ES2273355T3 - Procedimiento de produccion de l - lisina. - Google Patents

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Abstract

UNA BACTERIA CORINEFORME QUE ALBERGA UNA ASPARTOQUINASA EN LA CUAL LA INHIBICION POR FEEDBACK POR L - LISINA Y L - TREONINA ESTA SUSTANCIALMENTE DESENSIBILIZADA, Y COMPRENDIENDO UNA SECUENCIA DE ADN MEJORADA QUE CODIFICA UNA DIHIDRODIPICOLINATO REDUCTASA, UNA SECUENCIA DE ADN MEJORADO QUE CODIFICA UNA DIHIDROPICOLINATO REDUCTASA, UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA UNA DIHIDROPICOLINATO SINTETASA, UNA SECUENCIA DE ADN MEJORADO QUE CODIFICA DIAMINOPIMELATO DECARBOXILASA Y UNA UNA SECUENCIA DE ADN MEJORADO QUE CODIFICA ASPARTATO AMINOTRANSFERASA; UN METODO PARA LA PRODUCCION DE L - LISINA COMPRENDIENDO LOS PASOS DE CULTIVO DE LA BACTERIA CORINEFORME EN UN MEDIO APROPIADO PARA PERMITIR LA PRODUCCION Y ACUMULACION DE L - LISINA EN UN CULTIVO DE LA BACTERIA Y LA RECOLECCION DE L - LISINA DEL CULTIVO; Y UN ADN RECOMBINANTE UTILIZABLE PARA LA PRODUCCION DE LA BACTERIA CORINEFORME.

Description

Procedimiento de producción de L-lisina.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de L-lisina mediante el cultivo de un microorganismo obtenido mediante la modificación de una bacteria corineiforme, usada para la producción fermentativa de un aminoácido o similar mediante una técnica basada en la ingeniería genética.
La L-lisina, que se usa como aditivo en el forraje, se produce de forma habitual mediante un procedimiento fermentativo que usa una cepa mutante productora de L-lisina que pertenece a las bacterias corineiformes. Varias de las cepas de L-lisina que se conocen en la actualidad están creadas mediante mutaciones artificiales que parten de cepas de tipo salvaje que pertenecen a las bacterias corineiformes.
Al igual que para las bacterias corineiformes, se describe un vector de plásmido que se puede replicar de manera autónoma en las células bacterianas, y que tiene un gen marcador de resistencia al fármaco (ver la Patente de los Estados Unidos Nº 4.514.502), y un procedimiento para introducir un gen en células bacterianas (por ejemplo, la Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 2-207791). Se describe igualmente la posibilidad de cultivar bacterias productoras de L-treonina o L-isoleucina usando las técnicas descritas más arriba (ver por ejemplo las Patentes de los Estados Unidos Nº 4.452.890 y 4.442.208). Tal como para el cultivo de una bacteria productora de L-lisina, se conoce una técnica, en la que un gen que participa en la biosíntesis de la L-lisina se incorpora en un vector de plásmido para amplificar el gen en células bacterianas (por ejemplo, Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta 56-160997).
Entre los genes conocidos para la biosíntesis de la L-lisina se incluyen por ejemplo, un gen de la dihidrodipicolinato reductasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 7-75578) y un gen de la aspartato amino transferasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 6-102028) en el que se clona un gen que participa en la biosíntesis de la L-lisina, así como el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 60-87788), un gen de la dihidropicolinato sintasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 6-55149), y un gen de la diaminopimelato decarboxilasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 60-62994), en la que la amplificación de un gen afecta a la productividad de la L-lisina.
Al igual que para los enzimas que participan en la biosíntesis de la L-lisina, se conoce el caso de un enzima que experimenta inhibición por retroalimentación cuando se usa como tipo salvaje. En este caso, se estimula la productividad de la L-lisina introduciendo el gen de un enzima que tiene una mutación tal que se insensibiliza dicha inhibición por retroalimentación. Entre dichos genes conocidos se incluye de manera específica, por ejemplo, un gen de la aspartoquinasa (Documento de la Publicación Internacional WO 94/25605).
Tal como se ha descrito más arriba, se han obtenido algunos resultados exitosos mediante la amplificación de genes del sistema de la biosíntesis de la L-lisina, o la introducción de genes mutantes. Por ejemplo, una bacteria corineiforme, que alberga un gen mutante de la aspartoquinasa que insensibiliza la inhibición concertada mediante lisina y treonina, produce una cantidad considerable de L-lisina (aproximadamente 25 g/L). Sin embargo esta bacteria experimenta una disminución en su velocidad de crecimiento cuando se compara con una bacteria que alberga un gen no mutante de la aspartoquinasa. También se informa de que se mejora la productividad de la L-lisina introduciendo un gen de la dihidropicolinato sintasa además del gen mutante de la aspartoquinasa (Applied and Environmental Microbiology, 57(6), 1746-1752 (1991)). Sin embargo, dicha bacteria experimenta una disminución adicional en su velocidad de crecimiento.
Así como para el gen de la dihidrodipicolinato reductasa, se ha demostrado que la actividad de la dihidropicolinato reductasa se ve aumentada en una bacteria corineiforme en la que se ha introducido el gen, sin embargo, no se incluyen informes de la influencia sobre el rendimiento de la L-lisina (Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta
Nº 7-75578).
En las circunstancias presentes, no se conoce ningún caso de bacterias corineiformes en las que nadie haya tenido éxito en la mejora remarcable del rendimiento de la L-lisina sin restringir el crecimiento, combinando una variedad de genes para la biosíntesis de la L-lisina. No se ha informado de ningún caso en el que se pretenda aumentar el crecimiento mejorando a la vez un gen de la biosíntesis de la L-lisina.
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención es mejorar el rendimiento de la L-lisina de una bacteria corineiforme mediante el uso de materiales genéticos de secuencias de ADN que codifiquen la aspartoquinasa (denominada a partir de ahora en el presente documento como "AK", haciendo que un gen que codifica una proteína AK se denomine a partir de ahora en el presente documento como "lysC", si es necesario), la dihidrodipicolinato reductasa (denominada a partir de ahora en el presente documento como "DDPR", haciendo que un gen que codifica una proteína DDPR se denomine a partir de ahora en el presente documento como "dapB", si es necesario), la dihidrodipicolinato sintasa (denominada de manera abreviada a partir de ahora en el presente documento como "DDPS", haciendo que un gen que codifica una proteína DDPS se denomine a partir de ahora en el presente documento como dapA, si es necesario), la diaminopimelato decarboxilasa (denominada a partir de ahora en el presente documento como "DDC", haciendo que un gen que codifica una proteína DDC se denomine a partir de ahora en el presente documento como "lysA", si es necesario), y la aspartato aminotransferasa (denominada a partir de ahora en el presente documento como "AAT", haciendo que un gen que codifica una proteína AAT se denomine a partir de ahora en el presente documento como "aspC", si es necesario, que son enzimas importantes para la biosíntesis de la L-lisina en las células de las bacterias corineiformes.
El principio de la presente invención se basa en el hecho de que se puede mejorar el rendimiento de la L-lisina aumentando el lysC mutante (denominado simplemente a partir de ahora en el presente documento como "lysc mutante", si es necesario) que codifica la AK mutante (denominada simplemente a partir de ahora en el presente documento como "AK mutante", si es necesario) en el que se insensibiliza la inhibición concertada por la lisina y la treonina, dapA, dapB, lysA y aspC en combinación.
A saber, la presente invención proporciona un ADN recombinante que se puede replicar de manera autónoma en las células de la bacterias corineiformes, que comprende una secuencia de ADN que codifica una aspartoquinasa en la que se insensibiliza de manera sustancial la inhibición por retroalimentación de la L-lisina y L-treonina, una secuencia de ADN que codifica una dihidrodipicolinato reductasa, una secuencia de ADN que codifica la dihidrodipicolinato sintasa, una secuencia de ADN que codifica la diaminopimelato decarboxilasa, y una secuencia de ADN que codifica la aspartato aminotransferasa.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una bacteria corineiforme que alberga una aspartoquinasa en la que se insensibiliza de manera sustancial la inhibición por retroalimentación de la L-lisina y L-treonina, y que comprende una secuencia de ADN mejorada que codifica la dihidrodipicolinato reductasa, una secuencia de ADN mejorada que codifica la dihidrodipicolinato sintasa, una secuencia de ADN mejorada que codifica la diaminopimelato decarboxilasa y una secuencia de ADN mejorada que codifica la aspartato aminotransferasa.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para producir L-lisina que comprende las etapas de cultivar una cualquiera de las bacterias corineiformes descritas anteriormente en un medio apropiado para permitir producirse y acumularse a la L-lisina en un cultivo de la bacteria, y recoger la L-lisina a partir del cultivo.
La presente invención proporciona también un ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 31. Un ejemplo del ADN es un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos entre los números de nucleótido 879 a 2174 en una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 30.
La presente invención proporciona de manera adicional un vector pVK7 que se puede replicar de manera autónoma en las células de Escherichia coli y Brevibacterium lactofermentum, y que comprende un emplazamiento de clonación múltiple y lacZ'.
Las bacterias corineiformes a las que hace referencia la presente invención son un grupo de microorganismos que se definen en el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ª ed., p. 599 (1974), que son bastoncillos pequeños aerobios Gram-positivos no ácidos que no tienen capacidad de formación de esporas. Entre las bacterias corineiformes se incluyen bacterias que pertenecen al género Corynebacterium, bacterias que pertenecen al género Brevibacterium, que se habían clasificado hasta la fecha en el género Brevibacterium pero que se han unido a las bacterias que pertenecen al género Corynebacterium en la actualidad, y las bacterias que pertenecen al género Brevibacterium muy relacionada con las bacterias que pertenecen al género Corynebacterium.
De acuerdo con la presente invención, se puede mejorar el rendimiento de la L-lisina de las bacterias corineiformes.
Breve explicación de los dibujos
La Fig. 1 ilustra un procedimiento de construcción de los plásmidos p399AK9B y p399AKYB que comprenden el lysC mutante.
La Fig. 2 ilustra el proceso de construcción de un plásmido pDPRB que comprende dapB y Brevi.-ori.
La Fig. 3 ilustra el proceso de construcción de un plásmido pDPSB que comprende dapA y Brevi.-ori.
La Fig. 4 ilustra el proceso de construcción de un plásmido p299LYSA que comprende lysA.
La Fig. 5 ilustra el proceso de construcción de un plásmido pLYSAB que comprende lysA y Brevi.-ori.
La Fig. 6 ilustra el proceso de construcción de un plásmido PCRCAB que comprende lysC, dapB y Brevi.-ori.
La Fig. 7 ilustra el proceso de construcción de un plásmido pCB que comprende los mutantes lysC y dapB.
La Fig.8 ilustra un proceso de construcción de un plásmido pAB que comprende dapA, dapB y Brevi.-ori
La Fig.9 ilustra un proceso de construcción de un plásmido pCAB que comprende lysC, dapA, dapB, y Brevi.-ori.
