y AvaI, y los extremos escindidos se hicieron romos. Después de eso, el fragmento fue insertado en un sitio SmaI de pMW119 para obtener un plásmido pDDH. A continuación, pDDH fue digerido con SalI y EcoRI, seguido de la formación de extremos romos. Después de eso, el fragmento obtenido fue ligado con pUC18 que había sido digerido con SmaI. El plásmido así obtenido fue denominado pUC18DDH. Se introdujo Brevi.-ori en pUC18DDH para construir un plásmido que portaba ddh autónomamente replicable en bacterias corineformes. pHK4 fue digerido con enzimas de restricción KpnI y BamHI, y los extremos escindidos se hicieron romos. La formación de extremos romos se realizó utilizando el estuche DNA Blunting (producido pro Takara Shuzo) según el método designado. Tras la formación de extremos romos, se ligó un conector PstI fosforilado (producido por Takara Shuzo) de manera que fuera insertado en el sitio PstI de pHSG299. El plásmido construido como se ha descrito antes, fue denominado pPK4. A continuación, pUC18DDH fue digerido con XbaI y KpnI, y el fragmento generado fue ligado con pPK4 que había sido digerido con KpnI y XbaI. De este modo se construyó un plásmido que portaba ddh autónomamente replicable en bacterias corineformes. Este plásmido fue denominado pPK4D. El procedimiento de construcción de pPK4D se muestra en la Fig. 3.

Ejemplo 3: Construcción del Plásmido que Porta tanto ddh como lysA

El plásmido pUC18DDH que portaba ddh fue digerido con EcoRI y después se hicieron romos los extremos y se sometieron a digestión adicionalmente con XbaI para extraer un fragmento de ADN que contenía ddh. Este fragmento ddh fue ligado con el plásmido p399LYSA que portaba lysA que había sido digerido con BamHI y después se hicieron romos los extremos y se sometió a digestión adicionalmente con XbaI. El plásmido obtenido fue denominado p399DL. El procedimiento de construcción de p399DL se muestra en la Fig. 4. A continuación, se introdujo Brevi.-ori en p399DL. pHKD4 fue digerido con XbaI y BamHI, y los extremos escindidos se hicieron romos. Tras la formación de los extremos romos, se ligó un conector XbaI fosforilado para realizar una modificación de manera que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori pudiera ser escindido de pHK4 mediante digestión solo con XbaI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado fue ligado con p399DL que también había sido digerido con XbaI para construir un plásmido que contenía ddh y lysA autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido fue denominado pDL. El procedimiento de construcción de pDL se muestra en la Fig. 5.

Ejemplo 4: Preparación de lysC mutante, dapB y dapB a partir de Brevibacterium lactofermentum

<1> Preparación del Gen lysC de tipo salvaje y del Gen lysC Mutante a partir de Brevibacterium lactofermentum

(1)

Preparación de los lysC de tipo salvaje y mutante y preparación de plásmidos que los portan Se utilizaron una cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, y una cepa mutante productora de L-lisina AJ3445 (FERM BP-1944) obtenida de la cepa ATCC 13689 mediante un tratamiento de mutación como donadores de ADN cromosómico. La cepa AJ3445 había sido sometida a mutación de manera que lysC se cambiaba para que implicara una desensibilización sustancial de la inhibición concertada por lisina y treonina (Journal of Biochemistry, 68, 701-710 (1.970)). Un fragmento de ADN que contenía lysC fue amplificado a partir de ADN cromosómico según el método de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa; ver White, T.J. y col., Trends Genet., 5, 185 (1.989)). En cuanto a los cebadores de ADN utilizados para la amplificación, se sintetizaron ADN de hebra sencilla de 23 meros y 21 meros que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID NUMS: 10 y 11 con el fin de amplificar una región de aproximadamente 1.643 pb que codificaba lysC basándose en una secuencia conocida para Corynebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology (1.991), 5(5), 11971204; y Mol. Gen. Genet. (1.990), 224, 317-324). El fragmento génico amplificado de 1.643 pb fue confirmado mediante electroforesis en gel de agarosa. Después de eso, el fragmento separado por escisión del gel fue purificado según un método habitual, y fue digerido con las enzimas de restricción NruI (producida por Takara Shuzo) y EcoRI (producida por Takara Shuzo). Se utilizó pHSG399 (ver Takeshita, S. y col., Gen (1.987), 61, 63-74) como vector de clonación para el fragmento génico. pHSG399 fue digerido con las enzimas de restricción SmaI (producida por Takara Shuzo) y EcoRI, y fue ligado con el fragmento lysC amplificado. El ADN fue ligado utilizando un estuche de ligadura de ADN (producido por Takara Shuzo) según un método designado. De este modo se prepararon plásmidos, en los cuales los fragmentos lysC amplificados a partir de los cromosomas de Brevibacterium lactofermentum estaban ligados con pHSG399 respectivamente. El plásmido que portaba lysC de ATCC 13869 (cepa de tipo salvaje) fue denominado p399AKY, y el plásmido que portaba lysC de AJ3463 (bacteria productora de L-lisina) fue denominado p399AK9. Se introdujo Brevi.-ori en p399AKY y p399AK9 respectivamente para construir plásmidos que portaban lysC autónomamente replicable en bacterias corineformes. pHK4 fue digerido con las enzimas de restricción KpnI y BamHI (producidas por Takara Shuzo), y los extremos escindidos se hicieron romos. La formación de extremos romos se realizó utilizando un estuche DNA Blunting (producido por Takara Shuzo) según el método designado. Tras la formación de los extremos romos, se ligó un conector BamHI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar una modificación de manera que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori pudiera ser

