PL190430B1 - Zrekombinowany DNA, bakteria maczugowata, sposób wytwarzania L-lizyny oraz DNA - Google Patents

Abstract

1 . Zrekombinowany DNA replikujacy sie autonomicznie w komórkach bakterii ma- czugowatej, obejmujacy sekwencje DNA kodujaca aspartokinaze charakteryzujaca sie znaczacym zmniejszeniem czulosci hamowania zwrotnego przez L-lizyne i L-treonine, i sekwencje DNA kodujaca reduktaze dihydrodipikolinianowa, sekwencje DNA kodujaca synteze dihydrodipikolinianowa, sekwencje DNA kodujaca dekarboksylaze diaminopime- linianowa oraz sekwencje DNA kodujaca aminotransferaze asparaginianowa, przy czym aspartokinaza charakteryzujaca sie znaczacym zmniejszeniem czulosci hamowania zwrotnego przez L-lizyne i L-treonine jest zmutowana aspartokinaza pochodzaca z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasowa odpowiadajaca 279 reszcie alaniny (liczac od konca N czasteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 zmieniona jest na reszte treoninowa w podjednostce alfa, zas reszta aminokwasowa odpowiadajaca 30 reszcie alaniny (liczac od konca N czasteczki) w sekwencji aminokwasowej przedstawionej nr 7 zmieniona jest na reszte treoninowa w podjednostce beta. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany DNA, bakteria maczugowata, sposób wytwarzania L-lizyny oraz DNA.

L-lizyna, wykorzystywana jako dodatek paszowy, wytwarzana jest zazwyczaj sposobem fermentacyjnym z użyciem zmutowanych szczepów bakterii maczugowatych wytwarzających L-lizynę. Obecnie znane są różne bakterie wytwarzające L-lizynę, uzyskane w wyniku sztucznej mutagenezy dzikich, należących do korynebakterii (bakterii maczugowatych).

Znany jest wektor plazmidowy ulegający autonomicznej replikacji w komórkach bakteryjnych i posiadający gen markerowy warunkujący oporność na antybiotyk (Patent US 4,514,502) i sposób wprowadzania genu do komórek bakteryjnych (np. Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 2—2^7791), dla bakterii maczugowatych.

Znana jest również możliwość hodowania bakterii wytwarzających L-treoninę lub L-izoleucynę, sposobami podanymi powyżej (Patent US 4,452,890 i 4,442,208). Podobnie jak w przypadku hodowania bakterii wytwarzających L-lizynę znany jest sposób, w którym gen uczestniczący w biosyntezie L-lizyny wprowadzony jest do wektora plazmidowego w celu powielenia genu w komórkach bakteryjnych (np. Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 56-1(50997).

Znane geny uczestniczące w biosyntezie L-lizyny obejmują, na przykład, gen kodujący reduktazę kwasu dihydrodipikolinowego (Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 7-75578) i gen kodujący aminotransferazę kwasu asparaginowego (Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 6-102028), dla których gen uczestniczący w biosyntezie L-lizyny został sklonowany, jak również gen kodujący karboksylazę fosfoenolopirogromanową (Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 60-87788) i gen kodujący syntazę kwasu diaminopi.melinowego (Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 6-55149) i gen kodujący dekarboksylazę diarninopimdinianową (Japońskie zgłoszenie Patentowe Nr 60-62994), dla których amplifikacja genu wpływa na produktywność L-lizyny.

Co do enzymów uczestniczących w biosyntezie L-lizyny, znany jest przypadek enzymu podlegającego hamowaniu zwrotnemu, gdy enzym występuje w formie dzikiej. W tym przypadku produktywność L-lizyny można polepszyć wprowadzając gen kodujący wspomniany enzym posiadający mutacje, zmniejszające czułość hamowania zwrotnego. Przykłady tak działających enzymów obejj^^j^ na przykład gen aspartokinazy (Publikacja WO 94/25605).

Jak to przedstawiono powyżej, pewne sukcesy osiągnięto sposobem amplifikacji genów systemu biosyntezy L-lizyny lub poprzez wprowadzanie genów zmutowanych. Na przykład bakteria maczugowata niosąca zmutowany gen aspartokinazy ze zmniejszoną czułością hamowania łącznego przez lizynę i treoninę wytwarza znaczące ilości L-lizyny (około 25 g/L). Jednakże bakteria ta charakteryzuje się obniżonym tempem wzrostu, w porównaniu z bakteria niosącą niezmutowany gen aspartokinazy. Donoszono również, że produktywność L-lizyny ulega polepszeniu przez dodatkowe wprowadzenie genu syntazy dihydrodipikohnianowej obok zmutowanego genu aspartokinazy (Appl Envir Microbiol 57(6), 1746-1752 (1991)). Bakteria taka charakteryzuje się jednak również obniżonym tempem wzrostu.

Podobnie jak dla genu reduktazy dihydrodipikolinowej, wykazano również, że aktywność reduktazy wzrasta w bakterii maczugowatej, do której wprowadzono wymieniony gen, nie doniesiono jednak o wpływie tej manipulacji na produktywność L-lizyny (Japońskie Zgłoszenie Patentowe 7-7(5/578).

Nie jest znany obecnie przypadek udanego i znaczącego poprawienia wydajności uzyskiwania L-lizyny przez bakterie maczugowate bez ograniczania tempa wzrostu sposobem manipulowania wieloma genami systemu biosyntezy L-lizyny. Nie donoszono również o przypadku polepszania wzrostu bakterii poprzez wzmocnienie genu biosyntezy L-lizyny.

Celem wynalazku jest zwiększenie wydajności wytwarzania L-lizyny bez ograniczania wzrostu bakterii maczugowatej, poprzez wykorzystanie materiałów genetycznych w postaci sekwencji DNA kodujących aspartokinazę (Oznaczaną dalej skrótem AK; gen kodujący AK oznaczany jest dalej skrótem lysC, jeżeli jest to konieczne), reduktazę dihydrodipikolinianową (określaną następnie skrótem DDPR, a gen ją kodujący skrótem dapB”), syntazę dihydrodipikolinianową (oznaczaną skrótem DDPS, a gen ją kodujący dapA), dekarboksylazę diaminopimelinianową (oznaczaną skrótem DDC, a gen ją kodujący skrótem lys.A)

190 430 i aminotransferazę asparagimanowa (oznaczaną skrótem AAT, a gen ją kodujący skrótem aspC), które to enzymy są istotnymi enzymami biosyntezy L-lizyny w korynebakteriach.

Wynalazek opiera się na obserwacji, że można zwiększyć wytwarzanie L-lizyny wzmacniając kombinację zmutowanego genu lysC (dalej określany jako zmutowany lysC) kodujący zmutowaną AK, charalderyzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania przez L-lizynę i L-treoninę oraz genów dapA, dapB, lysA i aspC.

Wynalazek dostarcza zrekombinowanego DNA replikującego się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, obejmującego sekwencję DNA kodującą aspartokinazę charaktnryzyącą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę i sekwencję DNA kodującą reduktazę dihydrodipikolinianową, sekwencję DNA kodującą syntazę dihydrodipikolinianową sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimelinianową oraz sekwencję DNA kodującą aminotransferazę asparaginianową przy czym aspartokinaza charakteryzująca się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę jest zmutowaną, aspartokinazą pochodzącą z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasowa odpowiadająca 279 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 zmieniona jest na resztę treoninową w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasowa odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej przedstawionej nr 7 zmieniona jest na resztę treonrnową w podjednostce beta.

W korzystnym wariancie, sekwencja DNA kodująca reduktazę dihydrodipikolinianową koduje sekwencję aminokwasowa nr 11 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą jak sekwencja aminokwasowa nr 11.

W korzystnym wariancie, sekwencja DNA kodująca syntezę, dihydrodipikolimanową koduje sekwencję aminokwasowa nr 15 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo taką -samą jak sekwencja aminokwasowa nr 15.

Korzystnie, sekwencja DNA kodująca dekarboksylazę diaminopimelinianową koduje sekwencję aminokwasową.nr 20 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo takasa majak sekwencja aminokwasowa nr 20.

Korzystnie, sekwencja DNA kodująca aminotransferazę asparagimanowa koduje sekwencję aminokwasowa nr 24 albo 31 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą jak sekwencja aminokwasowa nr 24 albo 31.

Wynalazek dostarcza również bakterię maczugowatą niosącą aspartokinazę charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę oraz zawierająca wzmocnioną sekwencję DNA kodującą reduktazę dihydrodipikolinianową wzmocnioną sekwencję DNA kodującą syntazę cίihydrodipikolinianową, wzmocnioną sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimelinianowaą oraz wzmocnioną sekwencję DNA kodującą aminotransferazę asparaginńanową przy czym aspartokinaza charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę jest zmutowaną aspartokknaz. pochodzącą z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasowa odpowiadająca 279 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 zmieniona jest na resztę treoninową w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasowa odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej przedstawionej nr 7 zmieniona jest na resztę treonrnową w podjednostce beta.

Korzystnie, bakteria według wynalazku jest stransformowana poprzez wprowadzenie zrekombinowanego DNA według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-lizyny charakteryzujący się tym, że hoduje się bakterię maczugowatą według wynalazku w pożywce odpowiedniej do wytwarzania i akumulacji L-lizyny w hodowli bakteryjnej, a następnie wyodrębnia się L-lizynę z hodowli.

Wynalazek dostarcza także DNA kodujący białko obejmujące sekwencję aminokwasową nr 31. _

Korzystnie, DNA według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową od pozycji 879 do pozycji 2174 w sekwencji nukleotydowej nr 30.

Bakteria maczugowata wymieniana w wynalazku to grupa mikroorganizmów definiowana według Bergey's Manual of Determinative Bacteriology wyd. 8, str. 599 (1974), charak190 430 teryzowana jako bakterie Gram-dodatnie, kwasoodpome pałeczki, nie tworzące endospor. Korynebakterie obejmują bakterie należące do rodzaju Corynebacterium, bakterie należące do rodzaju Brecdbacterium, pierwotnie klasyfikowane w rodzaju Brevibacterium, lecz ostatnio przeniesione do rodzaju Corynebacterium i bakterie należące do rodzaju Brevibacterium blisko spokrewnione z bakteriami należącymi do rodzaju Corynebacterium.