La Fig. 10 ilustra un proceso de construcción de un plásmido pCABL que comprende los mutantes lysC, dapA, dapB, lysA, y Brevi.-ori
La Fig. 11 ilustra el proceso de construcción de nuevos vectores de clonación para bacterias corineiformes, pVK6 y pVK7,
La Fig. 12 ilustra un proceso de construcción de un plásmido pOm que comprende aspC.
La Fig. 13 ilustra dos ORF en un fragmento de ADN cromosómico ATCC 13869.
La Fig. 14 ilustra un proceso de construcción de pORF1.
Descripción detallada de la invención <1> Preparación de los genes para la biosíntesis de la L-lisina usados para la presente invención
Los genes para la biosíntesis de la L-lisina usados en la presente invención se obtienen de forma respectiva preparando ADN cromosómico procedente de una bacteria como donante de ADN, construyendo una biblioteca de ADN cromosómico usando un vector de plásmido, o similar, seleccionando una cepa que alberga un gen deseado, y recuperando, a partir de dicha cepa seleccionada, ADN recombinante en el que se ha insertado el gen. El ADN donante del gen para la biosíntesis de la L-lisina usado en la presente invención no está limitado de manera específica, siempre que el gen deseado para la biosíntesis de la L-lisina exprese una proteína enzimática que funcione en las células de las bacterias corineiformes. Sin embargo, se prefiere que el ADN donante proceda de una bacteria corineiforme.
Todos los genes lysC, dapA, dapB y lysA que se originan a partir de bacterias corineiformes tienen secuencias conocidas. De acuerdo con ello, se pueden obtener llevando a cabo su amplificación de acuerdo con el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase White, T. J. y col., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
Cada uno de los genes para la biosíntesis de la L-lisina usados en la presente invención se puede obtener de acuerdo con algunos procedimientos como los que se ejemplifican a continuación.
(1) Preparación del lysC mutante
Se puede preparar un fragmento de ADN que contiene el lysC mutante a partir de una cepa mutante en la que se ha insensibilizado de forma sustancial la inhibición sinérgica por retroalimentación mediante L-lisina y L-treonina (Documento Internacional de Publicación WO 94/25605). Dicha cepa mutante se puede obtener, por ejemplo, a partir de un grupo de células originadas a partir de una cepa de tipo salvaje de una bacteria corineiforme sometida a un tratamiento de mutación aplicando un tratamiento de mutación ordinario tal como irradiación con ultravioleta y tratamiento con un agente mutagénico tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Se puede medir la actividad de AK usando un procedimiento descrito por Miyajima, R. y col. en The Journal of Biochemistry (1968), 63(2), 139-148. El más preferido es aquel en el que una cepa mutante está representada por una bacteria productora de L-lisina AJ3445 (FERM P-1944) derivada mediante un tratamiento de mutación de una cepa de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (que ha cambiado su nombre en la actualidad por el de Corynebacterium glutamicum).
De manera alternativa, se puede obtener también el lysC mutante mediante un tratamiento de mutación in vitro con un ADN de plásmido que contenga el lysC de tipo salvaje. En otro aspecto, se conoce de forma específica la información sobre la mutación para insensibilizar la inhibición por retroalimentación sinérgica de AK mediante L-lisina y L-treonina (Documento Internacional de Publicación de WO 94/25605). De acuerdo con ello, se puede obtener también el lysC mutante a partir del lysC de tipo salvaje en función de la información de acuerdo con, por ejemplo, el procedimiento de mutagénesis dirigida al emplazamiento.
Se puede aislar un fragmento que comprende lysC a partir de una bacteria corineiforme preparando ADN cromosómico de acuerdo con, por ejemplo, un procedimiento de Saito y Miura (H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)), y amplificar el lysC de acuerdo con el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase White, T. J. y col., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
Los cebadores de ADN se ejemplifican mediante un ADN de cadena simple de 23-mer y 21-mer que tienen la secuencia de nucleótidos que se muestra en las SEC. DE ID. N^{os}: 1 y 2 del listado de secuencias con el objetivo de amplificar, por ejemplo, una región de aproximadamente 1.643 pb que codifica el lysC basándose en una secuencia conocida de Corynebacterium glutamicum (véase Molecular Microbiology (1991), 5 (5), 1197-1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). Se puede sintetizar el ADN de acuerdo con un procedimiento ordinario usando un sintetizador de ADN modelo 380B producido por Applied Biosystems y usando el procedimiento de la fosfoamidita (véase Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). Se puede llevar a cabo la PCR usando el ADN Thermal Cycler Model PJ2000 producido por Takara Shuzo, y usando la polimerasa Taq ADN de acuerdo con un procedimiento establecido por el suministrador.
Se prefiere que el lysC amplificado mediante PCR se enlace con un vector de ADN que se pueda replicar de manera autónoma en células de E. coli y/o bacterias corineiformes para preparar ADN recombinante, y que el ADN recombinante se introduzca en las células de E. coli anteriores. Dicha condición facilita las operaciones posteriores. El vector que se puede replicar de manera autónoma en células de E. coli es de forma preferible un vector de plásmido que de manera preferible se puede replicar de manera autónoma en células de un huésped, entre los que se incluyen por ejemplo pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, y RSF1010.
Cuando se inserta en dichos vectores un fragmento de ADN que tiene la capacidad de permitir que un plásmido se pueda replicar de manera autónoma en bacterias corineiformes, se puede usar como un así llamado vector lanzadera que se puede replicar de manera autónoma tanto en E. coli como en bacterias corineiformes.
Dicho vector lanzadera incluye lo siguiente: se muestran los microorganismos que albergan cada uno de los vectores con números de acceso en las autoridades internacionales de depósito (entre paréntesis):
pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM PB-3532)
pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM PB-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)
pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM PB-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)
pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM PB-138)
pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)
pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM PB-140).
Estos vectores se pueden obtener como sigue a partir de los microorganismos depositados. Las células recogidas en la fase de crecimiento logarítmico se lisaron usando lisozima y SDS, seguido de la separación de un lisato mediante centrifugación a 30.000 X g para obtener un sobrenadante. Se añadió a este sobrenadante polietilén glicol, seguido por fraccionamiento y purificación mediante una centrifugación en gradiente de densidades en equilibrio de cloruro de cesio - bromuro de etidio.
Se puede transformar la E. coli introduciendo un plásmido de acuerdo con, por ejemplo, un procedimiento de D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) o un procedimiento en el que las células receptoras se tratan con cloruro de calcio para aumentar su permeabilidad al ADN (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Se obtiene la lysC de tipo salvaje cuando se aísla la lysC a partir de una cepa de AK de tipo salvaje, a la vez que se obtiene lysC mutante cuando se aísla la lysC a partir de una cepa de AK mutante de acuerdo con el procedimiento que se ha descrito más arriba.
Un ejemplo de una secuencia de nucleótido de un fragmento de ADN que contiene el lysC de tipo salvaje se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 3 en el Listado de Secuencias. La secuencia de aminoácidos de \alpha-subunidades de una proteína AK de tipo salvaje se deduce de la secuencia de nucleótidos, y se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 4 en el Listado de Secuencias junto con la secuencia de ADN. Sólo se muestra la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 5. Se deduce una secuencia de aminoácidos de \beta-subunidades de una proteína AK de tipo salvaje a partir de la secuencia de nucleótidos del ADN, y se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 6 en el Listado de Secuencias junto con la secuencia de ADN. Sólo se muestra la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 7. En cada una de las subunidades, se usa GTG como codón de iniciación, y se representa un aminoácido correspondiente por la metionina. Sin embargo, esta representación se refiere a metionina, valina, o formilmetionina.
El lysC mutante usado en la presente invención no se limita de manera específica siempre que codifique una AK en la que se haya insensibilizado la inhibición por retroalimentación sinérgica mediante L-lisina y L-treonina. Sin embargo, el lysC mutante se ejemplifica mediante una que incluya una mutación en la que un residuo de aminoácido correspondiente al residuo de alanina 279º que cuenta con un N-terminal se cambie por un residuo de aminoácido diferente a la alanina y diferente a un aminoácido ácido en la \alpha-subunidad, y que un residuo de aminoácido correspondiente al residuo de alanina 30º que cuenta con un N-terminal se cambie por un residuo de aminoácido diferente a la alanina y diferente a un aminoácido ácido en la \beta-subunidad, de la secuencia de aminoácidos de la AK de tipo salvaje. La secuencia de aminoácidos de la AK de tipo salvaje incluye de forma específica la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 5 en el Listado de Secuencias como las \alpha-subunidades, y la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC. DE ID. Nº: 7 en el Listado de Secuencias como las \beta-subunidades.
Se prefieren aquellos residuos de aminoácidos diferentes a la alanina y diferentes de los aminoácidos ácidos, e incluyen residuos de treonina, arginina, cisteína, fenilalanina, prolina, serina, tirosina, y valina.
El codón correspondiente a un residuo de aminoácido a sustituir no está limitado de forma específica por su tipo, siempre que codifique el residuo de aminoácido. Se prefiere que la secuencia de aminoácidos de la AK de tipo salvaje sea ligeramente diferente dependiendo de la diferencia de especie bacteriana y de cepa bacteriana. Los AK que tienen mutaciones basadas en, por ejemplo, sustitución, delección, o inserción de uno o más residuos de aminoácidos en una o más posiciones irrelevantes para la actividad enzimática según se ha descrito más arriba, se pueden usar también para la presente invención. Se puede obtener un ADN que codifique un AK que tenga una mutación espontánea aislando un ADN que se puede hibridar con, por ejemplo, el ADN que tenga parte de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 3 con la condición restrictiva. Por "condición restrictiva" definida en el presente documento se entiende una condición bajo la cual se forma un híbrido específico, y no se forma un híbrido no específico. Es difícil expresar la condición de forma clara con valores numéricos. Sin embargo, la condición se ejemplifica con una condición bajo la cual, los ácidos nucleicos que muestran elevada homología, por ejemplo ADN con una homología de no menos el 90% se hibridan entre sí, mientras que los ácidos nucleicos que muestran una homología inferior a la señalada no se hibridan entre sí, o una condición de una temperatura procedente de la temperatura de fusión (Tm) de un híbrido completamente emparejado de (Tm-30)ºC, de manera preferible comprendida entre Tm y (Tm-20)ºC y una concentración de sal correspondiente a 1 X SSC, de manera preferible 0,1 X SSC.
