HU224492B1 - Eljárás L-lizin előállítására - Google Patents

Eljárás L-lizin előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU224492B1
HU224492B1 HU9702360A HUP9702360A HU224492B1 HU 224492 B1 HU224492 B1 HU 224492B1 HU 9702360 A HU9702360 A HU 9702360A HU P9702360 A HUP9702360 A HU P9702360A HU 224492 B1 HU224492 B1 HU 224492B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
amino acid
seq
lysine
gly
Prior art date
Application number
HU9702360A
Other languages
English (en)
Inventor
Masakazu Sugimoto
Yasuhiko Yoshihara
Tsuyoshi Nakamatsu
Masayuki Araki
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18179293&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU224492(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of HU9702360D0 publication Critical patent/HU9702360D0/hu
Publication of HUP9702360A2 publication Critical patent/HUP9702360A2/hu
Publication of HUP9702360A3 publication Critical patent/HUP9702360A3/hu
Publication of HU224492B1 publication Critical patent/HU224492B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát egy korineform baktérium képezi, amely olyanaszpartokinázt hordoz, amely aszpartokinázban az L-lizin és L-treoninokozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen levan csökkentve, és amely baktérium tartalmaz egy, dihidrodipikolinát-reduktázt kódoló, fokozott aktivitású DNS-szekvenciát, egydihidrodipikolinát-szintázt kódoló, fokozott aktivitású DNS-szekvenciát, egy, diamino-pimelát-dekarboxilázt kódoló, fokozottaktivitású DNS-szekvenciát és egy, aszpartát-amino-transzferáztkódoló, fokozott aktivitású DNS- szekvenciát. A találmány tárgyátképezi továbbá eljárás L-lizin termelésére, amely során az említettkorineform baktériumot megfelelő tápközegben tenyésztik, ami lehetővéteszi L-lizin termelődését és felhalmozódását a baktériumsejt-tenyészetben, majd az L-lizint a tenyészetből kinyerik. A találmánytárgyát képezi egy rekombináns DNS is, amely alkalmas találmányszerinti korineform baktériumok előállítására. A találmány szerintimegoldás alkalmas L-lizin ipari méretekben történő előállítására.

Description

A találmány tárgya eljárás L-lizin előállítására egy mikroorganizmus tenyésztése révén, amely mikroorganizmus előállítása egy, aminosavak vagy rokon vegyületek fermentációs előállítására alkalmas korineform baktérium módosításával, génsebészeti módszereken alapuló eljárásokkal történt. A találmány tárgyát képezik továbbá az említett módosított korineform baktériumok, valamint L-lizin-bioszintézisgéneket tartalmazó rekombináns DNS-ek, amelyek segítségével az említett módosítás megtörtént.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható L-lizin ipari előállítására fermentációs módszerekkel.
A takarmánydúsítóként használt L-lizint általában egy, a korineform baktériumok közé tartozó L-lizin-termelő mutáns törzs alkalmazásával állítják elő fermentációs módszerekkel. A jelenleg ismert különböző L-lizin-termelő baktériumokat mesterséges mutációval állították elő a korineform baktériumokhoz tartozó vad típusú törzsekből kiindulva.
Ami a korineform baktériumokat illeti, eddig feltártak egy, baktériumsejtekben autonóm módon replikálódni képes plazmidvektort, amely drogrezisztencia-markergéneket hordoz [4 514 502-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], valamint egy eljárást gének baktériumsejtekbe történő bejuttatására [például 2-207791-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés]. Feltártak továbbá egy lehetőséget arra, hogy L-treonint és L-izoleucint termelő baktériumokat a fent leírt módszerekkel tenyésszenek [4452890-es és 4442208-as számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés], L-lizin-termelő baktérium tenyésztésére ismert egy eljárás, amely során egy, az L-lizin bioszintézisében szerepet játszó gént építenek be egy plazmidvektorba annak érdekében, hogy baktériumsejtekben amplifikálják a gént [például 56-160997-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés].
Az L-lizin bioszintézisében szerepet játszó ismert gének például a dihidropikolinát reduktázgénje [7-75578-as számú közzétett japán szabadalmi bejelentés] és az aszpartát-amino transzferázgénje [6-102028-as számú japán közzétételi irat], ahol egy, az L-lizin bioszintézisében részt vevő gént klónoztak, továbbá a foszfoenol-piruvát karboxilázgénje [60-87788-as számú közzétett japán szabadalmi bejelentés], a dihidrodipikolinát szintázgénje [6-55149-es számú japán szabadalmi bejelentés] és a diamino-pimelát dekarboxilázgénje [60-62994-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés], ahol gén amplifikálása hat az L-lizin termelékenységére.
Ismeretes olyan eset is, ahol az L-lizin bioszintézisében részt vevő egyik enzim vad típusára visszacsatolásos gátlás jellemző. Ebben az esetben az L-lizin-előállítás termelékenységét egy olyan enzimgén bejuttatásával növelték meg, amely a visszacsatoló gátlásra való érzékenységet megszüntető mutációt tartalmazott. Ilyen gén például az aszpartokinázgén [WO 94/25605-ös számú nemzetközi közzétételi irat].
A fent leírtak szerint sikert értek el az L-lizin bioszintetikus rendszerének génjei amplifikálása, illetve mutáns gének bevitele révén. Egy olyan mutáns aszpartokináz génjét tartalmazó korineform baktérium például, amely aszpartokináznak csökkent az érzékenysége lizin és treonin együttes gátlóhatásával szemben, számottevő mennyiségű L-lizint termel (kb. 25 g/L-t). Ennek a baktériumnak azonban a szaporodási sebessége kisebb, mint amelyik a vad típusú aszpartokinázgént hordozza. Azt is közölték, hogy az L-lizin előállításának termelékenysége tovább javítható azzal, hogy a mutáns aszpartokináz génjének bevitele mellett dihidropikolinát szintázgént is visznek be [Applied and Environmental Microbiology, 57 (6), 1746, (1991)]. Egy ilyen baktérium növekedési sebessége azonban tovább csökken.
Ami a dihidropikolinát reduktázgénjét illeti, kimutatták, hogy egy olyan korineform baktériumban, amelybe a gént bejuttatták, a dihidropikolinát reduktázaktivitása megnövekedett. Arra nézve azonban nem közöltek semmit, hogy ez hogyan hat az L-lizin termelékenységére [7-75578-as számú japán szabadalmi bejelentés].
Jelen körülmények között a korineform baktériumokat tekintve egy eset sem ismeretes, ahol az L-lizin-termelés jelentős javítása az L-lizin bioszintézisgénjei közül többnek a kombinálásával ne okozta volna a szaporodás sebességének csökkenését. Eddig nem közöltek még olyan esetet, amelyben egy, az L-lizin bioszintetikus rendszer részét képező gén aktivitásának fokozása mellett a baktérium szaporodási sebességét is növelni szándékozták volna.
A találmány szerinti megoldás célja L-lizin-termelés javítása korineform baktériumban az alább felsorolt enzimeket kódoló DNS-szekvenciájú genetikai anyagok alkalmazásával: aszpartokináz (amit a leírásban a továbbiakban „ΑΚ’’-val jelölünk, azzal a feltétellel, hogy egy AK-fehérjét kódoló gént a továbbiakban „lysC”-vel jelölünk, ha szükséges); dihidrodipikolinát-reduktáz (amit a leírásban a továbbiakban „DDPR”-rel jelölünk, azzal a feltétellel, hogy egy DDPR-fehérjét kódoló gént a továbbiakban „dapB”-vel jelölünk, ha szükséges); dihidrodipikolinát-szintáz (amit a leírásban a továbbiakban „DDPS”-sel jelölünk, azzal a feltétellel, hogy egy DDPS-fehérjét kódoló gént a továbbiakban „dapA”-val jelölünk, ha szükséges); diamino-pimelát-dekarboxiláz (amit a leírásban a továbbiakban „DDC”-vel jelölünk, azzal a feltétellel, hogy egy DDC-fehérjét kódoló gént a továbbiakban „lysA”-val jelölünk, ha szükséges); valamint az aszpartát-amino-transzferáz (amit a leírásban a továbbiakban „AAT”-nek jelölünk, azzal a feltétellel, hogy egy AAT-fehérjét kódoló gént a továbbiakban „aspC”-vel jelölünk, ha szükséges). A fenti enzimek korineform baktériumok sejtjeiben az L-lizin bioszintézisének fontos enzimjei.
A találmány szerinti megoldás elve azon a felismerésen alapul, hogy az L-lizin-termelést javítani lehet L-lizin és L-treonin együttes gátlóhatásával szemben lecsökkenteti érzékenységű mutáns AK-t (amit a leírásban a továbbiakban szükség esetén „mutáns AK”-ként jelölünk) kódoló mutáns lysC (amit a leírásban a továbbiakban szükség esetén „mutáns lysC”-ként jelölünk), dapA, dapB, lysA és aspC aktivitásának fokozásával, a géneket kombinálva.
HU 224 492 Β1
A találmány tárgyát képezi tehát egy, korineform baktériumok sejtjeiben autonóm módon replikálódni képes rekombináns DNS, amely tartalmaz egy olyan aszpartokinázt kódoló DNS-szekvenciát, amely aszpartokinázban az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenységet lényegesen lecsökkentettük, továbbá dihidrodipikolinát-reduktázt kódoló DNS-szekvenciát, dihidrodipikolinát-szintázt kódoló DNS-szekvenciát, diamino-pimelát-dekarboxilázt kódoló DNS-szekvenciát és aszpartát-amino-transzferázt kódoló DNS-szekvenciát.
A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy, L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlás tekintetében lényegesen lecsökkentett érzékenységű aszpartokináz génjét hordozó korineform baktérium, amely tartalmaz továbbá egy, dihidrodipikolinát-reduktázt kódoló fokozott aktivitású DNS-szekvenciát, egy, dihidrodipikolinát-szintázt kódoló fokozott aktivitású DNS-szekvenciát, egy, diamino-pimelát-dekarboxilázt kódoló fokozott aktivitású DNS-szekvenciát és egy, aszpartát-amino-transzferázt kódoló fokozott aktivitású DNS-szekvenciát.
A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás L-lizin előállítására, azzal jellemezve, hogy a több lépésből álló eljárás során a fent leírt korineform baktériumok közül bármelyiket megfelelő tápközegben tenyésztjük, és így L-lizin termelődését és felhalmozódását váltjuk ki a baktériumsejt-tenyészetben, majd az L-lizint kinyerjük a tenyészetből.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy, a szekvencialistában a 31-es azonosító számon megadott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló DNS. Erre a DNS-re példa egy, a szekvencialistában a 30-as azonosító számon megadott nukleotidszekvencia 879. nukleotidjától a 2174. nukleotidjáig terjedő nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy vektor, a pVK7, amelyik autonóm módon replikálódni képes Escherichia coli és Brevibacterium lactofermentum sejtjeiben, és tartalmaz egy többszörös klónozóhelyet, valamint lacZ'-t.
A korineform baktériumok a találmányi leírásban a mikroorganizmusok egy olyan csoportját jelentik - összhangban a Berge’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiad. 559, (1974) meghatározásával -, amelyek aerob, Gram-pozitív, savnak nem ellenálló, pálcika alakú baktériumok, és amelyek nem képesek spórák képzésére. A korineform baktériumok magukban foglalják a Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumokat, azokat a mind ez ideig a Brevibacterium nemzetségbe sorolt baktériumokat, amelyeket jelenleg a Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumokkal együvé soroltak be, valamint a Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumokkal közeli rokonságban levő Brevibacterium nemzetségbe tartozó baktériumokat.
A találmány szerinti megoldás megvalósítása révén a korineform baktérium L-lizin-termelő képességét és a termelt L-lizin mennyiségét növelni lehet.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábra bemutatja a mutáns lysC-t tartalmazó p399AK9B és p399AKYB plazmidok elkészítésének folyamatát.
A 2. ábra bemutatja a dapB-t és a Brevi. ori.-t (Brevibacterium-eredetü replikációs origó) tartalmazó pDPRB plazmid elkészítésének folyamatát.
A 3. ábra bemutatja a dapA-t és a Brevi. ori.-t tartalmazó pDPSB plazmid elkészítésének folyamatát.
A 4. ábra bemutatja a lysA-t tartalmazó p299LYSA plazmid elkészítésének folyamatát.
Az 5. ábra bemutatja a lysA-t és a Brevi. ori.-t tartalmazó pLYSAB plazmid elkészítésének folyamatát.
A 6. ábra bemutatja a lysC-t, a dapB-t és a Brevi.
ori.-t tartalmazó pCRCAB plazmid elkészítésének folyamatát.
A 7. ábra bemutatja a lysC-t és a dapB-t tartalmazó pCB plazmid elkészítésének folyamatát.
A 8. ábra bemutatja a dapA-t, a dapB-t és a Brevi.
ori.-t tartalmazó pAB plazmid elkészítésének folyamatát.
A 9. ábra bemutatja a lysC-t, a dapA-t, a dapB-t és a Brevi. ori.-t tartalmazó pCAB plazmid elkészítésének folyamatát.
A 10. ábra bemutatja a lysC-t, a dapA-t, a dapB-t, a lysA-t és a Brevi. ori.-t tartalmazó pCABL plazmid elkészítésének folyamatát.
A 11. ábra bemutatja a korineform baktériumokhoz használható új klónozóvektorok, a pVK6 és a pVK7 elkészítésének folyamatát.
A 12. ábra bemutatja az aspC-t tartalmazó pOm plazmid elkészítésének folyamatát.
A 13. ábra bemutat két ORF-et egy ATCC13869ből származó kromoszomális DNS-fragmensen.
A 14. ábra bemutatja a pORF1 elkészítésének folyamatát.
1. Az L-lizin-bioszintézis találmány szerinti megoldásban alkalmazott génjeinek előállítása
Az L-lizin-bioszintézis találmány szerinti megoldásban alkalmazott génjeit a következő lépések során nyertük: baktériumból mint DNS-donorból kromoszomális DNS-t tisztítottunk, kromoszomális DNS-könyvtárat készítettünk plazmidvektor vagy hasonló alkalmazásával, kiválasztottunk egy, a kívánt gént hordozó törzset, majd a kiválasztott törzsből kinyertük a rekombináns DNS-t, amelybe a gént inszertáltuk. A DNS-donor, amelyből a találmány szerinti megoldásban alkalmazott L-lizin-bioszintézisgén származik, bármi lehet, feltéve, hogy a kiválasztott L-lizin-bioszintézisgén olyan enzimet kódol, amely korineform baktériumsejtekben működőképes. A DNS-donor azonban előnyösen egy korineform baktérium.
HU 224 492 Β1
A korineform baktériumból származó lysC-, dapA-, dapB- és a lysA-gének mindegyikének szekvenciája ismert. Ennek megfelelően előállíthatjuk őket a polimeráz-láncreakció (PCR) [White, T. J. és munkatársai, Trends. Génét. 5, 185, (1989)] módszerével amplifikálást végezve.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazott L-lizin-bioszintézisgének mindegyike előállítható az alábbiakban példaképpen bemutatott módszerek valamelyikével.
(1) Mutáns lysC előállítása
A mutáns lysC-t tartalmazó DNS-fragmenst előállíthatjuk egy olyan mutáns törzsből, amelyben az AK L-lizin és L-treonin okozta szinergikus visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenységet lényegesen lecsökkentettük [WO 94/25605-ös számú nemzetközi közzétételi irat]. Egy ilyen mutáns törzset úgy kaphatunk, hogy például egy korineform baktérium vad típusú törzse sejtjeinek egy csoportját mutációt okozó kezelésnek vetünk alá. Ilyen szokványos mutációs kezelés például az ultraibolya fénnyel történő besugárzás vagy egy mutációt okozó szer, például az N-metil-N’-nitro-N-nitrozoguanidin (NTG) alkalmazása. Az AK-aktivitást Miyajima és munkatársai által leírt módszer szerint végezhetjük [Journal of Biochemistry 63(2), 139, (1968)]. Ilyen mutáns törzsként legelőnyösebben egy L-lizin-termelő baktériumot, az AJ3445-öt (FERM P-1944) alkalmazhatjuk, amelyet a Brevibacterium lactofermentum ATT 0,13869 (amelynek jelenlegi, megváltozott neve Corynebacterium glutamicum) vad típusú törzsének mutációs kezelésével hozhatunk létre.
Egy másik lehetőség mutáns lysC előállítására az, hogy a plazmid-DNS-t, ami a vad típusú lysC-t tartalmazza, in vitro mutációs kezelésnek vetjük alá. Más szempontból ugyanis pontosan ismerjük a mutációt, ami az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenységet lényegesen lecsökkenti [WO 94/25605-ös számú nemzetközi közzétételi irat]. Ennek megfelelően a mutáns lysC-t előállíthatjuk a vad típusú lysC-ből ennek az ismeretnek az alapján például a helyspecifikus mutagenezis módszerével.
Egy, lysC-t tartalmazó fragmenst izolálhatunk egy korineform baktériumból úgy, hogy kromoszomális DNS-t állítunk elő Saito és Kimura módszerével például [Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, (1963)], majd a lysC-t a PCR-módszerrel amplifikáljuk [White, T. J. és munkatársai, Trends. Génét. 5, 185, (1989)].
A DNS-láncindítókra példák a szekvencialistában az 1-es és a 2-es azonosító számon megadott 23 és 21 tagú nukleotidszekvenciák. Ezekkel például a Corynebacterium glutamicum ismert lysC-szekvenciájából 1643 bp-nyit lehet amplifikálni [Molecular Microbiology 5(5), 1197, (1991); Mól. Gén. Génét., 224, 317, (1990)]. A DNS-t szokványos módszerrel, például az .Applied Biosystems model 380B” DNS-szintetizáló készülékét alkalmazva szintetizálhatjuk meg [Tetrahedron Letters 22, 1859, (1981)]. A PCR-t elvégezhetjük egy „DNA Thermal Cycler Model PJ2000” PCR-készüléket (Takara Shuzo) alkalmazva Taq DNS-polimeráz segítségével, a forgalmazó cég által javasolt módszer alapján.
A PCR segítségével amplifikált lysC-t előnyösen olyan vektor-DNS-sel ligáljuk, amelyik autonóm módon replikálódni képes E. coli és/vagy valamely korineform baktérium sejtjeiben. így tehát rekombináns DNS-t készítünk, amelyet visszajuttatunk az E. co//-sejtekbe. Ezek az előkészületek megkönnyítik a soron következő műveleteket. Az E. co/í-sejtekben autonóm módon replikálódni képes vektor előnyösen egy plazmidvektor, amelyik előnyösen autonóm módon replikálódni képes olyan gazdasejtekbe, amelyek például a következő plazmidokat hordozzák: pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010.
Ha egy olyan DNS-fragmenst inszertálunk ezekbe a vektorokba, amely képessé teszi őket korineform baktériumban való autonóm módon történő replikálódásra, úgynevezett átviteli („shuttle) vektorként alkalmazható vektorokhoz jutunk, amelyek autonóm módon replikálódni képesek mind E. coliban, mind korineform baktériumban.
Ilyen átviteli vektorok az alábbiak. A vektorokat hordozó mikroorganizmusokat és azok nyilvántartási számait nemzetközi deponálási hatóságoknál (zárójelben) szintén feltüntetjük.
pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) pAJ655: Escherichia coli AJ 11882 (FERM BP-136)
Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC39135) pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC39136) pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC39137) pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140) Ezek a vektorok az alább leírtak szerint nyerhetők ki a deponált mikroorganizmusokból. A növekedésük logaritmikus fázisában összegyűjtött sejteket lizozim és SDS jelenlétében feltárjuk, majd a feltárt sejteket 30 000 g-vel lecentrifugáljuk. A felülúszóhoz polietilénglikolt adunk, majd cézium-bromidos egyensúlyi sűrűséggradiens-centrifugálással frakcionáljuk és tisztítjuk etidium-bromid jelenlétében.
Az E. coli-sejteket transzformálhatjuk például plazmid bejuttatásával, amit végezhetünk például D. L. Morrison módszerével [Methods in Enzymology, 68, 326, (1970)], vagy egy másik módszerrel, ahol a befogadó sejtet kalcium-kloriddal kezeljük, hogy a DNS-sel szembeni áteresztőképességét megnöveljük [M. Mandel és A. Higa, J. Mól. Bioi., 53, 159, (1970)].
A vad típusú lysC-t egy, AK-ra nézve vad típusú törzsből kaphatjuk meg lysC a fent leírtak szerinti izolálásával, a mutáns lysC-t pedig úgy, hogy egy, AK-ra nézve mutáns törzsből izolálunk lysC-t, ugyancsak a fentiek alapján.