escindida de pHK4 mediante digestión sólo con BamHI. Este plásmido fue digerido con BamHI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado fue ligado con p399AKY y p399AK9 que también habían sido digeridos con BamHI para preparar los plásmidos que portaban lysC autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido que portaba el gen lysC de tipo salvaje originado a partir de p399AKY fue denominado p399AKYB, y el plásmido que portaba el gen lysC mutante originado a partir de p399AK9 fue denominado p399AK9B. El procedimiento de construcción de p399AK9B y p399AKYB se muestra en la Fig. 6. La cepa AJ12691 obtenida introduciendo el plásmido lysC mutante p399AK9B en una cepa de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum (AJ12036, FERM BP-734) fue consignada el 10 de Abril de 1.992 con el número de acceso FERM P-12198 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón), transferido a una consigna internacional basándose en el Tratado de Budapest el 10 de Febrero de 1.995, y consignado con el número de acceso FERM BP-4999.

(2)

Determinación de las secuencias de nucleótidos de lysC de tipo salvaje y lysC mutante de Brevibacterium lactofermentum El plásmido p399AKY que contenía lysC de tipo salvaje y el plásmido p399AK9 que contenía lysC mutante fueron preparados a partir de los respectivos transformantes para determinar las secuencias de nucleótidos de los lysC de tipo salvaje y mutante. La determinación de la secuencia de nucleótidos se realizó según el método de Sanger y col. (por ejemplo, F. Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1.977)). La secuencia de nucleótidos de lysC de tipo salvaje codificada por p399AKY se muestra en la SEC ID NUM: 12 del Listado de Secuencias. Por otra parte, la secuencia de nucleótidos de lysC mutante codificada por 399AK9 tenía solo la mutación de un nucleótido de manera que la G 1051a se cambiaba por A en la SEC ID NUM: 12 en comparación con lysC de tipo salvaje. Se sabe que lysC de Corynebacterium glutamicum tiene dos subunidades (, ) codificadas en un marco de lectura idéntico de una hebra de ADN idéntica (ver Kalinowsky, J. y col., Molecular Microbiology (1.991) 5(5), 1197-1204). A juzgar por la homología, se espera que el gen secuenciado aquí tenga dos subunidades (, ) codificadas en un marco de lectura idéntico en una hebra de ADN idéntica. Una secuencia de aminoácidos de la subunidad  de la proteína AK de tipo salvaje deducida de la secuencia de nucleótidos del ADN se muestra en la SEC ID NUM: 13 junto con la secuencia de ADN. En la SEC ID NUM: 14 solo se muestra la secuencia de aminoácidos. En la SEC ID NUM: 15 se muestra la secuencia de aminoácidos de la subunidad  de la proteína AK de tipo salvaje junto con el ADN. En la SEC ID NUM: 16 sólo se muestra la secuencia de aminoácidos. En cada una de las subunidades, se utiliza GTG como codón de iniciación, y el aminoácido correspondiente está representado por la metionina. Sin embargo, esta representación hace referencia a metionina, valina, o formilmetionina. Por otra parte, la mutación de la secuencia de lysC mutante representa la existencia de una sustitución de un resto aminoácido tal como el resto alanina 279 de la subunidad  es intercambiado por un resto treonina, y un resto alanina 30 de la subunidad  es intercambiado por un resto treonina en la secuencia de aminoácidos de la proteína AK de tipo salvaje (SEC ID NUM: 14, 16).