Według wynalazku można polepszyć ilości i tempo produkcji L-lizyny przez bakterie maczugowate.

Przedmiot wynalazku w przykładach realizacji jest odtworzony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia sposób konstruowania plazmidów p399AK9B i p399AKYB obejmujących zmutowany gen lysC, fig. 2 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pDPBR obejmującego gen dapB i Brevi.-ori, fig. 3 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pDPBS obejmującego gen dapA i Brevi.-ori, fig. 4 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pLYSA obejmującego gen lysA, fig. 5 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pLYSAB obejmującego gen lysA i Brevi.-ori, fig. 6 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCRCAB obejmującego gen lysC, dapB i Brevi.-ori, fig. 7 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCB obejmującego zmutowany gen lysC i dapB, fig. 8 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pAB obejmującego gen dapA, dapB i Brevi.-ori, fig. 9 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCAB obejmującego zmutowany gen lysC, dapA, dapB i Brevi.-ori, fig. 10 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCABL obejmującego zmutowany gen lysC, dapA, dapB, lysA i Brevi.-ori, fig. 11 przedstawia sposób konstruowania nowych wektorów do klonowania w komórkach bakterii maczugowatych, pVK6 i pVK7, fig. 12 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pOm obejmującego gen aspC, fig. 13 ilustruje dwie otwarte ramki odczytu z fragmentu chromosomalnego DNA ze szczepu ATCC 13869, zaś fig. 14 przedstawia sposób konstruowania pORFl.

<1> Przygotowanie genów biosyntezy L-lizyny

Geny biosyntezy L-lizyny uzyskiwane są odpowiednio poprzez przygotowanie chromosomalnego DNA z bakterii, służącej jako źródło DNA, konstruowaniu biblioteki chromosomalnego DNA z wykorzystaniem wektora plazmidowego lub podobnego, wybraniu szczepu niosącego pożądany gen i odzyskaniu, z wybranego genu, zrekombinowanego DNA, do którego włączony jest wymieniony gen. Źródło DNA genów biosyntezy L-lizyny nie jest szczegółowo ograniczone, przy założeniu iż pożądany gen biosyntezy L-lizyny koduje białko enzymatyczne działające w komórkach bakterii maczugowatych. Korzystnym źródłem DNA są jednak bakterie maczugowate.

Wszystkie geny, lysC, dapA, dapB i lysA z bakterii maczugowatych mają znaną sekwencję. W związku z tym można je uzyskać stosując technikę PGR (reakcji łańcuchowej polimerazy; patrz: White TJ i wsp Trends Genet 5, 185, 1989).

Każdy z genów biosyntezy L-lizyny można uzyskać stosując sposoby wyszczególnione poniżej.

(1) Przygotowanie zmutowanego genu lysC

Fragment DNA obejmujący zmutowany gen lysC można uzyskać ze zmutowanego szczepu, w którym czułość synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treomną została w znaczący sposób zmniejszona (publikacja WO 94/25605). Wymieniony zmutowany szczep można uzyskać na przykład z grupy komórek pochodzących ze szczepu typu dzikiego korynebakterii poddanych działaniu mutagenizującemu np. naświetlaniu ultrafioletem i działaniu takich związków jak N-metyło-N'-mtro-N-nittozoguarudyna (NTG). Aktywność AK można określać stosując metodę opisaną przez Miyajima R i wsp. J Biochem 63 (2), 139-148, 1968. Najkorzystniejszy szczep zmutowany reprezentowany jest przez bakterię wytwarzającą L-lizynę AJ3445 (FERM P-1944) uzyskaną w wyniku mutagenezy dzikiego szczepu Brevibacterium lactofermentus ATCC 13869 (obecna nazwa: Corynebacterium glutatnicum).

Zmutowany gen lysC można również uzyskać metodą mutagenezy in vitro plazmidowego DNA obejmującego gen lysC typu dzikiego. Znane są dane o konkretnych mutacjach powodujących znaczące zmniejszenie czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treoniną (publikacja WO 94/25605). W związku z tym zmutowany gen

190 430 lysC można przygotować z genu lysC typu dzikiego wykorzystując wspomniane informacje, np. metodą mutagenezy kierowanej.

Fragment obejmujący gen lysC można wyizolować z bakterii maczugowatej otrzymując dtromosomalny DNA na przykład metodą Saito i Miury (Saito H, Miura K Biochem Bioph Acta 72, 619, 1963) i amplifikując gen lysC techniką łańcuchowej reakcji polimerazy (PGR; patrz White T i wsp Trend Genet 5, 185, 1989).

Startery DNA stanowią jednoniciowe 23 nukleotydowe i 21 nukleotydowe oligomery DNA o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 1 i 2 w Zestawieniu Sekwencji, służące do powielenia np. regionu liczącego około 1643 pz sekwencji kodującej genu lysC w oparciu o znaną sekwencję Corynebacterium glutamicum (Mol Microbiol (1991), 5(5), 1197-1204; Mol Gen Genet (1990), 224, 317-324). DNA można zsyntezować metodami standardowymi, stosując syntetyzer 380B firmy Applied Biosystems i metodę fosforoamidynową (Tetrahedron Lett (1981), 22, 1859). Powielanie techniką PGR można prowadzić w tenmocyklerze PJ2000 firmy Takara Shuzo, stosując polimerazę Taq, zgodnie z zaleceniami producenta.

Korzystne, by gen lysC powielany techniką PCR w celu otrzymania zrekombinowanego DNA zligowany był z DNA wektora replikującego się autonomicznie w komórkach E.coli i/lub korynebakterii, i by /rekombinowany DNA wprowadzony był następnie do komórek E.coli. Następujące założenia czynią łatwymi kolejne manipulacje. Wektor autonomicznie replikujący się w komórkach E.coli korzystnie jest wektorem plazmidowym, ulegającym korzystnie autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza, obejmującym na przykład pUC19, pUC 18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 i RSF1010.

Gdy do wymienionych wektorów zostanie wprowadzony fragment DNA posiadający zdolność do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej, wektory te wykorzystać można jako wektory przenośnikowe (shuttle vector), ulegające replikacji zarówno w komórkach E.coli, jak w bakterii maczugowatej. .

Poniżej wymieniono wektory przenośnikowe. Wymieniono również mikroorganizmy niosące każdy z wektorów i numery nadane przez międzynarodowe organizacje depozytowe (w nawiasach).

pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) pAJ655: Escherichia coli AJ 11882 (FERMBP-136)

Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAJ1844: Escherichia coliAJ11883 (FERM BP-.137)

Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ61l: Escherichia coli AJ 11884 (FERM BP-138) pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440: Bacillus subtilis AJ 11901 (FERM BP-140)

Wektory można otrzymać ze zgromadzonych w depozytach mikroorganizmów w następujący sposób. Komórki należy zebrać w fazie logarytmicznej wzrostu i ziizować użyciu lizozymu i SDS, a następnie oddzielić od lizatu przez wirowanie przy 30.000 x g w celu uzyskania supematantu. Do supematantu należy dodać glikolu polietylenowego, a następnie frakcjonować i oczyszczać poprzez wirowanie w gradiencie CsCl z bromkiem etydyny.

E.coli można transformować przez wprowadzenie plazmidu według metody, na przykład, D M Morrisona (Methods Enzymol 68, 326, 1979) lub metodą w której komórki biorcy traktowane są CaCh w celu zwiększenia przepuszczalności ścian komórkowych dla DNA (Handel M, Higa A J Mol Biol 53, 159, 1970).

Gen lysC typu dzikiego uzyskuje się przez izolację genu ze szczepu produkującego dziką formę AK, podczas gdy zmutowany gen lysC uzyskuje się ze zmutowanego szczepu AK, według przedstawionych wyżej sposobów.

Przykładowa sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA obejmującego gen lysC typu dzikiego przedstawia Sek Id Nr 3 w Zestawieniu Sekwencji. Sekwencję aminokwasową podjednostki alfa białka AK typu dzikiego wyprowadzoną z wyżej wymienionej sekwencji nukleotydowej przedstawia Sek Id Nr 4 w zestawieniu sekwencji wraz z sekwencją DNA. Sek Id Nr 5 przedstawia jedynie sekwencję aminokwasowa. Sekwencję aminokwasową podjednostki beta białka AK typu dzikiego wyprowadzoną z sekwencji DNA przedstawia Sek Id Nr 6 w Zestawieniu Sekwencji wraz z sekwencją DNA. Sek Id Nr 7 obrazuje jedynie

190 430 sekwencję aminokwasową. W każdej z podjednostek GTG stanowi kodon inicjacyjny i odpowiadającym mu aminokwasem jest metionina. Kodon ten może jednak określać zarówno metioninę, jak walinę lyb formylometioninę.

Zmutowany gen lysC według wynalazku koduje AK, w której czułość synergistycznego hamowania zwrotnego L-lizyną i L-treoniną została w znaczący sposób zmniejszona. Zmutowany gen lysC obejmuje mutację, w której reszta aminokwasową odpowiadająca 279 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 zmieniona jest na resztę treoninową w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasową odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej przedstawionej nr 7 zmieniona jest na resztę treoninową w podjednostce beta.

Kodon odpowiadający podstawianej reszcie aminokwasowej nie jest w szczególny sposób ograniczony, co do typu, przy założeniu że koduję wymieniona resztę aminokwasową. Jest możliwe, że sekwencja aminokwasowa AK typu dzikiego może się nieco różnić, w zależności od gatunku i szczepu bakterii. Białko AK zmutowane poprzez na przykład substytucje:, delecję lub insercję jednej lub więcej reszt aminokwasowych w jednej lub więcej pozycji gdy mutacja pozostaje bez wpływu na aktywność enzymatyczną przedstawioną powyżej, może być również wykorzystana. DNA kodujący AK, niosący mutacje spontaniczne można uzyskać izolując DNA hybrydyzujący w warunkach ścisłych z na przykład DNA posiadającego część sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 3.