A vad típusú lysC-t tartalmazó DNS-fragmens nukleotidszekvenciájára példa a szekvencialistában a 3-as azonosító számon megadott szekvencia. A vad típusú AK-fehérje α-alegységének nukleotidszekvenciából származtatott aminosavszekvenciáját a DNS-szekvenciával együtt mutatja a szekvencialistában a 4-es azo4
HU 224 492 Β1 nősítő számon megadott szekvencia. Az aminosavszekvenciát önmagában a szekvencialistában az 5-ös azonosító számon megadott szekvencia mutatja. A vad típusú AK-fehérje β-alegységének nukleotidszekvenciából származtatott aminosavszekvenciáját a DNS-szekvenciával együtt mutatja a szekvencialistában a 6-os azonosító számon megadott szekvencia. Az aminosavszekvenciát önmagában a szekvencialistában a 7-es azonosító számon megadott szekvencia mutatja. Az alegységek mindegyikében GTG a kezdőkodon, itt azonban az ennek megfelelő aminosav a metionin. Az ennek a kodonnak megfelelő aminosav lehet mindazonáltal metionin, valin és formil-metionin egyaránt.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazott mutáns lysC bármilyen lehet, feltéve, hogy olyan AK-t kódol, ahol az L-lizin és L-treonin okozta szinergikus visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen le van csökkentve. A mutáns lysC-re példa azonban az, amely olyan AK-t kódol, ahol az aminosavak közül a vad típusú AK α-alegységének N-terminálisától számított 279. alaninnak megfelelő aminosav más, de nem savas aminosavra van kicserélve, és a β-alegységének N-terminálisától számított 30. alaninnak megfelelő aminosav más, de nem savas aminosavra van kicserélve. A vad típusú AK a-alegységének aminosavszekvenciája a szekvencialistában az 5-ös azonosító számon megadott szekvencia, míg a β-alegységének aminosavszekvenciája a szekvencialistában a 7-es azonosító számon megadott szekvencia.
A nem savas, alanintól különböző aminosavak előnyösen például a következők lehetnek: treonin, arginin, cisztein, fenil-alanin, prolin, szerin, tirozin és valin.
A helyettesítő aminosavnak megfelelő kodon nem csupán egyféle lehet, de az adott aminosavat kell kódolnia. Megjósolható, hogy a vad típusú AK-k aminosavszekvenciái kismértékben eltérhetnek egymástól baktériumfajonként és baktériumtörzsenként. Azok az AK-k, amelyeken egy vagy több helyen mutációt hajtottak végre, és így egy vagy több aminosavat például szubsztituáltak, deletáltak vagy inszertáltak, de ez a fentiekkel egybehangzóan nem volt hatással az enzim aktivitására, szintén alkalmazhatók a találmány szerinti megoldás megvalósítása során. Spontán mutációt tartalmazó AK-t kódoló DNS-t olyan DNS izolálásával nyerhetünk, amelyik képes hibridizálni például a szekvencialistában a 3-as azonosító számon megadott nukleotidszekvencia egy részével sztringens körülmények között. A leírásban használt „sztringens körülmények” alatt olyan körülményeket értünk, amelyek között a kívánt specifikus hibrid keletkezik, de más nemspecifikus hibridizáció nem következik be. Nem könnyű ezeket a körülményeket számértékekkel világosan kifejezni. Ilyenekre példaképpen megemlíthetünk azonban olyan körülményeket, amelyek közepette nagymértékű homológiát mutató nukleinsavak, például nem kevesebb mint 90%-ban homológ DNS-ek hibridizálnak egymással, és ennél kisebb homológiát mutató nukleinsavak nem hibridizálnak egymással, vagy olyan körülményeket, ahol a hőmérséklet egy teljesen összeilleszkedett hibrid olvadási hőmérséklete, és annál 30 °C-kal alacsonyabb hőmérséklet között, előnyösen az olvadási hőmérséklet és annál 20 °C-kal alacsonyabb hőmérséklet között van, a sókoncentráció pedig megfelel 1*SSC-nek, előnyösen pedig 0,1*SSC-nek.
Egyéb AK-kat, amelyeken mesterséges mutációt végzünk, például egy vagy több aminosav szubsztitúcióját, delécióját vagy inszercióját, szintén alkalmazhatunk, feltéve, hogy a mutáció nem fejt ki lényeges befolyást az AK-aktivitásra, és az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lecsökkentett mivoltára. Mesterséges mutációt hordozó, AK-t kódoló DNS-t úgy kaphatunk, hogy a nukleotidszekvenciát szubsztitúcióval, delécióval vagy inszercióval egy adott helyen módosítjuk például helyspecifikus mutagenezissel. Hasonlóképpen, mutációt hordozó lysC-t valamilyen ismert, mutációt okozó kezelési módszerrel (mutagén kezeléssel) állíthatunk elő. Ilyen módszer például a lysC-t tartalmazó DNS in vitro kezelése hidroxil-aminnal vagy hasonlóval, például a lysC-t tartalmazó DNS-t hordozó mikroorganizmus kezelése mutagénekkel, mint például az ultraibolya-besugárzás vagy a szokványos mesterséges mutagenezis során alkalmazott mutagén szer, mint például az N-metil-N-nitro-N-nitrozoguanidin (NTG), vagy a salétromsav. A mutagén kezelés után a mutált helyet meghatározhatjuk úgy, hogy kiválasztunk egy DNS-t vagy mikroorganizmust, amely olyan AK-aktivitással rendelkező AK-t kódol vagy termel, amely AK aminosavszekvenciáját megváltoztattuk a mutagén kezelésnek alávetett DNS által kódolt vagy mikroorganizmus által termelt AK-hoz képest. A bejuttatott mutáció helye bármi lehet, feltéve, hogy az AK-aktivitásra és az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen lecsökkenteti mivoltára nincs lényeges hatása. A mutációk száma és minősége a helytől és a megváltoztatott aminosav minőségétől, illetve a fehérje térszerkezetében elfoglalt helyétől függően változó, és nem korlátozza más, csupán az a feltétel, hogy ne legyen lényeges hatása az AK-aktivitásra és az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen lecsökkented mivoltára. A mutációk száma általában 1—20-ig terjedhet, előnyösen 1-10-ig.
A fent leírt mutációt hordozó AK aminosavszekvenciájában a fentiekben körülírt alaninnak megfelelő aminosav meghatározása szakember számára nem jelent nehézséget.
A p399AK9B lysC-ben mutáns plazmid AJ12036 törzsbe (FERM BP-734) mint vad típusú Brevibacterium lactofermentum törzsbe történt bejuttatásával kapott AJ12691-es törzset 1992. április 10-én helyeztük letétbe FERM P-12918 nyilvántartási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry” Intézetnél (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan), majd 1995. február 10-én a Budapesti Egyezménynek megfelelően is letétbe helyeztük a FERM ΒΡ-4999-es nyilvántartási számon.
HU 224 492 Β1 (2) dapB előállítása
Egy, dapB-t tartalmazó DNS-fragmenst korineform baktérium kromoszómájából PCR segítségével állíthatunk elő. DNS-donorként bármilyen törzs választható, a leírásban példaképpen a Brevibacterium lactofermentum ATCC13869-es törzs szerepel.
A DDPR-t kódoló gén DNS-szekvenciája a Brevibacterium lactofermentum esetében ismert [Journal of Bacteriology 175(9), 2743, (1993)J, ennek alapján pedig PCR-láncindítók készíthetők. Ilyen PCR-láncindítók például azok a 23 bázispárból álló DNS-szakaszok, amelyek a szekvencialistában a 8-as, valamint a 9-es azonosító számon vannak megadva. A DNS szintézise, a PCR, valamint a kapott dapB-t tartalmazó plazmid előállítása ugyanúgy végezhető el, mint azt fent a lysC esetében leírtuk.
A dapB-t tartalmazó DNS-fragmens nukleotidszekvenciája, valamint a nukleotidszekvencia által kódolt származtatott aminosavszekvencia a szekvencialistában a 10-es azonosító számon van megadva, az aminosavszekvencia önmagában pedig a 11-es azonosító számon. Az ezeket az aminosavszekvenciákat kódoló DNS-fragmenseken kívül a találmány szerinti megoldásban alkalmazhatunk a szekvencialistában a 11-es azonosító számon megadott szekvenciával lényegében azonos aminosavszekvenciákat kódoló DNS-fragmenseket is, nevezetesen olyan aminosavszekvenciákat, amelyekben egy vagy több aminosavat szubsztituáltunk, deletáltunk vagy inszertáltunk, feltéve, hogy ennek nem volt lényeges hatása a DDPR-aktivitásra. Spontán vagy mesterséges mutációt tartalmazó dapB-t ugyanolyan módon kaphatunk, mint spontán vagy mesterséges mutációt tartalmazó AK-t kódoló DNS-t, amelyben a mutációnak nincs hatása az AK aktivitására és az L-lizin és L-treonin okozta szinergikus visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen lecsökkentett mivoltára.
A dapB-t tartalmazó, az alábbiakban példában leírt módon kapott pCRDAPB plazmid E. coli JM109 törzsbe történt bejuttatásával kapott AJ13107-es törzset 1995. május 26-án helyeztük letétbe FERM BP-5114 nyilvántartási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry” Intézetnél (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan), a Budapesti Egyezménynek megfelelően.
(3) dapA előállítása
Egy, dapA-t tartalmazó DNS-fragmenst korineform baktérium kromoszómájából PCR segítségével állíthatunk elő. DNS-donorként bármilyen törzs választható, a leírásban példaképpen a Brevibacterium lactofermentum ATCC13869-es törzs szerepel.
A DDPS-t kódoló gén DNS-szekvenciája Corynebacterium glutamícum esetében ismert [Nucleic Acids. Rés., 18(21), 6421, (1990); EMBL nyilvántartási szám: X53993], ennek alapján pedig PCR-láncindítók készíthetők. Ilyen PCR-láncindítók például azok a 23 bázispárból álló DNS-szakaszok, amelyek a szekvencialistában a 12-es, valamint a 13-as azonosító számon vannak megadva. A DNS szintézise, a PCR, valamint a kapott dapA-t tartalmazó plazmid előállítása ugyanúgy végezhető el, mint azt fent a lysC esetében leírtuk.
A dapA-t tartalmazó DNS-fragmens nukleotidszekvenciája, valamint a nukleotidszekvencia által kódolt származtatott aminosavszekvencia a szekvencialistában a 14-es azonosító számon van megadva, az aminosavszekvencia önmagában pedig a 15-ös azonosító számon. Az ezeket az aminosavszekvenciákat kódoló DNS-fragmenseken kívül a találmány szerinti megoldásban alkalmazhatunk a szekvencialistában a 15-ös azonosító számon megadott szekvenciával lényegében azonos aminosavszekvenciákat kódoló DNS-fragmenseket is, nevezetesen olyan aminosavszekvenciákat, amelyekben egy vagy több aminosavat szubsztituáltunk, deletáltunk vagy inszertáltunk, feltéve, hogy ennek nem volt lényeges hatása a DDPS-aktivitásra. Spontán vagy mesterséges mutációt tartalmazó dapA-t ugyanolyan módon kaphatunk, mint spontán vagy mesterséges mutációt tartalmazó AK-t kódoló DNS-t, amelyben a mutációnak nincs hatása az AK aktivitására és az L-lizin és L-treonin okozta szinergikus visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen lecsökkentett mivoltára.
A dapA-t tartalmazó, az alábbiakban példában leírt módon kapott pCRDAPA plazmid E. coli JM109 törzsbe történt bejuttatásával kapott AJ13106-os törzset 1995. május 26-án helyeztük letétbe FERM BP-5113 nyilvántartási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry” Intézetnél (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan), a Budapesti Egyezménynek megfelelően.
(4) lysA előállitása
Egy, lysA-t tartalmazó DNS-fragmenst korineform baktérium kromoszómájából PCR segítségével állíthatunk elő. DNS-donorként bármilyen törzs választható, a leírásban példaképpen a Brevibacterium lactofermentum ATCC13869-es törzs szerepel.
A korineform baktériumokban a lysA és az argS (arginil-tRNS-szintáz génje) egy operont alkot. A lysA expresszióját az argS-től 5’-irányban elhelyezkedő promoter irányítja [Journal of Bactriology, nov., 7356 (1993)]. Ezen gének DNS-szekvenciái a Corynebacterium glutamícum esetében ismertek [Molecular Microbiology 4(11), 1819, (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112 (1988)], ennek alapján pedig PCR-láncindítók készíthetők. Ilyen PCR-láncindítók például azok a 23 bázispárból álló DNS-szakaszok, amelyek a szekvencialistában a 16-os, valamint azok, amelyek a 17-es azonosító számon vannak megadva. Előbbiek megfelelnek a Molecular Microbiology alábbi cikkében a 11-es és a 33-as számon megadott oligonukleotidoknak [Molecular Microbiology 4(11), 1819, (1990)], utóbbiak (a 17-es azonosító számon megadottak) megfelelnek a Molecular and General Genetics alábbi cikkében az 1370-es és az 1392-es számon megadott oligonukleotidoknak [Molecular and General Genetics, 212, 112 (1988)]. A DNS szintézise, a PCR,
HU 224 492 Β1 valamint a kapott lysA-t tartalmazó plazmid előállítása ugyanúgy végezhető el, mint azt fent a lysC esetében leírtuk.
Az alábbiakban leírt példában egy promotert, az argS-t és lysA-t tartalmazó DNS-fragmenst alkalmaztuk a lysA aktivitásának fokozására. Az argS azonban nem képezi a találmány szerinti megoldás nélkülözhetetlen elemét. Alkalmazhatunk egy olyan DNS-fragmenst is, amelyben a lysA-t közvetlenül a promoter közelébe ligáltuk, tőle 3’-irányban.
Az argS-t és a lysA-t tartalmazó DNS-fragmens nukleotidszekvenciája, valamint a nukleotidszekvencia által kódolt származtatott aminosavszekvencia a szekvencialistában a 18-as azonosító számon van megadva, egy argS által kódolt aminosavszekvencia példaképpen a 19-es azonosító számon, továbbá egy lysA által kódolt aminosavszekvencia példaképpen a 20-as azonosító számon. Az ezeket az aminosavszekvenciákat kódoló DNS-fragmenseken kívül a találmány szerinti megoldásban alkalmazhatunk a szekvencialistában a 20-as azonosító számon megadott szekvenciával lényegében azonos aminosavszekvenciákat kódoló DNS-fragmenseket is, nevezetesen olyan aminosavszekvenciákat, amelyekben egy vagy több aminosavat szubsztituáltunk, deletáltunk vagy inszertáltunk, feltéve, hogy ennek nem volt lényeges hatása a DDC-aktivitásra. Spontán vagy mesterséges mutációt tartalmazó lysA-t ugyanolyan módon kaphatunk, mint spontán vagy mesterséges mutációt tartalmazó AK-t kódoló DNS-t, amelyben a mutációnak nincs hatása az AK aktivitására és az L-lizin és L-treonin okozta szinergikus visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen lecsökkentett mivoltára.
(5) aspC előállítása
Az aspC-t tartalmazó DNS-fragmenst olyan mikroorganizmus kromoszómájából készített génkönyvtárból lehet előállítani, mint például a korineform baktériumok vagy az Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumok, kimutatásra egy AAT-hiányos törzs auxotróf sajátságával szembeni komplementaritást kihasználva. DNS-donorként választható bármilyen korineform baktériumtörzs, a leírásban példaképpen a Brevibacterium lactofermentum ATCC13869-es törzs szerepel. Választható továbbá DNS-donorként bármilyen E. coli-törzs is, a leírásban példaképpen az E. co//'-JM109-es törzs szerepel.
Előnyösen korineform baktériumból származó aspC előállítására ismert egy eljárás [6-102028-as számú japán szabadalmi irat], amely eljárással aspC előállítható.
AAT-t kódoló DNS-szekvencia ismert az E. coli esetében [Kuramitsu, S. és munkatársai, Journal of Biochemistry, 97(4), 1259, (1985)], ennek alapján pedig PCR-láncindítók készíthetők. Ilyen PCR-láncindítók például azok a 20 bázispárból álló DNS-szakaszok, amelyek a szekvencialistában a 21-es, valamint a 22-es azonosító számon vannak megadva. A DNS szintézise, a PCR, valamint a kapott dapA-t tartalmazó plazmid előállítása ugyanúgy végezhető el, mint azt fent a lysC esetében leírtuk.
Az aspC-t tartalmazó DNS-fragmens nukleotidszekvenciája, valamint a nukleotidszekvencia által kódolt származtatott aminosavszekvencia a szekvencialistában a 23-as azonosító számon van megadva, az aminosavszekvencia önmagában pedig a 24-es azonosító számon. Egy további, aspC-t tartalmazó DNS-fragmens nukleotidszekvenciája, valamint a nukleotidszekvencia által kódolt származtatott aminosavszekvencia a szekvencialistában a 30-as azonosító számon van megadva, az aminosavszekvencia önmagában pedig a 31-es azonosító számon. Az ezeket az aminosavszekvenciákat kódoló DNS-fragmenseken kívül a találmány szerinti megoldásban alkalmazhatunk a szekvencialistában a 24-es vagy 31-es azonosító számon megadott szekvenciával lényegében azonos aminosavszekvenciákat kódoló DNS-fragmenseket is, nevezetesen olyan aminosavszekvenciákat, amelyekben egy vagy több aminosavat szubsztituáltunk, deletáltunk vagy inszertáltunk, feltéve, hogy ennek nem volt lényeges hatása a AAT-aktivitásra. Spontán vagy mesterséges mutációt tartalmazó aspC-t ugyanolyan módon kaphatunk, mint spontán vagy mesterséges mutációt tartalmazó AK-t kódoló DNS-t, amelyben a mutációnak nincs hatása az AK aktivitására és az L-lizin és L-treonin okozta szinergikus visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen lecsökkentett mivoltára.
A szekvencialistában a 30-as azonosító számon megadott nukleotidszekvencia a Corynebacterium lactofermentumböl származik, és első előállítása a 9. példában alább leírt, találmány szerinti eljárással történt. A találmány tárgyát képezi tehát egy, a szekvencialista 31-es azonosító számán megadott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló DNS. Ilyen DNS például egy, a szekvencialistában a 30-as azonosító számon megadott nukleotidszekvencia 879. és 2174. nukleotidja közötti nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS.
2. A találmány szerinti rekombináns DNS és korineform baktérium
A találmány szerinti korineform baktérium hordoz egy aszpartokinázt (mutáns AK), amely AK-ban az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenységet lényegesen lecsökkentettük, továbbá benne a dihidrodipikolinát-reduktázt kódoló DNS-szekvencia, a dihidrodipikolinát-szintázt kódoló DNS-szekvencia, a diamino-pimelinát-dekarboxilázt kódoló DNS-szekvencia és az aszpartát-amino-transzferázt kódoló DNS-szekvencia aktivitása fokozott.
A „fokozott aktivitású” a leírásban használt értelemben azt jelenti, hogy a DNS által kódolt enzim intracelluláris aktivitása megnövekedett, például a gén kópiaszámának növelése, erős promoter alkalmazása, nagy specifikus aktivitású enzimet kódoló gén alkalmazása vagy ezen módszerek kombinálása révén.
A mutáns AK-t hordozó korineform baktérium termelheti a mutáns aszpartokinázt mutáció eredményeképpen, vagy lehet olyan is, amely a mutáns lysC bejuttatásával van transzformálva.
HU 224 492 Β1
A fent leírt DNS bejuttatására alkalmas korineform baktériumokra szolgáljanak példaként az alábbi lizintermelő vad típusú törzsek:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870; Corynebacteríum acetoglutamicum ATCC15806; Corynebacterium callunae ATCC15991; Corynebacterium glutamicum ATCC13032; (Brevibacterium divaricatum) ATCC14020; (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869; (Corynebacterium lilium) ATCC15990; (Corynebacterium flavum) ATCC14067; Corynebacterium melassecola ATCC17965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066; Brevibacterium immariophilum ATCC14068; Brevibacterium roseum ATCC13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240; Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354; Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12340 (FERIM BP-1539).