<2> Preparación de dapB de Brevibacterium lactofermentum

(1)

Preparación de dapB y construcción del plásmido que porta dapB Se utilizó una cepa de tipo salvaje ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum como donador de ADN cromosómico. El ADN cromosómico fue preparado a partir de la cepa ATCC 13869 según el método habitual. Se amplificó un fragmento de ADN que contenía dapB a partir del ADN cromosómico según la PCR. Como cebadores de ADN utilizados para la amplificación, se sintetizaron ADN de 23 meros que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID NUMS: 21 y 22 del Listado de Secuencias respectivamente con el fin de amplificar una región de aproximadamente 2,0 kb que codificaba DDPR basándose en la secuencias conocida para Brevibacterium lactofermentum (ver Journal of Bacteriology, 157(9), 2743-2749 (1.993)]. Las síntesis de ADN y PCR se realizaron de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 1. Se utilizó pCR-Script (producido por Invitrogen) como vector de clonación para el fragmento génico amplificado de 2.001 pb, y se ligó con el fragmento de dapB amplificado. De este modo se construyó un plásmido, en el cual el fragmento dapB de 2.001 pb amplificado a partir del cromosoma de Brevibacterium lactofermentum era ligado con pCR-Script. El plásmido obtenido como se ha descrito antes, que tenía dapB originado a partir de ATCC 13869, fue denominado pCRDAPB. Una cepa AJ13107 transformante obtenida introduciendo pCRDAPB en E. coli JM109 ha sido consignada internacionalmente desde el 16 de Mayo de 1.995 con el número de acceso FERM BP-5114 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) basándose en el Tratado de Budapest. Un fragmento de 1.101 pb que contenía un gen estructural de DDPR fue extraído mediante digestión de pCRDAPB con EcoRV y SphI. Este fragmento fue ligado con pHSG399 que había sido digerido con HincII y SphI para preparar un plásmido. El plásmido preparado fue denominado p399DPR. Se introdujo Brevi.-ori en el p399DPR preparado para construir un plásmido que llevaba dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. pHK4 fue digerido con una enzima de restricción

KpnI (producida por Takara Shuzo), y los extremos escindido se hicieron romos. La formación de extremos romos se realizó utilizando un estuche DNA Blunting (producido por Takara Suzo) según el método designado. Tras la formación de extremos romos, se ligó un conector BamHI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar una modificación de manera que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori pudiera ser escindido de pHK4 mediante digestión solamente con BamHI. Este plásmido fue digerido con BamHI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado fue ligado con p399DPR que también había sido digerido con BamHI para preparar un plásmido que contenía dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido preparado fue denominado pDPRB. El procedimiento de construcción de pDPRB se muestra en la Fig. 7.

(2)

Determinación de la secuencia de nucleótidos de dapB a partir de Brevibacterium lactofermentum Se preparó ADN plasmídico a partir de la cepa AJ13107 que albergaba p399DPR, y se determinó su secuencia de nucleótidos de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1. En la SEC ID NUM: 23 se muestran la secuencia de nucleótidos determinada y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos. En la SEC ID NUM: 24 se muestra solamente la secuencia de aminoácidos.

<3> Preparación de dapA a partir de Brevibacterium lactofermentum

(1) Preparación de dapA y construcción del plásmido que porta dapA Se utilizó una cepa de tipo salvaje ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum como donador de ADN cromosómico. El ADN cromosómico fue preparado a partir de la cepa ATCC 13869 según el método habitual. Se amplificó un fragmento de ADN que contenía dapA a partir del ADN cromosómico según la PCR. Como cebadores de ADN utilizados para la amplificación, se sintetizaron ADN de 23 meros que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID NUMS: 17 y 18 del Listado de Secuencias respectivamente con el fin de amplificar una región de aproximadamente 1,5 kb que codificaba DDPS basándose en la secuencia conocida para Corynebacterium glutamicum (ver Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1.990); Núm. de acceso EMBL X53993). Las síntesis de ADN y la PCR se realizaron de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 1. Se utilizó pCR1000 (producido por Invitrogen, ver Bio/Technology, 9, 657-663 (1.991)) como vector de clonación para el fragmento génico amplificado de