Teirnin warunki ścisłe oznacza warunki, w których powstają specyficzne hybrydy, i nie powstają hybrydy niespecyficzne. Trudno jednak opisać liczbowo wymienione warunki hybrydyzacji. Warunki te przedstawione są wartościami, przy których kwasy nukleinowe wykazujące wysoką homologię, na przykład DNA wykazujące homologię nie mniejszą niż 90% hybrydyzują ze sobą, i kwasy nukleinowe wykazujące homologię mniejszą niż podana powyżej nie hybrydyzują ze sobą, lub przedstawione są wartościami temperatury hybrydyzacj i w zakresie od temperatury topnienia (T_m) w pełni parujących hybryd do temperatury (T_m - 30)°C, korzystnie od T_m do temperatury (T_m - 20)°C, i przy stężeniu soli odpowiadającym 1 x SSC, korzystnie 0.1 x SSC.

Można również zastosować inne AK, posiadające sztuczne mutacje, na przykład substytucje, delecję lub insercję innych i więcej reszt aminokwasowych, przy założeniu że mutacja pozostaje bez wpływu na aktywność enzymatyczną charakteryzująca się znaczącym zmniejszeniem czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności przez L-lizynę i L-treoninę. DNA kodujący AK niosący sztucznie wprowadzone mutacje można uzyskać modyfikując sekwencję nukleotydową tak, by otrzymać pożądaną substytucję, delecję lub insercję w specyficznej pozycji, na przykład drogą mutagenezy kierowanej. Zmutowany gen lysC można otrzymać również poprzez traktowanie mutagenem. Traktowanie mutagenem in vitro obejmuje kontaktowanie DNA obejmującego gen lysC z hydroksylaminą lub substancji podobną, i traktowanie mikroorgmuizmu niosącego DNA obeimujący gen lysC mutagenem takim jak ultrafiolet czy mutagenem stosowanym standardowo w sztucznej mutagenezie takim, jak N-metylo-N^nitro-N-nitrrzzguahdyna (NTG) lub kwas azotowy.

Po mutagenizacji miejsce wprowadzenie mutacji czy wystąpienia mutacji można określić wybierając DNA lub mikroorganizm kodujący lub wytwarzający AK posiadający aktywność AK i którego sekwencja aminokwasowa jest zmutowana, kodowany przez DNA poddany mutagenezie lub pochodzący z mikroorganizmu poddanego traktowaniu mutagenem. Miejsce wprowadzenia mutacji nie jest szczególnie ograniczone, przy założeniu, że mutacja nie wpływa w sposób znaczący na aktywność AK i na zmniejszenie czułość hamowania zwrotnego. Ilość wprowadzanych mutacji zmienia się w zależności od miejsca lub rodzaju zmutowanego aminokwasu w przestrzennej strukturze białka i nie jest w sposób szczególny ograniczona, przy założeniu że nie wpływa w sposób znaczący na aktywność AK i na zmniejszenie czułość hamowania zwrotnego. Liczba mutacji waha się zazwyczaj od 1 do 20, korzystnie od 1 do 10.

Szczep AJ 12691 uzyskany przez wprowadzenie plazmidu p399AK9B ze zmutowanym genem lysC do szczepu AJ12036 (FERM BP-734) jako do szczepu dzikiego Brewibactenum lactofermentus został przekazany do depozytu 10.04.1992, i uzyskał numer depozytowy FERM P-12918 w National Institute of Bioscience and Human Technology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and

190 430

Industry (1-3. Higashi 1-chome. Tsukuba-shi. Ibaraki-ken, 305 Japonia). i przekazany został do depozytu międzynarodowego zgodnie z układem budapesztańskim 10.02.1995 i uzyskał numer depozytowy FERM BP-4999.

(2) Przygotowanie genu dapB

Fragment DNA obejmujący gen dapB można przygotować z chromosomu bakterii maczugowatej techniką PGR. Dawca DNA nie jest w szczególny sposób ograniczony. choć jako przykład wybrano szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Sekwencja DNA genu kodującego DDPR jest znana dla Brevibacterium lactofermentum (J Bacteriol 175(9). 2743-2749. 1993) i na tej podstawie można przygotować startery do powielania DNA. Przykładami takich starterów są 23 nukleotydowe oligomery DNA 0 sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 8 w Zestawieniu Sekwencji. Syntezę DNA. PGR i otrzymanie plazmidu zawierającego dapB można dokonać tak samo. jak opisano to powyżej. dla genu lysC.

Sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA obejmującego dapB i wyprowadzona zeń sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest Sek Id Nr 10. Sama sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest Sek Id Nr 11. Oprócz fragmentów DNA kodujących sekwencję aminokwasową. można wykorzystać sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe zasadniczo takie same. jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 11. to jest sekwencje aminokwasowe posiadające mutacje typu substytucji. delecji lub insercji jednego lub więcej aminokwasów przy założeniu. że nie mają one zasadniczego wpływu na aktywność DDC. Gen lysA posiadający mutacje spontaniczne lub sztuczne można uzyskać w ten sam sposób. jak DNA posiadający mutacje nie wywierające wpływu na aktywność DDPR. Gen dapB z mutacjami spontanicznymi lub sztucznie wprowadzonymi można otrzymać w ten sam sposób, co DNA kodujący A posiadający mutacje nie wpływające na zmniejszenie czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treoniną.

Stransformowany szczep AJ13107 otrzymany poprzez wprowadzenie plazmidu pCRDAPB obejmującego gen dapB do szczepu E.coli JM109 przedstawiony w przykładzie poniżej został przekazany do depozytu 26.05.1995. i uzyskał numer depozytowy FERM BP-5I14 w National Institute of Bioscience and Human Tedrnology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3. Higashi 1-ehome. Tsukuba-shi. Ibaraki-ken. 305 Japonia) w oparciu o Układ Budapesztański.

(3) Otrzymanie dapA

Fragment DNA obejmujący gen dapA można przygotować z chromosomu bakterii maczugowatej techniką PGR. Dawca DNA nie jest w szczególny sposób ograniczony. choć jako przykład wybrano szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Sekwencja DNA genu kodującego DDPR jest znana dla Corynebacterium glutamicum (Nucleic Acids Res 18(21). 6421. 1990; numer depozytowy EMBL Χ539993) i na tej podstawie można przygotować startery do powielania DNa. Przykładami takich starterów są 23 nukleotydowe oligomery DNA o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 12 i 13 w Zestawieniu Sekwencj i. Syntezę DNA. PCR i otrzymanie plazmidu zawierającego dapA można dokonać tak samo. jak opisano to powyżej. dla genu lysC.

Sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA obejmującego dapA i wyprowadzona zeń sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest Sek Id Nr 14. Sama sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest Sek Id Nr 15. Oprócz fragmentów DNA kodujących sekwencję aminokwasowa. można wykorzystać sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe zasadniczo takie same. jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 15. to jest sekwencje aminokwasowe posiadające mutacje typu substytucji. delecji lub inercji jednego lub więcej aminokwasów przy założeniu. że nie mają one zasadniczego wpływu na aktywność DDPS. Gen dapA posiadający mutacje spontaniczne lub_sztuczne można uzyskać w ten sam sposób. jak DNA posiadający mutacje nie wywierające wpływu na aktywność DDPS. Gen dapA z mutacjami spontanicznymi lub sztucznie wprowadzonymi można otrzymać w ten sam sposób. co DNA kodujący aK posiadający mutacje nie wpływające na zmniejszenie czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-Hzyną i L-treoniną

190 430

Str^jfoirnowany szczep AJ13107 otrzymany poprzez wprowadzenie plazmidu pCRDAPB obejmującego gen dapA do szczepu E.coli JM109 przedstawiony w przykładzie poniżej został przekazany do depozytu 26.05.1995, i uzyskał numer depozytowy FERM BP-5113 w National Institute of Bioscience and Human Technology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia) w oparciu o Układ Budapesztański.

(4) Przygotowanie lysA

Fragment DNA obejmujący gen lysA można przygotować z chromosomu bakterii maczugowatej te^lunik^ą PGR. Dawca DNA nie jest w szczególny sposób ograniczony, choć jako przykład wybrano szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

U bakterii maczugowatych gen lysA tworzy operon wraz z genem argS (gen kodujący arginylo-RNA) i lysA położony jest w kierunku 3' od genu argS. Ekspresja lysA regulowana jest przez promotor położony przed genem argS (J Bacteriol Nov, 7356-7362, 1993). Sekwencja DNA tych genów jest znana dla Corynebacterium glutamicum (Mol Microbiol 4(11), 1819-1830, 1990; Mol GenGenet212, 112-119, 1988), i na tej podstawie można przygotować startery do powielania DNA. Przykładami takich starterów są 23 nukleotydowe oligomery DNA o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 16 w Zestawieniu Sekwencji (odpowuadają nukleotydom od 11 do 33 w sekwencji nukleotydowej opublikowanej w Mol Microbiol, 4(11), 1819-1830, 1990) i o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 17 w Zestawieniu Sekwencji (odpowiadają nukleotydom od pozycji 1370 do 1392 w sekwencji nukleotydowej podanej w Mol Gen Genet 212, 112-19, 1988). Syntezę DNA, PGR i otrzymanie plazmidu zawierającego lysA można dokonać tak samo, jak opisano to powyżej, dla genu lysC.

W przykładzie podanym później, fragment DNA obejmujący promotor, gen argS i gen lysA został użyty w celu wzmocnienia genu lysA. Gen argS nie jest zasadniczo niezbędny. Dopuszczalne jest wykorzystanie fragmentu DNA w którym gen lysA zligowany jest tuż za promotorem.

Sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA obejmującego argS i lysA, i sekwencja aminokwasowa wyprowadzona z sekwencji wymienionej nukleotydowej zostały przedstawione Sek Id Nr 18. Przykład sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen argS przedstawia Sek Id Nr 19; i przykład sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen lysA przedstawia Sek Id Nr 20. Oprócz fragmentów DNA kodujących wymienione sekwencje aminokwasowe, można wykorzystać sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe zasadniczo takie same, jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 20, to jest sekwencje aminokwasowe posiadające mutacje typu substytucji, delecji lub insercji jednego lub więcej aminokwasów przy założeniu, że nie mają one zasadniczego wpływu na aktywność DDC. Gen lysA posiadający mutacje spontaniczne lub sztuczne można uzyskać w ten sam sposób, jak DNA posiadający mutacje nie wywierające wpływu na aktywność AK i na zmniejszenie czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treoniną.