Se pueden usar también otros AK, que tienen una mutación artificial basada en por ejemplo, sustitución, delección, o inserción de uno o más residuos de aminoácidos siempre que no tengan influencia sustancial sobre la actividad de AK, y sobre la insensibilización de la inhibición por retroalimentación sinérgica mediante L-lisina y L-treonina. Se puede obtener un ADN que codifica AK que tenga la mutación artificial modificando la secuencia de nucleótidos para la sustitución, delección, o inserción dada en un emplazamiento específico mediante, por ejemplo, mutagénesis específica del emplazamiento. Igualmente, se puede usar una lysC que tenga una mutación mediante tratamiento mutagénico conocido. Entre los tratamientos mutagénicos se incluyen tratamiento in vitro de un ADN que contenga lysC con hidroxialanina o similar, y tratamiento de un microorganismo que albergue un ADN que contenga lysC con un mutágeno tal como irradiación con ultravioleta o un agente mutagénico usado para mutagénesis artificial ordinaria tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o ácido nítrico. Tras el tratamiento mutagénico, se puede determinar el emplazamiento en el que se introduce la mutación o en el que la mutación tiene lugar seleccionando un ADN o un microorganismo que codifique o produzca la AK que tenga la actividad AK y cuya secuencia de aminoácidos se haya mutado a partir del ADN sometido a tratamiento mutagénico o el microorganismo sometido a tratamiento mutagénico. El emplazamiento en el que se produce la mutación no se restringe de manera específica siempre que no ejerza influencia sustancial sobre la actividad de AK y sobre la insensibilización a la inhibición por retroalimentación. El número de mutaciones introducidas varía dependiendo del emplazamiento y del tipo de aminoácido mutado en la estructura estérica de una proteína, y no se restringe de manera específica siempre que no ejerza influencia sustancial sobre la actividad de la AK y sobre la insensibilización a la inhibición por retroalimentación. Este número está normalmente comprendido entre 1 y 20, de manera preferible entre 1 y 10.
Se puede determinar fácilmente por una persona experta en la técnica un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de alanina especificado en la secuencia de aminoácidos de AK que tiene la mutación tal como se ha descrito anteriormente
Se ha depositado una cepa AJ12691 obtenida mediante introducción de un plásmido lysC mutante p399AK9B en una cepa AJ12036 (FERM PB-734) como una cepa de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum el 10 de abril de 1992 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Technology del Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japón), con el número de acceso FERM P-12918 y se ha transferido a depósito internacional basado en el Tratado de Budapest el 10 de febrero de 1995, y depositado con el número de acceso FERM PB-4999.
(2) Preparación del dapB
Se puede preparar un fragmento de ADN que contiene el dapB a partir del cromosoma de una bacteria corineiforme mediante PCR. El donante de ADN no se limita de manera específica, sin embargo, se ejemplifica mediante la cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Se conoce una secuencia que codifica la DDPR para Brevibacterium lactofermentum (Journal of Bacteriology, 175 (9), 2743-2749 (1993)), en función de que se pueden preparar los cebadores de ADN para la PCR. Dichos cebadores de ADN se ejemplifican de manera específica por los ADN de 23-mers que tienen secuencias de nucleótidos de manera respectiva representadas en las SEC DE ID N^{os}. S: 8 y 9 del Listado de Secuencias. Se pueden llevar a cabo la síntesis de ADN, la PCR y la preparación de un plásmido que contiene el dapB obtenido de la misma manera que para el lysC descrito más arriba.
Se ilustran en la SEC DE ID Nº: 10 una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene dapB y una secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos. Únicamente se muestra la secuencia de aminoácidos en la SEC DE ID Nº: 11. De manera adicional a los fragmentos de ADN que codifican esta secuencia de aminoácidos, se pueden usar de manera equivalente los fragmentos de ADN de esta invención para las secuencias de aminoácidos que son sustancialmente la misma que la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 11, a saber, secuencias de aminoácidos que tienen mutaciones basadas en, por ejemplo, sustitución, delección o inserción de uno o más amino ácidos siempre que no haya influencia sustancial sobre la actividad de DPR. Se puede obtener el dapB que tiene mutaciones espontáneas o artificiales de la misma manera que los que codifican el ADN de AK que tienen mutaciones que no ejercen influencia sobre la actividad de AK y sobre la insensibilización de la inhibición por retroalimentación sinérgica mediante L-lisina y L-treonina.
Una cepa transformante AJ13107 obtenida mediante la introducción del plásmido pCRDAPB que contiene dapB que se obtiene en el ejemplo descrito más adelante sobre la cepa de E. coli JM109 está desde el 26 de Mayo de 1995 en depósito internacional en el Nacional Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Tecnology del Ministry of Internacional Trade and Industry (1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japón) bajo el número de acceso FERM BP-5114 basado en el Tratado de Budapest.
(3) Preparación de dapA
Se puede preparar un fragmento de ADN que contiene dapA a partir del cromosoma de una bacteria corineiforme mediante PCR. El donante de ADN no se limita de manera específica, sin embargo, se ejemplifica mediante la cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Se conoce una secuencia de ADN que codifica DDPS para Corynebacterium glutamicum (véase Nucleic Acids Research, 18 (21), 6421 (1990); EMBL Nº de acceso X53993), en función de la cual se pueden preparar cebadores de ADN para la PCR. Dichos cebadores de ADN se ejemplifican de forma específica mediante ADN de 23-mers que de manera respectiva tienen la secuencia de nucleótidos que se muestra en las SEC. DE ID. N^{os}. 12 y 13 en el Listado de Secuencias. Se pueden llevar a cabo la síntesis de ADN, la PCR, y la preparación de un plásmido que contiene dapA de la misma forma que se ha descrito para el lysC descrito más arriba.
Se ejemplifican una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene el dapA, y una secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos en la SEC. DE ID. Nº: 14, Se muestra únicamente la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 15. de manera adicional a los fragmentos de ADN que codifican esta secuencia de aminoácidos, la presente invención puede usar de manera equivalente fragmentos de ADN que codifican de manera sustancial las mismas secuencias de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 15, a saber, las secuencias de aminoácidos que tienen mutaciones basadas en, por ejemplo, sustitución, delección, o inserción de uno o más aminoácidos siempre que no exista influencia sustancial sobre la actividad de DDPS. Se puede obtener el dapA que tiene mutación espontánea o artificial de la misma manera que la del ADN que codifica la AK que tiene la mutación que no ejerce influencia sobre la actividad de AK y sobre la insensibilización por retroalimentación sinérgica mediante L-lisina y L-treonina.
Una cepa transformante AJ13106 obtenida mediante la introducción del plásmido pCRDAPA que contiene dapA que se obtiene en el ejemplo descrito más adelante sobre la cepa de E. coli JM109 está desde el 26 de Mayo de 1995 en depósito internacional en el Nacional Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Tecnology del Ministry of Internacional Trade and Industry (1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japón) bajo el número de acceso FERM BP-5113 basado en el Tratado de Budapest.
4) Preparación de lysA
Se puede preparar un fragmento de ADN que contiene lysA a partir del cromosoma de una bacteria corineiforme mediante PCR. El donante de ADN no se limita de manera específica, sin embargo, se ejemplifica mediante la cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
En la bacteria corineiforme, lysA forma un operón conjuntamente con argS (gen de la arginil ARNt-sintasa), y lysA se encuentra corriente debajo de argS La expresión de lysA se regula mediante un promotor que existe corriente arriba de argS (véase Journal of Bacteriology, Nov., 7356-7362 (1993)). Se conocen las secuencias de estos genes para Corynebacterium glutamicum (véase Molecular Microbiology, 4 (11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)), en función de qué cebadores de ADN se pueden preparar para la PCR. Dichos cebadores de ADN se ejemplifican de manera específica mediante los ADN de 23-mers que tienen de manera respectiva las secuencias de nucleótidos que se muestran en la SEC DE ID Nº: 16 del Listado de Secuencias (que corresponden a los números de nucleótido 11 a 33 en una secuencia de nucleótidos descrita en Molecular Microbiology, 4 (11), 1819-1830 (1990)) y la SEC DE ID Nº: 17 (que corresponde a los números de nucleótido 1370 a 1392 en una secuencia de nucleótidos descrita en Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)). Se puede llevar a cabo la síntesis de ADN, la PCR y la preparación del plásmido que contiene el lysA obtenido de la misma manera que la descrita más arriba para lysC.
En el Ejemplo descrito más adelante se usaron, un fragmento de ADN que contiene un promotor, argS y lysA con el fin de mejorar lysA. Sin embargo, argS no es esencial para la presente invención. Es permisible usar un fragmento de ADN en el que lysA se enlace justamente corriente debajo de un promotor.
Se ejemplifica una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene argS, y lysA, y una secuencia de aminoácidos deducida que se debe codificar mediante la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 18. Se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos codificada por argS en la SEC. DE ID. Nº: 19, y se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos codificada por lysA en la SEC. DE ID. Nº: 20. Además de los fragmentos de ADN que codifican estas secuencias de aminoácidos la presente invención puede usar de forma equivalente fragmentos de ADN que codifiquen secuencias de aminoácidos que sean sustancialmente las mismas que las secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEC. DE ID. Nº: 20, a saber, secuencias de aminoácidos que tengan mutaciones basadas en, por ejemplo, sustitución, delección o inserción de uno o más aminoácidos, siempre que no tengan una influencia sustancial sobre la actividad de DDC. Se puede obtener un lysA que tenga mutaciones espontáneas o artificiales de la misma manera que el ADN que codifica un AK que tenga una mutación que no ejerza influencia sobre la actividad AK y sobre la insensibilización de la inhibición por retroalimentación sinérgica mediante L-lisina y L-treonina.
(5) preparación de aspC
Se puede preparar un fragmento de ADN que contiene aspC a partir de una biblioteca de genes preparada a partir del cromosoma de un microorganismo tal como una bacteria corineiforme y una bacteria que pertenece al género Escherichia usando como indicación la complementariedad en una propiedad auxotrofa de una cadena deficiente en AAT. El donante de ADN de la bacteria corineiforme no está limitado de manera específica, sin embargo, esto se ejemplifica por la cepa ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum. El donante de ADN de la bacteria que pertenece al género Escherichia no está específicamente limitado, sin embargo, esto se ejemplifica por la cepa JM109 de E. coli.
De manera específica, se conoce un procedimiento para preparar el aspC de una bacteria corineiforme (Publicación de patente Japonesa Nº 6-102028) y se puede preparar aspC de acuerdo con este procedimiento.
Se conoce una secuencia que codifica el AAT de E. coli (Kuramitsu, S. y col., J. Biochem., 97 (4), 1259-1262 (1985)), en función de cuáles cebadores de la PCR se pueden preparar. Dichos cebadores se ejemplifican de manera específica mediante el ADN de 20-mers que tiene las secuencias de nucleótidos de manera respectiva representadas en las SEC DE ID N^{os}.: 21 y 22 en el Listado de Secuencias. Se pueden llevar a cabo la síntesis de ADN, la PCR, y la preparación de un plásmido que contiene el aspC obtenido de la misma manera que la descrita más arriba para lysC.
Se ilustra una secuencia de un fragmento de ADN que contiene aspC, y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 23. Únicamente se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 11, y se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos codificada lysA en la SEC. DE ID. Nº: 24. Se ilustran otra secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene aspC y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos en la SEC DE ID Nº: 30. Únicamente se muestra la secuencia de aminoácidos en la SEC DE ID Nº: 31. De manera adicional a los fragmentos de ADN que codifican esta secuencia de aminoácidos, la presente invención puede usar de manera equivalente fragmentos de ADN que codifican de manera sustancial las mismas secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEC DE ID Nº: 24 ó 31, a saber, las secuencias de aminoácidos que tienen mutaciones basadas en, por ejemplo, sustitución, delección o inserción, de uno o más aminoácidos siempre que no exista influencia sustancial sobre la actividad de AAT. Se puede obtener un aspC que tenga mutaciones espontáneas o artificiales de la misma manera que el ADN que codifica un AK que tenga una mutación que no ejerza influencia sobre la actividad de AK y sobre la insensibilización de la inhibición por retroalimentación sinérgica mediante L-lisina y
L-treonina.