A fenti baktériumtörzseken kívül mások is alkalmazhatók gazdaként, ilyenek lehetnek például L-lizin termelésére képes mutáns törzsek, amelyek a korábban említett törzsek leszármazottai. Ilyen mesterséges mutáns törzsek például a következők: S-(2-aminometilj-ciszteinnel (a továbbiakban „AEC) szemben rezisztens mutáns törzsek, ilyen például a Brevibacterium lactofermentum AJ11087 (NRRL B—1147) (56-1914-es, 56-1915-ös, 57-14157-es, 57-14158-as, 57-30474-es, 58-10075-ös, 59-4993-as, 61-35840-es, 62-24074-es, 62-36673-as, 5-11958-as, 7-112437-es és 7-112438-as számú japán közzétételi iratok); mutáns törzsek, amelyek növekedéséhez aminosavak, például L-homoszerin szükségesek (48-28078-as és 56-6499-es számú japán szabadalmi bejelentések); mutáns törzsek, amelyek AEC-vel szemben rezisztensek és növekedésükhöz aminosavak, például L-leucin, L-homoszerin, L-prolin, L-szerin, L-arginin, L-alanin és L-valin szükségesek (3708395-ös és 3825472-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés); L-lizint termelő mutáns törzsek, amelyek DL-a-amino-kaprolaktámmal, a-amino-lauril-laktámmal, aszpartátanalógokkal, „szulfa”-hatóanyagokkal, kinoidokkal és N-lauril-leucinnel szemben ellenállóak;); L-lizint termelő mutáns törzsek, amelyek oxálacetát-dekarboxiláz és a légzőrendszer enzimjeinek inhibitoraival szemben ellenállóak (50-53588-as, 50-31093-as, 52-102498-as, 53-9394-es, 53-86089-es, 55-9783-as,
55- 9759-es, 56-32995-ös és 56-39778-as számú közzétett japán szabadalmi bejelentések, és 53-43591-es és 53-1833-as számú japán közzétételi iratok); L-lizint termelő mutáns törzsek, amelyek növekedéséhez inozitol vagy ecetsav szükséges (55-9784-es és
56- 8692-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentések); L-lizint termelő mutáns törzsek, amelyek érzékenységet mutatnak fluor-pirosszőlősavval és 34 °C-nál nem alacsonyabb hőmérséklettel szemben (55-9783-as és a 53-86090-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés); valamint a Brevibacterium és a Corynebacterium nemzetségekhez tartozó mutáns törzsek, amelyek etilénglikollal szemben rezisztensek és
L-lizint termelnek (4411997-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).
A találmány egy konkrét megvalósítási módja szerint annak érdekében, hogy - amint azt fent leírtuk egy gazdasejtben fokozzuk az L-lizin bioszintetikus rendszere génjeinek aktivitását, a géneket plazmidvektor, transzpozon, fágvektor vagy hasonló alkalmazásával bejuttatjuk a gazdasejtbe. A bejuttatásától azt várjuk, hogy még kis kópiaszámú vektorok esetén is génaktivitást fokozó hatása legyen. Előnyösen azonban nagy kópiaszámú vektort alkalmazunk. A vektorok lehetnek például plazmidvektorok, mint például a fent leírt pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148, pAJ440. Lehetnek emellett transzpozonok is, mint amelyek például a következő hivatkozásokban szerepelnek: W002/02627-es és WO93/18151-es számú nemzetközi közzétételi iratok; 445385-ös számú európai szabadalmi leírás; 6-46867-es számú közzétett japán szabadalmi leírás; Vertes, A. A. és munkatársai, Mól. Microbiol., 11, 739-746 (1994); Bonamy, C. és munkatársai, Mól. Microbiol., 14, 571-581 (1994); Vertes, A. A. és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 245, 397-405, (1994); Jagar, W. és munkatársai, FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995); 7-107976-os és 7-327680-as számú közzétett japán szabadalmi bejelentések, valamint hasonlók.
A találmány szerinti megoldás megvalósítása során nem az az egyetlen lehetőség, hogy a mutáns lysC aktivitását fokozzuk. Alkalmazhatunk olyan törzseket is, ahol a kromoszomális DNS-en elhelyezkedő lysC tartalmaz mutációt, vagy amelyben a mutáns lysC be van építve a kromoszomális DNS-be. Egy másik lehetőség, hogy a mutáns lysC-t plazmidvektor alkalmazásával juttatjuk be. Másfelől előnyösen a dapA, a dapB, a lysA és az aspC aktivitását fokozzuk a hatékony L-lizin-termelés érdekében.
A dapA-, a dapB-, a lysA- és az aspC-gének mindegyikét egymást követően bejuttathatjuk a gazdasejtbe, sorrendben különböző vektorokat alkalmazva. Más megközelítésben, két- vagy háromféle gén egyetlen vektor alkalmazásával kombinálva is bejuttatható. Amennyiben különböző vektorokat alkalmazunk, a gének bármely sorrendben bejuttathatok, előnyösen azonban olyan vektorokat alkalmazunk, amelyek stabilan fennmaradnak és replikálódnak a gazdasejtben, és amelyek képesek egymás mellett párhuzamosan létezni.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint korineform baktériumhoz, aspC bejuttatására, vektorként előnyösen alkalmazható a pVK7 vektor. A találmány tárgyát képező pVK7 vektor egy, korineform baktériumokhoz használható klónozóvektor, amely autonóm módon replikálódni képes Escherichia coli és Brevibacterium lactofermentum sejtjeiben egyaránt, tartalmaz egy többszörös klónozóhelyet, valamint lacZ’-t. A pVK7 vektor elkészíthető a 8. példában alább leírt eljárással.
Mutáns AK-t hordozó korineform baktériumot, amelyik a fokozott aktivitású dapB-t, dapA-t, lysA-t és aspC-t is tartalmazza, úgy kaphatunk, hogy például egy korineform baktériumba mint gazdasejtbe mutáns
HU 224 492 Β1 lysC-t, dapB-t, dapA-t, lysA-t és aspC-t tartalmazó, korineform baktériumok sejtjeiben autonóm módon replikálódó rekombináns DNS-t juttatunk.
A fent említett rekombináns DNS-eket úgy kaphatjuk meg például, hogy minden egyes - L-lizin bioszintézisében részt vevő - gént egy vektorba (például plazmid-, transzpozon- vagy fágvektorba) inszertálunk a fent leírtak szerint.
Amennyiben plazmidot alkalmazunk vektorként, a rekombináns DNS-t bejuttathatjuk a gazdasejtbe elektromos pulzus módszerével [Sugimoto és munkatársai, 2-207791-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés]. Gén amplifikálását transzpozonnal úgy végezhetjük el, hogy egy, plazmidot hordozó transzpozont juttatunk be a gazdasejtbe, és indukáljuk a transzpozon átugrását.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazott korineform baktériumban a fent említett géneken kívül az L-lizin-bioszintézisben részt vevő egyéb gének aktivitása is fokozott lehet, úgymint például DNS-szekvenciák, amelyek foszfoenol-piruvát-karboxilázt, illetve diamino-pimelát-dekarboxilázt kódolnak.
3. Eljárás L-lizin termelésére
L-lizint hatékonyan termelhetünk úgy, hogy a fent leírtak szerint a fokozott aktivitású, L-lizin bioszintéziséhez szükséges géneket hordozó korineform baktériumot megfelelő tápközegben tenyésztjük így lehetővé téve L-lizin termelődését és felhalmozódását a baktériumsejt-kultúrában, majd az L-lizint kinyerjük a kultúrából.
Az alkalmazható tápközeg lehet például egy közönséges tápközeg, amelyik szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen ionokat és nem kötelezően egyéb szerves komponenseket tartalmaz.
Szénforrásként cukrokat, mint például glükózt, fruktózt, szacharózt, melaszt és keményítőhidrolizátumot alkalmazhatunk, valamint szerves savakat, mint például fumársavat, citromsavat és borostyánkősavat.
Nitrogénforrásként alkalmazhatunk ammóniumsókat, mint például az ammónium-szulfát, ammónium-klorid, ammónium-foszfát; szerves eredetű nitrogént, például szójabab-hidrolizátumot; ammóniagázt vagy vizes ammóniát.
Szerves, nyomnyi mennyiségben szükséges anyagokat biztosító tápanyagforrásként kívánatos például Brvitamint, L-homoszerint, élesztőkivonatot vagy hasonlót alkalmazni megfelelő mennyiségben. A fentiek mellett kálium-foszfátot, magnézium-szulfátot, vas- és magnéziumiont stb. adunk kis mennyiségben a tápközeghez, ha szükséges.
A tenyésztést előnyösen aerob körülmények között végezzük 30-90 órán keresztül. A tenyésztési hőmérsékletet előnyösen 25 °C és 90 °C közé állítjuk be, a pH-t pedig 5 és 8 közé. Szerves vagy szervetlen, savas vagy bázikus anyagok, ammóniagáz vagy hasonlók egyaránt alkalmazhatók a pH-beállítás során. Az L-lizint kinyerhetjük a tenyészetből a szokványos ioncsere módszerének, kicsapási módszereknek, valamint egyéb módszerek kombinálásával.
Az alábbiakban példák segítségével a találmány szerinti megoldást közelebbről is ismertetjük.
1. példa: Vad típusú és mutáns lysC-gén előállítása Brevibacterium lactofermentumöó/ (1) Vad típusú és mutáns lysC-gének, valamint az őket tartalmazó plazmidok előállítása
A Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 és egy, az ATCC13869-es törzsből kiindulva mutációs kezeléssel kapott L-lizin-termelő törzs, az AJ3445 (FERM P-1944) szolgáltak kromoszomális DNS donorjaként. Az AJ3445-ÖS törzset mutációnak vetettük alá, aminek során a lysC-t megváltoztattuk úgy, hogy az AK-ban az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenységet lényegesen lecsökkentettük [Journal of Biochemistry, 68, 701, (1970)].
A lysC-t tartalmazó DNS-fragmenst kromoszomális DNS-ből amplifikáltuk PCR-módszerrel [„polimerase chain reaction”, polimeráz-láncreakció, lásd White, T. J. és munkatársai, Trends. Génét., 5, 185, (1989)]. Az amplifikáláshoz használt DNS-láncindítókként a szekvencialistában az 1-es és 2-es azonosító számon megadott szekvenciájú 23 tagú egyes szálú DNS-eket szintetizáltuk meg, hogy velük egy kb. 1643 bp hosszúságú, a lysC-t kódoló régiót amplifikáljuk a Corynebacterium glutamicum esetében ismert szekvencia alapján [Molecular Microbiology 5(5), 1197, (1991); Mól. Gén. Génét., 224, 317, (1990)]. A DNS-t a szokványos módon szintetizáltuk meg egy „model 380B” (Applied Biosystems) szintetizálókészüléket és a foszforamidit-módszert alkalmazva [Tetrahedron Letters 22, 1859, (1981)].
A gén PCR-rel történő amplifikálását egy „DNA Thermal Cycler Model PJ2000” készülékkel (Takara Shuzo) végeztük, Taq-polimerázt alkalmazva a forgalmazó utasításai szerint. Az 1643 bp hosszúságú génfragmens amplifikálásának sikeres mivoltáról agaróz-gélelektroforézis segítségével győződtünk meg. Ezután a gélből kivágott fragmenst a szokványos módszerrel tisztítottuk, majd Nrul (Takara Shuzo) és EcoRI (Takara Shuzo) restrikciós enzimekkel megemésztettük.
A génfragmens számára klónozóvektorként a pHSG399-et [Takeshita, S. és munkatársai, Gene, 61, 63-74 (1987)] alkalmaztuk. A pHSG399-et Smal (Takara Shuzo) és EcoRI restrikciós enzimekkel megemésztettük, és az amplifikált lysC-fragmenssel ligáltuk. A DNS ligálását a „DNA ligation kit” (Takara Shuzo) segítségével végeztük el a feltüntetett módszer alapján. Ilyenformán olyan plazmidokat állítottunk elő, amelyekben a Brevibacterium lactofermentum kromoszómáiból amplifikált lysC-fragmenseket pHSG399-cel ligáltuk. Az ATCC13869-ből (vad típusú törzs) származó lysC-t tartalmazó plazmidot p399AKY-nak jelöltük, azt a plazmidot pedig, amelyik az AJ3463-ból származó (L-lizin-termelő baktérium) plazmidot tartalmazta, p399AK9-nek.
A p399AKY-ba és a p399AK9-be olyan DNS-fragmenst inszertáltunk, ami egy plazmidot képessé tesz autonóm módon replikálódni Corynebacterium nemzetséghez tartozó baktériumokban (a leírásban használt értelemben a „Brevi.-ori. ilyen DNS-fragmenst jelöl), így rendre olyan lysC-t tartalmazó plazmidokat állítva elő,
HU 224 492 Β1 amelyek képesek autonóm módon replikálódni Corynebacterium nemzetséghez tartozó baktériumokban. A Brevi.-ori.-t a pHK4 plazmidvektorból állítottuk elő, ami tartalmazza a Brevi.-ori.-t, és autonóm módon replikálódik mind Escherichia coli, mind a Corynebacteríum nemzetséghez tartozó baktériumok sejtjeiben. A pHK4-et a pHC4 Kpnl-gyel (Takara Shuzo) és BamHl-gyel (Takara Shuzo) végzett emésztésével, a Brevi.-ori.-fragmens extrahálásával és az előzőleg szintén Kpnl-gyel és BamHI-gyel megemésztett pHSG298-cal [5-7491-es számú közzétett japán szabadalmi leírás] való ligálással állítottuk elő. A pHK4 a gazdasejtet ellenállóvá teszi kamamicinnel szemben. A pHK4-et hordozó Escherichia coli törzset Escherichia coli AJ13136-nak jelöltük, és 1995. augusztus 1-jén helyeztük letétbe FERM BP-5186-os nyilvántartási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry” Intézetnél (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan).
A pHK4-et Kpnl és BamHI restrikciós enzimekkel megemésztettük, és a hasított végeket tompa végűvé tettük. A tompa végek kialakítását „DNA Blunting kit” reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával végeztük el a feltüntetett módszer szerint. A tompa vég kialakítása után foszforilált BamHI-linkert (Takara Shuzo) ligáltunk a tompa végekhez, ezzel a módosítással elérve azt, hogy a Brevi.-őri.-szakasznak megfelelő DNS-fragmens pHK4-ből csupán BamHI-gyel végzett emésztéssel is kivágható legyen. Ez utóbbi plazmidot emésztettük BamHI-gyel, és a kapott Brevi.-őri. DNS-fragmenst ligáltuk az előzőleg rendre szintén BamHI-gyel emésztett p399AKY-nal és p399AK9-cel. így a lysC-t tartalmazó és Corynebacteríum nemzetséghez tartozó baktériumsejtekben autonóm módon replikálódni képes plazmidokat hoztunk létre.
A vad típusú lysC-gént tartalmazó, p399AKY-ból származó plazmidot p399AKYB-nek, a p399AK9-ből származót p399AK9B-nek jelöltük. A p399AKYB és a p399AK9B létrehozásának folyamatát az 1. ábra szemlélteti. A mutáns lysC-t tartalmazó p399AK9B-nek a vad típusú Brevibacterium lactofermentumba (AJ 12036-os törzs, FERM BP-734) történt bejuttatásával kapott AJ12691-es törzset 1992. április 10-én helyeztük letétbe FERM P-12918 nyilvántartási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry Intézetnél (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan), majd 1995. február 10-én a Budapesti Egyezménynek megfelelően is letétbe helyeztünk a FERM ΒΡ-4999-es nyilvántartási számon.
(2) A Brevibacterium lactofermentumőó/ származó vad típusú és a mutáns lysC nukleotidszekvenciájának meghatározása
A vad típusú lysC-t tartalmazó p399AKY és a mutáns lysC-t tartalmazó p399AK9 plazmidokat a megfelelő transzformánsokból tisztítottuk a vad típusú és a mutáns lysC nukleotidszekvenciájának meghatározása érdekében. A nukleotidszekvencia meghatározását Sanger és munkatársai módszerével végeztük [Sanger, F. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977)].
A vad típusú lysC p399AKY által kódolt nukleotidszekvenciáját a szekvencialistában a 3-as azonosító számon adtuk meg. Másfelől, a mutáns lysC p399AK9 által kódolt nukleotidszekvenciája csupán egy nukleotidban tartalmaz mutációt, nevezetesen az 1051. G A-ra változott a szekvencialistában a 3-as azonosító számon megadott, vad típusú lysC-nek megfelelő szekvenciához képest. Ismert, hogy a Corynebacteríum glutamicum lysC-génjének terméke két alegységből áll (a és β), amelyek azonos DNS-szálon azonos leolvasási fázisban vannak kódolva [Kalinowsky, J. és munkatársai, Molecular Microbiology 5(5), 1197 (1991)]. A homológjából ítélve feltételezhetjük, hogy a találmány szerinti génszekvencia szintén két alegységet kódol (a és β), amelyek kódolórégiói azonos DNS-szálon azonos leolvasási fázisban helyezkednek el.
A vad típusú AK-fehérje α-alegysége DNS-ének nukleotidszekvenciájából származtatott aminosavszekvenciát a szekvencialistában a 4-es azonosító számon adtuk meg a DNS-szekvenciával együtt. Az aminosavszekvenciát önmagában a szekvencialistában az 5-ös azonosító számon adtuk meg. A vad típusú AK-fehérje β-alegysége DNS-ének nukleotidszekvenciájából származtatott aminosavszekvenciát a szekvencialistában a 6-os azonosító számon adtuk meg a DNS-szekvenciával együtt. Az aminosavszekvenciát önmagában a szekvencialistában a 7-es azonosító számon adtuk meg. Az alegységek mindegyikében GTG a kezdőkodon, itt azonban az ennek megfelelő aminosav a metionin. Az ennek a kodonnak megfelelő aminosav lehet mindazonáltal metionin, valin és formil-metionin egyaránt.
Másfelől, a mutáns lysC szekvenciájában a mutáció egy olyan szubsztitúciót jelent, ahol a mutáns lysC olyan AK-t kódol, amelyben a vad típusú AK a-alegységének N-terminálisától számított 279. alanin treoninra van kicserélve, és a β-alegység N-terminálisától számított 30. alanin treoninra van kicserélve. (A szekvencialistában az 5-ös és a 7-es azonosító számon megadott szekvenciák.)
2. példa: dapB előállítása Brevibacterium lactofermentumőó/ (1) dapB előállítása és a dapB-t tartalmazó plazmid elkészítése
A vad típusú Brevibacterium lactofermentum ATCC13869-es törzset használtuk a kromoszomális DNS donorjaként. A kromoszomális DNS-t az ATCC13869-es törzsből a szokványos módon állítottuk elő. A dapB-t tartalmazó DNS-fragmenst a kromoszomális DNS-ből PCR segítségével amplifikáltuk. DNS-láncindítókként azok a 23 bázispárból álló DNS-szakaszok szolgáltak, amelyek a szekvencialistában a 8-as, valamint a 9-es azonosító számon vannak megadva. Ezekkel amplifikáltunk egy kb. 2,0 kb hosszúságú régiót, amely a Brevibacterium lactofermentum esetében ismert szekvenciája alapján a DDPR-t kódolja [Journal of Bacteriology, 175(9), 2743, (1993)]. A DNS szintézisét és a PCR-t az 1. példában leírtak szerint vé10
HU 224 492 Β1 geztük el. A 2001 bp hosszúságú amplifikált génfragmenshez klónozóvektorként a pCR-Script-vektort (Invitrogen) használtuk, ezt ligáltuk az amplifikált dapB-fragmenssel. így tehát egy olyan plazmidot készítettünk, amelyben a Brevibacterium lactofermentum kromoszómájából amplifikált 2001 bp hosszúságú dapB-fragmenst a pCR-Scripttel ligáltuk. A fent leírt plazmidot, amelyben a dapB az ATCC13869-ből származott, pCRDAPB-nek jelöltük. A pCRDAPB E. coli JM109-es törzsbe történt bejuttatásával kapott AJ13107-es törzset 1995. május 26-án helyeztük letétbe nemzetközileg a Budapesti Egyezménynek megfelelően a FERM BP-5114 nyilvántartási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry Intézetnél (1-3, Higashi
I- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan).
Egy, a DDPR-struktúrgént tartalmazó 1101 bp hosszúságú fragmenst úgy kaptunk meg, hogy a pCRDAPB-t emésztettük EcoRV-tel és Sphl-gyel. Ezt a fragmenst ligáltuk az előzőleg Hincll-vel és Sphl-gyel megemésztett pHSG399-be, ezzel újabb plazmidot kapva, amelyet p399DPR-nek jelöltünk.
Annak érdekében, hogy a korineform baktériumban autonóm módon replikálódni képes, dapB-t tartalmazó plazmidot kapjunk, Brevi.-ori.-t juttattunk be az elkészített p399DPR plazmidba. A pHK4-et megemésztettük Kpnl restrikciós enzimmel (Takara Shuzo), majd a hasított végeket tompa végekké tettük. A tompa végek kialakítását „DNA Blunting kit reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával végeztük el a feltüntetett módszer szerint. A tompa végek kialakítása után egy foszforilált BmaHI-linkert (Takara Shuzo) ligáltunk hozzájuk, hogy ezzel a módosítással a Brevi.-ori.-szakasznak megfelelő DNS-fragmens a pHK4-ből BamHI-gyel kívághatóvá váljék. Ezt a plazmidot emésztettük BamHI-gyel, és a kapott Brevi.-ori. DNS-fragmenst az előzőleg szintén BamHI-gyel megemésztett p399DPR plazmiddal ligáltuk, hogy korineform baktériumban autonóm módon replikálódni képes dapB-t tartalmazó plazmidhoz jussunk. Ezt a plazmidot jelöltük pDPRB-nek. A pDPRB elkészítésének folyamatát mutatja be a 2. ábra.
(2) Brevibacterium lactofermentumbó/ származó dapB nukleotidszekvenciájának meghatározása
A p399DPR-t hordozó AJ13107-es törzsből plazmid-DNS-t állítottunk elő, majd az 1. példában leírttal azonos módon meghatároztuk a nukleotidszekvenciáját. A meghatározott nukleotidszekvenciát és a belőle származtatott aminosavszekvenciát a szekvencialistában a 10-es azonosító számon adtuk meg. Az aminosavszekvenciát önmagában a szekvencialistában a
II- es azonosító számon adtuk meg.