1.411 pb, y se ligó con el fragmento de dapA amplificado. La ligadura de ADN se llevó a cabo utilizando un estuche de ligadura de ADN (producido por Takara Shuzo) según el método designado. De este modo se construyó un plásmido, en el cual el fragmento dapA de 1.411 pb amplificado a partir del cromosoma de Brevibacterium lactofermentum era ligado con pCR1000. El plásmido obtenido como se ha descrito antes, que tenía dapA originado a partir de ATCC 13869, fue denominado pCRDAPA. Una cepa AJ13106 transformante obtenida introduciendo pCRDAPA en la cepa de E. coli JM109 ha sido consignada internacionalmente desde el 26 de Mayo de 1.995 con el número de acceso FERM BP-5113 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) basándose en el Tratado de Budapest. Se introdujo Brevi.-ori en el pCRDAPA preparado para construir un plásmido que llevaba dapA autónomamente replicable en bacterias corineformes. pHK4 fue digerido con las enzimas de restricción KpnI y BamHI (producidas por Takara Shuzo), y los extremos escindidos se hicieron romos. La formación de extremos romos se realizó utilizando un estuche DNA Blunting (producido por Takara Suzo) según el método designado. Tras la formación de extremos romos, se ligó un conector SmaI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar una modificación de manera que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori pudiera ser escindido de pHK4 mediante digestión solamente con SmaI. Este plásmido fue digerido con SmaI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado fue ligado con pCRDAPA que también había sido digerido con SmaI para preparar un plásmido que contenía dapA autónomamente replicable en bacterias corineformes. Este plásmido fue denominado pDPSB. El procedimiento de construcción de pDPSB(Kmr) se muestra en la Fig. 8.

(2) Determinación de la secuencia de nucleótidos de dapS a partir de Brevibacterium lactofermentum El ADN plasmídico fue preparado a partir de la cepa AJ13106 que albergaba pCRDAPA, y su secuencia de nucleótidos fue determinada de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1. En la SEC ID NUM: 19 se muestran la secuencia de nucleótidos determinada y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos. En la SEC ID NUM: 20 se muestra solamente la secuencia de aminoácidos.

<4> Construcción del Plásmido que Porta Tanto lysC Mutante como dapA Se construyó un plásmido que portaba lysC mutante, dapA, y el origen de replicación de una bacteria corineforme a partir del plásmido pCRDAPA que portaba dapA y el plásmido p399AK9B que portaba lysC mutante y Brevi.-ori. p399AK9B fue completamente digerido con SalI, y después se hicieron romos los extremos. Un conector EcoRI fue ligado con él para construir un plásmido en el cual el sitio SalI estaba modificado a un sitio EcoRI. El plásmido obtenido fue denominado p399AK9BSE. El lysC mutante y Brevi.ori fueron escindidos como un fragmento mediante digestión parcial de p399AK9BSE con EcoRI. Este fragmento fue ligado con pCRDAPA que había sido digerido con EcoRI. El plásmido obtenido fue denominado pCRCAB. Este plásmido es autónomamente replicable en E. coli y bacterias corineformes, y proporciona al huésped resistencia a la kanamicina, portando el plásmido tanto lysC mutante como dapA. El procedimiento de construcción de pCRCAB se muestra en la Fig. 9.

<5> Construcción del Plásmido que Porta Tanto lysC Mutante como dapB Se construyó un plásmido que portaba lysC mutante y dapB a partir del plásmido p399AK9 que portaba lysC mutante y el plásmido p399DPR que portaba dapB. Se extrajo un fragmento de 1.101 pb que contenía un gen estructural de DDPR mediante digestión de p399DPR con EcoRV y SphI. Este fragmento fue ligado con p399AK9 que había sido digerido con SalI y después se habían hecho romos los extremos y se habían digerido adicionalmente con SphI para construir un plásmido que portaba tanto el lysC mutante como dapB. Este plásmido fue denominado p399AKDDPR. A continuación, se introdujo Brevi.-ori en el p399AKDPR. El plásmido pHK4 que contenía Brevi.-ori fue digerido con una enzima de restricción KpnI (producida por Takara Shuzo), y los extremos escindidos se volvieron romos. La formación de extremos romos se realizó utilizando un estuche DNA Blunting (producido por Takara Shuzo) según el método designado. Tras la formación de extremos romos, se ligó un conector BamHI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar una modificación de manera que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori pudiera ser escindido de pHK4 mediante digestión sólo con BamHI. Este plásmido fue digerido con BamHI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado fue ligado con p399AKDDPR que también había sido digerido con BamHI para construir un plásmido que portaba el lysC mutante y dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido fue denominado pCB. El procedimiento de construcción de pCB se muestra en la Fig.