El aspC que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº:30 se origina a partir de Corynebacterium lactofermentum, y se ha obtenido en primer lugar de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 9 descrito a continuación por la presente invención. De esta manera, la presente invención proporciona un ADN que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 31. Un ejemplo del ADN incluye un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de número de nucleótido 879 a 2174 en una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 30.
<2> ADN recombinante y bacterias corineiformes de la presente invención
Las bacterias corineiformes de la presente invención albergan una aspartoquinasa (AK mutante) en la que se ha insensibilizado de manera sustancial la inhibición por retroalimentación sinérgica mediante L-lisina y L-treonina, mientras que se ha estimulado la secuencia de ADN que codifica una dihidrodipicolinato reductasa, la secuencia de ADN que codifica una dihidrodipicolinato sintasa, la secuencia de ADN que codifica una diaminopimelato decarboxilasa y el ADN que codifica una aspartato aminotransferasa.
El término "mejora" en el presente documento hace referencia al hecho que la actividad intracelular de un enzima codificado por el ADN se aumenta mediante, por ejemplo, incrementar el número de copias de un gen, usando un promotor fuerte, usando un gen que codifica un enzima con una elevada actividad específica, o combinando estos procedimientos.
La bacteria corineiforme que alberga la AK mutante se puede elegir entre las que producen la aspartoquinasa mutante como resultado de una mutación, o las que hayan sido transformadas mediante la introducción de un lysC mutante.
Entre los ejemplos de bacterias corineiformes usadas para introducir el ADN descrito más arriba se incluyen, por ejemplo, las siguientes cepas de tipo salvaje productoras de lisina:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991;
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;
(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM PB-1539).
Se pueden usar otras aparte de las cepas bacterianas descritas más arriba, las que se pueden usar como huésped incluyen por ejemplo, cepas mutantes que tengan una capacidad productora de L-lisina derivada de las cepas anteriormente mencionadas. Entre dichas cepas artificiales mutantes se incluyen las siguientes: S-(2-aminoetil)-cisteína (a partir de ahora en el presente documento abreviada como "AEC") cepas mutantes resistentes (por ejemplo, Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147), Publicación de Patente Japonesa con números. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437, y 7-112438); cepas mutantes que requieren para su crecimiento aminoácidos tales como L-homoserina (Publicaciones de Patente Japonesa con números. 48-28078 y 56-6499); cepas mutantes que presentan resistencia a AEC y requieren aminoácidos tales como L-leucina, L-homoserina, (Publicaciones de Patente Japonesa N^{os} 48-28078 y 56-6499); cepas mutantes que presentan resistencia a AEC y requieren aminoácidos tales como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina, y L-valina (Patentes de los Estados Unidos con números 3.708.395 y 3.825.472); cepas mutantes productoras de L-lisina que presentan resistencia a DL-\alpha-amino-\varepsilon-caprolactama, \alpha-amino-laurilactama, análogos de aspartato, sulfa fármacos, quinoides, y N-lauroil leucina; cepas mutantes productoras de L-lisina que presentan resistencia a inhibidores de la oxialoacetato decarboxilasa o enzimas del sistema respiratorio (Solicitudes de Patente Japonesa abierta a consulta Nº. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 y 56-39778, y Publicaciones de Patente Japonesa con números. 53-43591 y 53-1833); cepas mutantes productoras de L-lisina que requieren inositol o ácido acético (Solicitudes de Patente Japonesa abiertas a consulta Nº. 55-9784 y 56-8692); cepas mutantes productoras de L-lisina que muestran sensibilidad al ácido fluoropirúvico o a temperatura no inferior a 34ºC (Solicitudes de Patente Japonesa abiertas a consulta N^{os} 55-9783 y 53-86090); y cepas mutantes productoras que pertenezcan a los géneros Brevibacterium o Corynebacterium que presenten resistencia a etilén glicol y produzcan L-lisina (Patente de los Estados Unidos Nº 4.411.997).
En una forma de realización específica, con el fin de estimular los genes de la biosíntesis de la L-lisina en los huéspedes tal como se ha descrito más arriba, los genes se introducen en el huésped mediante un vector de plásmido, transposón o vector de fago o similar. Tras la introducción, se espera que se produzca mejora en cierta extensión, incluso usando un vector de bajo tipo de copia. Sin embargo, se prefiere usar un vector de múltiple tipo de copia. Entre dichos vectores se incluyen, los vectores de plásmido, pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148, y pAJ440 que se describen más arriba. Además, los transposones derivados de bacterias corineiformes se describen en los Documentos Internacionales de Publicación WO 02/02627 y WO 93/18151, en la Publicación de Patente Europea Nº 445385, en la Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 6-46867, en Vertes, A. A. y col., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994), en Bonamy, C., y col., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994), en Vertes, A. A. y col., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994), en Jagar, W. y col., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995), en la Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 7-107976, en la Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 7-327680 y similares.
En la presente invención, no es indispensable que se mejore de forma específica el lysC mutante. Se permite el uso de aquellas que tengan una mutación en el lysC del ADN cromosómico o en el que se incorpore el lysC mutante en el ADN cromosómico. De manera alternativa, se puede introducir el lysC mutante mediante el uso de un vector de plásmido. Por otra parte, se prefiere mejorar dapA y dapB, lysA, y aspC con el fin de producir L-lisina de manera eficiente.
Se pueden introducir cada uno de los genes de lysC, dapA, dapB, lysA, y aspC de forma sucesiva en el huésped usando vectores diferentes, de manera respectiva. De manera alternativa, se pueden introducir conjuntamente dos, tres, cuatro o cinco especies de genes usando un vector único. Cuando se usan vectores diferentes, los genes se pueden introducir en cualquier orden, sin embargo, se prefiere el uso de vectores que tengan un mecanismo estable de compartir y alojar en el huésped, y que sean capaces de coexistir entre sí.
De manera particular, como vector para introducir el aspC en la bacteria corineiforme, se usa de manera preferible un vector pVK7. El vector pVK7 es un vector de clonación de la bacteria corineiforme proporcionado por la presente invención, que se puede replicar de manera autónoma en las células de Escherichia coli y Brevibacterium lactofermentum, y que comprende un emplazamiento de clonación múltiple y lacZ'. Se puede construir el vector pVK7 de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 8 descrito a continuación.
Se puede obtener una bacteria corineiforme que alberga la AK mutante y que comprende además dapB, dapA, lysA y aspC por ejemplo mediante la introducción en una bacteria corineiforme huésped, de un ADN recombinante que contiene lysC y dapB, dapA, lysA y aspC mutantes que se puede replicar de manera autónoma en las células de las bacterias corineiformes.
Se pueden obtener los ADN recombinantes mencionados mas arriba, por ejemplo, insertando cada uno de los genes que participan en la biosíntesis de la L-lisina en un vector tal como un vector de plásmido, transposón o vector de fago, como se ha descrito más arriba.
En el caso de que se use un plásmido como vector, el ADN recombinante se puede introducir en el huésped de acuerdo con el procedimiento del pulso eléctrico (Sugimoto y col., Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 2-207791). Se puede llevar a cabo la amplificación del gen usando transposones mediante la introducción de un plásmido que trasporta un transposón al interior de la célula huésped, e induciendo la transposición del transposón.
En las bacterias corineiformes usadas en la presente invención, se pueden mejorar un gen que participa en la biosíntesis de la L-lisina tal como una secuencia de ADN que codifica una fosfoenolpiruvato carboxilasa y una secuencia de ADN que codifica una diaminopimelato deshidrogenada de manera adicional a los genes mencionados más arriba.
<3> Procedimiento para la producción de L-lisina
Se puede producir L-Lisina de manera eficiente mediante el cultivo, en un medio apropiado de una bacteria corineiforme que comprende los genes mejorados de la biosíntesis de la L-lisina que se describen más arriba, para permitir que se produzca y acumule la L-lisina en el cultivo de la bacteria, y recoger la L-lisina del cultivo.
El medio a usar se ejemplifica mediante un medio ordinario que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y de manera opcional otros componentes orgánicos
Como fuente de carbono, es posible utilizar azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas, y almidón hidrolizado; y ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico, y ácido succínico.
Como fuente de nitrógeno, es posible utilizar sales de amonio inorgánico tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, y fosfato de amonio; nitrógeno orgánico tales como hidrolizado de soja; amoniaco gas; y amoniaco acuoso.
Como nutrientes orgánicos traza, es deseable contener sustancias necesarias tales como vitamina B_{1}, y L-homoserina o extracto de levadura o similar, en cantidades apropiadas. Además de los anteriores, si es necesario se pueden añadir pequeñas cantidades de fosfato de potasio, sulfato de magnesio, ión hierro e ión manganeso.
Es preferible llevar a cabo los cultivos en condiciones aerobias durante aproximadamente 30 a 90 horas. La temperatura de cultivo se controla de manera preferible entre 25ºC y 37ºC, y el pH se controla de manera preferible entre 5 y 8 durante el cultivo. Para el ajuste del pH se pueden usar sustancias inorgánicas u orgánicas, ácidas o alcalinas, o amoniaco gaseoso o similares. Se puede recoger la L-lisina de los cultivos combinando un procedimiento ordinario de resina de intercambio iónico, un procedimiento de precipitación, y otros procedimientos conocidos.
Ejemplos
La presente invención se explicará de forma más específica con referencia a los Ejemplos.
Ejemplo 1 Preparación del gen lysC de tipo salvaje y el gene lysC mutante procedentes de Brevibacterium lactofermentum <1> Preparación de los lysC de tipo salvaje y mutante, y preparación de los plásmidos que los contienen
Se usaron como donantes de ADN cromosómico una cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, y una cepa mutante productora de L-lisina AJ3445 (FERM P-1944) obtenida a partir de la cepa ATCC 13869 mediante un tratamiento de mutación. Se sometió la cepa AJ3445 a mutación de forma que se cambió el lysC para implicar insensibilización sustancial de la inhibición concertada mediante L-lisina y L-treonina (Journal of Biochemistry, 68, 701-710 (1970)).
Se amplificó un fragmento de ADN que contiene el lysC a partir de ADN cromosómico de acuerdo con el procedimiento de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa); véase White, T. J. y col., Trends Genet., 5, 185 (1989)). Al igual que para los cebadores de ADN usados para la amplificación, se sintetizaron ADN de cadena única de 23-mer y 21-mer que tienen la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEC. DE ID. N^{os}: 1 y 2 con el fin de amplificar una región de aproximadamente 1.643 pb que codifican el lysC en función de una secuencia conocida del Corynebacterium glutamicum (véase Molecular Microbiology (1991), 5 (5), 1197-1204; y Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). Se sintetizó el ADN de acuerdo con un procedimiento ordinario usando un sintetizador de ADN modelo 380B producido por Applied Biosystems y usando el procedimiento de la fosfoamidita (véase Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).