3. példa: dapA előállítása Brevibacterium lactofermentumbó/ (1) dapA előállítása és a dapA-t tartalmazó plazmid elkészítése
A vad típusú Brevibacterium lactofermentum ATCC13869-es törzset használtuk a kromoszomális DNS donorjaként. A kromoszomális DNS-t az
ATCC13869-es törzsből a szokványos módon állítottuk elő. A dapA-t tartalmazó DNS-fragmenst a kromoszomális DNS-ből PCR segítségével amplifikáltuk. DNS-láncindítókként azok a 23 bázispárból álló DNS-szakaszok szolgáltak, amelyek a szekvencialistában a 12-es, valamint a 13-as azonosító számon vannak megadva. Ezekkel amplifikáltunk egy kb. 1,5 kb hosszúságú régiót, amely a Corynebacteríum glutamicum esetében ismert szekvencia alapján megállapíthatóan a DDPS-t kódolja [Nucleic Acids. Rés., 18(21), 6421, (1990); EMBL nyilvántartási szám: X53993]. A DNS szintézisét és a PCR-t az 1. példában leírtak szerint végeztük el. A pCR1000 plazmidot [Invitrogen, lásd még Bio/Technology 9, 657 (1991)] alkalmaztuk az 1,411 bp hosszúságú amplifikált génfragmens klónozóvektoraként, és ezt ligáltuk az amplifikált dapA-fragmenssel. A DNS ligálását a „DNA ligation kit reagenskészlet (Takara Shuzo) segítségével végeztük el a feltüntetett módszer alapján. így tehát egy olyan plazmidot készítettünk, amelyben a Brevibacterium lactofermentum kromoszómájából amplifikált 1,411 bp hosszúságú dapA-fragmenst a pCR1000-rel ligáltuk. A fent leírt plazmidot, amelyben a dapA az ATCC13869-ből származott, pCRDAPA-nak jelöltük.
A pCRDAPA E. coli JM109-es törzsbe történt bejuttatásával kapott AJ13106-os törzset 1995. május 26-án helyeztük letétbe nemzetközileg a Budapesti Egyezménynek megfelelően a FERM BP-5113 nyilvántartási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry Intézetnél (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan).
A Brevi.-ori.-t bejuttattuk az elkészített pCRDAPA plazmidba, ezzel az így létrehozott plazmid képessé vált autonóm módon replikálódni korineform baktériumsejtekben. A pHK4-et Kpnl és BamHI restrikciós enzimekkel (Takara Shuzo) emésztettük, a hasított végeket pedig tompa végekké tettük. A tompa végek kialakítását „DNA Blunting kit” reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával végeztük el a feltüntetett módszer szerint. A tompa végek kialakítása után egy foszforilált Smal-linkert (Takara Shuzo) ligáltunk hozzájuk, hogy ezzel a módosítással a Brevi.-ori.-szakasznak megfelelő DNS-fragmens a pHKI-ből csupán Smal-gyel is kivághatóvá váljék. Ezt a plazmidot emésztettük Smal-gyel, és a kapott Brevi.-ori. DNS-fragmenst az előzőleg szintén Smal-gyel megemésztett pCRDAPA plazmiddal ligáltuk, hogy korineform baktériumban autonóm módon replikálódni képes dapA-t tartalmazó plazmidhoz jussunk. Ezt a plazmidot jelöltük pDPSB-nek. A pDPSB(Kmr) elkészítésének folyamatát mutatja be a 3. ábra.
(2) Brevibacterium lactofermentumbó/ származó dapA nukleotidszekvenciájának meghatározása
A pCRDAPA-t hordozó AJ 13106-os törzsből plazmid-DNS-t állítottunk elő, majd az 1. példában leírttal azonos módon meghatároztuk a nukleotidszekvenciáját. A meghatározott nukleotidszekvenciát és a belőle származtatott aminosavszekvenciát a szekvencialistában a 14-es azonosító számon adtuk meg. Az amino11
HU 224 492 Β1 savszekvenciát önmagában a szekvencialistában a 15-ös azonosító számon adtuk meg.
4. példa: lysA előállítása Brevibacteríum lactofermentumbó/ (1) lysA előállítása és a lysA-t tartalmazó plazmid elkészítése
A Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869-es vad típusú törzset alkalmaztuk kromoszomális DNS-donorként. A kromoszomális DNS-t az ATCC13869-es törzsből nyertük a szokványos módon. Az argS-t, lysA-t és az őket tartalmazó operon egy promoterét a kromoszomális DNS-ből amplifikáltuk PCR segítségével. Amplifikáláshoz használt DNS-láncindítókként azok a 23 bázispárból álló DNS-szakaszok szolgáltak, amelyek a szekvencialistában a 16-os, valamint a 17-es azonosító számon vannak megadva. Ezekkel amplifikáltunk egy kb. 3,6 kb hosszúságú régiót, amely a Corynebacterium glutamicum esetében ismert szekvencia alapján megállapíthatóan az arginil-tRNS-szintázt és a DDC-t kódolja [Molecular Microbiology 4(11), 1819, (1990) Molecular and General Genetics, 212, 112 (1988)]. A DNS szintézise és a PCR ugyanúgy végezhető el, mint azt fent az 1. példában leírtuk. A pontosan 3579 bp hosszúságú génfragmens amplifikálásához a pHSG399-et használtuk. A pHSG399-et Smal restrikciós enzimmel (Takara Shuzo) emésztettük, majd az amplifikált lysA-t tartalmazó DNS-fragmenssel ligáltuk. Az így kapott plazmidot, amely tartalmazta az ATCC13869-ből származó lysA-t, p399LYSA-nak jelöltük.
A lysA-t tartalmazó DNS-fragmenst a p399LYSA Kpnl-gyel (Takara Shuzo) végzett emésztése során kaptuk meg. Ezt a DNS-fragmenst a pHSG299-be ligáltuk, amelyet előzőleg Kpnl-gyel és BamHI-gyel emésztettünk meg. A kapott plazmidot p299LYSA-nak jelöltük. A p299LYSA elkészítésének folyamatát a 4. ábra mutatja be.
A Brevi.-ori.-t beépítettük a kapott p299LYSA plazmidba, ezáltal egy, lysA-t tartalmazó, korineform baktériumban autonóm módon replikálódni képes plazmidot hoztunk létre. A pHK4-et Kpnl és BamHI enzimekkel emésztettük, majd a hasított végeket tompa végűvé tettük. A tompa végek kialakítását a „DNA Blunting kit” reagenskészlet (Takara Shuzo) segítségével végeztük a feltüntetett módszer alkalmazásával. A tompa vég kialakítása után foszforilált Kpnl-linkert (Takara Shuzo) ligáltunk a tompa végekhez, ezzel a módosítással elérve azt, hogy a Brevi.-őri.-szakasznak megfelelő DNS-fragmens pHK4-ből csupán Kpnl-gyel végzett emésztéssel is kivágható legyen. Ez utóbbi plazmidot emésztettük Kpnl-gyel, és a kapott Brevi.-ori. DNS-fragmenst ligáltuk az előzőleg szintén Kpnl-gyel emésztett p299LYSA-val, ezzel egy, lysA-t tartalmazó, korineform baktériumsejtekben autonóm módon replikálódni képes plazmidot nyerve. A kapott plazmidot pLYSAB-nak jelöltük. A pLYSAB elkészítésének folyamatát az 5. ábra mutatja be.
(2) A Brevibacteríum lactofermentumbó/ származó lysA nukleotidszekvenciájának meghatározása
A p299LYSA plazmid-DNS-t izoláltuk, és nukleotidszekvenciáját meghatároztuk az 1. példában leírtakkal azonos módon. A meghatározott nukleotidszekvenciát és a nukleotidszekvencia által kódolt aminosavszekvenciát a szekvencialistában a 18-as azonosító számon adtuk meg. A nukleotidszekvencia részét képező gének, az argS, illetve a lysA által kódolt aminosavszekvenciákat a szekvencialistában rendre a 19-es és a 20-as azonosító számon adtuk meg.
5. példa: Escherichia colibó/ származó aspC előállítása és aspC-t tartalmazó plazmid elkészítése
Escherichia coli JM109-es törzset alkalmaztunk kromoszomális DNS-donorként. A kromoszomális DNS-t az Escherichia coli JM109-es törzsből nyertük a szokványos módon. Az aspC-t tartalmazó fragmenst kromoszomális DNS-ből amplifikáltuk PCR segítségével. Amplifikáláshoz használt DNS-láncindítókként azok a 20 bázispárból álló DNS-szakaszok szolgáltak, amelyek a szekvencialistában a 21-es, valamint a 22-es azonosító számon vannak megadva. Ezen láncindítók tervezésénél az E. coli esetében ismert szekvenciát vettük alapul [J. Biochem., 97(4), 1259 (1985)]. A DNS szintézise és a PCR ugyanúgy végezhető el, mint azt fent az 1. példában leírtuk. A pontosan 3579 bp hosszúságú amplifikált fragmenst a pCR1000 TA-klónozó vektorba klónoztuk. A kapott plazmidot pCRASPC-ként jelöltük.
Az aspC-t tartalmazó amplifikált DNS nukleotidszekvenciáját és a nukleotidszekvencia által kódolt származtatott aminosavszekvenciát a szekvencialistában a 23-as azonosító számon adtuk meg. Az aminosavszekvenciát önmagában a szekvencialistában a 24-es azonosító számon adtuk meg.
1. összehasonlító példa: Mutáns lysC-t és dapA-t kombinálva tartalmazó plazmid elkészítése
Egy mutáns lysC-t, dapA-t és korineform baktériumokban működőképes replikációs origót tartalmazó plazmidot készítettünk a dapA-t tartalmazó pCRDAPA plazmidból és a mutáns lysC-t, valamint a Brevi.-ori.-t tartalmazó p399AK9B plazmidból kiindulva. A p399AK9B-t teljesen megemésztettük Sall-gyel, majd a végeket tompává tettük. Egy EcoRI-linkert ligáltunk hozzájuk egy olyan plazmid létrehozása érdekében, ahol a Sall-helyet EcoRI-hellyé alakítottuk át. A kapott plazmidot p399AK9BSE-nek jelöltük. A mutáns lysC-t és a Brevi.-ori.-t egy fragmensként kivágtuk EcoRI-gyel részlegesen emésztve a p399AK9BSE-t. Ezt a fragmenst ligáltuk az előzetesen EcoRI-gyel emésztett pCRDAPA-val. A kapott plazmidot pCRCAB-nek jelöltük. Ez a plazmid autonóm módon replikálódni képes E. coliban és korineform baktériumokban, a gazdasejtnek kanamicinrezisztenciát biztosít, továbbá a mutáns lysC-t és a dapA-t kombinálva tartalmazza. A pCRCAB elkészítésének folyamatát a
6. ábra mutatja be.
2. összehasonlító példa: Mutáns lysC-t és dapB-t kombinálva tartalmazó plazmid elkészítése
A mutáns lysC-t és a dapB-t tartalmazó plazmidot a mutáns lysC-t tartalmazó p399AK9 és a dapB-t tartal12
HU 224 492 Β1 mazó p399DPR plazmidokból kiindulva készítettük el. A p399DPR plazmid EcoRV-tel és Sphl-gyel történt emésztésével a DDPR struktúrgénjét tartalmazó 1101 bp hosszúságú fragmenst nyertünk. Ezt a fragmenst ligáltuk az előzőleg Sall-gyel megemésztett, tompa végűvé tett és Sphl-gyel tovább emésztett p399AK9-cel, hogy olyan plazmidot készíthessünk, amelyik a mutáns lysC-t és a dapB-t kombinálva tartalmazza. Ezt a plazmidot jelöltük p399AKDDPR-nek.
Ezután bejuttattuk a Brevi.-ori.-t a kapott p399AKDDPR-be. A Brevi.-ori.-t tartalmazó pHK4 plazmidot Kpnl restrikciós enzimmel emésztettük (Takara Shuzo), a hasított végeket pedig tompa végekké tettük. A tompa végek kialakítását „DNA Blunting kit reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával végeztük el a feltüntetett módszer szerint. A tompa végek kialakítása után egy foszforilált BamHI-linkert (Takara Shuzo) ligáltunk hozzájuk, hogy ezzel a módosítással a Brevi.-őri.-szakasznak megfelelő DNS-fragmens a pHK4-ből BamHI-gyel kivághatóvá váljék. Ezt a plazmidot emésztettük BamHI-gyel, és a kapott Brevi.-ori. DNS-fragmenst az előzőleg szintén BamHI-gyel megemésztett p399AKDDPR plazmiddal ligáltuk, hogy korineform baktériumban autonóm módon replikálódni képes mutáns lysC-t és dapB-t tartalmazó plazmidhoz jussunk. Ezt a plazmidot jelöltük pCB-nek. A pCB elkészítésének folyamatát mutatja be a 7. ábra.
3. összehasonlító példa: dapA-t és dapB-t kombinálva tartalmazó plazmid elkészítése
A dapA-t tartalmazó pCRDAPA plazmidot Kpnl-gyel és EcoRI-gyel emésztettük, egy dapA-t tartalmazó DNS-fragmenshez jutva így. Ezt a fragmenst ligáltuk az előzőleg Kpnl-gyel és EcoRI-gyel megemésztett pHSG399 vektorplazmiddal. A kapott plazmidot p399DPS-nek jelöltük.
Másrészről a dapB-t tartalmazó pCRDAPB plazmidot Sacll-vel és EcoRI-gyel emésztettük, egy 2,0 kb hosszúságú, DDPR-t kódoló régiót tartalmazó DNS-fragmenshez jutva így. Ezt a fragmenst ligáltuk az előzőleg Sacll-vel és EcoRI-gyel megemésztett p399DPS plazmiddal. A kapott, dapA-t és dapB-t kombinálva tartalmazó plazmidot p399AB-nek jelöltük.
Ezután bejuttattuk a Brevi.-ori.-t a kapott p399AB-be. A Brevi.-ori.-t tartalmazó pHK4 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztettük (Takara Shuzo), a hasított végeket pedig tompa végekké tettük. A tompa végek kialakítását „DNA Blunting kit” reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával végeztük el a feltüntetett módszer szerint. A tompa végek kialakítása után egy foszforilált Kpnl-linkert (Takara Shuzo) ligáltunk hozzájuk, hogy ezzel a módosítással a Brevi.-ori.-szakasznak megfelelő DNS-fragmens a pHK4-ből csupán Kpnl-gyel is kivághatóvá váljék. Ezt a plazmidot emésztettük Kpnl-gyel, és a kapott Brevi.-ori. DNS-fragmenst az előzőleg szintén Kpnl-gyel megemésztett p399AB plazmiddal ligáltuk, hogy korineform baktériumban autonóm módon replikálódni képes dapA-t és dapB-t tartalmazó plazmidhoz jussunk. Ezt a plazmidot jelöltük pAB-nek. A pAB elkészítésének folyamatát mutatja be a 8. ábra.
6. példa: Mutáns lysC-t, dapA-t és dapB-t kombinálva tartalmazó plazmid elkészítése
A p399DPS plazmidot EcoRI-gyel és Sphl-gyel emésztettük és tompa végűvé tettük, majd a dapA-génfragmenst kinyertük. Ezt a fragmenst ligáltuk az előzőleg Sall-gyel megemésztett és tompa végűvé tett p399AK9-cel, a mutáns lysC-t és a dapA-t együttesen tartalmazó p399CA plazmidot kapva így.
A dapB-t tartalmazó pCRDAPB plazmidot EcoRl-gyel emésztettük és tompa végűvé tettük, majd egy, 2,0 kb hosszúságú, dapB-t tartalmazó DNS-fragmens kinyerése érdekében Sacl-gyel megemésztettük. A mutáns lysC-t és dapA-t tartalmazó p399CA plazmidot Spel-gyel megemésztettük és tompa végűvé tettük, majd Sacl-gyel is megemésztettük és a kapott dapB-fragmenssel ligáltuk. így tehát egy, mutáns lysC-t, dapA-t és dapB-t tartalmazó plazmidot nyertünk. Ezt a plazmidot jelöltük p399CAB-nek.
Ezután bejuttattuk a Brevi.-ori.-t a kapott p399CAB-be. A Brevi.-ori.-t tartalmazó pHK4 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztettük (Takara Shuzo), a hasított végeket pedig tompa végekké tettük. A tompa végek kialakítását „DNA Blunting kit” reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával végeztük el a feltüntetett módszer szerint. A tompa végek kialakítása után egy foszforilált Kpnl-linkert (Takara Shuzo) ligáltunk hozzájuk, hogy ezzel a módosítással a Brevi.-ori.-szakasznak megfelelő DNS-fragmens a pHK4-ből csupán Kpnl-gyel is kivághatóvá váljék. Ezt a plazmidot emésztettük Kpnl-gyel, és a kapott Brevi.-ori. DNS-fragmenst az előzőleg szintén Kpnl-gyel megemésztett p399CAB plazmiddal ligáltuk, hogy korineform baktériumban autonóm módon replikálódni képes mutáns lysC-t, dapA-t és dapB-t tartalmazó plazmidhoz jussunk. Ezt a plazmidot jelöltük pCAB-nek. A pCAB elkészítésének folyamatát mutatja be a 9. ábra.
7. példa: Mutáns lysC-t, dapA-t, dapB-t és lysA-t kombinálva tartalmazó plazmid elkészítése
A lysA-t tartalmazó p299LYSA plazmidot Kpnl-gyel és BamHI-gyel emésztettük, majd a lysA-génfragmenst kinyertük. Ezt a fragmenst ligáltuk az előzőleg Hpal-gyel (Takara Shuzo) megemésztett és tompa végűvé tett pCAB-vel, ily módon egy, mutáns lysC-t, dapA-t, dapB-t és lysA-t kombinálva tartalmazó, korineform baktériumsejtekben autonóm módon replikálódni képes plazmidot kapva. Az így elkészített plazmidot jelöltük pCABL-nek. A pCABL elkészítésének folyamatát mutatja be a
10. ábra. Megjegyezzük, hogy noha a Hpal hasítóhely, amelyre a lysA-gént inszertáltuk, a dapB-gént tartalmazó DNS-fragmensen belül helyezkedik el a pCALB-ben, a dapB-gén nem kapcsolódik ki, ugyanis a Hpal-hely a dapB-gén promoterrégiójától 5'-irányban helyezkedik el (a szekvencialistában a 10-es azonosító számon megadott szekvencia 611. és 616. nukleotidja között).
8. példa: Egy aspC-t tartalmazó plazmid elkészítése
Vektorként aspC bejuttatására korineform baktériumba egy újonnan elkészített korineform baktériumokhoz használható klónozóvektort, a pVK7-et használtuk.
HU 224 492 Β1
A pVK7-et úgy készítettük el, hogy pHSG299-et, egy E. colihoz használható vektort [Kmr; Takeshita, S. és munkatársai, Gene, 61, 63 (1987)] ligáltunk pAM330-cal, egy Brevibacteríum lactofermentumhoz használható kriptikus plazmiddal az alábbiak szerint. A pAM330-at a Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869-es törzsből állítottuk elő. A pHSG299-et egy, pusztán egyetlen helyen hasító restrikciós enzimmel, az Avall-vel emésztettük (Takara Shuzo), T4-DNS-polimeráz alkalmazásával tompa végűvé tettük, valamint az előzőleg Hindlll-mal emésztett (Takara Shuzo) és T4-polimeráz alkalmazásával tompa végűvé tett pAM330-cal ligáltuk. A pHSG299-be inszertált pAM330 orientációjától függően a két kapott plazmidot pVK6-nak és pVK7-nek jelöltük. A további kísérletekben a pVK7-et használtuk. A pVK7 E. coli és Brevibacteríum lactofermentum sejtjeiben egyaránt autonóm módon replikálódni képes, és lacZ’-t és a pHSG299-ből származó többszörös klónozóhelyet tartalmaz. A pVK6 és a pVK7 elkészítésének folyamatát a 11. ábra mutatja be.
Az elkészített átviteli vektorral, a pVK7-tel aspC-t ligáltunk. A pCRASPC plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel (Takara Shuzo) emésztettük, és az előzőleg szintén EcoRI-gyel megemésztett pVK7-tel ligáltuk. A ligálást a „DNA Ligation kit” reagenskészlettel (Takara Shuzo) végeztük el. Az aspC pVK7-tel végzett ligálásával kapott plazmidok közül egy olyat, amelyikben az inszertált aspC-fragmens orientációja megfelelt a lac-promoter pVK7-beli transzkripciós orientációjának, pOm-nek jelöltünk. A pOm elkészítésének folyamatát mutatja be a 12. ábra.