(5) Otrzymanie genu aspC

Fragment DNA obejmujący gen aspC można otrzymać z biblioteki genowej uzyskanej z chromosomalnego DNA mikroorganizmu takiego, jak korynebakteria i bakteria należąca do rodzaju Escherichia stosując jako wskaźnik zasadę komplementamości do cechy auksotrofii szczepu bez aktywności AAT. Dawca DNA należący do korynebakterii nie jest w szczególny sposób ograniczony, choć jako przykład wybrano szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Dawca DNA należący do rodzaju Escherichia nie jest w szczególny sposób ograniczony, choć jako przykład wybrano szczep E.coli JM109.

Konkretnie, sposób otrzymania aspC z bakterii maczugowatej jest znany (Japońskie zgłoszenie Patentowe Nr 6-102028) i gen aspC można uzyskać według tego sposobu.

Sekwencja genu kodującego AAT jest znana dla E.coli (Kuramitsu S i wsp J Biochem 97(4), 1259-1262, 1985), i na tej podstawie można zaprojektować startery do reakcji PCR. Przykładami takich starterów są 20 nukleotydowe oligomery DNA o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 21 i Sek Id Nr 22 w Zestawieniu Sekwencji. Syntezę DNA, PCR i otrzymanie plazmidu zawierającego gen ppc można dokonać tak samo, jak opisano to powyżej, dla genu lysC.

190 430

Sekwencja nukleotydową fragmentu DNA obejmującego gen aspC i sekwencja aminokwasowa wyprowadzona z wymienionej sekwencji nukleotydowej pzedstawiona jest Sek Id Nr 23. Sama sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest Sek Id Nr 24. Inna sekwencja nukleotydową fragmentu DNA obejmującego aspC i kodującego wyprowadzone z sekwencji nukleotydowej sekwencje aminokwasowe ilustruje Sek Id Nr 30. Samą sekwencję aminokwasowa wyprowadzoną z sekwencji nukleotydowej przedstawia Sek Id Nr 31. Oprócz fragmentów DNA kodujących wymienione sekwencje aminokwasowe, można wykorzystać sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe zasadniczo takie same, jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 24 lub 31, to jest sekwencje aminokwasowe posiadające mutacje typu substytucji, delecji lub insercji jednego lub więcej aminokwasów przy założeniu, że nie mają one zasadniczego wpływu na aktywność AAT. Gen aspC niosący mutacje spontaniczne lub sztuczne można uzyskać w ten sam sposób, jak DNA posiadający mutacje nie wywierające wpływu na aktywność AK i na zmniejszenie czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treoniną.

Gen aspC posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną Sek Id Nr 30 pochodzi ze szczepu Corynebacterium lactofermentum i został po raz pierwszy otrzymany sposobem przedstawionym w przykładzie 9 poniżej. Wynalazek dostarcza zatem DNA kodującego białko obejmujące sekwencję aminokwasowa przedstawioną Sek Id Nr 31. Przykładowa sekwencja DNA obejmuje DNA obejmujące sekwencję nukleotydową od pozycji 879 do pozycji 2174 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 30.

<2> Zrekombinowany DNA i bakteria maczugowata

Zrekombinowany DNA obejmujący sekwencję DNA kodującą aspartokinazę, w której czułość synergistycznego hamowania zwrotnego L-lizyną i L-treoniną została w znaczący sposób zmniejszona i wzmocnioną sekwencję DNA kodującą syntazę dihydrodipimelinianową, wzmocnioną sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimelinianową, wzmocnioną sekwencję DNA koduj ącą aminotransferazę asparaginianową.

Termin wzmocniony, wzmożony (enhanced) dotyczy zjawiska zwiększenia wewnątrzkomórkowej aktywności enzymu kodowanego przez DNA, sposobem zwiększenia liczby kopii genu, użycia mocniejszego promotora, użycia genu kodującego enzym o wyższej aktywności specyficznej czy połączeniem wymienionych sposobów.

Baktera maczugowata niosąca zmutowaną AK może być bakterią wytwarzającą zmutowaną aspartokinazę w wyniku mutacji, lub bakterią transformowaną poprzez wprowadzenie zmutowanego genu lysC.

Przykłady korynebakterii wykorzystywanych do wprowadzenia DNA przedstawionego powyżej obejmują, na przykład, następujące szczepy typu dzikiego wytwarzające lizynę:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;

Corynebacterium callunaeATCC 15991;

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;

(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;

(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;

(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;

(Brevibacterium flavum)ATCC 14067;

Corynebacterium melassecola ATCC 17965;

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;

Brevibacterium immariophilium ATCC 14068;

Brevibacterium roseum ATCC 13825;

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;

Corynebacterium thermoamino.genes AJ 12340 (FERM BP-1539).

Inni użyteczni gospodarze bakteryjni obejmują szczepy na przykład zmutowane posiadające zdolność wytwarzania L-lizyny, pochodzące z wymienionych wyżej szczepów. Takim sztucznym, zmutowanym szczepem jest: szczep oporny na S-(2-aminoetylo)cysteinę (skracany dalej jako AEC) (na przykład Brevibacterium lactofermentum

190 430

AJ11082 (NRRL B-l 1-47) (Japońska Publikacja Patentowa Nr 56-1914 56-1915 57-14157 57-1^158 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 i 7-112438); zmutowane szczepy wymagające do wzrostu aminokwasu, takiego jak L-homoseryna (Japońska Publikacja Patentowa Nr 48-28078 i 56-6499); zmutowane szczepy wykazujące oporność na AEC i wymagające aminokwasów takich jak L-leucyna, L-homoseryna, L-prolina, L-seryna, L-arginina. L-alanina, L-walina (Patent US 3,708,395 i 3,825,472)1; zmutowane szczepy wytwarzające L-lizynę wykazujące oporność na DL-alfaamino-etakaprolaktam, ulfa-aminz-laurylzlaktam, analog asparaginianu, sulfonamidy, chinoid i N-lauroyloleucynę; zmutowane szczepy wytwarzające L-lizynę wykazujące oporność na inhibitory dekarboksylazy oksylooctanową lub enzymów układu oddechowego (Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 i 56-39778 i Japońska Publikacja Patentowa Nr 53-43591 i 53-1833); zmutowane szczepy wytwarzające L-lizynę wymagające inozytolu lub kwasu octowego (Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 55-9874 i 56-8692); zmutowane szczepy wytwarzające L-lizynę wykazujące wrażliwość na kwas fluooopiozgronowy lub temperaturę nie mniejszą niż 34°C (Japońskie zgłoszenie Patentowe Nr 55-9783 i 53-86090); wytwarzające zmutowane szczepy należące do rodzaju Brevibacterium lub Corynebacterium wykazujące oporność na glikol etylenowy i wytwarzające L-lizynę (Patent US 4,411,997).

W konkretnym zastosowaniu według wynalazku, w celu wzmocnienia genów biosyntezy L-lizyny w komórce gospodarza jak podano to wyżej, geny wprowadzane są do gospodarza z wykorzystaniem wektora plazmidowego, transpozonu, wektora fagowego lub podobnego. Po wprowadzeniu, możliwe jest wzmocnienie do pewnego stopnia, nawet przy wykorzystaniu niskokopiowego wektora. Korzystne jest jednak wykorzystanie wysokokopiowego wektora. Wektor taki obejmuje na przykład wektory plazmidowe: pAJ655, pAJl 844, pAJól 1, pAJ3148 i pAJ440 przedstawione powyżej.

Ponadto, można zastosować transpozony pochodzące z bakterii maczugowatej, jak przedstawiono to publikacji W002/02627 i WO93/18151, Europejskim Zgłoszeniu Pat^eno-wym Nr 44538, Japońskim Zgłoszniu Patentowym Nr 6-46867, Vertes AA i wsp Mol Microbiol 11, 739-746 (1994), Bonamy C i wsp Mol MiaroWol 14, 571-581 (1994), Vertes AA i wsp Mol Gen Genet 245, 397-405 (1994), Jagar W i wsp FEMS Microb Lett 126, 1-6 (1995), Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 7-107*976, 7-327680 i podobne.

Nie jest bezwzględnie konieczne by zmutowany gen lysC był wzmacniany. Możliwe jest wykorzystanie zmutowanego genu lysC położonego w chromosomalnym DNA, lub zmutowanego genu lysC zintegrowanego z chromosomalnym DNA. Alternatywnie, zmutowany gen lysC można wprowadzić z wykorzystaniem wektora plazmidowego. Z drugiej strony geny dapA, dapB, lysA i aspC są korzystnie wzmacniane dla uzyskania efektywnego wytwarzania L-lizyny.

Każdy z genów lysC, dapA, dapB, lysA i aspC można sukcesywnie wprowadzić do komórki gospodarza w wykorzystaniem różnych wektorów. Alternatywnie, dwa, trzy, cztery lub pięć rodzajów genów można wprowadzić na tym samym wektorze. Gdy wykorzystywane są różne wektory geny można wprowadzić w dowolnym porządku, jednak korzystnie stosować wektory mające stabilne medrcuri^^mu przekazywania w czasie podziałów do komórek potomnych i zdolne do wzajemnej koegzystencji w komórce gospodarza.

Konkretnie, jako wektor do wprowadzenia genu aspC do bakterii maczugowatej można korzystnie zastosować wektor pVK7. Wektor pVK7 jest wektorem do klonowania w bakteriach maczugow^ych według wynalazku, zdolnym do autonomicznej replikacji w komórkach Escherichia coli i Brevibacterium lactofermentum, i obejmującym miejsce rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych (MCS) oraz lacZ'. Wektor pVK7 można otrzymać sposobem przedstawionym w przykładzie 8 poniżej.