El gen se amplificó por PCR usando un ADN Thermal Cycler Model PJ2000 producido por Takara Shuzo, y usando polimerasa Taq ADN de acuerdo con un procedimiento diseñado por el fabricante. Se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa el fragmento de gen amplificado de 1.643 kb. Tras de eso, el fragmento retirado del gel se purificó de acuerdo con un procedimiento ordinario, y se digirió con los enzimas de restricción NruI (producido por Takara Shuzo) y EcoRI (producido por Takara Shuzo).
Se usó el pHSG399 (ver Takeshita, S. y col., Gene (1987), 61, 63-74) como vector de clonación para el fragmento de gen. El pHSG399 se digirió con los enzimas de restricción SmaI (producido por Takara Shuzo) y EcoRI, y se usó unido con el fragmento amplificado de lysC. Se enlazó el ADN usando un kit de enlace de ADN (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Una vez preparados los plásmidos, en los que los fragmentos de lysC amplificados de cromosomas procedentes de Brevibacterium lactofermentum se ligaron con pHSG399, de manera respectiva. El plásmido que comprendía lysC procedente de ATCC 13869 (cepa de tipo salvaje) se designó como p399AKY, y el plásmido que comprendía lysC procedente de AJ3463 (bacteria productora de L-lisina) se designó como p399AK9.
Se introdujo un fragmento de ADN (denominado a partir de ahora en el presente documento como "Brevi.-ori") que tiene la capacidad de fabricar un plásmido que se puede replicar de manera autónoma en una bacteria que pertenece al género Corynebacterium en p399AKI y p399AK9 de forma respectiva para preparar plásmidos que contienen lysC que se puede replicar de manera autónoma en bacterias que pertenecen al género Corynebacterium. Se preparó Brevi.-ori a partir de un vector de plásmido pHK4 que contiene el Brevi.-ori y que se puede replicar de manera autónoma en células tanto de Escherichia coli como pertenecientes al género Corynebacterium. Se preparó el pHK4 digiriendo el pHC4 con KpnI (producido por Takara Shuzo) y BamHI (producido por Takara Shuzo), extrayendo un fragmento Brevi.-ori y ligándolo con pHSG298 que se había digerido también con KpnI y BamHI (ver Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 5-7491). El pHK4 proporciona resistencia a la kanamicina a un huésped. La Escherichia coli que alberga pHK4 se denominó como Escherichia coli AJ13136, y se depositó el 1 de agosto de 1995 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Technology del Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japón) bajo el número de acceso FERM
PB-5186.
El pHK4 se digirió con los enzimas de restricción KpnI y BamHI, y se enromaron los extremos rotos. La formación de los extremos enromados se llevó a cabo usando un ADN Blunting kit (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la formación de los extremos romos, se ligó un ligante BamHI (producido por Takara Shuzo) para hacer una modificación tal que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori se pudiera cortar del pHK4 mediante digestión con únicamente BamHI. Se digirió este plásmido con BamHI, de forma respectiva, y el fragmento Brevi.-ori de ADN generado se ligó con p399AKY y p399AK9 que se habían digerido también con BamHI de forma respectiva para preparar plásmidos, que contuviera cada uno el gen lysC que se puede replicar de manera autónoma en bacterias que pertenecen al género Corynebacterium.
El plásmido que contiene el gen de lysC de tipo salvaje originado en p399AKI se denominó como p399AKYB, y el plásmido que contiene el gen de lysC mutante originado en p399AK9 se denominó como p399AK9B. En la Fig. 1 se muestra el procedimiento de construcción de p399AK9B y p399AKYB. Una cepa de AJ12691 obtenida por introducción del plásmido p399AK9B con lysC mutante en una cepa de Brevibacterium lactofermentum (cepa AJ12036, FERM PB-734) de tipo salvaje se depositó el 10 de abril de 1992 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Technology del Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japón), bajo el número de acceso FERM P-12918, y transferido a un depósito internacional basado en el Tratado de Budapest el 10 de Febrero de 1995, y depositado bajo el número de acceso FERM PB-4999.
<2> Determinación de las secuencias de nucleótidos del lysC de tipo salvaje y del lysC mutante procedente de Brevibacterium lactofermentum
El plásmido p399AKY que contiene el lysC de tipo salvaje y el plásmido p399AK9 que contiene el lysC mutante se prepararon a partir de sus transformantes respectivos para determinar las secuencias de nucleótidos de los lysC de tipo salvaje y mutante. Se llevó a cabo la determinación de las secuencias de nucleótidos mediante un procedimiento de Sanger y col. (por ejemplo, F. Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).
La secuencia de nucleótidos del lysC de tipo salvaje codificado por el p399AKY se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 3 en el Listado de Secuencias. Por otra parte, la secuencia de nucleótidos del lysC mutante codificado por el p399AK9 que tiene únicamente la mutación de un nucleótido tal como que el 1051º G se cambió por A en la SEC. DE ID. Nº: 3 cuando se compara con el lysC de tipo salvaje. Se sabe que el lysC de Corynebacterium glutamicum tiene dos subunidades (\alpha, \beta) codificadas en un marco de lectura idéntico sobre una hebra de ADN idéntica (ver Kalinowski, J. y col., Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197-1204). Juzgando a partir de la homología, se asume que el gen secuenciado en el presente documento también tiene dos subunidades (\alpha, \beta) codificadas en un marco de lectura idéntico sobre una hebra de ADN idéntica.
Se muestra una secuencia de aminoácidos de la \alpha-subunidad de la proteína AK de tipo salvaje deducida procedente de las secuencia de nucleótidos de ADN en la SEC. DE ID. Nº: 4 junto con la secuencia de ADN. Solo se muestra la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 5. Se muestra una secuencia de aminoácidos de la \beta-subunidad de la proteína AK de tipo salvaje deducida procedente de la secuencia de nucleótidos del ADN en la SEC. DE ID. Nº: 6 junto con la secuencia de ADN. Sólo se muestra la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 7. En cada una de las unidades, se usa GTG como codón de iniciación, y el correspondiente aminoácido se representa por la metionina. Sin embargo, esta representación hace referencia a metionina, valina, o formilmetionina.
Por otra parte, la mutación en la secuencia del lysC mutante significa la incidencia de la sustitución de residuos de aminoácido tales como que se cambia el residuo Nº 279 de alanina de de la \alpha-subunidad por un residuo de treonina, y que se cambia el residuo Nº 30 de la alanina de la \beta-subunidad por un residuo de treonina en la secuencia de aminoácidos de la proteína de tipo salvaje AK (SEC. DE ID. N^{os}: 5, 7).
Ejemplo 2 Preparación de dapB a partir de Brevibacterium lactofermentum <1> Preparación de dapB y construcción de plásmido que contiene dapB
Se usó una cepa ATCC 13869de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum como donante ADN cromosómico. Se preparó ADN cromosómico procedente de las cepa ATCC 13869 de acuerdo con un procedimiento ordinario. Se amplificó un fragmento de ADN que contiene el dapB, a partir del ADN cromosómico de acuerdo con la PCR. Al igual que con los cebadores de ADN usados para la amplificación, se usó ADN de 23-mers que tiene las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEC. DE ID. N^{os}: 8 y 9 en el Listado de Secuencias, de forma respectiva con el fin de amplificar una región de aproximadamente 2,0 kb que codifica DDPR en función de una secuencia conocida de Brevibacterium lactofermentum (ver Journal of Bacteriology, 175 (9), 2743-2749 (1993). Se llevó a cabo la síntesis del ADN y la PCR de la misma forma que se ha descrito en Ejemplo 1. Se uso pcR-Script (producido por Invitrogen) como vector de clonación para el fragmento amplificado del gen de 2.001 pb, y se ligó con el fragmento dapB amplificado. De esta manera se construyó un plásmido en el que se ligó el fragmento dapB de 2.001 pb amplificado a partir del cromosoma de Brevibacterium lactofermentum con pCR-Script. Se designó el plásmido obtenido tal como se ha descrito más arriba, que tenía un dapB que se originaba a partir de ATCC 13869, como pCRDAPB. Se ha depositado internacionalmente una cepa transformante AJ13107 obtenida introduciendo pCRDAPB en la cepa JM109 de E. coli el 26 de Mayo de 1995 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Technology del Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japón) bajo el número de acceso FERMP BP-5114 basado en el Tratado de Budapest.
Se extrajo un fragmento de 1.101 pb que contenía un gen estructural de DDPR digiriendo pCRDAPB con EcoRV y SphI. Se ligó este fragmento con pHSG399 que se ha digerido con HincII y SphI para preparar un plásmido. El plásmido preparado se designó como p399DPR.
Se introdujo Brevi.-ori en el p399DPR para construir un plásmido que transporta dapB que se replica de manera autónoma en una bacteria corineiforme Se digirió pHK4 con el enzima de restricción KpnI (producido por Takara Shuzo) y se enromaron los extremos rotos. Se llevó a cabo la formación de los extremos enromados usando el kit DNA Blunting (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la formación del extremo enromado se ligó el ligante BamHI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para hacer modificaciones de forma que el fragmento de ADN que corresponde a la porción Brevi.-ori pudiera escindirse de pHK4 mediante la digestión con únicamente BamHI. Se digirió este plásmido con BamHI, y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado se ligó con p399DPR que se ha digerido también con BamHI para preparar un plásmido que contiene el dapB que se replica de forma autónoma en la bacteria corineiforme. Se designó el plásmido preparado como pDRPB. Se muestra en la Fig. 2 el proceso de construcción de pDPRB.
<2> Determinación de la secuencia de nucleótidos de dapB procedente de Brevibacterium lactofermentum
Se preparó el plásmido de ADN a partir de la cepa AJ13107 que alberga p399DPR, y se determinó su secuencia de nucleótidos de la misma forma que se ha descrito en el Ejemplo 1. Se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 10 una secuencia de nucleótidos determinada y una secuencia de aminoácidos que se deduce a partir de la secuencia de nucleótidos. Se muestra en la SEC DE ID Nº: 11 únicamente la secuencia de aminoácidos.
Ejemplo 3 Preparación de dapA a partir de Brevibacterium lactofermentum <1> Preparación de dapA y construcción del plásmido que contiene dapA
Se usó una cepa ATCC 13869de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum como donante de ADN cromosómico. Se preparó el ADN cromosómico a partir de las cepas ATCC 13869 de acuerdo con un procedimiento ordinario. Se amplificó un fragmento de ADN que contiene dapA a partir de los ADN cromosómicos de acuerdo con PCR. Al igual que con los cebadores de ADN usados para la amplificación, se sintetizaron ADN de 23-mers con la secuencia de nucleótidos que se muestra en las SEC. DE ID. N^{os}: 12 y 13 en el Listado de Secuencias, de forma respectiva, con el fin de amplificar una región de aproximadamente 1,5 kb que codifica DDPS en función de una secuencia conocida de Corynebacterium glutamicum (véase Nucleic Acids Research, 18 (21), 6421 (1990); EMBL Nº de acceso X53993. Se llevaron a cabo La síntesis del ADN y la PCR de la misma forma que se ha descrito en Ejemplo 1. Se usó pCR1000 (producido por Invitrogen, véase Bio/Technology, 9, 657-663 (1991)) como un vector de clonación del fragmento de gen amplificado de 1.411 pb, y se ligó con el fragmento dapA amplificado. Se llevó a cabo la ligadura del ADN usando el kit de ligadura del ADN (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. De esta manera se construyó un plásmido, en el que se ligó el fragmento dapA de 1.411 pb amplificado a partir del cromosoma de Brevibacterium lactofermentum con pCR1000. El plásmido obtenido tal como se ha descrito más arriba, que tenía el dapA que se origina a partir de ATCC 13869, se designó como pCRDAPA.