10.

<6> Construcción del Plásmido que Porta Tanto dapA como dapB El plásmido pCRDAPA que portaba dapA fue digerido con KpnI y EcoRI para extraer un fragmento de ADN que contenía dapA y el fragmento fue ligado con el plásmido vector pHSG399 que había sido digerido con KpnI y EcoRI. El plásmido obtenido fue denominado p399DPS. Por otra parte, el plásmido pCRDAPB que portaba dapB fue digerido con SacII y EcoRI para extraer un fragmento de ADN de 2,0 kb que contenía una región que codificaba DDPR y el fragmento fue ligado con p399DPS que había sido digerido con SacII y EcoRI para construir un plásmido que portaba tanto dapA como dapB. El plásmido obtenido fue denominado p399AB. A continuación, se introdujo Brevi.-ori en p399AB. pHK4 que portaba Brevi.-ori fue digerido con una enzima de restricción BamHI (producida por Takara Shuzo), y los extremos escindidos se volvieron romos. La formación de extremos romos se realizó utilizando un estuche DNA Blunting (producido por Takara Shuzo) según el método designado. Tras la formación de extremos romos, se ligó un conector KpnI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar una modificación de manera que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori pudiera ser escindido de pHK4 mediante digestión solamente con KpnI. Este plásmido fue digerido con KpnI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado fue ligado con p399AB que también había sido digerido con KpnI para construir un plásmido que portaba dapA y dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido fue denominado pAB. El procedimiento de construcción de pAB se muestra en la Fig. 11.

<7> Construcción del Plásmido que Porta lysC Mutante, dapA, y dapB Juntos Se sometió a digestión p399DPS con EcoRI y SphI seguido de la formación de extremos romos para extraer un fragmento génico dapA. Este fragmento fue ligado con p399AK9 que había sido digerido con SalI y sus extremos se habían vuelto romos para construir un plásmido p399CA en el cual coexistían lysC mutante y dapA. El plásmido pCRDAPB que portaba dapB fue digerido con EcoRI y sus extremos se volvieron romos, seguido de digestión con SacI para extraer un fragmento de ADN de 2,0 kb que comprendía dapB. El plásmido p399CA que portaba dapA y lysC mutante fue digerido con SpeI y sus extremos se volvieron romos, y después de eso fue digerido con SacI y ligado con el fragmento dapB extraído para obtener un plásmido que portaba lysC mutante, dapA, y dapB. Este plásmido fue denominado p399CAB. A continuación, se introdujo Brevi.-ori en p399CAB. El plásmido pHK4 que portaba Brevi.-ori fue digerido con una enzima de restricción BamHI (producida por Takara Shuzo), y los extremos escindidos se volvieron romos. La formación de extremos romos se realizó utilizando un estuche DNA Blunting (producido por Takara Shuzo) según el método designado. Tras la formación de extremos romos, se ligó un conector KpnI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar una modificación de manera que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori pudiera ser escindido de pHK4 mediante digestión solamente con KpnI. Este plásmido fue digerido con KpnI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado fue ligado con p399CAB que también había sido digerido con KpnI para construir un plásmido que portaba lysC mutante, dapA y dapB juntos autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido fue denominado pCAB. El procedimiento de construcción de pCAB se muestra en la Fig. 12.