9. példa: aspC előállítása Brevibacteríum lactofermentumóó/ (1) Brevibacteríum lactofermentum-eredefű aspC előállítása
A Corynebacterium nemzetséghez tartozó, aszparaginsavra nézve auxotróf 102-7 törzset, amit az aspC-aktivitás (AAT-aktivitás) hiánya tett aszparaginsavra nézve auxotróffá [I. Shiio és K. Ujikawa, J. Biochem., 84, 647, (1978)], transzformáltunk egy génkönyvtár bejuttatásával [WO95/23224-es számú nemzetközi közzétételi irat], amely génkönyvtárat úgy készítettünk el, hogy a Brevibacteríum lactofermentum vad típusú ATCC13869-es kromoszomális DNS-ének különböző fragmenseit ligáltuk egy, a Corynebacterium nemzetséghez tartozó baktériumok sejtjeiben működőképes vektorral.
A kapott transzformánsokat összegyűjtöttük és desztillált vízzel kétszer mostuk. Néhány tízezernyi transzformánst szélesztettünk minimális tápközeggel, az ammónián kívül más nitrogénforrást nem tartalmazó „Médium 10”-zel [I. Shiio és K. Ujikawa, J. Bíochem., 84, 647, (1978)] készült agarlemezen, hogy megkaphassuk azokat a transzformánsokat, amelyek megszűntek aszparaginsavra nézve auxotrófnak lenni, és kitűnően nőttek a lemezen. A kapott, aszparaginsav-auxotrófiát kiküszöbölt törzsből plazmid-DNS-t állítottunk elő, és a kapott plazmidot pAC-nek jelöltük. Amikor a vad típusú Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869-es törzset pAC-vel transzformáltuk, a transzformáns aspC aktivitása megnövekedett (1. táblázat). Az aktivitás meghatározása ismert módszerrel történt [Sizer, I. W., Jenkins, W. T„ Meth. Enzymol., 5, 677 (1962)].
Az eredmények alátámasztják, hogy a plazmidDNS-ben elhelyezkedő, ATCC13869-es törzs kromoszomális DNS-éből származó 2,5 kb hosszúságú fragmens tartalmazta a Brevibacteríum lactofermentumból származó aspC-t.
1. táblázat
Törzs/plazmid aspC-aktivitás (relatív érték)
ATCC13869 1,0
ATCC13869/pCABL 8,9
(2) Brevibacteríum lactofermentum-eredefű aspC analízise
A 2,5 kb hosszúságú fragmens nukleotidszekvenciáját a dideoximódszerrel határoztuk meg Sanger és munkatársai szerint [Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463, (1977)]. A meghatározott nukleotidszekvenciát a szekvencialistában a 25-ös azonosító számon adtuk meg. A nukleotidszekvenciát a „GENETYX-MAC Version 7.3” programmal (Software Kaihatsu KK) analizáltuk. Az ORF-ek („Open Reading Frame”, nyílt leolvasási fázis) után kutatva két ORF-et találtunk, amelyek egymással ellentétes irányban átfedtek, amint az a 13. ábrán látható. Azt a 432 vagy 436 aminosav hosszúságú ORF-et, amelyet a szekvencialistában a 25-ös azonosító számon megadott szekvencia 879-881-ig vagy a 897-899-ig terjedő ATG nukleotidok, mint iniciációs kodon és a 2175-2177-ig terjedő TGA nukleotidok, mint terminációs kodon közötti szakasz nukleotidszekvenciája normális orientációban kódol, ORF1-nek neveztük el. Azt a 393 aminosav hosszúságú ORF-et, amelyet a szekvencialistában a 25-ös azonosító számon megadott szekvencia 2163-2165-ig terjedő CAC nukleotidokkal komplementer GTG nukleotidok, mint iniciációs kodon és a 984-986-ig terjedő TCA nukleotidokkal komplementer TGA nukleotidok, mint terminációs kodon közötti szakasz nukleotidszekvenciája fordított orientációban kódol, ORF2-nek neveztük el.
(3) Az aspC-t kódoló ORF meghatározása
Egy, az ORF1-et teljes hosszúságban, de az ORF2-t csupán részlegesen tartalmazó DNS-fragmenst amplifikáltunk PCR segítségével a pAC plazmidból, hogy meggyőződjünk arról, vajon melyik ORF kódolja az AAT-fehérjét a kettő közül. Amplifikáláshoz használt DNS-láncindítókként azok a 23 bázispárból álló, a szekvencialistában a 25-ös azonosító számon megadott szekvencia alapján alkalmazott szintetikus DNS-szakaszok szolgáltak, amelyek a szekvencialistában a 26-os, valamint a 27-es azonosító számon vannak megadva. A DNS szintézisét és a PCR-t ugyanúgy végeztük el, mint azt fent az 1. példában leírtuk. A szekvencialistában a 25-ös azonosító számon megadott szekvencia 126. nukleotidjától a 2187. nukleotidig
HU 224 492 Β1 terjedő, 2062 bp hosszúságú amplifikált fragmenst a pCR2.1 TA-klónozó vektorba (Invitrogen) klónoztuk. Az így elkészített plazmidot pCRORF1-nek jelöltük.
Ugyanezen a módon egy, szekvencialistában a 25-ös azonosító számon megadott szekvencia 975. nukleotidjától a 2517. nukleotidig terjedő, 1543 bp hosszúságú, ORF2-t kódoló génfragmenst amplifikáltunk és klónoztunk. Az így elkészített plazmidot pCRORF2-nek jelöltük.
Annak érdekében, hogy a klónozott DNS-fragmenst Corynebacterium nemzetséghez tartozó baktériumsejtekbe juttathassuk be, a DNS-fragmenseket a 8. példában leírt átviteli vektorral ligáltuk. A pCRORF1-et EcoRI restrikciós enzimmel (Takara Shuzo) emésztettük, majd előzőleg szintén EcoRI-gyel emésztett pVK7-tel ligáltuk. A ligálást a „DNA Ligation kit” reagenskészlettel (Takara Shuzo) végeztük el. Az így elkészített plazmidot pORF1-nek jelöltük. A pORF1 elkészítésének folyamatát mutatja be a 14. ábra.
A pORF2-t ugyanígy készítettük el pCRORF2-ből és pVK7-ből.
Az előállított pORF1-et és pORF2-t vad típusú Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 sejtekbe juttattuk be a 9. példában leírtakkal azonos módon. Az ATCC13869 és a kapott plazmid bejuttatásával nyert ATCC13869/ORF1 és ATCC13869/ORF2 törzsek aspC-aktivitásait meghatároztuk. Az aktivitás meghatározását ugyanúgy végeztük, amint azt az 1. példában leírtuk. Amint az a 2. táblázatban látható, az aspC aktivitásának növekedése csupán az ATCC13869/pORF1 esetében figyelhető meg, jelezve, hogy az aspC-t az ORF1 kódolja.
A Brevibacterium lactofermentumból származó aspC, a fenti kísérletekben meghatározott nukleotidszekvenciáját és a nukleotidszekvencia által kódolt származtatott aminosavszekvenciát a szekvencialistában a 30-as azonosító számon adtuk meg. Az aminosavszekvencia önmagában a szekvencialistában a 31-es azonosító számon van megadva. A „GENEBANK”-ben homológiakutatást végezve nem találtunk homológiát semmilyen ismert aminosavszekvenciával, beleértve a más élőlényekből származó AAT-fehérjéket is.
2. táblázat
Törzs/plazmid aspC-aktivitás (relatív érték)
ATCC 13869 1,0
ATCC13869/pORF1 10,1
ATCC13869/pORF2 1,2
10. példa: Az L-lizin bioszintézisének génjeit tartalmazó plazmidok bejuttatása a Brevibacterium lactofermentum L-lizin-termelő baktériumba
A 7. példában leírt módon elkészített pCABL(Cmr) plazmidot a Brevibacterium lactofermentum AJ 11087 (NRRL B—11470) L-lizin-termelő baktériumtörzsbe juttattuk be. Az AJ11082-es törzs AEC-rezisztens. A plazmidokat elektromospulzus-módszerrel [Sugomoto és munkatársai, 2-207791-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés] juttattuk be. A transzformánsokat a plazmid drogrezisztencia-markerei alapján szelektáltuk. A transzformánsok szelekcióját 5 pg/ml klór-amfenikolt tartalmazó teljes tápközegben végeztük, amennyiben klór-amfenikol-rezisztenciagént tartalmazó plazmidot juttattunk be a sejtekbe, olyan esetben pedig, amikor a bejuttatott plazmid kanamicinrezisztencia-gént tartalmazott, 25 pg/ml kanamicint tartalmazó tápközegben.
A fent leírt módon nyert AJ11082/pCABL transzformánst Escherichia coliból származó aspC-t tartalmazó pOm(Kmr) plazmiddal vagy Brevibacterium lactofermentumból származó aspC-t tartalmazó pORF1(Kmr) plazmiddal transzformáltuk. Mivel a pCABL a pHM1519 replikációs origóját használja Brevibacterium lactofermenfum-sejtekben, a Km-rezisztenciagént pedig markerként, továbbá a pOm a pAM330 replikációs origóját használja Brevibacterium lactofermentum-sefiekben, a Km-rezisztenciagént pedig markerként, mindkét plazmid stabilan fennmarad Brevibacterium lactofermentum-sejtekben. így tehát az AJ11082/pCABL/pOm és az AJ11082/pCABL/pORF1 törzseket kaptuk, amelyek tartalmaznak egy, L-lizin bioszintézisében részt vevő gént tartalmazó és egy aspC-t tartalmazó plazmidot.
A fent leírttal azonos módon a p399AK9B-t (Cmr), a pDPSB-t (Cmr), a pDPRB-t (Cmr), a pLYSAB-t (Cmr), a pOm-et, a pCRCAB-t (Kmr), a pAB-t (Cmr), a pCB-t (Cmr) és a pCAB-t (Cmr) is bejuttattuk az AJ 11087 törzsbe, hogy olyan transzformánsokat kapjunk, amelyekben a mutáns lysC, a dapA, a dapB, a lysA vagy az aspC aktivitása külön-külön, illetve két vagy három géné kombinálva, fokozott.
11. példa: A transzformánsok aspC-aktivitásának meghatározása
Meghatároztuk az AJ11082/pCABL, az AJ 11082/pCABL/pOm és az AJ11082/pCABL/pORF1 transzformánsok aspC-aktivitását. Az aktivitás meghatározását a 9. példában leírtakkal azonos módon végeztük. Amint az a 3. táblázatban látható, azt figyeltük meg, hogy a pOm-vektorban elhelyezkedő lac-promoter Brevibacterium lactofermentumban is működőképes volt, és az AJ11082/pCABL/pOm aspC-aktivitása körülbelül háromszorosára nőtt. Az aspC-aktivitás további, körülbelül kilencszeres növekedése volt megfigyelhető az AJ11082/pCABL/pORF1 esetében.
3. táblázat
Törzs/plazmid aspC-aktivitás (relatív érték)
AJ11082 1,0
AJ11082/pOm 3,2
AJ11082/pORF1 10,1
AJ11082/pCABL 0,9
AJ 11082/pCABL/pOm 2,9
AJ11082/pCABL/pORF1 11,5
HU 224 492 Β1
12. példa: L-lizin termelése
A 10. példában leírt, előállított transzformánsok mindegyikét L-lizin termelésére alkalmas tápközegben végeztük, hogy az L-lizin-termelő képességet számszerűen is jellemezni tudjuk. Az L-lizin termelésére al- 5 kalmas tápközegnek az alábbiakban adjuk meg az összetételét és előállításának módját.
Az alábbi komponenseket (kalcium-karbonát kivételével) feloldottuk (1 L-ben), és a pH-t 8,0-ra állítottuk be KOH-dal. A tápközeget 115 °C-on sterilizáltuk 15 per- 10 cig, a szárított kalcium-karbonátot (50 g), amit előzőleg külön sterilizáltunk forró levegővel, ezután adtuk hozzá.
Glükóz 100 g
(NH4)2SO4 55 g
kh2po4 ig
MgSO4.7H2O ig
Biotin 500 pg
Tiamin 2000 pg
FeSO4.7H2O 0,01 g
MnSO4.7H2O 0,01 g
Nikotinamid 5 mg
Fehérjehidrolizátum (Mamenou) 30 ml
Kalcium-karbonát 50 g
A különböző típusú transzformánsok mindegyikét, valamint a kiindulási törzseket a fent leírt összetételű tápközegbe oltottuk le, és 31,5 °C-on, himbán rázatva tenyésztettük őket. A tenyésztés ideje 40, illetve 72 óra volt, a termelt L-lizin mennyiségét a különböző esetekben az 1. táblázatban tüntettük fel. A táblázatban lysC* mutáns lysC-t jelent. A sejttömeg-növekedést mennyiségileg is meghatároztuk 101-szeres hígítás után 562 nm-en mérve az OD-t.
4. táblázat
L-lizin felhalmozódása 40, illetve 72 órás tenyésztés után
Baktériumtörzs/ plazmid Bejuttatott gén A termelt L-lizin koncentrációja (g/L) Sejttömeg-növekedés ODseyiOI
40 óra múlva 72 óra múlva
AJ11082 22,0 29,8 0,450
AJ11082/p399AK9B lysC* 16,8 34,5 0,398
AJ11082/pDPSB dapA 18,7 33,8 0,410
AJ11082/pDPRB dapB 19,9 29,9 0,445
AJ11082/pLYSAB lysA 19,8 32,5 0,356
AJ11082/pOm aspC(£)1 21,8 30,9 0,457
AJ11082/pOm aspC/BJ2 21,5 31,2 0,450
AJ11082/pCRCAB lysC*, dapA 19,7 36,5 0,360
AJ11082/pAB dapA, dapB 19,0 34,8 0,390
AJ11082/pCB lysC*, dapB 23,3 35,0 0,440
AJ11082/pCAB lysC*, dapA, dapB 23,0 45,0 0,425
AJ 11082/pCABL lysC*, dapA, dapB, lysA 26,2 46,5 0,379
AJ11082/pCABL/ pOm lysC*, dapA, dapB, lysA, aspCfEJ 26,7 47,6 0,415
AJ 11082/pCABL/ pORF1 lysC*, dapA, dapB, lysA, aspC(BJ 27,1 48,8 0,410
1: Escherichia coliból származó aspC
2: Brevibacterium lactofermentumból származó aspC
Amint az látható, amikor a mutáns lysC-, dapA-, dapB-, lysA- vagy aspC-gének aktivitását külön-külön 55 fokoztuk, a termelt L-lizin mennyisége megnövekedett vagy nem változott a kiindulási törzs által termelt mennyiséghez képest 72 órás tenyésztés után, 40 órás tenyésztés után azonban a termelt L-lizin mennyisége kisebb volt, mint a kiindulási törzs által termelt mennyi- 60 ség. Az L-lizin-termelődés sebessége tehát csökkent a rövid idejű tenyésztés során. Hasonlóképpen, amikor a mutáns lysC és a dapA, vagy a dapA és a dapB aktivitását őket kombinálva fokoztuk, a termelt L-lizin mennyisége nagyobb volt a kiindulási törzs által termelt mennyiségnél 72 órás tenyésztés után, 40 órás tenyésztés után azonban a termelt L-lizin mennyisége ki16
HU 224 492 Β1 sebb volt, mint a kiindulási törzs által termelt mennyiség. Rövid idejű tenyésztés után tehát az L-lizin-termelés sebessége csökkent.