Una cepa transformante AJ13106 obtenida introduciendo pCRDAPA en la cepa JM109 de E. coli se ha depositado internacionalmente el 26 de mayo de 1995 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Technology del Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japón) bajo el número de acceso FERM BP-5113, basado en el Tratado de Budapest.
Se introdujo Brevi.-ori en el pCRDAP preparado para construir un plásmido que transporta dapA que se replica de manera autónoma en la bacteria corineiforme. Se digirió pHK4 con los enzimas de restricción KpnI y BamHI (producidos por Takara Shuzo) y se enromaron los extremos rotos. Se llevó a cabo la formación de los extremos enromados usando el kit DNA Blunting (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la formación del extremo enromado se ligó el ligante SmaI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para hacer modificaciones de forma que el fragmento de ADN que corresponde a la porción Brevi.-ori pudiera escindirse de pHK4 mediante la digestión con únicamente SmaI. Se digirió este plásmido con SmaI, y el fragmento Brevi.-ori de ADN generado se ligó con pCRDAPA que se ha digerido también con SmaI para preparar un plásmido que contiene el dapA que se replica de forma autónoma en la bacteria corineiforme. Se designó este plásmido como pDPSB. Se muestra en la Fig. 3 el proceso de construcción de pDPSB (Km^{r}).
<2> Determinación de la secuencia de nucleótidos de dapA a partir de Brevibacterium lactofermentum
Se preparó ADN de plásmido a partir de la cepa AJ3106 que alberga pCRDAPA, y se determinó su secuencia de nucleótidos de la misma manera a la descrita en el Ejemplo 1. Se muestran en la SEC DE ID Nº: 14 una secuencia de nucleótidos determinada y una secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos. Se muestra en la SEC DE ID Nº: 15 únicamente la secuencia de aminoácidos.
Ejemplo 4 Preparación del lysA a partir de Brevibacterium lactofermentum <1> Preparación del lysA y construcción de plásmido que contiene el lysA
Se usó una cepa ATCC 13869de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum como donante ADN cromosómico. Se preparó ADN cromosómico procedente de la cepa ATCC 13869 de acuerdo con un procedimiento ordinario. Un fragmento de ADN que contiene argS, lysA, y un promotor de un operón que los contiene se amplificaron a partir del ADN cromosómico de acuerdo con la PCR. Al igual que con los cebadores de ADN usados para la amplificación, se usó ADN sintético de 23-mers con la secuencia de nucleótidos que se muestra en las SEC. DE ID. N^{os}: 16 y 17 en el Listado de Secuencias, de forma respectiva con el fin de amplificar una región de aproximadamente 3,6 kb que codifica la arginil-ARNt sintasa y DDC sobre la base de una secuencia conocida de Corynebacterium glutamicum (véase Molecular Microbioloby, 4(11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)). Se llevó a cabo la síntesis del ADN y la PCR de la misma forma que se ha descrito en Ejemplo 1. Se usó el pHSG399 como vector de clonación para el fragmento amplificado del gen de 3.579 pb. Se digirió el pHSG399 con un enzima de restricción SmaI (producido por Takara Shuzo), y se ligó con el fragmento de ADN que contiene el lysA amplificado. Se obtuvo un plásmido tal como se ha descrito más arriba, que tenía un lysA originado a partir de ATCC 13869, y que se designó como p399LYSA.
Se extrajo un fragmento de ADN que contiene lysA digiriendo el p399LYSA con KpnI (producido por Takara Shuzo) y BamHI (producido por Takara Shuzo). Este fragmento de ADN se ligó con pHSG299 que se había digerido con KpnI y BamHI. El plásmido obtenido se designo como p299LYSA. Se muestra en la Fig. 4 el proceso de construcción del p299LYSA.
Se introdujo Brevi.-ori en el p299LYSA obtenido para construir un plásmido que transportaba el lysA que se puede replicar de manera autónoma en las bacterias corineiformes. El pHK4 se digirió con los enzimas de restricción KpnI y BamHI, y los extremos romos se enromaron. Se llevó a cabo la formación de los extremos enromados mediante un ADN Blunting kit (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la formación de los extremos romos, se ligó un enlazante KpnI fosforilado para hacer una modificación de tal manera que el fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori se pudiera extraer del pHK4 mediante digestión únicamente con KpnI. Se digirió este plásmido con KpnI, y el fragmento Brevi.-ori de ADN generado se ligó con p299LYSA que se había digerido también con KpnI para preparar un plásmido que contiene lysA que se puede replicar de manera autónoma en las bacterias corineiformes. El plásmido preparado se designó pLYSAB. Se muestra en la Fig. 5. el procedimiento de construcción del pLYSAB.
<2> Determinación de la secuencia de nucleótidos del lysA procedente de Brevibacterium lactofermentum
Se preparó el ADN de plásmido de p299LYSA, y se determinó su secuencia de nucleótidos de la misma forma que se ha descrito en el Ejemplo 1. se muestran en la SEC. DE ID. Nº: 10 una secuencia de nucleótidos determinada y una secuencia de aminoácidos que se deduce que es codificada por la secuencia de nucleótidos. Respecto de la secuencia de aminoácidos, se muestran una secuencia de nucleótidos codificada por argS y una secuencia de aminoácidos codificada por lysA en las SEC. DE ID. N^{os}: 19 y 20, de forma respectiva.
Ejemplo 5 Preparación del aspC a partir de Escherichia coli y construcción del plásmido que contiene aspC
Se usó una cepa JM109 de Escherichia coli como donante ADN cromosómico. Se preparó ADN cromosómico procedente de la cepa JM109 de E. coli de acuerdo con un procedimiento ordinario. Se amplificó un fragmento de ADN que contiene aspC a partir del ADN cromosómico de acuerdo con la PCR. Al igual que con los cebadores de ADN usados para la amplificación, se usó ADN de 20-mers con la secuencia de nucleótidos que se muestra en las SEC. DE ID. N^{os}: 21 y 22 en el Listado de Secuencias, en función de una secuencia conocida de E. coli (véase Kuramitsu, S. y col., J. Biochem., 97 (4), 1259-1262 (1985)). Se llevó a cabo la síntesis del ADN y la PCR de la misma forma que se ha descrito en Ejemplo 1. Se clonó el fragmento amplificado del gen de 1.331 pb en el vector de clonación Ta pCR1000. Se designó el plásmido construido como pCRASPC.
Se muestran en la SEC DE ID Nº: 23 una secuencia de de nucleótidos del ADN amplificado que contiene aspC y una secuencia de aminoácidos deducida codificada por la secuencia de nucleótidos. Se muestra en la SEC DE ID Nº: 24 únicamente la secuencia de aminoácidos.
Ejemplo comparativo 1
Construcción del plásmido que comprende la combinación de los mutantes lysC y dapA
Se construyó un plásmido que comprende los mutantes lysC, dapA, y un origen de replicación para bacterias corineiformes a partir del plásmido pCRDAPA que comprende dapA y el plásmido p399AK9B que comprende los mutantes lysC y Brevi.-ori. El p399AK9B se digirió de manera completa con SalI, y a continuación se enromaron los extremos, y se ligaron con el ligante EcoRI para construir un plásmido en el que se modificó el emplazamiento SalI en un emplazamiento EcoRI. Se designó el plásmido obtenido como p399AK9BSE. Los mutantes lysC y Brevi.-ori se escindieron como un fragmento digiriendo parcialmente p399AK9BSE con EcoRI. Se ligó este fragmento con pCRDAPA que se había digerido con EcoRI. Se designó el plásmido obtenido como pCRCAB. Este plásmido se puede replicar de manera autónoma en E. coli y bacterias corineiformes, y proporciona resistencia a la kanamicina a un huésped, el plásmido comprende una combinación del mutante lysC y dapA. Se muestra en la Fig. 6 el proceso de construcción de pCRCAB
Ejemplo comparativo 2
Construcción del plásmido que comprende la combinación de los mutantes lysC y dapB
Se construyó un plásmido que comprende los mutantes lysC y dapB a partir del plásmido p399AK9 que tiene el mutante lysC y el plásmido p399AK9 que tiene dapB. Se extrajo un fragmento de 1.101 pb que contenía un gen estructural de DDPR digiriendo p399DPR con EcoRV y SphI. Se ligó este fragmento con p399AK9 que se ha digerido con SalI y a continuación se enromaron los extremos y se digirieron de manera adicional con SphI para construir un plásmido que comprende una combinación de los mutantes lysC y dapB. Se designó este plásmido como p399AKDDPR.
A continuación se introdujo Brevi.-ori en el p399AKDDPR obtenido. Se digirió el plásmido pHK4 que contenía Brevi.-ori con el enzima de restricción KpnI (producido por Takara Shuzo) y se enromaron los bordes de los extremos rotos. Se llevó a cabo la formación del extremo enromado usando el ADN Blunting kit (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la formación del extremo enromado, se ligó un ligante BamHI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar la modificación de tal manera que pudiera romperse el fragmento de ADN que corresponde a la porción Brevi.-ori a partir de pHK4 mediante digestión únicamente con BamHI. Se digirió este plásmido con BamHI, y el fragmento de ADN de Brevi.-ori generado se ligó con p399AKDDPR que se había digerido también con BamHI para construir un plásmido que contiene los mutantes lysC y dapB que se pueden replicar de manera autónoma en las bacterias corineiformes. Se designó el plásmido construido como pCB. Se muestra en la Fig. 7 el proceso de construcción de pCB.
Ejemplo comparativo 3
Construcción del plásmido que comprende la combinación de dapA y dapB
Se digirió el plásmido pCRDAPA que comprende dapA con KpnI y EcoRI para extraer un fragmento de ADN que contenía dapA, y se ligó con el vector del plásmido pHSG399 que se había digerido con KpnI y EcoRI. Se designó el plásmido obtenido como p399DPS.
Por otra parte, se digirió el plásmido pCRDAPB que comprende dapB con SacII y EcoRI para extraer un fragmento de 2,0 Kb que contiene una región que codifica DDPR, y se ligó con p399DPS que se había digerido con SacII y EcoRI para construir un plásmido que comprende una combinación de dapA y dapB. Se designó el plásmido obtenido como p399AB.