<8> Construcción del Plásmido que Portaba lysC Mutante, dapA, dapB, y lysA Juntos El plásmido p299LYSA que portaba lysA fue digerido con KpnI y BamHI y sus extremos se volvieron romos, y después se extrajo un fragmento génico lysA. Este fragmento fue ligado con pCAB que había sido digerido con HpaI (producido por Takara Shuzo) y sus extremos se volvieron romos para construir un plásmido que portaba lysC mutante, dapA, dapB, y lysA juntos autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido fue denominado pACBL. El procedimiento de construcción de

imagen7

el gen dapB no está dividido. 5

<9> Construcción del Plásmido que Porta lysC Mutante, dapA, dapB, ddh, y lysA Juntos pHSG299 fue digerido con XbaI y KpnI, y fue ligado con p399DL, que portaba ddh y lysA que había sido digerido con XbaI y KpnI. El plásmido construido fue denominado p299DL. p299DL fue digerido con XbaI y KpnI y sus extremos se volvieron romos. Tras la formación de extremos romos, se extrajo un fragmento de

10 ADN que portaba ddh y lysA. Este fragmento de ADN fue ligado con el plásmido pCAB que portaba lysC mutante, dapA, y dapB juntos que había sido digerido con HpaI y cuyos extremos se habían vuelto romos para construir un plásmido que portaba lysC mutante, dapA, dapB, lysA y ddh juntos autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido fue denominado pCABDL. El procedimiento de construcción de pCABDL se muestra en la Fig. 14.

15 Ejemplo 5: Introducción de los Plásmidos que Portan los Genes para la Biosíntesis de L-lisina en una Bacteria Productora de L-lisina de Brevibacterium Lactofermentum

Los plásmidos que portaban los genes para la biosíntesis de L-lisina construidos como se ha descrito

20 antes, esto es, pLYSAB(Cmr), pPK4D(Cmr), p399AK9B(Cmr), pPDSB(Kmr), pDPRB(Cmr), pCRCAB(Kmr), pAB(Cmr), pDL(Cmr), pCB(Cmr), pCAB(Cmr), pCABL(Cmr), y pCABDL(Cmr) fueron introducidos en una bacteria productora de L-lisina AJ11082 (NRRL B-11470) de Brevibacterium lactofermentum respectivamente. La cepa AJ11082 tiene la propiedad de ser resistente a AEC. Los plásmidos fueron introducidos según el método del pulso eléctrico (Sugimoto y col., Solicitud de Patente Japonesa Abierta a

25 la Inspección Pública Núm. 2-207791). Los transformantes fueron seleccionados basándose en los marcadores de resistencia a fármacos poseídos por los respectivos plásmidos. Los transformantes fueron seleccionados en un medio completo que contenía 5 g/ml de cloramfenicol cuando se introducía un plásmido que portaba un gen de resistencia al cloramfenicol, o los transformantes fueron seleccionado en un medio completo que contenía 25 g/ml de kanamicina cuando se introducía un plásmido que portaba

30 un gen de resistencia a la kanamicina.

Ejemplo 6: Producción de L-lisina

Cada uno de los transformantes obtenidos en el Ejemplo 5 fue cultivado en un medio productor de L-lisina

35 para evaluar su productividad de L-lisina. El medio productor de L-lisina tenía la siguiente composición. [Medio productor de L-lisina] Se disolvieron los siguientes componentes distintos de carbonato de calcio (por litro) para realizar un ajuste del pH de 8,0 con KOH. El medio fue esterilizado a 115°C durante 15 minutos, y se añadió al medio esterilizado carbonato de calcio (50 g) que había sido esterilizado por separado en aire caliente en estado

40 seco.

Glucosa (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 .7H2O Biotina Tiamina FeSO4 .7H2O MnSO4 .7H2O Nicotinamida Producto hidrolizado de proteína (Mamenou) Carbonato de calcio

100 g 55 g 1 g 1 g 500 g 2.000 g 0,01 g 0,01 g 5 mg 30 ml 50 g

45 Cada uno de los diversos tipos de los transformantes y la cepa de origen fueron inoculados en el medio que tenía la composición descrita antes para realizar el cultivo a 31,5°C con sacudimiento oscilante. La cantidad de L-lisina producida al cabo de 40 o 72 horas de cultivo, y el crecimiento al cabo de 72 horas (DO562) se muestran la Tabla 1. En la Tabla, lysC* representa lysC mutante. El crecimiento fue determinado cuantitativamente midiendo la DO a 560 nm tras diluir 101 veces.