Korynebakteria niosąca zmutowaną _ AK i obejmująca ponadto wzmocniony gen dapB, dapA, lysA i aspC uzyskana została, na przykład, sposobem wprowadzenia do korynebakteryjnego gospodarza, zreformowanego DNa obejmującego zmutowany gen lysC, i geny dapB, dapA, lysA i aspC, replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej.

190 430

Wymienione /rekombinowane cząsteczki DNA można uzyskać na przykład poprzez wprowadzenie każdego z genów uczestniczących w biosyntezie L-lizyny do wektora, takiego jak wektor plazmidowy, transpozonu lub wektora fagowego, przedstawionych powyżej.

W przypadku gdy jako wektor stosowany jest plazmid, zrekombinowany DNA można wprowadzić do gospodarza metodą elektroporacji pulsowej (Sugimoto i wsp Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 2-207791). Amplifikację genu z wykorzystaniem transpozonu można dokonać przez wprowadzenie plazmidu niosącego transpozon do komórki gospodarza i indukcję przeniesienia transpozonu.

W bakterii maczugowatej według wynalazku można również wzmocnić inne geny, uczestniczące w biosyntezie L-lizyny, na przykład sekwencję DNA kodującą karboksylazę f<xsfoerwUopiirngrornanovvą i sekwencję DNA kodującą dehydrogenazę diaminopimelinianową, oprócz wzmocnienia wyżej wymienionych genów.

< 3> Sposób wytwarzania L-lizyny

L-lizynę można efektywnie wytwarzać poprzez hodowanie bakterii maczugowatej obejmującej wzmocnione geny biosyntezy L-lizyny jak podano to wyżej, w odpowiednim podłożu, w celu wytworzenia L-lizyny i gromadzenia w hodowli bakteryjnej oraz zbierania L-lizyny z hodowli.

Pożywka stosowana może być zwyczajną pożywką zawierającą źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne i w zależności od potrzeb inne składniki organiczne.

Źródłem węgla jest zwykle cukier: glukoza, fruktoza, sacharoza, melasa i hydrolizat skrobiowy;, kwas organiczny, taki jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy czy kwas bursztynowy.

Źródłem azotu mogą być nieorganiczne sole amonowe, takie jak siarczan amonowy, chlorek amonowy i fosforan amonowy; azot organiczny, taki jak hydrolizat sojowy; amoniak gazowy; i roztwór wodny amoniaku.

Źródłem śladowych substancji odżywczych, jeżeli jest pożądane dodanie substancji takich jak witamina Bi i L-homoseryna czy ekstrakt drożdżowy lub podobne w odpowiednich ilościach. Jeżeli jest to konieczne, inne substancje takie jak fosforan potasowy, siarczan magnezowy, jon żelaza, jon manganu i inne dodawane są w niewielkich ilościach.

Hodowla prowadzona jest korzystnie w warunkach tlenowych przez około od 30 do 90 godzin. Temperatura hodowli jest korzystnie utrzymywana na poziomie od 25 do 37°C, a pH · utrzymywane jest korzystnie w zakresie od 5 do 8 w czasie hodowli. Do ustalania pH można stosować substancje zarówno organiczne, jak nieorganiczne, kwasowe lub zasadowe, amoniak gazowy i podobne. L-lizynę można zbierać z hodowli sposobem chromatografii z żywicąjonowymienną, sposobem precypitacyjnym i innymi znanymi metodami.

Przykład 1: Otrzymanie genu lysC typu dzikiego i zmutowanego genu lysC z Brevibacterium lactolermentum <1> Otrzymanie genu lysC typu dzikiego i zmutowanego genu lysC oraz przygotowanie plazmidów zawierających wymienione geny

Szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 i zmutowany szczep wytwarzający L-lizynę AJ3445 (FERM P-1944) uzyskany ze szczepu ATCC 13869 przez mutagenizację, wykorzystano jako dawców DNA chromosomalnego. Szczep AJ3445 poddano mutagenizacji tak, że gen lysC został zmieniony w celu uzyskania znaczącego zmniejszenia czułości hamowania zwrotnego przez lizynę i treoninę (J Biochem 68, 701-710, 1970).

Fragment DNA obejmujący gen lysC powielono z chromosomalnego DNA techniką PGR (reakcji łańcuchowej polimerazy; patrz: White TJ i wsp Trends Genet 5, 185, 1989). Startery DNA stanowiły jednoniciowe 23- i 21-mery DNA o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 1 i 2 w Zestawieniu Sekwencji, służące do powielenia np. regionu liczącego około 1643 pz sekwencji kodującej genu lysC w oparciu o znaną sekwencję Corynebacterium glutamicum (Mol Microbiol (1991), 5(5), 1197-11204; Mol Gen Genet (1990), 224, 317-324). DNAzsyntezowano metodą standardową, stosując ^yntetyzer 380B firmy Applied Biosystems i metodę fosforoamidynową (Terahedron Lett (1981), 22, 1859).

Powielanie techniką PGR prowadzono stosując teIrnocskler PJ2000 firmy Takara Shuzo i polimerazę Taq, zgodnie z zaleceniami producenta. Powielony fragment genu lysC liczący około 1643 pz sprawdzono techniką elektroforezy agarozowej. Następnie fragment wycięto

190 430 z żelu, oczyszczono metodą standardową i strawiono enzymami r^s^l^c^^y^ymi Nrul (Takara Shuzo) i EcoRI (Takara Shuzo).

pHSG399 (Takeshita S i wsp Gene (1987) 61, 63-74) wykorzystano jako wektor do klonowania wymienionego fragmentu genu. pSHG399 enzymami rest^:ryl^i^;y^ymi Smal (Takara Shuzo) i EcoRI i zligowano następnie z zamplifikowanym fragmentem genu lysC. DNA ligowano wykorzystując zestaw do ligowania DNA (Takara Shuzo) postępując zgodnie ze wskazaniami producenta. Następnie otrzymano plazmidy, w których fragment lysC zamplifikowany z Chromosomu Brevibacter^^m lactofermentum został zligowany z pHSG399. Plazmid obejmujący gen lysC ze szczepu ATCC 13896 (szczepu dzikiego) określono mianem p3999AKY, plazmid obejmujący gen lysC ze szczepu AJ3463 (bakteria wytwarzająca L-lizynę) oznaczono jako p399AK9.

Fragment DNA (dalej określany jako Brevi.-zri) nadający plazmidowi zdolność autonomicznej replikacji w bakteriach należących do rodzaju Corynebacterium wprowadzono do plazmidów p399AKY i p399AK9, w celu przygotowania plazmidów niosących lysC i zdolnych do autonomicznej replikacji w bakteriach należących- do rodzaju Corynebacterium. Brevi.-ori otrzymano z wektora plazmidowego pHK4 obejmującego Brevi.-ori, autonomicznie replikującego się w komórkach Escherichia coli i bakteriach należących do rodzaju Corynebacterium. pHK4 skonstruowano trawiąc plazmid pHC4 enzymem KpnI (Takara Shuzo) i BamHI (Takara Shuzo), ekstrahując fragment Brevi.-ori i ligując wymieniony fragment z pHSG298 strawionym również KpnI i BamHI (publikacja JP 5-7-491).

pHK4 nadaje gospodarzowi oporności na kanamycynę. Escherichia coli niosąca pHK4 została określona jako Escherichia coli AJ13136, i przekazana do depozytu 1.08.1995, i uzyskał numer depozytowy FERM BP-5186 w National Institute of Bioscience and Human Technology należącym do Agency of Industrial Science and Teclhnology w ramach Ministry of Internationa Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia).

pHK4 strawiono enzymami rest^ir^l^c^jyj^i^mi KpnI i BamHI. a utworzone lepkie końce przeprowadzono w końce tępe. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforykiwany linker BamHI (Takara Sh-uzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 przez trawienie BamHI. Plazmid strawiono BamHI i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z plazmidem p399AKY i p399AK9 również strawionymi BamHI, w celu przygotowania plazmidów zawierających gen lysC zdolny do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należącej do rodzaju ίΛΗ'ΥΙκΤίΙ^Βΐΐηΐ.

Plazmid zawierający gen lysC typu dzikiego pochodzący z p399AKY określono mianem p399AKYB, a plazmid zawierający zmutowany gen lysC pochodzący z plazmidu p399AK9 oznaczono jako p399AK9B. Proces konstruowania plazmidów p399AKYB i p399AK9B przedstawiono na fig 1. Szczep AJ12691 uzyskany przez wprowadzenie plazmidu p399AK9B zawierającego zmutowany gen lysC do dzikiego szczepu Brevibacterium lactofermentum (szczep AJ12036, FERM BP-734) przekazana do depozytu 10.04.1992, i uzyskał numer depozytowy FERM P-112918 w National Institute of Bioscience and Human Tecłrnology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia) i przekazany został do depozytu międzynarodowego zgodnie z układem budapesztańskim 10.02.1995 i uzyskał numer depozytowy FERM BP-4999.

<2> Określenie sekwencji nukleotydowych genu lysC typu dzikiego i zmutowanego genu lysC z Brevibacterium lactofermentum

Plazmid p399AKY zawierający gen lysC typu dzikiego i plazmid p399AK9 zawierający zmutowany gen lysC otrzymano z odpowiednich transformantów w celu oznaczenia sekwencji nukleotydowej genów lysC: typu dzikiego i zmutowanego. Oznaczenie sekwencji prowadzono zgodnie z metodą Sangera i wsp (np. F Sanger i wsp Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463, 1977).

Sekwencję genu lysC typu dzikiego z plazmidu p399AKY obrazuje Sek Id Nr 3 w Zestawieniu Sekwencji. Sekwencję nukleotydowa zmutowanego genu lysC z plazmidu p399AK9 z pojedynczą mutacją w nukleotydzie 1051, zmieniającą G w A, w porównaniu

190 430 z genem lysC typu dzikiego, obrazuje Sek Id Nr 3.Wiadomo, że gen lysC z Corynebacterium glutamicum posiada dwie podjednostki (alfa i beta) kodowane przez identyczne ramki odczytu, z identycznego łańcucha DNA (Kalinowski J i wsp Mol Microbiol (1991) 5(5), 1197-1204). Sądząc z homologii, zakłada się że zsekwencjonowany gen posiada również dwie podjednostki (alfa i beta), kodowane przez identyczne ramki odczytu, z identycznego łańcucha DNA.