A continuación se introdujo Brevi.-ori en p399AB. Se digirió pHK4 que contenía Brevi.-ori con un enzima de restricción BamHI (producido por Takara Shuzo), y se enromaron los extremos de los bordes rotos. Se llevó a cabo la formación del extremo enromado de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la formación del extremo enromado, se ligó un ligante KpnI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar la modificación de tal manera que el fragmento de ADN que corresponde a la porción Brevi.-ori pudiera romperse a partir de pHK4 mediante digestión únicamente con KpnI. Se digirió este plásmido con KpnI, y se ligó el fragmento Brevi.-ori de ADN generado con p399AB que se había digerido con KpnI para construir un plásmido que contenía dapA y dapB que se pueden replicar de manera autónoma en las bacterias corineiformes. Se designó el plásmido construido como pAB. Se muestra en la Fig. 8 el proceso de construcción de pAB.
Ejemplo 6 Construcción del plásmido que comprende la combinación de los mutantes lysC, dapA, y dapB
Se digirió p399DPS con EcoRI y SphI y se enromaron los extremos, seguido por la extracción de un fragmento de gen dapA. Se ligó este fragmento con el p399AK9 que se había digerido con SalI y se enromaron los extremos para construir el plásmido p399CA en el que coexisten los mutantes lysC y dapA.
Se digirió el plásmido pCRDAPB que comprende dapB con EcoRI y se enromaron los extremos, seguido por la digestión con SacI para extraer un fragmento de ADN de 2,0 kb que comprende dapB. Se digirió el plásmido p399CA que comprende dapA y el mutante lysC con SpeI y se enromaron los extremos, y se digirió posteriormente con SacI y se ligó con el fragmento de dapB extraído para obtener un plásmido que comprende los mutantes lysC, dapA, y dapB. Se designó este plásmido como p399CAB.
A continuación se introdujo Brevi.-ori en p399CAB. Se digirió el plásmido pHK4 que comprende Brevi.-ori con un enzima de restricción BamHI (producido por Takara Shuzo), y se enromaron los extremos de los bordes rotos. Se llevó a cabo la formación del extremo enromado usando un ADN Blunting kit (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la formación del extremo enromado, se ligo un ligante KpnI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para realizar la modificación de tal manera que pudiera romperse el fragmento de ADN que corresponde a la porción Brevi.-ori a partir de pHK4 mediante digestión con únicamente KpnI. Se digirió este plásmido con KpnI, y se ligó el fragmento Brevi.-ori de ADN generado con p399CAB que se había digerido con KpnI para construir un plásmido que comprende una combinación de los mutantes lysC, dapA, y dapB que se pueden replicar de manera autónoma en las bacterias corineiformes. Se designó el plásmido construido como pCAB.. Se muestra en la Fig. 9 el proceso de construcción de pCAB.
Ejemplo 7 Construcción del plásmido que comprende la combinación de los mutantes lysC, dapA, dapB, y lysA
Se digirió el plásmido p299LYSA que comprende lysA con KpnI y BamHI y se enromaron los extremos, y a continuación se extrajo un fragmento del gen lysA. Se ligó este fragmento con pCAB que se había digerido con HpaI (producido por Takara Shuzo) y se enromaron los extremos para construir un plásmido que comprende la combinación de los mutantes lysC, dapA, dapB, y lysA que se pueden replicar de manera autónoma en las bacterias corineiformes. Se designó el plásmido construido como pCABL. Se muestra en la Fig. 10 el proceso de construcción de pCABL. Se debe señalar que el fragmento del gen lysA se insertó en el emplazamiento HpaI en un fragmento de ADN que contiene el gen dapB en pCABL, sin embargo, el emplazamiento HpaI se localiza corriente arriba del promotor del gen dapB (números de nucleótidos 611 a 616 en la SEC DE ID Nº: 10) y el gen dapB no se desacopló.
Ejemplo 8 Construcción del plásmido que comprende aspC
Se usó como vector para la introducción de aspC en las bacterias corineiformes, un vector de clonación de las bacterias corineiformes, pVK7 que se construyó de nuevo. Se construyó pVK7 ligando pHSG299, un vector de E. coli (Km^{r}; Takeshita, S. y col., Gene, 61, 63-74 (1987)) con pAM330, un plásmido críptico para Brevibacterium lactofermentum tal como se describe a continuación. Se preparó pAM330 a partir de la cepa ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum. Se digirió pHSG299 con un enzima de restricción dando como resultado un emplazamiento de rotura, AvaII (producido por Takara Shuzo), se enromaron los extremos usando T4 ADN polimerasa, y se ligaron con pAM330 que se había digerido con HindIII (producido por Takara Shuzo) y se enromaron los extremos usando T4 ADN polimerasa. Dependiendo de la orientación del pAM330 insertado en pHSG299, se designaron los dos plásmidos obtenidos como pVK6 y pVK7, y se usó pVK7 para los siguientes experimentos. pVK7 se puede replicar de manera autónoma en E. coli y Brevibacterium lactofermentum y tiene un emplazamiento de clonación múltiple que se origina a partir de pHSG299 y lacZ'. Se muestra en la Fig. 11 el proceso de construcción de pVK6 y pVK7.
Se ligó aspC con el vector lanzadera construido pVK7. Se digirió pCRASPC con el enzima de restricción EcoRI (producido por Takara Shuzo) y se ligó con pVK7 que se había digerido también con EcoRI. Se llevó a cabo la ligadura del ADN usando el kit de ligadura del ADN (producido por Takara Shuzo). Entre aquellos en los que se ligó el fragmento de aspC con pVK7, uno en el que se insertó el fragmento en la misma orientación que la orientación de la transcripción del promotor lac poseído por pVK7 se designó como pOm. Se muestra en la Fig 12 este proceso de construcción de pOm.
Ejemplo 9 Preparación del aspC de Brevibacterium lactofermentum <1> Preparación del aspC que se origina de Brevibacterium lactofermentum
Se transformó una cepa 102-7 auxotrofa al ácido aspártico que pertenece al género Corynebacterium que fue deficiente en la actividad de aspC (actividad AAT) por ser auxotrofa al ácido aspártico (I. Shiio y K. Ujikawa, J. Biochem., 84, 647 (1978)), introduciendo una biblioteca de genes (Publicación Internacional Nº WO 95/23224) preparada mediante ligadura de diversos fragmentos de ADN cromosómico de la cepa ATCC 13869 de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum con un vector que funciona en las células de las bacterias que pertenecen al género Corynebacterium. Se recogieron los transformantes obtenidos y se lavaron dos veces con agua destilada. Se plaquearon decenas de miles de los transformantes sobre placas de agar de un medio mínimo, medio 10 que no contenía otras fuentes de nitrógeno que el amoníaco (I. Shiio y K. Ujikawa, J. Biochem., 84, 647 (1978)) para obtener transformantes con auxotrofía restablecida al ácido aspártico y que mostraron un excelente crecimiento sobre la placa. Se recuperó el ADN del plásmido a partir de la tinción obtenida restableciendo la auxotrofía al ácido aspártico, y se designó el plásmido obtenido como pAC. Cuando la cepa ATCC 13869 de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum se transformó con pAC, se incrementó la actividad aspC del transformante (Tabla 1). Se llevó a cabo la determinación de la actividad de acuerdo con un procedimiento conocido (véase Sizer, I. W. y Jenkins, W. T., Meth. Enzymol., vol. 5, 677-679 (1962).
A partir de estos resultados, se confirmó que el fragmento de aproximadamente 2,5 kb del ADN cromosómico de la cepa ATCC 13869 del ADN del plásmido contenía el aspC de Brevibacterium lactofermentum.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
Cepa/Plásmido Actividad aspC (Valor relativo)
ATCC13869 1,0
ATCC13869/pCABL 8,9
<2> Análisis del aspC que se origina a partir de brevibacterium lactofermentum
Se determinó una secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN de 2,5 kb de acuerdo con el procedimiento dideoxi de Sangar y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)).Se mostró la secuencia de nucleótidos determinada en la SEC DE ID Nº: 25. Se analizó la secuencia de nucleótidos usando el programa GENETYX-MAC Versión 7.3 (Software Kaihatsu KK). La investigación del ORF (Marco de Lectura Abierto) mostró dos ORF que se superponían en la orientación opuesta tal como se muestra en la Fig. 13. Se designó como ORF1 el ORF de 432 aminoácidos o 462 aminoácidos que se codificaban en la orientación normal entre el ATG de número de nucleótido 579 a 881 ó 897 a 899 como codón de iniciación y el TAG de número de nucleótido de 2175 a 2177 como codón de terminación en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 25. Se designó como ORF2 el ORF de 393 aminoácidos que se codifican en la orientación inversa entre el GTG complementario al CAC de número de nucleótido d 2163 a 2165 como codón de iniciación y el TGA complementario al TCA de número de nucleótido de 894 a 986 como codón de terminación en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 25.
<3> Determinación del ORF que codifica aspC
Se amplificó un fragmento de ADN que no contenía el ORF2 de longitud completa y que codificaba para el ORF1 de longitud completa mediante la PCR a partir de pAC para confirmar si el ORF codifica la proteína AAT entre los dos ORF. Al igual que para los cebadores de ADN usados para la amplificación, se usaron de manera respectiva los ADN sintéticos de 23-mers que tienen las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEC DE ID N^{os}: 26 y 27 en el Listado de Secuencias. Se llevó a cabo la síntesis del ADN y la PCR de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 1. Se clonó el fragmento amplificado de 2.062 pb de número de nucleótido 126 a 2.187 en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 25 en un vector de clonación TA pCR2.1 (producido por Invitrogen). Se designó el plásmido construido como pCRORF1.
De la misma manera, se amplificó y clonó un fragmento de gen de 1.543 pb de número de nucleótido 975 a 2. 517 en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 25, que codificaba únicamente para el ORF2 de longitud completa. Se designó el plásmido construido como pCRORF2. Para introducir los fragmentos de ADN clonado en las células de las bacterias que pertenecen al género Corynebacterium, se ligaron los fragmentos de ADN con el vector lanzadera descrito en el Ejemplo 8. Se digirió pCRORF1 con un enzima de restricción EcoRI (producido por Takara Shuzo), y se ligó con pVK7 que se había digerido con el enzima de restricción EcoRI. Se llevó a cabo la ligadura del ADN usando el kit de Ligadura del ADN (producido por Takara Shuzo). Se designó el plásmido construido como pORF1. Se muestra en la Fig. 14 el proceso de construcción de pORF1.
De la misma manera, se construyó pORF2 a partir de pCRORF2 y pVK7.
Se introdujeron los pORF1 y pORF2 preparados en las células de la cepa ATCC 13869 de tipo salvaje de Brevibacterium lactofermentum de la misma manera que en el Ejemplo 9. Se determinaron las actividades aspC de la ATCC 13869 y de las cepas ATCC 13869/pORF1 y ATCC 13869/pORF2 introducidas en el plásmido obtenido. Se llevó a cabo la determinación de la actividad de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 1. Tal como se muestra en la Tabla 2, se observó un incremento en la actividad aspC únicamente para ATCC 13869/pORF1, indicando que aspC se codifica por ORF1.