50

Tabla 1

Acumulación de L-lisina tras un Cultivo de 40 o 72 horas

Cepa Bacteriana /plásmido

Gen Introducido Cantidad producida Crecimiento

L-lisina(g/l)

(DO562/101)

Tras 40 h

Tras 72 h

AJ11082

22,0 29,8 0,450

AJ11082/pLYSAB

lysA 19,8 32,5 0,356

AJ11082/pPK4D

ddh 19,0 33,4 0,330

AJ11082/p399AK9B

lysC 16,8 34,5 0,398

AJ11082/pDPSB

dapA 18,7 33,8 0,410

AJ11082/pDPRB

dapB 19,9 29,9 0,445

AJ11082/pCRCAB

lysC*,dapA 19,7 36,5 0,360

AJ11082/pAB

dapA,dapB 19,0 34,8 0,390

AJ11082/pDL

lysA,ddh 23,3 31,6 0,440

AJ11082/pCB

lysC*,dapB 23,3 35,0 0,440

AJ11082/pCAB

lysC*,dapA dapB 23,3 31,6 0,440

AJ11082/pCABL

lysC*,dapA, dapB,lysA 26,2 46,5 0,379

AJ11082/pCABDL

lysC*,dapA, dapB,lysA, ddh 26,5 47,0 0,409

5 Como se ha mostrado antes, cuando lysA, ddh, lysC mutante, dapA, o dapB eran intensificados individualmente, la cantidad de L-lisina producida al cabo de 72 horas de cultivo era mayor o equivalente a la producida por la cepa de origen, sin embargo, la cantidad de L-lisina producida al cabo de 40 horas de cultivo era menor que la producida por la cepa de origen. Es decir, la velocidad de producción de L-lisina 10 disminuía en el cultivo durante un corto período de tiempo. De un modo similar, cuando se intensificaban lysC mutante y dapA, o dapA y dapB combinados, la cantidad de L-lisina producida al cabo de 72 horas de cultivo era mayor que la producida por la cepa de origen, no obstante, la cantidad de L-lisina producida al cabo de 40 horas de cultivo era más pequeña que la producida por la cepa de origen. De este modo la velocidad de producción de L-lisina disminuía. 15 Por otra parte, cuando sólo se intensificaban lysA y ddh combinados, el crecimiento mejoraba, la velocidad de producción de L-lisina se restauraba con éxito en el corto período de cultivo, y la cantidad de L-lisina acumulada también mejoraba en el cultivo durante un período largo. Asimismo, en el caso de la cepa en la que dapB era intensificado junto con lysC mutante, y en el caso de la cepa en la que dapA así como estos genes eran intensificados simultáneamente, el crecimiento 20 mejoraba y la velocidad de producción de L-lisina aumentaba en comparación con la cepa de origen. En el caso de la cepa en la que estos tres genes eran intensificados simultáneamente, tanto la velocidad de producción de L-lisina como la cantidad de L-lisina acumulada mejoraban adicionalmente intensificando adicionalmente lysA y ddh.

Claims (7)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   5 1. Una bacteria corineforme que tiene una secuencia de ADN que codifica una aspartoquinasa que se desensibiliza en inhibición de retroalimentación por L-lisina y L-treonina y en la que las actividades enzimáticas intracelulares de dihidrodipicolinato reductasa, dihidropicolinato sintasa, diaminopimelato descarboxilasa y diaminopimelato deshidrogenasa se elevan por el aumento de un número de copias de las secuencias de ADN que codifican dichas enzimas.

   10
2. 2. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN que codifica la dihidrodipicolinato reductasa codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24 en el listado de secuencias o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24.

   15
3. 3. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN que codifica la dihidrodipicolinato sintasa codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 20 en el listado de secuencias o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 20.

   20
4. 4. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN que codifica la aspartoquinasa se proporciona como un mutante en el que el 279º resto de alanina se cambia a un resto de aminoácido distinto de una alanina y distinto de un aminoácido ácido en SEQ ID NO: 14, y un 30º resto de alanina se cambia a un resto de aminoácido distinto de alanina y distinto de un aminoácido

   25 ácido en SEQ ID NO: 16.
5. 5. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN que codifica la diaminopimelato descarboxilasa codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 en el listado de secuencias o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de

   30 aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5.
6. 6. La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN que codifica la diaminopimelato deshidrogenasa codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9 en el listado de secuencias o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la

   35 secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9.
7. 7. Un método para producir L-lisina que comprende las etapas de cultivar en un medio dicha bacteria corineforme como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para permitir que la L-lisina se produzca y acumule en un cultivo, y la recuperación de la L-lisina del cultivo.

   40

   49