Sekwencja aminokwasowa podjednostki alfa AK typu dzikiego wyprowadzona z sekwencji nukleotydowej DNA przedstawia Sek Id Nr 4, wraz z sekwencją Dna. Sek Id Nr 5 przedstawia jedynie sekwencję aminokwasową. Sekwencję aminokwasową podjednostki beta białka AK typu dzikiego wyprowadzisną z sekwencji DNA przedstawia Sek Id Nr 6 w Zestawieniu Sekwencji wraz z sckwencią DNa. Sek Id Nr 7 obrazuje jedynie sekwencję aminokwasową. W każdej z podjednostek GTG stanowi kodon inicjacyjny i odpowiadającym mu aminokwasem jest metionina. Kodon ten odnosić się może jednak do metioniny, waliny lub formylometioniny.

Z drugiej strony, mutacja w sekwencji zmutowanego genu lysC oznacza wystąpienie substytucji reszty aminokwasowej, takiej że reszta alaniny 279 podjednostki alfa zmieniona jest w resztę treoniny, i że reszta alaniny 30 podjednostki beta zmieniona jest w resztę treoniny, w porównaniu z sekwencią białka AK typu.dzikiego (Sek Id Nr 5, 7).

Przykład 2: Otrzymanie genu dapA z Brevibacterium lactofermentum <1> Otrzymanie genu dapB i konstrukcja plazmidu zawierającego dapB

Szczep Brevibacterium lactofermentum typu dzikiego ATCC 13869 wykorzystano jako dawcę DNA. Chromosomalny DNA otrzymano standardowymi metodami. Fragment DNA obejmujący gen dapB zamplifikowano z chromosomalnego DNA techniką PCR. Do powielania użyto startery DNA, w postaci syntetycznych DNA o długości 23 nukleotydów, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 8 i 9 w Zestawieniu Sekwencji i zostały użyte do zamplifikowania regionu wielkości ok. 2.0 kpz kodującego DDPR w oparciu o sekwencję Brevibacterium lactofennentum (J Bacteriol 175(9), 2743-2749, 1993).

Syntezę DNA i reakcję PCR prowadzono tak, jak przedstawiono to w przykładzie 1. Jako wektor do klonowania zamplifikowanego fragmentu genu o wielkości 2001 pz wykorzystano plazmid pCR-Script (Invitrogen) i zligowano z powielonym fragmentem genu dapB. W ten sposób skonstruowano plazmid, w którym fragment dapB liczący 2001 pz zamplifikowany z dir^moatmu Brevibacterium lactofermentum został zligowany z plazmidem pCR-Script. Plazmid otrzymany jak podano powyżej, posiadający dapB pochodzący ze szczepu ATCC 13869 oznaczono symbolem pCRDAPB.

Szczep stransfonmowany AJ12106, otrzymany przez wprowadzenie pCRDAPB do E.coli JM109 został przekazany do depozytu międzynarodowego 26.05.1995, i uzyskał numer depozytowy FERM BP-5114 w National Institute of Bioscience and Human Tedrnology należącym-do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia), zgodnie z układem budapesztańskim.

Fragment o wielkości 1101 pz obejmujący gen strukturalny kodujący DDPR został następnie wyodrębniony przez trawienie plazmidy pCRDAPB enzymami ECoRV i SphI. Fragment ten zligowano z pHSG399 strawionym uprzednio enzymami HincII i SphI i otrzymano plazmid. Otrzymany plazmid oznaczono symbolem p399DPR.

Do p399DPR wprowadzono następnie Brevi.-ori w celu otrzymania plazmidu niosącego gen dapB i zdolnego do autonomicznej replikacji w korynebakterii. pHK4 strawiono enzymami rei^tty^l^c^^jj^^mi KpnI (Takara Shuzo) i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker BamHI (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 jedynie przez trawienie BamHI. Otrzymany plazmid strawiono BamHI Smal i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z p399DPR strawionym uprzednio BamHI, otrzymując plazmid zawierający dapB, zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pDPRB. Sposób konstruowania plazmidu pDPRB przedstawiono na fig 2.

190 430 <2> Określenie sekwencji nukleotydowych genu dapB z Brevibacterium lactofermentum

Plazmidowe DNA otrzymano ze szczepu AJ 13107 niosącego plazmid p399DPR i określono jego sekwencję nukleotydową tak. jak podano w przykładzie 1. Określoną sekwencję nukleotydową i sekwencję aminokwasową wyprowadzoną z otrzymanej sekwencji nukleotydowej przedstawia Sek Id Nr 10. Sekwencja aminokwasowi przedstawiona jest Sek Id Nr 11.

Przykład 3: Otrzymanie genu dapA z Brevibacterium lactofermentum <1> Otrzymanie genu dapA i konstrukcja plazmidu zawierającego dapA

Szczep Brevibacterium lactofermentum typu dzikiego ATCC 13869 wykorzystano jako dawcę DNA. Chromosomalny DNA otrzymano ze szczepu ATCC 13896 standardowymi metodami. Fragment DNA obejmujący gen dapA Zamplifikowano z chromosomalnego DNA techniką PCR. Do powielania użyto startery DNA. w postaci syntetycznych DNA o długości 23 nukleotydów. o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 12 i 13 w Zestawieniu Sekwencji i zostały użyte do zamplifikowania regionu wielkości ok. 1.5 kpz kodującego DDPS w oparciu o sekwencję Corynebacterium glutamicum (Nucleic Acids Res 18(21). 6421. 1990; EMBL nr depozytu Χ53993). Syntezę DNA i reakcję PCR prowadzono tak. jak przedstawiono to w przykładzie 1.

Jako wektor do klonowania wykorzystano plazmid pCR1000 (Invitrogen; Bio/Techniques 9. 657-663. 1991) zamplifikowanego fragmentu genu o wielkości 1411 pz i zligowano z powielonym fragmentem genu dapA. Ligacji dokonano stosując zestaw do ligacji (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. W ten sposób skonstruowano plazmid w którym fragment dapA o wielkości 1411 pz zamplifikowany z chromosomu Brevibacterium lactofenmentum został zligowany z pCR1000. Plazmid otrzymany jak podano powyżej. posiadający dapA pochodzący z ATCC 13869 oznaczono symbolem pCRDAPA.

Szczep stransformowany AJ12106. otrzymany przez wprowadzenie pCRDAPA do E.coli JM109 został przekazany do depozytu międzynarodowego 26.05.1995. i uzyskał numer depozytowy FERM BP-5113 w National Institute of Bioscience and Human Tedrnology należącym do Agency of Industrial Science and Tedhnology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3. Higashi 1-chome. Tsukuba-shi. Ibaraki-ken. 305 Japonia). zgodnie z układem budapesztańskim.

Do pCRDAPA wprowadzono następnie Brevi.-ori w celu otrzymania plazmidu niosącego gen dapA. zdolnego do autonomicznej replikacji w korynebakterii. pHK4 strawiono enzymami restiykcyynymi KpnI i BamHI (Takara Shuzo) i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych. do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker SmaI (Takara Shuzo). tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 jedynie przez trawienie Smal. Otrzymany plazmid strawiono SmaI i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z pCRDAPA strawionym uprzednio SmaI. otrzymując plazmid zawierający gen dapA. zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pDPSB. Sposób konstruowania plazmidu pDPSB (Km^r) przedstawiono na fig 3.

<2> Określenie sekwencji nukleotydowych genu dapA z Brevibacterium lactofermentum

Plazmidowe DNA ze szczepu AJ13106 niosącego plazmid pCRDAPA otrzymano i oznaczono jego sekwencję nukleotydową. jak podano w przykładzie 1. Określoną sekwencję nukleotydową i sekwencję aminokwasową wyprowadzoną z otrzymanej sekwencji nukleotydowej przedstawia Sek Id Nr 14. Sekwencję aminokwasową przedstawia Sek Id Nr 15.

Przykład 4: Otrzymanie genu lysA z Brevibacterium lactofermentmn.

<1> Otrzymanie genu lysA i konstruowanie plazmidu zawierającego gen lysA

Szczep Brevibacterium lactofermentum typu dzikiego ATCC 13869 wykorzystano jako dawcę DNA. Chromosomalny DNA otrzymano ze szczepu ATCC 13896 standardowymi metodami. Fragment DNA obejmujący argS. lysA i promotor operonu zawierającego oba geny Zamplifikowano z chromosomalnego DNA tecłmiką PCR. Do powielania użyto startery DNA. w postaci syntetycznych DNA o długości 23 nukleotydów. o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 16 i 17 w Zestawieniu Sekwencji i zostały użyte do zamplifikowania re16

190 430 gionu wielkości ok. 3.6 kpz kodującego syntazę arginylo-tRNA i DDC w oparciu o znaną sekwencję Corynebacterium glutamicum (Mol Microbiol 4(11), 1819-1830 (1990)· Mol Gen Genet 212, 112-119 (1988).

Syntezę DNA i PCR prowadzono jak przedstawiono to w przykładzie 1. Jako wektora użyto plazmidu pHSG399 do klonowania fragmentu PCR o wielkości 3.579 pz. pHSG399 strawiono enzymem restrykcyjnym Smal (Takara Shuzo) i zligowano z fragmentem DNA obejmującym gen lysA. Plazmid zawierający gen lysA, pochodzący z ATCC 13869, otrzymano jak podano powyżej i oznaczono jako p399LYSA.

Fragment DNA obejmujący gen lysA ekstrahowano przez trawienie plazmidu p399LYSA enzymem KpnI (Takara Shuzo) i BamHI (Takara Shuzo). Wymieniony fragment DNA ligowano z plazmidem pHSG299 strawionym KpnI i BamHI. Uzyskany plazmid oznaczono jako p299LYSA. Proces konstrukcji plazmidu p299LYSA przedstawiono na fig. 4.