Ezzel szemben annak a törzsnek az esetében, ahol a dapB és a mutáns lysC aktivitását, a lysC, a dapA és 5 a dapB aktivitását a géneket kombinálva fokoztuk, valamint annak a törzsnek az esetében, ahol a lysC-t, a dapA-t, a dapB-t és a lysA-t kombinálva fokoztuk az aktivitásukat, a rövid idejű tenyésztés és a hosszú idejű tenyésztés során is nőtt a felhalmozódott L-lizin mennyisége. Annak a két törzsnek az esetében, ahol a mutáns lysC, a dapA, a dapB, a lysA és az Escherichia coliból származó aspC aktivitását, illetve a mutáns lysC, a dapA, a dapB a lysA és a Brevibacterium lactofermentumból származó aspC aktivitását őket kombinálva fokoztuk, az L-lizin-termelő képesség tovább javult, mindkét tenyésztési periódusban. A második esetben a javulás nagyobb volt, mint az elsőben.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: nem
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus DNS ANTISZENSZ: igen
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1643 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: gemomi DNS EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: Brevibacterium lactofermentum (B) TÖRZS: ATCC 13869
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC ΑΑΑΤΑΤΤΑΆΑ TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840
HU 224 492 Β1
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320 CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1643 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: (A) ÉLŐLÉNY: Brevibacterium lactofermentum (B) TÖRZS: ATCC 13869
SAJÁTSÁG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 217-1482
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC ΑΑΆΤΑΤΤΑΑΑ TCGAATATCA ATATACGGTC 60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG Met 1 GCC Alá CTG Leu GTC Val GTA Val 5 CAG Gin 234
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282
Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Alá Glu Arg Ile Arg Asn Val
10 15 20
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330
Alá Glu Arg Ile Val Alá Thr Lys Lys Alá Gly Asn Asp Val Val Val
25 30 35
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378
Val Cys Ser Alá Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Alá
40 45 50
GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426
Alá Alá Val Asn Pro Val Pro Pro Alá Arg Glu Met Asp Met Leu Leu
55 60 65 70
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474
Thr Alá Gly Glu Arg Ile Ser Asn Alá Leu Val Alá Met Alá Ile Glu
75 80 85
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522
Ser Leu Gly Alá Glu Alá Gin Ser Phe Thr Gly Ser Gin Alá Gly Val
95 100
HU 224 492 Β1
CTC Leu ACC Thr ACC Thr 105 GAG Glu CGC Arg CAC His GGA Gly AAC Asn 110 GCA Alá CGC ATT GTT Val GAC Asp 115 GTC Val ACA Thr CCG Pro 570
Arg Ile
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618
Gly Arg Val Arg Glu Alá Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Alá
120 125 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666
Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Alá Val Alá Leu Alá Alá Alá Leu Asn
155 160 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762
Alá Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Alá
170 175 180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810
Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Alá Gin Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
185 190 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Alá Alá Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu
200 205 210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906
Arg Ser Val Glu Tyr Alá Arg Alá Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg
215 220 225 230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954
Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Alá Gly Ser Met Glu
235 240 245
GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002
Asp Ile Pro Val Glu Glu Alá Val Leu Thr Gly Val Alá Thr Asp Lys
250 255 260
TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050
Ser Glu Alá Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu
265 270 275
GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098
Alá Alá Lys Val Phe Arg Alá Leu Alá Asp Alá Glu Ile Asn Ile Asp
280 285 290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146
Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile
295 300 305 310
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194
Thr Phe Thr Cys Pro Arg Alá Asp Gly Arg Arg Alá Met Glu Ile Leu
315 320 325
AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242
Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp
330 335 340
HU 224 492 Β1
CAG Gin GTC Val GGC AAA GTC TCC Ser CTC Leu GTG Val 350 GGT Gly GCT Alá GGC ATG Gly Met AAG Lys 355 TCT Ser CAC His CCA Pro 1290
Gly 345 Lys Val
GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338
Gly Val Thr Alá Glu Phe Met Glu Alá Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
360 365 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386
Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg
375 380 385 390
GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434
Glu Asp Asp Leu Asp Alá Alá Alá Arg Alá Leu His Glu Gin Phe Gin
395 400 405
CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482
Leu Gly Gly Glu Asp Glu Alá Val Val Tyr Alá Gly Thr Gly Arg
410 415 420
AGTTTTAAAG ' GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542
TCGGCCAGGT ' TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602
TCTTTGCTTC i CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 421 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Alá Leu Val Val 5 Gin Lys Tyr Gly Gly 10 Ser Ser Leu Glu Ser 15 Alá
Glu Arg Ile Arg Asn Val Alá Glu Arg Ile Val Alá Thr Lys Lys Alá
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Alá Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Alá Alá Alá Val Asn Pro Val Pro Pro Alá Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Alá Gly Glu Arg Ile Ser Asn Alá Leu
65 70 75 80
Val Alá Met Alá Ile Glu Ser Leu Gly Alá Glu Alá Gin Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gin Alá Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Alá Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Alá Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Alá Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Alá Val Alá
145 150 155 160
HU 224 492 Β1
Leu Alá Alá Alá Leu 165 Asn Alá Asp Val Cys 170 Glu Ile Tyr Ser Asp 175 Val
Asp Gly Val Tyr Thr Alá Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Alá Gin Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Alá Alá Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Alá Arg Alá Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Alá Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Alá Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Alá Thr Asp Lys Ser Glu Alá Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Alá Alá Lys Val Phe Arg Alá Leu Alá Asp
275 280 285
Alá Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Alá Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Alá Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Alá
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Alá Glu Phe Met Glu Alá Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Alá Alá Alá Arg Alá
385 390 395 400
Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Alá Val Val Tyr
405 410 415
Alá Gly Thr Gly Arg 420
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1643 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: (A) ÉLŐLÉNY: Brevibacterium lactofermentum
HU 224 492 Β1 (B) TÖRZS: ATCC 13869
SAJÁTSÁG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 964-1482
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240
GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360
GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960
CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008
Met Glu Glu Alá Val Leu Thr Gly Val Alá Thr Asp Lys Ser Glu 15 10 15
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT
Alá Lys Val Thr Val 20 Leu Gly Ile Ser Asp 25
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA
Lys Val Phe Arg 35 Alá Leu Alá Asp Alá 40 Glu
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC
Leu Gin Asn 50 Val Ser Ser Val Glu 55 Asp Gly
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG
Thr Cys 65 Pro Arg Alá Asp Gly 70 Arg Arg Alá
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG
Leu 80 Gin Val Gin Gly Asn 85 Trp Thr Asn Val
GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG
Gly Lys Val Ser Leu 100 Val Gly Alá Gly Met 105
ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT
Thr Alá Glu Phe 115 Met Glu Alá Leu Arg 120 Asp
TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC
Leu Ile Ser 130 Thr Ser Glu Ile Arg 135 Ile Ser
GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT
Asp Leu 145 Asp Alá Alá Alá Arg 150 Alá Leu His
AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056
Lys Pro Gly Glu Alá Alá
ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104
Ile Asn Ile Asp Met Val
ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152
Thr Thr Asp Ile Thr Phe
ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200
Met Glu Ile Leu Lys Lys
CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248
Leu Tyr Asp Asp Gin Val
95
AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296
Lys Ser His Pro Gly Val
110
GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344
Val Asn Val Asn Ile Glu
125
GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392
Val Leu Ile Arg Glu Asp
140
GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440
Glu Gin Phe Gin Leu Gly
155
HU 224 492 Β1
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490
Gly Glu Asp Glu Alá Val Val Tyr Alá Gly Thr Gly Arg 160 165 170
AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550
GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610
TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 172 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Glu Glu Alá Val 5 Leu Thr Gly Val Alá 10 Thr Asp Lys Ser Glu 15 Alá
Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Alá Alá Lys
20 25 30
Val Phe Arg Alá Leu Alá Asp Alá Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu
35 40 45
Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr
50 55 60
Cys Pro Arg Alá Asp Gly Arg Arg Alá Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu
65 70 75 80
Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly
85 90 95
Lys Val Ser Leu Val Gly Alá Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
100 105 110
Alá Glu Phe Met Glu Alá Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu
115 120 125
Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Leu Asp Alá Alá Alá Arg Alá Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly
145 150 155 160
Glu Asp Glu Alá Val Val Tyr Alá Gly Thr Gly Arg
165 170
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: nem
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23
HU 224 492 Β1
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus DNS
ANTISZENSZ: igen
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 2001 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATiPUS: genomi DNS
EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: Brevibacterium lactofermentum (B) TÖRZS: ATCC 13869
SAJÁTSÁG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 730-1473
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT 60
GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG 120
ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC 180
TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC 240
AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG 300
GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC 360
ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG TCACAACTGG 420
AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA 480
AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT 540
AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT 600
GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT 660
TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA 720
AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT 768
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Alá Lys Gly Arg
10
GTT Val GGT Gly 15 CAA Gin ACT Thr ATT Ile GTG Val GCA Alá 20 GCA Alá GTC Val AAT Asn GAG Glu TCC Ser 25 GAC Asp GAT Asp CTG Leu GAG Glu 816
CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC 864
Leu Val Alá Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp
30 35 40 45
AAC GGC GCT GAA GTT GTC GTT GAC TTC ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG 912
Asn Gly Alá Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Alá Val Met
50 55 60
GGC AAC CTG GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCT GCG GTT GTT GGA 960
Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Alá Val Val Gly
65 70 75
HU 224 492 Β1
1008
ACC Thr ACG Thr GGC Gly 80 TTC Phe GAT Asp GAT Asp GCT Alá CGT Arg 85 TTG Leu GAG Glu CAG Gin GTT Val CGC Arg 90 GCC Alá TGG Trp CTT Leu
GAA GGA AAA GAC AAT GTC GGT GTT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC
Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Alá Pro Asn Phe Alá Ile
95 100 105
TCT GCG GTG TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC TTC TTC
Ser Alá Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gin Alá Alá Arg Phe Phe
110 115 120 125
GAA TCA GCT GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC ccc AAC AAG CTG GAT GCA
Glu Ser Alá Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Alá
130 135 140
CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA CGC
Pro Ser Gly Thr Alá Ile His Thr Alá Gin Gly Ile Alá Alá Alá Arg
145 150 155
AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT
Lys Glu Alá Gly Met Asp Alá Gin Pro Asp Alá Thr Glu Gin Alá Leu
160 165 170
GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC
Glu Gly Ser Arg Gly Alá Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Alá Val
175 180 185
CGC ATG TCC GGC ATG GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG
Arg Met Ser Gly Met Val Alá His Glu Gin Val Ile Phe Gly Thr Gin
190 195 200 205
GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT
Gly Gin Thr Leu Thr Ile Lys Gin Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe
210 215 220
GCA CCA GGT GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC
Alá Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Alá Gin His Pro Gly
225 230 235
CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC
Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
240 245
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
1493
GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 248 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
1553
1613
1673
1733
1793
1853
1913
1973
2001
HU 224 492 Β1
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Gly Ile Lys Val 5 Gly Val Leu Gly
Thr Ile Val Alá 20 Alá Val Asn Glu Ser 25
Glu Ile Gly 35 Val Asp Asp Asp Leu 40 Ser
Glu Val 50 Val Val Asp Phe Thr 55 Thr Pro
Glu 65 Phe Cys Ile Asn Asn 70 Gly Ile Ser
Phe Asp Asp Alá Arg 85 Leu Glu Gin Val
Asp Asn Val Gly 100 Val Leu Ile Alá Pro 105
Leu Thr Met 115 Val Phe Ser Lys Gin 120 Alá
Glu Val 130 Ile Glu Leu His His 135 Pro Asn
Thr 145 Alá Ile His Thr Alá 150 Gin Gly Ile
Gly Met Asp Alá Gin 165 Pro Asp Alá Thr
Arg Gly Alá Ser 180 Val Asp Gly Ile Pro 185
Gly Met Val 195 Alá His Glu Gin Val 200 Ile
Leu Thr 210 Ile Lys Gin Asp Ser 215 Tyr Asp
Val 225 Leu Val Gly Val Arg 230 Asn Ile Alá
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
245
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=,.szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: nem
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC
Lys Gly Arg Val Gly Gin 15
Asp Leu Glu Leu Val Alá 30
Leu Val Asp Asn Gly Alá 45
Alá Val Met Gly Asn Leu 60
Val Val Gly Thr Thr Gly 75 80
Alá Trp Leu Glu Gly Lys 95
Phe Alá Ile Ser Alá Val 110
Arg Phe Phe Glu Ser Alá 125
Leu Asp Alá Pro Ser Gly 140
Alá Alá Arg Lys Glu Alá 155 160
Gin Alá Leu Glu Gly Ser 175
His Alá Val Arg Met Ser 190
Gly Thr Gin Gly Gin Thr 205
Asn Ser Phe Alá Pro Gly 220
His Pro Gly Leu Val Val 235 240
HU 224 492 Β1
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus DNS
ANTISZENSZ: nem
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1411 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: Brevibacterium lactofermentum (B) TÖRZS: ATCC 13869
SAJÁTSÁG:
(A) NÉV/KULCS: cds (B) ELHELYEZKEDÉS: 311...1213
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT 60
TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGCC CGTATGTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC 120
ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTGTA AAAGACAGCC 180
GTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT GTGGCTTGGG CGATTGTTAT 240
GCAAAAGTTG TTAGGTTTTT TGCGGGGTTG TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGGTAAC 300
CTTGAACTCT ATG AGC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG CAC 349
Met Ser Thr Gly Leu Thr Alá Lys Thr Gly Val Glu His
10
TTC Phe GGC ACC GTT Val GGA GTA Gly Val GCA ATG GTT ACT CCA Pro TTC Phe 25 ACG Thr GAA Glu TCC Ser GGA Gly 397
Gly 15 Thr Alá 20 Met Val Thr
GAC ATC GAT ATC GCT GCT GGC CGC GAA GTC GCG GCT TAT TTG GTT GAT 445
Asp Ile Asp Ile Alá Alá Gly Arg Glu Val Alá Alá Tyr Leu Val Asp
30 35 40 45
AAG GGC TTG GAT TCT TTG GTT CTC GCG GGC ACC ACT GGT GAA TCC CCA 493
Lys Gly Leu Asp Ser Leu Val Leu Alá Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro
50 55 60
ACG ACA ACC GCC GCT GAA AAA CTA GAA CTG CTC AAG GCC GTT CGT GAG 541
Thr Thr Thr Alá Alá Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Alá Val Arg Glu
65 70 75
GAA GTT GGG GAT CGG GCG AAC GTC ATC GCC GGT GTC GGA ACC AAC AAC 589
Glu Val Gly Asp Arg Alá Asn Val Ile Alá Gly Val Gly Thr Asn Asn
80 85 90
ACG CGG ACA TCT GTG GAA CTT GCG GAA GCT GCT GCT TCT GCT GGC GCA 637
Thr Arg Thr Ser Val Glu Leu Alá Glu Alá Alá Alá Ser Alá Gly Alá
95 100 105
HU 224 492 Β1
GAC Asp 110 GGC Gly CTT Leu TTA Leu GTT Val GTA ACT CCT Pro TAT Tyr TAC Tyr TCC Ser 120 AAG Lys CCG AGC CAA GAG 685
Val 115 Thr Pro Ser Gin Glu 125
GGA TTG CTG GCG CAC TTC GGT GCA ATT GCT GCA GCA ACA GAG GTT CCA 733
Gly Leu Leu Alá His Phe Gly Alá Ile Alá Alá Alá Thr Glu Val Pro
130 135 140
ATT TGT CTC TAT GAC ATT CCT GGT CGG TCA GGT ATT CCA ATT GAG TCT 781
Ile Cys Leu Tyr Asp He Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser
145 150 155
GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG GTC AAG 829
Asp Thr Met Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Alá Val Lys
160 165 170
GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG 877
Asp Alá Lys Gly Asp Leu Val Alá Alá Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr
175 180 185
GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT 925
Gly Leu Alá Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu
190 195 200 205
GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC 973
Alá Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Alá Alá Pro
210 215 220
ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC 1021
Thr Alá Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val
225 230 235
CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA 1069
Arg Alá Arg Glu Ile Asn Alá Lys Leu Ser Pro Leu Val Alá Alá Gin
240 245 250
GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG 1117
Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Alá Lys Alá Alá Leu Arg Leu Gin
255 260 265
GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA AAT GAG 1165
Gly Ile Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Alá Pro Asn Glu
270 275 280 285
CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA 1213
Gin Glu Leu Glu Alá Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Alá Gly Val Leu
290 295 300
TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC : GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA 1273
AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC ; TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA 1333
CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG í AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC 1393
TCAAGGATCC CAACATTC 1411
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 301 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
HU 224 492 Β1
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Ser Thr Gly Leu 5 Thr Alá Lys Thr Gly 10 Val Glu His Phe Gly 15 Thr
Val Gly Val Alá Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp
20 25 30
Ile Alá Alá Gly Arg Glu Val Alá Alá Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
35 40 45
Asp Ser Leu Val Leu Alá Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
50 55 60
Alá Alá Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Alá Val Arg Glu Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Arg Alá Asn Val Ile Alá Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
85 90 95
Ser Val Glu Leu Alá Glu Alá Alá Alá Ser Alá Gly Alá Asp Gly Leu
100 105 110
Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gin Glu Gly Leu Leu
115 120 125
Alá His Phe Gly Alá Ile Alá Alá Alá Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu
130 135 140
Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met
145 150 155 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Alá Val Lys Asp Alá Lys
165 170 175
Gly Asp Leu Val Alá Alá Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Alá
180 185 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Alá Leu Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Alá Alá Pro Thr Alá Leu
210 215 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Alá Arg
225 230 235 240
Glu Ile Asn Alá Lys Leu Ser Pro Leu Val Alá Alá Gin Gly Arg Leu
245 250 255
Gly Gly Val Ser Leu Alá Lys Alá Alá Leu Arg Leu Gin Gly Ile Asn
260 2S5 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Alá Pro Asn Glu Gin Glu Leu