Se muestran en la SEC DE ID Nº: 30 la secuencia de nucleótidos del aspC de Brevibacterium lactofermentum determinada por los experimentos anteriormente mencionados y una secuencia de aminoácidos deducida que se codifica por la secuencia de nucleótidos. En la SEC DE ID Nº: 31 se muestra únicamente la secuencia de aminoácidos. La investigación de la homología en el GENEBANK no mostró homología con secuencias de aminoácidos conocidas incluyendo las proteínas AAT que se originan de otros organismos
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TABLA 2
Cepa/Plásmido Actividad aspC (Valor relativo)
ATCC13869 1,0
ATCC13869/pORF1 10,1
ATCC13869/pORF2 1,2
Ejemplo 10 Introducción de plásmidos que comprenden genes para la biosíntesis de lisina en la bacteria productora de L-lisina de Brevibacterium lactofermentum
Se introdujo el pCABL (Cm^{r}) construido en el Ejemplo 7 en una bacteria AJ11082 productora de L-lisina (NRRL B-11470) de Brevibacterium lactofermentum de manera respectiva. La cepa AJ11082 tiene una propiedad de resistencia a AEC. Se introdujo el plásmido de acuerdo con un procedimiento de pulso eléctrico (Sugimoto y col., Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta nº 2-207791). Se seleccionaron los transformantes en función de la posesión por el fármaco de un marcador de resistencia al fármaco. Se seleccionaron los transformantes en un medio completo que contenía 5 \mug/ml de cloranfenicol donde se introdujo un gen de resistencia al cloranfenicol, o se seleccionaron los transformantes en un medio completo que contenía 25 \mug/ml de kanamicina donde se introdujo un gen de resistencia a la kanamicina. El transformante AJ11082/pCABL obtenido tal como se ha descrito anteriormente se transformó con el plásmido pOm (Km^{r}) que tiene aspC de Escherichia coli o pORF1 (Km^{r}) que tiene aspC de Brevibacterium lactofermentum. Debido a que pCABL usa pHM1519 como un origen de replicación en las células de Brevibacterium lactofermentum y un gen de resistencia Cm como marcador, y pOm usa pAM330 como origen de replicación en las células de Brevibacterium lactofermentum y un gen de resistencia Km como marcador, ambos plásmidos se albergan de manera estable en las células de Brevibacterium lactofermentum. De esta manera, se obtuvieron las cepas AJ11082/pCABL/pOm y AJ11082/pCABL/pORF1 en las que un plásmido contiene un gen y un plásmido que contiene aspC participan en la biosíntesis de L-lisina.
De la misma manera que la descrita anteriormente se introdujeron p399AK9B (Cm^{r}), pDPSB (Km^{r}), pDPRB (Cm^{r}), pLYSAB (Cm^{r}), pOm, pCRCAB (Km^{r}), pAB (Cm^{r}), pCB (Cm^{r}), y pCAB (Cm^{r}) en la cepa AJ11082 para obtener transformante en los que estuvieran mejorados individualmente los mutantes lysC, dapA, dapB, lysA o aspC, o estuvieran mejorados dos o tres de estos genes en combinación.
Ejemplo 11 Determinación de la actividad aspC de los transformantes
Se determinaron las actividades aspC de los transformantes AJ11082/pCABL, AJ11082/pCABL/pOm y AJ11082/ pCABL/pORF1. Se llevó a cabo la determinación de la actividad de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 9 <3>. Tal como se muestra en la Tabla 3, se observó que el promotor lac en el vector pOm también funcionó en Brevibacterium lactofermentum y la actividad aspC de AJ11082/pCABL/pOm aumentó aproximadamente tres veces. Se observó un incremento adicional de aproximadamente 9 veces en la actividad aspC de AJ11082/pCABL/pORF1.
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TABLA 3
Cepa/Plásmido Actividad aspC (Valor relativo)
AJ11082 1,0
AJ11082/pOm 3,2
AJ11082/pORF1 10,1
AJ11082/pCABL 0,9
AJ11082/pCABL/pOm 2,9
AJ11082/pCABL/pORF1 11,5
Ejemplo 12 Producción de L-Lisina
Cada uno de los transformantes obtenidos en el Ejemplo 10 se cultivó en un medio de producción de L-lisina para evaluar la productividad de L-lisina. El medio de producción de L-lisina tenía la siguiente composición:
Medio de producción de L-lisina
Los siguientes componentes, excepto el carbonato de calcio, se disolvieron (en 1 L), y el pH se ajustó a 8,0 con KOH. El medio se esterilizó a 115ºC durante 15 minutos, y se añadió posteriormente a lo anterior el carbonato de calcio (50 g) en estado seco que se había esterilizado por separado en aire caliente
Glucosa 100 g
(NH_{4})_{2}SO_{4} 55 g
KH_{2}PO_{4} 1 g
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 1 g
Biotina 500 \mug
Tiamina 2000 \mug
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,01 g
MnSO4\cdot7H_{2}O 0,01 g
Nicotinamida 5 mg
Hidrolizado de proteína (Mamenou) 30 ml
Carbonato de calcio 50 g
Cada uno de los diferentes tipos de transformante y cepas padre se inocularon al medio con la composición que se describe más arriba para llevar a cabo el cultivo a 31,5ºC con agitación recíproca. Se muestra en la Tabla 1 la cantidad de L-lisina producida tras 40 ó 72 horas de cultivo y en la Tabla 4 se muestra el crecimiento tras 72 horas (DO_{562}). En la tabla, lysC* representa el lysC mutante. Se determinó de manera cuantitativa el crecimiento midiendo la DO a 562 nm tras diluir 101 veces.
TABLA 4 Acumulación de L-Lisina tras 40 ó 72 horas de cultivo 
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Nota 1: aspC de Escherichia coli
Nota 2: aspC de Brevibacterium lactofermentum 
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra más arriba, los mutantes lysC, dapA, dapB lysA, o aspC mejoraron individualmente, la cantidad de L-lisina producida fue mayor que o equivalente a la que produce la cepa padre tras 72 horas de cultivo, sin embargo, la cantidad de L-lisina producida es inferior a la producida por la cepa padre tras 40 horas de cultivo. A saber, la velocidad de producción de L-lisina disminuyó en cultivo durante un periodo de tiempo corto. De manera similar, cuando los mutantes lysC y dapA, o dapA y dapB se estimularon en combinación, la cantidad de L-lisina producida es mayor a la producida por la cepa padre tras 72 horas de cultivo, Sin embargo, la cantidad de L-lisina producida fue inferior que la producida por la cepa padre tras 40 horas de cultivo. De esta manera, disminuyó la velocidad de producción de L-lisina.
Por el contrario, en el caso de la cepa en la que se estimuló el dapB junto con el lysC mutante, la cepa en que se estimularon tres de los mutantes lysC, dapA y dapB, y la cepa en la que se estimularon cuatro de los mutantes lysC, dapA, dapB y lysA, se mejoró la cantidad acumulada de L-lisina en el período de cultivo a corto plazo y en el período de cultivo a largo plazo.
En el caso de la cepa en la que se estimularon cinco de los mutantes, lysC, dapA, dapB, lysA, y aspC de Escherichia coli, y en el de la cepa en la que se estimularon cinco de los mutantes, lysC, dapA, dapB, lysA, y aspC de Brevibacterium lactofermentum, se mejoró de manera adicional la productividad de la L-lisina en cualquiera de los períodos. La extensión de la mejora en la última fue mayor que en la de la primera.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: AJINOMOTO CO., LTD
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-LISINA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 31
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS:
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP:
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn, versión #1.0, versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: JP 8-325659
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 - DIC – 1996
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1643 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 3
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1643 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 217..1482
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 4
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 421 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 5
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1643 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 964...1482
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 172 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2001 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 730..1473
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 248 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1411 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 311..1213
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 14
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 301 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAAAACCGC CCTCCACAGGC GAA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3579 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 533..2182
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2188..3522
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
14
15
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 550 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 19
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 445 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 20
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACCTCGTCA TGTTTGAGAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGCCTACA AAATCGTGCA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1331 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Escherichia coli 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: JM109
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10..1197
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 23
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 396 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 24
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2517 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 25
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCAACGGA CGGTTGGAGC ATT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: si
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTATTCACT CTAGCTAGCG TAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGCTCAAGT CAAAAAATCT GAA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTGTCCC GGTTGGGCAT GCA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2517 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 879..2174
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 30
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 31:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
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(A)
LONGITUD: 432 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácidos
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(D)
TOPOLOGÍA: lineal
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
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(xiii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 31
28

Claims (11)

1. Un ADN recombinante que se puede replicar de manera autónoma en células de bacterias corineiformes, que comprende una secuencia de ADN que codifica una aspartoquinasa en la que se ha insensibilizado de forma sustancial la inhibición por retroalimentación debida a L-lisina y L-treonina, una secuencia de ADN que codifica una dihidrodipicolinato reductasa, una secuencia de ADN que codifica una dihidrodipicolinato sintasa, una secuencia de ADN que codifica una diaminopimelato decarboxilasa, y una secuencia de ADN que codifica una aspartato aminotransferasa.
2. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha aspartoquinasa en la que se ha insensibilizado de forma sustancial la inhibición por retroalimentación debida a L-lisina y L-treonina es una aspartoquinasa que está originada en bacterias corineiformes, y en el que dicha aspartoquinasa es una aspartoquinasa mutante en la que el residuo de aminoácido que corresponde al residuo de alanina Nº 279 tal como se cuenta desde su extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 5 se cambia por un residuo de aminoácido diferente de la alanina y diferente de un aminoácido ácido en su subunidad \alpha, y un el residuo de aminoácido que corresponde al residuo de alanina Nº 30 tal como tal como se cuenta desde su extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 7 se cambia por un residuo de aminoácido diferente de la alanina y diferente de un aminoácido ácido en su subunidad \beta.
3. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN que codifica la dihidrodipicolinato reductasa codifica una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 11, o una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente la misma que la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 11.
4. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN que codifica la dihidrodipicolinato sintasa codifica una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 15, o una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente la misma que la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC DE ID Nº: 15.
5. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN que codifica la diaminopimelato decarboxilasa codifica una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 20, o una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente la misma que la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº. 20.
6. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para la aspartato aminotransferasa codifica una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 24 ó 31, o una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente la misma que la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 24 ó 31.
7. Una bacteria corineiforme que alberga una aspartoquinasa en la que se ha insensibilizado de forma sustancial la inhibición por retroalimentación debida a L-lisina y L-treonina, y que comprende una secuencia de ADN mejorada que codifica una dihidrodipicolinato reductasa, una secuencia de ADN mejorada que codifica la dihidrodipicolinato sintasa, y una secuencia de ADN mejorada que codifica una diaminopimelato decarboxilasa, y una secuencia de ADN mejorada que codifica una aspartato aminotransferasa.
8. La bacteria corineiforme de acuerdo con la reivindicación 7, transformada mediante la introducción del ADN recombinante tal como se ha definido en la reivindicación 1.
9. Un procedimiento para producir L-lisina que comprende las etapas de cultivar dicha bacteria corineiforme tal como se ha definido en la reivindicación 7 u 8 en un medio apropiado para permitir que la L-lisina se produzca y acumule en un cultivo de la bacteria, y recoger la L-lisina del cultivo.
10. Un ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 31.
11. El ADN de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende una secuencia de nucleótidos de número de nucleótido 879 a 2174 en una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 30.
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