Brevi.-ori wprowadzono do p299LYSA w celu otrzymania plazmidu niosącego gen lysA zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. pHK4 strawiono enzymami restrykcyjnymi KpnI i BamHI, a utworzone lepkie końce przeprowadzono w końce tępe. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker KpnI (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 przez trawienie wyłącznie KpnI. Plazmid strawiono Kpnli otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z plazmidem p299LYSA również strawionym KpnI w celu przygotowania plazmidu zawierającego gen lysA zdolny do autonomicznej replikacji w komórkach korynebakterii. Otrzymany plazmid oznaczono jako pLYSAB. Proces konstrukcji plazmidu pLYSAB przedstawia fg 5.

<2> Określenie sekwencji nukleotydowych genu lysA z Brevibacterium lactofermentum

Plazmidowe DNA p299LYSA otrzymano i oznaczono jego sekwencję nukleotydową, jak podano w przykładzie 1. Określoną sekwencję nukleotydową i sekwencję aminokwasową wyprowadzoną z otrzymanej sekwencji nukleotydowej przedstawia Sek Id Nr 18. Wyprowadzoną sekwencję aminokwasową kodowaną przez gen argS i sekwencję aminokwasową kodowaną przez lysA przedstawia odpowiednio Sek Id Nr 19 i 20.

Przykład 5: Otrzymanie genu aspC z Escherichia coli i konstrukcja plazmidu zawierającego' aspC

Szczep Escherichia coli JM109 użyto jako dawcę DNA. Chromosomalny DNA otrzymano ze szczepu E.coli JM109 standardowymi metodami. Fragment DNA obejmujący gen aspC zamplifikowano z chromosomalnego DNA techniką PCR. Do powielania użyto startery DNA, w postaci syntetycznych DNA o długości 20 nukleotydów, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 21 i 22 w Zestawieniu Sekwencji i w oparciu o znaną sekwencję E.coli (Kuramitsu S i wsp J Biochem 97(4), 1259-1262, 1985). Syntezę DNA i PCR prowadzono jak przedstawiono to w przykładzie 1. Zamplifikowany fragment wielkości 1331 pz wprowadzono do wektora do klonowania typu TA pCRIOOO. Utworzony plazmid oznaczono jako pCRASPC.

Sekwencję nukleotydową zamplifikowanego fragmentu obejmującego gen aspC i wyprowadzoną sekwencję aminokwasową przedstawia Sek Id Nr 23. Sekwencję aminokwasową przedstawia Sek Id Nr 24.

Przykład porównawczy 1: Konstrukcja plazmidu obejmującego kompozycję zmutowanego genu lysC i dapA

Plazmid obejmujący zmutowany gen lysC, dapA i miejsce początku replikacji z bakterii maczugowatej utworzono z plazmidu pCRDAPA obejmującego gen dapA i plazmidu p399AK9B obejmującego zmutowany gen lysC i Brevi.-ori. p399AK9B strawiono całkowicie enzymem Sali i doprowadzono do formy z tępymi końcami. Następnie zligowano linker EcoRI w celu uzyskania plazmidu w którym miejsce Sali zmodyfikowano tak, by było rozpoznawane przez EcoRI. Uzyskany plazmid oznaczono jako p399AK9BSE. Zmutowany gen lysC i Brevi.-ori wycięto w postaci jednego fregmentu przez częściowe trawienie plazmidu p399AK9BSE enzymem EcoRI. Fragment otrzymany zligowano z pCRDAPA strawionym uprzednio EcoRI. Otrzymany plazmid nazwano pCRCAB. Plazmid ten ulega autonomicznej replikacji w komórce E.coli i w komórce bakterii maczugowatej i nadaje gospodarzowi opor190 430 ność na kanamycynę. Plazmid obejmuje kompozycję zmutowanego genu lysC i dapA. Sposób konstrukcji plazmidu pCRCAB przedstawiono na fig 6.

Przykład porównawczy 2: Konstrukcja plazmidu obejmującego kompozycję zmutowanego genu lysC i dapB

Plazmid obejmujący zmutowany gen lysC i dapB przygotowano w oparciu o plazmid p399AK9 zawierający zmutowany gen lysC i w oparciu o plazmid p399DPR posiadający gen dapB. Fragment o wielkości 1101 pz obejmujący gen strukturalny kodujący DDPR wycięto z plazmidu p399DPR enzymami EcoRV i SphI. Fragment ten zligowano z plazmidem p399AK9 strawionym uprzednio Sali i następnie przeprowadzonym do postaci z tępymi końcami i strawnonym następnie enzymem SphI, w celu otrzymania plazmidu obejmującego kompozycję zmutowanego genu lysC i dapB. Plazmid ten nazwano p399AKDDPR.

Do p399AKDDPR wprowadzono następnie Brevi.-ori. pHK4 obejmujący Brevi.-ori strawiono enzymem restrykcyjnym KpnI (Takara Shuzo) i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker BamHI (Takara Shuzo), tak by fragment DNA odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 jedynie przez trawienie BamHI. Otrzymany plazmid strawaono BamHI i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z p399AKDDPR strawionym uprzednio BamHI otrzymując plazmid zawierający zmutowany gen lysC i dapB, zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pCB. Sposób konstruowania plazmidu pCB przedstawiono na fig 7.

Przykład porównawczy 3: Konstrukcja plazmidu obejmującego kompozycję genów dapA i dapB

Plazmid pCRDAPA obejmujący gen dapA strawiono enzymami KpnI i EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA obejmującego gen dapA i zligowano następnie z wektorem plazmidowym pHSG399 strawionym uprzednio KpnI i EcoRI. Uzyskany plazmid oznaczono jako p399DPS.

Podobnie, plazmid pCRDAPB obejmujący gen dapB strawiono enzymami SacII i EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA o wielkości 2.0 kpz obejmującego region kodujący DDPR, i zligowano następnie z plazmidem p399DPS strawnonym uprzednio SacII i EcoRI w celu uzyskania plazmid obejmującego kompozycję genów dapA i dapB. Uzyskany plazmid określono jako p399AB.

Do p399AB wprowadzono następnie Brevi.-ori. pHK4 strawiono enzymem restrykcyjnym BamHI (Takara Shuzo) i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker KpnI (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Breviori mógł być wycinany z pHK4 jedynie przez trawienie KpnI. Otrzymany plazmid strawiono KpnI i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z p399AB strawionym uprzednio KpnI, otrzymując plazmid zawierający gen dapA i dapB, zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pAB. Sposób konstruowania plazmidu pAB przedstawiono na fig 8.

Przykład 6: Konstrukcja plazmidu obejmującego kombinację zmutowanego genu lysC, i genów dapA i dapB p399DPS strawiono enzymami EcoRI i SphI, doprowadzono do postaci z tępymi końcami, i wyodrębniono fragment obejmujący gen dapA. Fragment ten zligowano z plazmidem p399AK9 strawiony uprzednio SalI i doprowadzonym do postaci z tępymi końcami, w celu uzyskania plazmidu obejmującego kompozycję genów: zmutowanego lysC i dapA.

Plazmid pCRDAPB obejmujący gen dapB strawiono enzymem EcoRI i doprowadzono do postaci z tępymi końcami i strawiono następnie enzymem SacI w celu uzyskania fragmentu DNA o wielkości 2.0 kpz obejmującego gen dapB. Plazmid p399CA obejmujący gen dapA i zmutowany gen lysC strawiono SpeI i doprowadzono do postaci z tępymi końcami i następnie strawiono SacI i zligowano z otrzymanym fragmentem dapB w celu uzyskania plazmidu obejmującego zmutowany gen lysC, gen dapA i dapB. Otrzymany plazmid oznaczono jako p399CAB.

190 430

Do p399CAB wprowadzono następnie Brevi.-ori. pHK4 strawiono enzymem restrykcyjnym BamHI (Takara Shuzo) i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker KpnI (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.ori mógł być wycinany z pHK4 jedynie przez trawienie KpnI. Otrzymany plazmid strawiono KpnI i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z p399CAB strawionym uprzednio KpnI, otrzymując plazmid zawierający zmutowany gen lysC, gen dapA i dapB, zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pCAB. Sposób konstruowania plazmidu pCAB przedstawiono na fig 9.

Przykład 7: Konstrukcja plazmidu obejmującego kombinację zmutowanego genu lysC i genów dapA, dapB i lysA

Plazmid p299LYSA obejmujący gen lysA strawiono enzymami KpnI i BamHI i doprowadzono do postaci z gępymi końcami, i następnie wyodrębniono fragment obejmujący gen lysA. Otrzymany fragment zligowano z plazmidem pCAB strawionym Hpal (Takara Shuzo) i doprowadzonym do postaci z tępymi końcami w celu otrzymania plazmidu obejmującego kombinację zmutowanego genu lysC i genów dapA, dapB i lysA, zdolnego do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pCABL. Sposób konstruowania plazmidu pCABL przedstawiono na fig 10. Zaznaczono, że fragment zawierający gen lysA wstawiony jest w miejsce Hpal w fragmencie DNA niosącym gen dapB w pCABL, jednakże miejsce Hpal położone jest w kierunku 5' od promotora dla genu dapB (pozycje nukleotydowe od 611 do 616 w Sek Id Nr 10) i że gen dapB nie jest rozprężony.

Przykład 8: Konstrukcja plazmidy obejmującego aspC

Jako wektor służący do wprowadzenia genu aspC do bakterii maczugowatej użyto wektora do klonowania w korynebakteriach, nowo skonstruowanego plazmidu pVK7. pVK7 przygotowano ligując plazmid pSHG299 (wektor służący do klonowania w E.coli, Km^r, Takesita S i wsp Gene 61, 63-74, 1978) z plazmidem kryptycznym Brevibacterium lactofermentum, jak przedstawiono to poniżej. pAM330 sporządzono ze szczepu Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. pHSG299 strawiono enzymem restrykcyjnym mającym jedno miejsce cięcia, AvaII (Takara Shuzo), powstałe lepkie końce uzupełniono do końców tępych stosując polimerazę DNA z faga T4, i zligowano z plazmidem pAM330 strawionym uprzednio enzymem HindIII (Takara Shuzo) i uzupełnionym do postaci z tępymi końcami z wykorzystaniem polimerazy DNA z faga T4.