275 280 285
Glu Alá Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Alá Gly Val Leu
290 295 300
HU 224 492 Β1
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: nem
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: igen
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 3579 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: Brevibacterium lactofermentum (B) ELHELYEZKEDÉS: ATCC 13869
SAJÁTSÁG:
(A) NÉV/KULCS: cds (B) ELHELYEZKEDÉS: 533...2182
SAJÁTSÁG:
(A) NÉV/KULCS: cds (B) ELHELYEZKEDÉS: 2188...3522
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60
TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA 120
GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT 180
GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC 240
GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC 300
AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC 360
CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA 420
CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA 480
AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG 535
Met
ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT Thr Pro Alá Asp Leu Alá Thr Leu Ile Lys Glu Thr Alá Val Glu Val
TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gin Val Val
583
631
HU 224 492 Β1
GTG Val GAG Glu 35 CGT Arg CCG Pro CGT Arg AAC Asn CCA GAG CAC His GGC Gly GAT Asp TAC Tyr 45 GCC Alá ACC Thr AAC Asn ATT Ile 679
Pro 40 Glu
GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727
Alá Leu Gin Val Alá Lys Lys Val Gly Gin Asn Pro Arg Asp Leu Alá
50 55 60 65
ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775
Thr Trp Leu Alá Glu Alá Leu Alá Alá Asp Asp Alá Ile Asp Ser Alá
70 75 80
GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA 823
Glu Ile Alá Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Alá Alá Alá Alá
85 90 95
CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA 871
Gin Gly Glu Ile Val Alá Lys Ile Leu Alá Gin Gly Glu Thr Phe Gly
100 105 110
AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT 919
Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser
115 120 125
GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC 967
Alá Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Alá Alá
130 135 140 145
GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG 1015
Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Alá Ser Gly Alá Lys Val
150 155 160
ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC 1063
Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin Ile Asp Arg Phe
165 170 175
GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC 1111
Alá Leu Ser Leu Leu Alá Alá Alá Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp
180 185 190
GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA 1159
Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Alá Glu Alá Ile Val Glu
195 200 205
AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT 1207
Lys His Pro Glu Alá Leu Alá Leu Glu Pro Alá Alá Thr Gin Glu Leu
210 215 220 225
TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC 1255
Phe Arg Alá Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser
230 235 240
CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC 1303
Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser
245 250 255
CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC 1351
Leu Phe Glu Ser Gly Alá Val Asp Lys Alá Val Gin Val Leu Lys Asp
260 265 270
HU 224 492 Β1
AAC Asn GGC Gly 275 AAC Asn CTG Leu TAC Tyr GAA AAC Glu Asn 280 GAG Glu GGC Gly GCT Alá TGG Trp TGG Trp 285 CTG Leu CGT Arg TCC Ser ACC Thr 1399
GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC 1447
Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp
290 295 300 305
GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC 1495
Alá Alá Tyr Ile Alá Gly Asp Ile Alá Tyr Val Alá Asp Lys Phe Ser
310 315 320
CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT 1543
Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Alá Asp His His Gly
325 330 335
TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA 1591
Tyr Ile Alá Arg Leu Lys Alá Alá Alá Alá Alá Leu Gly Tyr Lys Pro
340 345 350
GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639
Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gin Met Val Asn Leu Leu Arg Asp
355 360 365
GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA 1687
Gly Lys Alá Val Arg Met Ser Lys Arg Alá Gly Thr Val Val Thr Leu
370 375 380 385
GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG 1735
Asp Asp Leu Val Glu Alá Ile Gly Ile Asp Alá Alá Arg Tyr Ser Leu
390 395 400
ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG 1783
Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp
405 410 415
GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC 1831
Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gin Tyr Gly His
420 425 430
GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC 1879
Alá Arg Leu Cys Ser Ile Alá Arg Lys Alá Glu Thr Leu Gly Val Thr
435 440 445
GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT 1927
Glu Glu Gly Alá Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp
450 455 460 465
CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GGT 1975
Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Alá Val Val Lys Alá Alá Alá
470 475 480
GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT 2023
Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Alá Arg Tyr Alá Glu Glu Leu Alá
485 490 495
GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT 2071
Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val
500 505 510
HU 224 492 Β1
GAT Asp GAG Glu 515 GAT Asp ACG Thr GCA Alá CCA ATC CAC ACA GCA CGT Arg CTG Leu 525 GCA Alá CTT Leu GCA Alá GCA Alá 2119
Pro Ile 520 His Thr Alá
GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167
Alá Thr Arg Gin Thr Leu Alá Asn Alá Leu His Leu Val Gly Val Ser
530 535 540 545
GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214
Alá Pro Glu Lys Met Met Alá Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu
550 1 5
CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262
Leu Pro Alá His Val Trp Pro Arg Asn Alá Val Arg Gin Glu Asp Gly
10 15 20 25
GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310
Val Val Thr Val Alá Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Alá Glu Glu Tyr
30 35 40
GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358
Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys
45 50 55
CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406
Arg Asp Met Alá Thr Alá Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Alá
60 65 70
TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454
Ser Lys Alá Phe Leu Thr Lys Thr Ile Alá Arg Trp Val Asp Glu Glu
75 80 85
GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502
Gly Leu Alá Leu Asp Ile Alá Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Alá Leu
90 95 100 105
GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550
Alá Alá Gly Phe Pro Alá Ser Arg Ile Thr Alá His Gly Asn Asn Lys
110 115 120
GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598
Gly Val Glu Phe Leu Arg Alá Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val
125 130 135
GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646
Val Leu Asp Ser Alá Gin Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Alá Alá
140 145 150
GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694
Gly Glu Gly Lys Ile Gin Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile
155 160 165
GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742
Glu Alá His Thr His Glu Phe Ile Alá Thr Ser His Glu Asp Gin Lys
170 175 180 185
TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790
Phe Gly Phe Ser Leu Alá Ser Gly Ser Alá Phe Glu Alá Alá Lys Alá
190 195 200
HU 224 492 Β1
GCC Alá AAC Asn AAC Asn GCA Alá 205 GAA Glu AAC Asn CTG Leu AAC Asn CTG Leu 210 GTT Val GGC Gly CTG Leu CAC His TGC Cys 215 CAC His GTT Val 2838
GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886
Gly Ser Gin Val Phe Asp Alá Glu Gly Phe Lys Leu Alá Alá Glu Arg
220 225 230
GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934
Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gin Ile His Ser Glu Leu Gly Val Alá Leu
235 240 245
CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982
Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Alá Tyr Thr Alá Alá
250 255 260 265
GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030
Glu Glu Pro Leu Asn Val Alá Glu Val Alá Ser Asp Leu Leu Thr Alá
270 275 280
GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT 3078
Val Gly Lys Met Alá Alá Glu Leu Gly Ile Asp Alá Pro Thr Val Leu
285 290 295
GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126
Val Glu Pro Gly Arg Alá Ile Alá Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr
300 305 310
GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174
Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg
315 320 325
CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA 3222
Arg Tyr Ile Alá Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Alá
330 335 340 345
CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270
Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Alá Arg Val Val Ser Arg Phe Alá Glu
350 355 360
GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318
Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly
365 370 375
GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366
Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly
380 385 390
GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414
Asp Phe Leu Alá Leu Alá Alá Thr Gly Alá Tyr Cys Tyr Alá Met Ser
395 400 405
TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462
Ser Arg Tyr Asn Alá Phe Thr Arg Pro Alá Val Val Ser Val Arg Alá
410 415 420 425
GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510
Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu
430 435 440
HU 224 492 Β1
TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC Ser Leu Glu Alá
445
GTGGAGGGCG GTTTTGG
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 550 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
3562
3579
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Alá Val 15 Glu
Met 1 Thr Pro Alá Asp 5 Leu Alá Thr Leu Ile 10 Lys Glu Thr
Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gin Val
20 25 30
Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Alá Thr Asn
35 40 45
Ile Alá Leu Gin Val Alá Lys Lys Val Gly Gin Asn Pro Arg Asp Leu
50 55 60
Alá Thr Trp Leu Alá Glu Alá Leu Alá Alá Asp Asp Alá Ile Asp Ser
65 70 75 80
Alá Glu Ile Alá Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Alá Alá Alá
85 90 95
Alá Gin Gly Glu Ile Val Alá Lys Ile Leu Alá Gin Gly Glu Thr Phe
100 105 110
Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val
115 120 125
Ser Alá Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Alá
130 135 140
Alá Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Alá Ser Gly Alá Lys
145 150 155 160
Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin Ile Asp Arg
165 170 175
Phe Alá Leu Ser Leu Leu Al a Alá Alá Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu
180 185 190
Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Alá Glu Alá Ile Val
195 200 205
Glu Lys His Pro Glu Alá Leu Alá Leu Glu Pro Alá Alá Thr Gin Glu
210 215 220
Leu Phe Arg Alá Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn
245 250 255
HU 224 492 Β1
Ser Leu Phe Glu 260 Ser Gly Alá Val Asp 265 Lys Alá Val Gin Val 270 Leu Lys
Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Alá Trp Trp Leu Arg Ser
275 280 285
Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly
290 295 300
Asp Alá Alá Tyr Ile Alá Gly Asp Ile Alá Tyr Val Alá Asp Lys Phe
305 310 315 320
Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Alá Asp His His
325 330 335
Gly Tyr Ile Alá Arg Leu Lys Alá Alá Alá Alá Alá Leu Gly Tyr Lys
340 345 350
Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gin Met Val Asn Leu Leu Arg
355 360 365
Asp Gly Lys Alá Val Arg Met Ser Lys Arg Alá Gly Thr Val Val Thr
370 375 380
Leu Asp Asp Leu Val Glu Alá Ile Gly Ile Asp Alá Alá Arg Tyr Ser
385 390 395 400
Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu
405 410 415
Trp Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gin Tyr Gly
420 425 430
His Alá Arg Leu Cys Ser Ile Alá Arg Lys Alá Glu Thr Leu Gly Val
435 440 445
Thr Glu Glu Gly Alá Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly
450 455 460
Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Alá Val Val Lys Alá Alá
465 470 475 480
Alá Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Alá Arg Tyr Alá Glu Glu Leu
485 490 495
Alá Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys
500 505 510
Val Asp Glu Asp Thr Alá Pro Ile His Thr Alá Arg Leu Alá Leu Alá
515 520 525
Alá Alá Thr Arg Gin Thr Leu Alá Asn Alá Leu His Leu Val Gly Val
530 535 540
Ser Alá Pro Glu Lys Met
545 550
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 445 aminosav
HU 224 492 Β1
TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje
A 20. Met 1 AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Leu 10 Pro Ala His Val Trp 15 Pro
Ala Thr Val Glu 5 Asn Phe Asn Glu
Arg Asn Ala Val Arg Gin Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
20 25 30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
35 40 45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
85 90 95
Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gin Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gin Asp
145 150 155 160
Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175
Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gin Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
195 200 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gin Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gin
225 230 235 240
Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290 295 300
HU 224 492 Β1
Alá 305 Gly Pro Ser Thr Val 310 Thr Ile Tyr Glu Val 315 Gly Thr Thr Lys Asp 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Alá Val Asp Gly
325 330 335
Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Alá Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
340 345 350
Alá Arg Val Val Ser Arg Phe Alá Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370 375 380
Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Alá Leu Alá Alá
385 390 395 400
Thr Gly Alá Tyr Cys Tyr Alá Met Ser Ser Arg Tyr Asn Alá Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Alá Val Val Ser Val Arg Alá Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
420 425 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Alá
435 440 445
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc=„színtetikus DNS”
ANTISZENSZ: nem
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: igen
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCGGCCTACA AAATCGTGCA 20
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1331 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: Escherichia coli
HU 224 492 Β1 (B) TÖRZS: JM109
SAJÁTSÁG:
(A) NÉV/KULCS: cds (B) ELHELYEZKEDÉS: 10...1197
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AACCTCGTC ATG TTT GAG AAC ATT ACC GCC GCT CCT GCC GAC CCG ATT 48
Met Phe Glu Asn Ile Thr Alá Alá Pro Alá Asp Pro Ile
10
CTG Leu GGC Gly 15 CTG Leu GCC Alá GAT Asp CTG Leu TTT Phe 20 CGT Arg GCC Alá GAT Asp GAA Glu CGT Arg 25 CCC Pro GGC Gly AAA Lys ATT Ile 96
AAC CTC GGG ATT GGT GTC TAT AAA GAT GAG ACG GGC AAA ACC CCG GTA 144
Asn Leu Gly Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val
30 35 40 45
CTG ACC AGC GTG AAA AAG GCT GAA CAG TAT CTG CTC GAA AAT GAA ACC 192
Leu Thr Ser Val Lys Lys Alá Glu Gin Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr
50 55 60
ACC AAA AAT TAC CTC GGC ATT GAC GGC ATC CCT GAA TTT GGT CGC TGC 240
Thr Lys Asn Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys
65 70 75
ACT CAG GAA CTG CTG TTT GGT AAA GGT AGC GCC CTG ATC AAT GAC AAA 288
Thr Gin Glu Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Alá Leu Ile Asn Asp Lys
80 85 90
CGT GCT CGC ACG GCA CAG ACT CCG GGG GGC ACT GGC GCA CTA CGC GTG 336
Arg Alá Arg Thr Alá Gin Thr Pro Gly Gly Thr Gly Alá Leu Arg Val
95 100 105
GCT GCC GAT TTC CTG GCA AAA AAT ACC AGC GTT AAG CGT GTG TGG GTG 384
Alá Alá Asp Phe Leu Alá Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val
110 115 120 125
AGC AAC CCA AGC TGG CCG AAC CAT AAG AGC GTC TTT AAC TCT GCA GGT 432
Ser Asn Pro Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Alá Gly
130 135 140
CTG GAA GTT CGT GAA TAC GCT TAT TAT GAT GCG GAA AAT CAC ACT CTT 480
Leu Glu Val Arg Glu Tyr Alá Tyr Tyr Asp Alá Glu Asn His Thr Leu
145 150 155
GAC TTC GAT GCA CTG ATT AAC AGC CTG AAT GAA GCT CAG GCT GGC GAC 528
Asp Phe Asp Alá Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Alá Gin Alá Gly Asp
160 165 170
GTA GTG CTG TTC CAT GGC TGC TGC CAT AAC CCA ACC GGT ATC GAC CCT 576
Val Val Leu Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro
175 180 185
ACG CTG GAA CAA TGG CAA ACA CTG GCA CAA CTC TCC GTT GAG AAA GGC 624
Thr Leu Glu Gin Trp Gin Thr Leu Alá Gin Leu Ser Val Glu Lys Gly
190 195 200 205
TGG TTA CCG CTG TTT GAC TTC GCT TAC CAG GGT TTT GCC CGT GGT CTG 672
Trp Leu Pro Leu Phe Asp Phe Alá Tyr Gin Gly Phe Alá Arg Gly Leu
210 215 220
HU 224 492 Β1
GAA Glu GAA Glu GAT Asp GCT Alá 225 GAA Glu GGA Gly CTG Leu CGC Arg GCT Alá 230 TTC Phe GCG Alá GCT Alá ATG Met CAT His 235 AAA Lys GAG Glu 720
CTG ATT GTT GCC AGT TCC TAC TCT AAA AAC TTT GGC CTG TAC AAC GAG 768
Leu Ile Val Alá Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu
240 245 250
CGT GTT GGC GCT TGT ACT CTG GTT GCT GCC GAC AGT GAA ACC GTT GAT 816
Arg Val Gly Alá Cys Thr Leu Val Alá Alá Asp Ser Glu Thr Val Asp
255 260 265
CGC GCA TTC AGC CAA ATG AAA GCG GCG ATT CGC GCT AAC TAC TCT AAC 864
Arg Alá Phe Ser Gin Met Lys Alá Alá Ile Arg Alá Asn Tyr Ser Asn
270 275 280 285
CCA CCA GCA CAC GGC GCT TCT GTT GTT GCC ACC ATC CTG AGC AAC GAT 912
Pro Pro Alá His Gly Alá Ser Val Val Alá Thr Ile Leu Ser Asn Asp
290 295 300
GCG TTA CGT GCG ATT TGG GAA CAA GAG CTG ACT GAT ATG CGC CAG CGT 960
Alá Leu Arg Alá Ile Trp Glu Gin Glu Leu Thr Asp Met Arg Gin Arg
305 310 315
ATT CAG CGT ATG CGT CAG TTG TTC GTC AAT ACG CTG CAG GAA AAA GGC 1008
Ile Gin Arg Met Arg Gin Leu Phe Val Asn Thr Leu Gin Glu Lys Gly
320 325 330
GCA AAC CGC GAC TTC AGC TTT ATC ATC AAA CAG AAC GGC ATG TTC TCC 1056
Alá Asn Arg Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gin Asn Gly Met Phe Ser
335 340 345
TTC AGT GGC CTG ACA AAA GAA CAA GTG CTG CGT CTG CGC GAA GAG TTT 1104
Phe Ser Gly Leu Thr Lys Glu Gin Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe
350 355 360 365
GGC GTA TAT GCG GTT GCT TCT GGT CGC GTA AAT GTG GCC GGG ATG ACA 1152
Gly Val Tyr Alá Val Alá Ser Gly Arg Val Asn Val Alá Gly Met Thr
370 375 380
CCA GAT AAC ATG GCT CCG CTG TGC GAA GCG ATT GTG GCA GTG CTG 1197
Pro Asp Asn Met Alá Pro Leu Cys Glu Alá Ile Val Alá Val Leu
385 390 395
TAAGCATTAA AAACAATGAA CGCGCTGAAA AGCGGGCTGA GACTGATGAC AAACGCAACA 1257
TTGCCTGATG GCTACGCTTA TCAGGCCTAC GCGTCCCCTG CAATATTTTG AATTTGCACG 1317
ATTTTGTAGG CCGG 1331
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 396 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met Phe Glu Asn Ile Thr Alá Alá Pro Alá Asp Pro Ile Leu Gly Leu 15 10 15
Alá Asp Leu Phe Arg Alá Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly 20 25 30
HU 224 492 Β1
Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser 35 40 45
Val Lys Lys Alá Glu Gin Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn 50 55 60
Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gin Glu 65 70 75 80
Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Alá Leu Ile Asn Asp Lys Arg Alá Arg 85 90 95
Thr Alá Gin Thr Pro Gly Gly Thr Gly Alá Leu Arg Val Alá Alá Asp 100 105 110
Phe Leu Alá Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro 115 120 125
Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Alá Gly Leu Glu Val 130 135 140
Arg Glu Tyr Alá Tyr Tyr Asp Alá Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp
145 150 155 160
Alá Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Alá Gin Alá Gly Asp Val Val Leu
165 170 175
Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu 180 185 190
Gin Trp Gin Thr Leu Alá Gin Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro 195 200 205
Leu Phe Asp Phe Alá Tyr Gin Gly Phe Alá Arg Gly Leu Glu Glu Asp 210 215 220
Alá Glu Gly Leu Arg Alá Phe Alá Alá Met His Lys Glu Leu Ile Val
225 230 235 240
Alá Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly
245 250 255
Alá Cys Thr Leu Val Alá Alá Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Alá Phe 260 265 270
Ser Gin Met Lys Alá Alá Ile Arg Alá Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Alá 275 280 285
His Gly Alá Ser Val Val Alá Thr Ile Leu Ser Asn Asp Alá Leu Arg 290 295 300
Alá Ile Trp Glu Gin Glu Leu Thr Asp Met Arg Gin Arg Ile Gin Arg
305 310 315 320
Met Arg Gin Leu Phe Val Asn Thr Leu Gin Glu Lys Gly Alá Asn Arg
325 330 335
Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gin Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly 340 345 350
HU 224 492 Β1
Leu Thr Lys Glu Gin Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr 355 360 365
Alá Val Alá Ser Gly Arg Val Asn Val Alá Gly Met Thr Pro Asp Asn 370 375 380
Met Alá Pro Leu Cys Glu Alá Ile Val Alá Val Leu
385 390 395
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 2517 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: Brevibacterium lactofermentum
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCAGCTTC GGGTGTTGAA GGGGCCGAAT AAGGAACTCG CGCAGTTGGG TCGTAGTTTG 60
TTTAAACGAC TTGGTGATGT GTTGGCGTAT TTCGATGTTG GTGTCTCCAA CGGTCCGGTC 120
GAAGCGATCA ACGGACGGTT GGAGCATTTG CGTGGGATTG CTCTAGGTTT CCGTAATTTG 180
AACCACTACA TTCTGCGGTG CCTTATCCAT TCAGGGCAGT TGGTCCATAA GATCAATGCA 240
CTCTAAAACA GGAAGAGCCC CTTTACAAGC GGCAAGACCA AACTGGGTGA CCGAAAATCT 300
TCAGGCCAAT CAGTTTTGGT CATATGGGAT GGTTTTTAGA CCTCGAAACC ATCCCATATG 360
ACCGAAGCCC GCGAAACTCT GTGTTCGTTG GTCGCCTGGT TCGGTCTCAA TGCCTTGCCG 420
AAACCACAAC GCCCCGAAAC CCAAAACTCC CCAATACATG AAAAAACCAG CTTCCCACCG 480
AAGTGAGAAG CTGGTTTAGT TTGCGGAGGA TAGGGGATTT GAACCCCTGA GGGATTGCTC 540
CCAACCCGCG TTCCAGGCGA GCGACATAGG CCGCTAGTCG AATCCTCCAG CTAGAACGGC 600
TGCAACGCAT GGCTGCTTTG TTCTGGGGAT TAGATTACAC AAAAGTCGTT TAGAAACTCA 660
AATCCGCTCG CAGTTGGCGT TTTCTGGGGC GGTTCAGCTA GAGTTATGCG AAGGATCCCG 720
TGCGGCGTTT ATCTTGTGAA CTCCCCCAGG GCAGGAATGC AGCAAGGGTC AGCGAGCTCT 780
GACGGGTGCG CGGGGTCCCC TAAAACGTCT AGAGTAGTGG CTTGAGGTCA CTGCTCTTTT 840
TTTGTGCCCT TTTTTTGGTC CGTCTATTTT GCCACCACAT GCGGAGGTAC GCAGTTATGA 900
GTTCAGTTTC GCTGCAGGAT TTTGATGCAG AGCGAATTGG TCTGTTCCAC GAGGACATTA 960
AACGCAAGTT TGATGAGCTC AAGTCAAAAA ATCTGAAGCT GGATCTTACT CGCGGTAAGC 1020
CTTCGTCGGA GCAGTTGGAT TTCGCTGATG AGCTGTTGGC GTTGCCTGGT AAGGGCGATT 1080
TCAAGGCTGC GGATGGTACT GATGTCCGTA ACTATGGCGG GCTGGATGGC ATTGTTGATA 1140
TTCGTCAGAT TTGGGCGGAT TTGCTGGGTG TTCCTGTGGA GCAGGTGCTG GCGGGGGATG 1200
CTTCGAGCTT GAACATCATG TTTGATGTGA TCAGCTGGTC GTACATTTTT GGTAACAATG 1260
ATTCGGTTCA GCCTTGGTCG AAGGAAGAAA CTGTTAAGTG GATTTGTCCT GTTCCGGGAT 1320
ATGATCGCCA TTTCTCCATC ACGGAGCGTT TCGGCTTTGA GATGATTTCT GTGCCAATGA 1380
ATGAAGACGG CCCTGATATG GATGCTGTTG AGGAATTGGT CAAGGATCCG CAGGTTAAGG 1440
GCATGTGGGT TGTGCCGGTA TTTTCTAACC CGACTGGTTT CACGGTGTCG GAGGACGTCG 1500
CAAAGCGTCT GAGCACGATG GAAACTGCGG CGCCGGACTT CCGCGTGGTG TGGGATAACG 1560
CTTACGCCGT TCATACTCTG ACCGATGAGT TCCCTGAGGT CATCGACATC GTTGGGCTTG 1620
GTGAGGCGGC GGGTAACCCG AACCGTTTCT GGGCGTTCAC TTCTACTTCG AAGATCACTC 1680
TCGCGGGTGC GGGCGTGTCC TTCTTCATGA CTTCTGCGGA GAACCGTAAG TGGTACTCCG 1740
GTCATGCGGG TATCCGTGGC ATTGGCCCTA ACAAGGTCAA TCAGTTGGCT CATGCGCGTT 1800
ACTTTGGCGA TGCTGAGGGA GTGCGCGCGG TGATGCGTAA GCATGCTGCG TCGTTGGCTC 1860
CGAAGTTCAA CAAGGTTCTG GAGATCCTGG ATTCTCGCCT TGCTGAGTAC GGTGTCGCGC 1920
AGTGGACTGT CCCTGCGGGC GGTTACTTCA TTTCCCTTGA TGTGGTTCCT GGTACGGCAT 1980
CTCGTGTGGC TGAGTTGGCT AAGGAAGCCG GCATTGCGTT GACGGGTGCG GGTTCTTCTT 2040
ACCCGCTGCG TCAGGATCCG GAGAACAAGA ACCTCCGTTT GGCGCCTTCT CTGCCTCCTG 2100
TTGAGGAACT TGAGGTTGCC ATGGATGGCG TGGCTACGTG TGTTTTGCTG GCAGCTGCGG 2160
AGCACTACGC TAGCTAGAGT GAATACCGCG GAAACTGCAC ATTGGATTAA CCGTTTGCTG 2220
CCGGGTCAGC CGGAGTTTCA CCAGGTTGGC GCGTTTAAAG TGGCGGGTTA CACGCTTGAT 2280
GATGAGTCAA TTGCGTGTTC TGTCAATTTC GGGCGCGTCA ACACGGGCCT GGTCACCGAG 2340
ACAGGCGCGG AAACCGTCGA TGTGCGAAGT GAGATTTTGA GCCTGGCCAG GGCCGACGTG 2400
HU 224 492 Β1
TCCGTGCCTG GGCGCGCCGT CGGCGCTGCT GCAACAATGC TTCTCGACGC CTCCCTCTCC 2460
TTCAAATCCG CCACCGATTC CAGTGTCACT CCCATGCATG CCCAACCGGG ACAGATC 2517
A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: nem
A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCAACGGA CGGTTGGAGC ATT 23
A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: igen
A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTATTCACT CTAGCTAGCG TAG 23
A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: nem
A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAGCTCAAGT CAAAAAATCT GAA 23
A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc=„szintetikus DNS”
ANTISZENSZ: igen
A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCTGTCCC GGTTGGGCAT GCA 23
A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 2517 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
EREDETI FORRÁS:
(A) ÉLŐLÉNY: Brevibacteríum lactofermentum
HU 224 492 Β1 (B) TÖRZS: ATCC 13869
SAJÁTSÁG:
(A) NÉV/KULCS: cds (B) ELHELYEZKEDÉS: 879-2174
A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCAGCTTC GGGTGTTGAA GGGGCCGAAT AAGGAACTCG CGCAGTTGGG TCGTAGTTTG 60
TTTAAACGAC TTGGTGATGT GTTGGCGTAT TTCGATGTTG GTGTCTCCAA CGGTCCGGTC 120
GAAGCGATCA ACGGACGGTT GGAGCATTTG CGTGGGATTG CTCTAGGTTT CCGTAATTTG 180
AACCACTACA TTCTGCGGTG CCTTATCCAT TCAGGGCAGT TGGTCCATAA GATCAATGCA 240
CTCTAAAACA GGAAGAGCCC CTTTACAAGC GGCAAGACCA AACTGGGTGA CCGAAAATCT 300
TCAGGCCAAT CAGTTTTGGT CATATGGGAT GGTTTTTAGA CCTCGAAACC ATCCCATATG 360
ACCGAAGCCC GCGAAACTCT GTGTTCGTTG GTCGCCTGGT TCGGTCTCAA TGCCTTGCCG 420
AAACCACAAC GCCCCGAAAC CCAAAACTCC CCAATACATG AAAAAACCAG CTTCCCACCG 480
AAGTGAGAAG CTGGTTTAGT TTGCGGAGGA TAGGGGATTT GAACCCCTGA GGGATTGCTC 540
CCAACCCGCG TTCCAGGCGA GCGACATAGG CCGCTAGTCG AATCCTCCAG CTAGAACGGC 600
TGCAACGCAT GGCTGCTTTG TTCTGGGGAT TAGATTACAC AAAAGTCGTT TAGAAACTCA 660
AATCCGCTCG CAGTTGGCGT TTTCTGGGGC GGTTCAGCTA GAGTTATGCG AAGGATCCCG 720
TGCGGCGTTT ATCTTGTGAA CTCCCCCAGG GCAGGAATGC AGCAAGGGTC AGCGAGCTCT 780
GACGGGTGCG CGGGGTCCCC TAAAACGTCT AGAGTAGTGG CTTGAGGTCA CTGCTCTTTT 840
TTTGTGCCCT TTTTTTGGTC CGTCTATTTT GCCACCAC ATG CGG AGG TAC GCA 893
Met Arg Arg Tyr Alá 1 5
GTT ATG AGT TCA Ser GTT Val 10 TCG Ser CTG Leu CAG Gin GAT Asp TTT Phe 15 GAT Asp GCA Alá GAG Glu CGA Arg ATT Ile 20 GGT Gly 941
Val Met Ser
CTG TTC CAC GAG GAC ATT AAA CGC AAG TTT GAT GAG CTC TAG TCA AAA 989
Leu Phe His Glu Asp Ile Lys Arg Lys Phe Asp Glu Leu Lys Ser Lys
25 30 35
AAT CTG AAG CTG GAT CTT ACT CGC GGT AAG CCT TCG TCG GAG CAG TTG 1037
Asn Leu Lys Leu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Pro Ser Ser Glu Gin Leu
40 45 50
GAT TTC GCT GAT GAG CTG TTG GCG TTG CCT GGT AAG GGC GAT TTC AAG 1085
Asp Phe Alá Asp Glu Leu Leu Alá Leu Pro Gly Lys Gly Asp Phe Lys
55 60 65
GCT GCG GAT GGT ACT GAT GTC CGT AAC TAT GGC GGG CTG GAT GGC ATT 1133
Alá Alá Asp Gly Thr Asp Val Arg Asn Tyr Gly Gly Leu Asp Gly Ile
70 75 80 85
GTT GAT ATT CGT CAG ATT TGG GCG GAT TTG CTG GGT GTT CCT GTG GAG 1181
Val Asp Ile Arg Gin Ile Trp Alá Asp Leu Leu Gly Val Pro Val Glu
90 95 100
CAG GTG CTG GCG GGG GAT GCT TCG AGC TTG AAC ATC ATG TTT GAT GTG 1229
Gin Val Leu Alá Gly Asp Alá Ser Ser Leu Asn Ile Met Phe Asp Val
105 110 115
ATC AGC TGG TCG TAC ATT TTT GGT AAC AAT GAT TCG GTT CAG CCT TGG 1277
Ile Ser Trp Ser Tyr Ile Phe Gly Asn Asn Asp Ser Val Gin Pro Trp
120 125 130
TCG AAG GAA GAA ACT GTT AAG TGG ATT TGT CCT GTT CCG GGA TAT GAT 1325
Ser Lys Glu Glu Thr Val Lys Trp Ile Cys Pro Val Pro Gly Tyr Asp
135 140 145
HU 224 492 Β1
CGC Arg 150 CAT His TTC Phe TCC Ser ATC Ile ACG Thr 155 GAG Glu CGT Arg TTC Phe GGC Gly TTT Phe 160 GAG Glu ATG Met ATT Ile TCT Ser GTG Val 165 1373
CCA ATG AAT GAA GAC GGC CCT GAT ATG GAT GCT GTT GAG GAA TTG GTC 1421
Pro Met Asn Glu Asp Gly Pro Asp Met Asp Alá Val Glu Glu Leu Val
170 175 180
AAG GAT CCG CAG GTT AAG GGC ATG TGG GTT GTG CCG GTA TTT TCT AAC 1469
Lys Asp Pro Gin Val Lys Gly Met Trp Val Val Pro Val Phe Ser Asn
185 190 195
CCG ACT GGT TTC ACG GTG TCG GAG GAC GTC GCA AAG CGT CTG AGC ACG 1517
Pro Thr Gly Phe Thr Val Ser Glu Asp Val Alá Lys Arg Leu Ser Thr
200 205 210
ATG GAA ACT GCG GCG CCG GAC TTC CGC GTG GTG TGG GAT AAC GCT TAC 1565
Met Glu Thr Alá Alá Pro Asp Phe Arg Val Val Trp Asp Asn Alá Tyr
215 220 225
GCC GTT CAT ACT CTG ACC GAT GAG TTC CCT GAG GTC ATC GAC ATC GTT 1613
Alá Val His Thr Leu Thr Asp Glu Phe Pro Glu Val Ile Asp Ile Val
230 235 240 245
GGG CTT GGT GAG GCG GCG GGT AAC CCG AAC CGT TTC TGG GCG TTC ACT 1661
Gly Leu Gly Glu Alá Alá Gly Asn Pro Asn Arg Phe Trp Alá Phe Thr
250 255 260
TCT ACT TCG AAG ATC ACT CTC GCG GGT GCG GGC GTG TCC TTC TTC ATG 1709
Ser Thr Ser Lys Ile Thr Leu Alá Gly Alá Gly Val Ser Phe Phe Met
265 270 275
ACT TCT GCG GAG AAC CGT AAG TGG TAC TCC GGT CAT GCG GGT ATC CGT 1757
Thr Ser Alá Glu Asn Arg Lys Trp Tyr Ser Gly His Alá Gly Ile Arg
280 285 290
GGC ATT GGC CCT AAC AAG GTC AAT CAG TTG GCT CAT GCG CGT TAC T T T 1805
Gly Ile Gly Pro Asn Lys Val Asn Gin Leu Alá His Alá Arg Tyr Phe
295 300 305
GGC GAT GCT GAG GGA GTG CGC GCG GTG ATG CGT AAG CAT GCT GCG TCG 1853
Gly Asp Alá Glu Gly Val Arg Alá Val Met Arg Lys His Alá Alá Ser
310 315 320 325
TTG GCT CCG AAG TTC AAC AAG GTT CTG GAG ATC CTG GAT TCT CGC CTT 1901
Leu Alá Pro Lys Phe Asn Lys Val Leu Glu Ile Leu Asp Ser Arg Leu
330 335 340
GCT GAG TAC GGT GTC GCG CAG TGG ACT GTC CCT GCG GGC GGT TAC TTC 1949
Alá Glu Tyr Gly Val Alá Gin Trp Thr Val Pro Alá Gly Gly Tyr Phe
345 350 355
ATT TCC CTT GAT GTG GTT CCT GGT ACG GCA TCT CGT GTG GCT GAG TTG 1997
Ile Ser Leu Asp Val Val Pro Gly Thr Alá Ser Arg Val Alá Glu Leu
360 365 370
GCT AAG GAA GCC GGC ATT GCG TTG ACG GGT GCG GGT TCT TCT TAC CCG 2045
Alá Lys Glu Alá Gly Ile Alá Leu Thr Gly Alá Gly Ser Ser Tyr Pro
375 380 385
HU 224 492 Β1
CTG Leu 390 CGT Arg CAG Gin GAT Asp CCG Pro GAG Glu 395 AAC Asn AAG Lys AAC Asn CTC Leu CGT Arg 400 TTG Leu GCG Alá CCT Pro TCT Ser CTG Leu 405 2093
CCT CCT GTT GAG GAA CTT GAG GTT GCC ATG GAT GGC GTG GCT ACG TGT 2141
Pro Pro Val Glu Glu Leu Glu Val Alá Met Asp Gly Val Alá Thr Cys
410 415 420
GTT TTG CTG GCA GCT GCG GAG CAC TAC GCT AGC TAGAGTGAAT , ACCGCGGAAA 2194
Val Leu Leu Alá Alá Alá Glu His Tyr Alá Ser
425 430
CTGCACATTG GATTAACCGT TTGCTGCCGG GTCAGCCGGA GTTTCACCAG GTTGGCGCGT 2254
TTAAAGTGGC GGGTTACACG CTTGATGATG AGTCAATTGC GTGTTCTGTC AATTTCGGGC 2314
GCGTCAACAC GGGCCTGGTC ACCGAGACAG GCGCGGAAAC CGTCGATGTG CGAAGTGAGA 2374
TTTTGAGCCT GGCCAGGGCC GACGTGTCCG TGCCTGGGCG CGCCGTCGGC GCTGCTGCAA 2434
CAATGCTTCT CGACGCCTCC CTCTCCTTCA AATCCGCCAC CGATTCCAGT GTCACTCCCA 2494
TGCATGCCCA ACCGGGACAG ATC 2517
A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 432 bázis
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 31. Met 1 AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Arg Tyr Alá Val 5 Met Ser Ser Val 10 Ser Leu Gin Asp Phe 15 Asp
Alá Glu Arg Ile 20 Gly Leu Phe His Glu Asp 25 Ile Lys Arg Lys 30 Phe Asp
Glu Leu Lys Ser 35 Lys Asn Leu Lys 40 Leu Asp Leu Thr Arg 45 Gly Lys Pro
Ser Ser 50 Glu Gin Leu Asp Phe 55 Alá Asp Glu Leu Leu 60 Alá Leu Pro Gly
Lys 65 Gly Asp Phe Lys Alá 70 Alá Asp Gly Thr Asp 75 Val Arg Asn Tyr Gly 80
Gly Leu Asp Gly Ile Val 85 Asp Ile Arg Gin 90 Ile Trp Alá Asp Leu 95 Leu
Gly Val Pro Val 100 Glu Gin Val Leu Alá Gly 105 Asp Alá Ser Ser 110 Leu Asn
Ile Met Phe Asp 115 Val Ile Ser Trp 120 Ser Tyr Ile Phe Gly 125 Asn Asn Asp
Ser Val 130 Gin Pro Trp Ser Lys 135 Glu Glu Thr Val Lys 140 Trp Ile Cys Pro
Val 145 Pro Gly Tyr Asp Arg 150 His Phe Ser Ile Thr 155 Glu Arg Phe Gly Phe 160
Glu Met Ile Ser Val Pro 165 Met Asn Glu Asp 170 Gly Pro Asp Met Asp 175 Alá
HU 224 492 Β1
Val Glu Glu Leu 180 Val Lys Asp Pro Gin 185 Val Lys Gly Met Trp 190 Val Val
Pro Val Phe Ser Asn Pro Thr Gly Phe Thr Val Ser Glu Asp Val Alá
195 200 205
Lys Arg Leu Ser Thr Met Glu Thr Alá Alá Pro Asp Phe Arg Val Val
210 215 220
Trp Asp Asn Alá Tyr Alá Val His Thr Leu Thr Asp Glu Phe Pro Glu
225 230 235 240
Val Ile Asp Ile Val Gly Leu Gly Glu Alá Alá Gly Asn Pro Asn Arg
245 250 255
Phe Trp Alá Phe Thr Ser Thr Ser Lys Ile Thr Leu Alá Gly Alá Gly
260 265 270
Val Ser Phe Phe Met Thr Ser Alá Glu Asn Arg Lys Trp Tyr Ser Gly
275 280 285
His Alá Gly Ile Arg Gly Ile Gly Pro Asn Lys Val Asn Gin Leu Alá
290 295 300
His Alá Arg Tyr Phe Gly Asp Alá Glu Gly Val Arg Alá Val Met Arg
305 310 315 320
Lys His Alá Alá Ser Leu Alá Pro Lys Phe Asn Lys Val Leu Glu Ile
325 330 335
Leu Asp Ser Arg Leu Alá Glu Tyr Gly Val Alá Gin Trp Thr Val Pro
340 345 350
Alá Gly Gly Tyr Phe Ile Ser Leu Asp Val Val Pro Gly Thr Alá Ser
355 360 365
Arg Val Alá Glu Leu Alá Lys Glu Alá Gly Ile Alá Leu Thr Gly Alá
370 375 380
Gly Ser Ser Tyr Pro Leu Arg Gin Asp Pro Glu Asn Lys Asn Leu Arg
385 390 395 400
Leu Alá Pro Ser Leu Pro Pro Val Glu Glu Leu Glu Val Alá Met Asp
405 410 415
Gly Val Alá Thr Cys Val Leu Leu Alá Alá Alá Glu His Tyr Alá Ser
420 425 430

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Rekombináns DNS, amely korineform baktériumok sejtjeiben autonóm módon replikálódni képes, és 55 tartalmaz egy, aszpartokinázt kódoló DNS-szekvenciát, amely aszpartokinázban az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen le van csökkentve, valamint tartalmaz egy, dihidrodipikolinát-reduktázt kódoló DNS-szekven- 60 ciát, egy, dihidrodipikolinát-szintázt kódoló DNS-szekvenciát, egy, diamino-pimelát-dekarboxilázt kódoló DNS-szekvenciát és egy, aszpartát-amino-transzferázt kódoló DNS-szekvenciát.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS, amely L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szemben lényegesen lecsökkentett érzékenységű aszpartokinázt kódoló DNS-szekvenciaként korineform baktériumból származó mutáns aszpartokinázt kódol,
    HU 224 492 Β1 és amely aszpartokinázban az α-alegység N-terminálisától számított, a szekvencialistában az 5-ös azonosító számon megadott aminosavszekvencia szerinti 279., alaninnak megfelelő aminosav alanintól eltérő, nem savas aminosavra van kicserélve, és a β-alegység N-terminálisától számított, a szekvencialistában a 7-es azonosító számon megadott aminosavszekvencia szerinti 30., alaninnak megfelelő aminosav alanintól eltérő, nem savas aminosavra van kicserélve.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS, amely dihidrodipikolinát-reduktázt kódoló DNS-szekvenciaként a szekvencialistában a 11-es azonosító számon megadott aminosavszekvenciát kódoló DNSszekvenciát tartalmaz, vagy olyan aminosavszekvenciát kódoló DNS-t, amely aminosavszekvencia lényegében megegyezik a szekvencialistában a 11-es azonosító számon megadott aminosavszekvenciával.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS, amely dihidrodipikolinát-szintázt kódoló DNS-szekvenciaként a szekvencialistában a 15-ös azonosító számon megadott aminosavszekvenciát kódoló DNSszekvenciát tartalmaz, vagy olyan aminosavszekvenciát kódoló DNS-t, amely aminosavszekvencia lényegében megegyezik a szekvencialistában a 15-ös azonosító számon megadott aminosavszekvenciával.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS, amely diamino-pimelát-dekarboxilázt kódoló DNSszekvenciaként a szekvencialistában a 20-as azonosító számon megadott aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, vagy olyan aminosavszekvenciát kódoló DNS-t, amely aminosavszekvencia lényegében megegyezik a szekvencialistában a 20-as azonosító számon megadott aminosavszekvenciával.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS, amely aszpartát-amino-transzferázt kódoló DNS-szekvenciaként a szekvencialistában a 24-es vagy a 31-es azonosító számon megadott aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, vagy olyan aminosavszekvenciát kódoló DNS-t, amely aminosavszekvencia lényegében megegyezik a szekvencialistában a 24-es vagy a 31-es azonosító számon megadott aminosavszekvenciával.
  7. 7. Korineform baktérium, amely olyan aszpartokinázt hordoz, amely aszpartokinázban az L-lizin és L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenység lényegesen le van csökkentve, és tartalmaz továbbá egy, dihidrodipikolinát-reduktázt kódoló, fokozott aktivitású DNS-szekvenciát, egy, dihidrodipikolinát-szintázt kódoló, fokozott aktivitású DNS-szekvenciát, egy, diamino-pimelát-dekarboxilázt kódoló, fokozott aktivitású DNS-szekvenciát és egy, aszpartát-amino-transzferázt kódoló, fokozott aktivitású DNS-szekvenciát.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti korineform baktérium, amely 1. igénypont szerinti rekombináns DNS bejuttatása útján van transzformálva.
  9. 9. Eljárás L-lizin termelésére, azzal jellemezve, hogy 8. igénypont szerinti korineform baktériumot megfelelő tápközegben tenyésztünk, és így L-lizin termelődését és felhalmozódását váltjuk ki a baktériumsejt-tenyészetben, majd az L-lizint a tenyészetből kinyerjük.
HU9702360A 1996-12-05 1997-12-05 Eljárás L-lizin előállítására HU224492B1 (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP32565996 1996-12-05

Publications (4)

Publication Number Publication Date
HU9702360D0 HU9702360D0 (en) 1998-03-02
HUP9702360A2 HUP9702360A2 (hu) 1999-06-28
HUP9702360A3 HUP9702360A3 (en) 2002-12-28
HU224492B1 true HU224492B1 (hu) 2005-09-28

Family

ID=18179293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9702360A HU224492B1 (hu) 1996-12-05 1997-12-05 Eljárás L-lizin előállítására

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6004773A (hu)
EP (1) EP0854189B1 (hu)
CN (2) CN1159443C (hu)
BR (1) BR9706059B1 (hu)
DE (1) DE69736698T2 (hu)
DK (1) DK0854189T3 (hu)
ES (1) ES2273355T3 (hu)
HU (1) HU224492B1 (hu)
PL (1) PL190430B1 (hu)
SK (1) SK285201B6 (hu)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU705550B2 (en) 1995-06-07 1999-05-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
DE19931317A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
JP2003135066A (ja) * 1999-03-19 2003-05-13 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
MXPA01013123A (es) * 1999-06-25 2002-06-21 Basf Ag Genes de corynebacterium glutamicum que codifican proteinas de via metabolica.
JP2003169674A (ja) * 1999-07-02 2003-06-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2003159092A (ja) * 1999-07-02 2003-06-03 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
BR0012020A (pt) 1999-07-02 2002-07-02 Ajinomoto Kk Proteìna, e, dna
US20020086371A1 (en) 1999-07-07 2002-07-04 Degussa-Huls Aktiengesellschaft L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine
DE19931314A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Lysin
US6861246B2 (en) 1999-07-07 2005-03-01 Degussa Ag L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of lysine
DE19943587A1 (de) 1999-09-11 2001-03-15 Degussa Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen
WO2001020009A1 (de) 1999-09-15 2001-03-22 Basf Plant Science Gmbh Pflanzen mit verändertem aminosäuregehalt und verfahren zu deren herstellung
JP4306169B2 (ja) * 1999-12-24 2009-07-29 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法及び新規遺伝子
US6927046B1 (en) 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
WO2002022666A2 (en) * 2000-09-12 2002-03-21 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the gora gene
MXPA03007089A (es) 2001-02-08 2004-10-15 Archer Daniels Midland Co Construccion de polinucleotidos para produccion incrementada de lisina.
DE10154292A1 (de) 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag Gene die für Stoffwechselweg-Proteine codieren
RU2244007C2 (ru) * 2002-02-27 2005-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты)
EP2818556B1 (en) 2004-10-07 2023-05-10 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing a basic substance
KR100628394B1 (ko) 2005-01-04 2006-09-26 씨제이 주식회사 코리네박테리움의 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 유전자의결실을 통한 알라닌 요구주의 제작 및 이를 이용한엘-라이신의 생산방법
DE102006032634A1 (de) 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
EP1881076A1 (en) * 2006-07-17 2008-01-23 Evonik Degussa GmbH Method for producing L-amino acids
AU2007295159B2 (en) * 2006-09-15 2012-09-13 Cj Cheiljedang Corporation A Corynebacteria having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same
KR100830826B1 (ko) 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
US8048624B1 (en) 2007-12-04 2011-11-01 Opx Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
US9023622B2 (en) 2009-02-10 2015-05-05 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Method for producing L-amino acid using a microorganism with decreased aspartate aminotransferase activity
WO2011038364A1 (en) 2009-09-27 2011-03-31 Opx Biotechnologies, Inc. Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products
US8809027B1 (en) 2009-09-27 2014-08-19 Opx Biotechnologies, Inc. Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase
US9169502B2 (en) * 2010-06-15 2015-10-27 Paik Kwang Industrial Co., Ltd. Method of producing L-lysine using a Corynebacterium glutamicum microorganism
IN2015DN01858A (hu) 2012-08-10 2015-05-29 Opx Biotechnologies Inc
US20150057465A1 (en) 2013-03-15 2015-02-26 Opx Biotechnologies, Inc. Control of growth-induction-production phases
US9512057B2 (en) 2013-03-15 2016-12-06 Cargill, Incorporated 3-hydroxypropionic acid compositions
JP6603658B2 (ja) 2013-07-19 2019-11-06 カーギル インコーポレイテッド 脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
EP2860256B1 (en) 2013-10-11 2017-03-08 CJ Cheiljedang Corporation Method of producing l-amino acids
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
CN110494566A (zh) 2017-02-02 2019-11-22 嘉吉公司 产生c6-c10脂肪酸衍生物的经遗传修饰的细胞
EP3456833A1 (en) * 2017-09-18 2019-03-20 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
WO2020257395A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in e. coli
CN114540399B (zh) * 2022-02-15 2024-05-03 宁夏伊品生物科技股份有限公司 一种制备l-缬氨酸的方法及其所用基因突变体和生物材料
CN114835783B (zh) * 2022-06-01 2024-06-25 宁夏伊品生物科技股份有限公司 NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5867699A (ja) * 1981-10-16 1983-04-22 Ajinomoto Co Inc プラスミド
US4861722A (en) * 1983-08-24 1989-08-29 Ajinomoto Company, Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JP3473042B2 (ja) * 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
AU705550B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
CA2180202A1 (en) * 1995-06-30 1996-12-31 Mika Moriya Method of amplifying gene using artificial transposon

Also Published As

Publication number Publication date
US6004773A (en) 1999-12-21
PL190430B1 (pl) 2005-12-30
BR9706059B1 (pt) 2012-02-22
DE69736698T2 (de) 2007-09-20
HUP9702360A2 (hu) 1999-06-28
HUP9702360A3 (en) 2002-12-28
BR9706059A (pt) 1999-10-05
PL323546A1 (en) 1998-06-08
EP0854189A2 (en) 1998-07-22
HU9702360D0 (en) 1998-03-02
EP0854189A3 (en) 2002-11-06
EP0854189B1 (en) 2006-09-20
CN1524956A (zh) 2004-09-01
CN1187540A (zh) 1998-07-15
CN1159443C (zh) 2004-07-28
SK285201B6 (sk) 2006-08-03
ES2273355T3 (es) 2007-05-01
SK163697A3 (en) 1998-07-08
CN1273592C (zh) 2006-09-06
DK0854189T3 (da) 2007-01-15
DE69736698D1 (de) 2006-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4168463B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
HU224492B1 (hu) Eljárás L-lizin előállítására
JP4035855B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
JP4075087B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
US8183017B2 (en) Method of producing L-lysine
JPH0970291A (ja) 人工トランスポゾンを用いた遺伝子増幅方法
WO2000053726A1 (fr) Procede de production de l-lysine

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20050808