W zależności od orientacji wstawki pAM330 w pHSG299 uzyskano dwa plazmidy, oznaczone jako pVK6 i pVK7, a pVK7 używano w dalszych doświadczeniach. pVK7 jest wektoram zdolnym do autonomicznej replikacji zarówno w komórkach E.coli, jak Brevibacterium lactofermentum i posiada MCS (miejsce rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych) pochodzące z plazmidu pHSG299 i lacZ¹. Sposób konstrukcji plazmidu pV7 przedstawia fig. 11.

Gen aspC został następnie zligowany z wektorem przenośnikowym pVK7. Plazmid pCRASPC został strawiony enzymem restrykcyjnym EcoRI (Takara Shuzo) i zligowany z wektorem pVK7 strawionym uprzednio EcoRI. Ligacji dokonano stosując zestaw do ligacji (DNA Ligation Kit, Takara Shuzo). Pomiędzy otrzymanymi plazmidami, w których fragment aspC został zligowany z pVK7, jeden plazmid posiadał wspomniany fragment wstawiony w tej samej orientacji, co orientacja transkrypcyjną promotora lac, obecnego w pVK7, i plazmid ten został oznaczony symbolem pOm. Sposób konstrukcji plazmidu pOm przedstawia figura 12.

Przykład 9: Otrzymanie genu aspC z Brevibacterium lactofermentum <1> Otrzymanie genu aspC pochodzącego z Brevibacterium lactofermentum

Szczep 102-7, auksotroficzny pod względem zapotrzebowania na kwas asparaginowy, należący do rodzaju Corynebacterium, pozbawiony aspC (pozbawiony aktywności AAT) (I Shiio, K Ujikawa J Biochem 84, 647, 1978) stransformowano poprzez wprowadzenie biblioteki genowej (Publikacja Międzynarodowa Nr WO/95/23224), uzyskanej z ligacji fragmentów chromosomalnego DNA różnej długości, pochodzącego z dzikiego szczepu

190 430

ATCC 13896 Brevibacterium lactofermentum, z wektorem działającym w komórkach bakterii należących do rodzaju Corynebacterium. Uzyskane transformanty zbierano i przemycano dwukrotnie wodą destylowaną. 10.000 transformantów wysiano na płytki agarowe z podłożem minimalnym. Podłoże 10 nie zawierało innego źródła azotu poza amoniakiem (I Shiio, K Ujikawa J Biochem 84, 647, 1978) w celu uzyskania transformantów z przywróconą auksotrofią kwasu asparaginowego i wykazujących dobry wzrost na szalkach. Plazmidowe DNA otrzymywano z wybranych szczepów z przywróconą auksotrofią kwasu asparaginowego, a otrzymany plazmid oznaczono jako pAC. Gdy szczep dziki ATCC 13896 Brevibacterium lactofermentum transformowano plazmidem pAC, aktywność aspC w transformantach wzrastała (tabela 1). Aktywność oznaczano znaną metodą (Sizer Iw Jenkins WT Methods Enzymol 5, 677-679, 192).

W oparciu o uzyskane dane potwierdzono zatem, że około 2.5 kpz fragment chromosomalnego DNA ze szczepu ATCC 13896 sklonowany w plazmidzie obeemuje gen aspC Brevibacterium lactofermentum.

Tabela 1

Szczep/plazmid	Aktywność aspC (wartości względne)
ATCC 13896	1.0
ATCC 13896/pCABL	8.9

<2> Analiza organizacji genu aspC z Brevibacterium lactofermentum

Sekwencję nuldeotydową fragmentu DDNA o wielkości 2.5 kpz oznaczono metodą dideoksy Sangera i wsp (Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463, 1977). Ustaloną sekwencję nukleotydową przedstawia Sek Id Nr 25. Sekwencję nukleotydową analizowano wykorzystując program GENETYX-MAC ver 7.3 (Software Kaihatsu KK). Poszukiwanie otwartych ramek odczytu (ORF) wykazało obecność dwu ORF, nakładających się na siebie w orientacji przeciwległej, jak pokazuje to fig 13. Otwarta ramka odczytu długości 432 lub 426 aminokwasów, kodowana w orientacji normalnej pomiędzy kodonem ATG rozpoczynającym się nukleotydem 579 do nukleotydu 881 lub od 897 do 899, lub pomiędzy kodonem inicjacyjnym TAG (nukleotydy od 2175 do 2177) do kodonu terminacyjnego, przedstawiono Sek Id Nr 25 i oznaczono jako ORF1. Otwarta ramka odczytu długości 393 aminokwasów kodowana w odwrotnej orientacji pomiędzy GTG komplementarnym do CAC (nukleotyd 2163-2165) tworzącym kodon inicjatorowy i kodonem TGA,, komplementarnym do TCA (mdrieotydy 984-986), tworzącym kodon te'rminacyjny, przedstawia Sek Id Nr 25, oznaczona symbolem ORF2.

Fragment DNA nie obejmujący całej długości ORF2 i kodujący pełną długość ORF1 powielono techniku PGR z plazmidu pAC w celu potwierdzenia która z dwu ORF koduje białko AAT. Do powielania użyto startery DNA, w postaci syntetycznych DNA o długości 23 nukleotydów, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 26 i 27 w Zestawieniu Sekwencji. Syntezę DNA i reakcję PGR prowadzono tak, jak przedstawiono to w przykładzie 1. Zamplifikowany fragment o wielkości 2062 pz (pozycje nukleotydowe 126 -2187) o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 25 wklonowano do wektora typu TApCR2.1 (Invitrogen). Otrzymany plazmid odnaczono symbolem pCRORF1.

W ten sam sposób fragment genu wielkości 1543 pz (pozycje nukleotydowe: 975-2517), przedstawiony Sek Id Nr 25, kodujący jedynie pełną ORF2 Zamplifikowano i sklonowano. Otrzymany plazmid oznaczono jako pCROPJty.

W celu wprowadzenia sklonowanych fragmentów DNA do komórek bakterii z rodzaju Corynebacterium, fragmenty DNA ligowano z wektorem przenośnikowym przedstawionym w przykładzie 8. pCRORFl strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI (Takara Shuzo) i zligowano z plazmidem pVK7, strawionym uprzednio enzymem EcoRI. Ligację prowadzono z wykorzystaniem zestawu DNA Ligation Kit (Takara Shuzo). Otrzymany plazmid oznaczono jako pORF1. Sposób otrzymania pORF1 przedstawia figura 14.

W ten sam sposób otrzymano z pCRORE2 i pVK7 plazmid pORE2.

190 430

Otrzymane pORF1 i pORF2 wprowadzono do komórek Brevibacterium lactofermentum szczepu dzikiego ATCC 13869 w sposób przedstawiony w przykładzie 9. Następnie oznaczono aktywności aspC w ATCC 13896 i szczepach stransfonmowanych ATCC13869/pOFRl i ATCC13869/pOFR2. Oznaczenie to prowadzono w taki sam sposób, jak podano to w przykładzie 1. Jak pokazuje tabela 2, wzrost aktywności aspC obserwowano jedynie dla ATCC13869/pOFR1, co wskazuje iż aspC kodowany jest przez ORF1.

ATCC13869/pOFRl, co wskazuje iż aspC kodowanyjest przez ORF1.

Sekwencja nukleotydowa aspC z Boevibacterium lactofermentum określona w opisanym wyżej doświadczeniu i sekwencja uminzkwaszwa wyprowadzona z sekwencji nukleotydowej przedstawione są Sek Id Nr 30. Sekwencja ^inokwasowa przedstawiona jest Sek Id Nr 31. Poszukiwanie sekwencji homologicznych w bazie danych sekwencji GENEBANK nie wykazało homologii ze znanymi sekwencjami aminokwasowymi, włączając w to białka AAT z innych organizmów.

Tabela 2

Szczep/plazmid	Aktywność ASP (wartości względne)
ATCC 13869	1.0
ATCC 13869/pORFl	10.1
ATCC 13869/pORF2	1.2

Przykład 10: Wprowadzenie plazmidów obeemujących geny biosyntezy L-liz.yny do szczepu Brevibacterium lactofermentum wytwarzającego L-liz.ynę

Plazmid pCABL (Cmr otrzymany jak podano to w przykładzie 7 wprowadzono do szczepu Breyibacteiriu^ lactofermentum AJ11082 (NRRL B-11470) wytwarzającego L-lizynę. Szczep AJ11082 charakteryzuje się cechą oporności na AEC. Plazmid wprowadzono sposobem elektroporacji pulsowej (Sugimoto i wsp Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr 2-207791). Transformanty wybierano wykorzystując obecność genu markerowego warunkującego oporność na antybiotyk w plazmidowym DNA. Tn^insformanty selekcjznowano na podłożu pełnym zawierającym 5 mikrog/ml chloramfenikolu, gdy transfznnanty selekcjonowano na podłożu pełnym zawierającym 25 mikrog/ml kanamycyny, gdy wprowadzano plazmid nadający oporność na kanamycynę.

Transformant AJ11082/pCABL otrzymany jak to podano wyżej transformowano następnie plazmidem pOm (Km^r) obeemującym gen aspC z Escherichia coli lub pORFl (Km) z Brevibacterium lactofermentum. Ponieważ plazmid pCALB korzysta z pHM1519 jako ori w komórkach Boevibacterium lactotfennentum i posiada gen oporności Cm, jako gen markerowy, a pOm wykorzystuje pAM330 jako ori w komórkach Breyibacterium lajtofeπnentum i posiada gen oporności Km, jako gen markerowy, oba plazmidy są stabilne w komórkach Breyibacterium lactofermentum.

Następnie otrzymano szczepy AJn082/pCALB/pOm i AJ11082/pCALB/pORFl niosące plazmid obee:mujący gen uczestniczący w biosyntezie L-lizyny i plazmid obeemujący aspC.

W ten sam sposób wprowadzono następujące plazmidy do szczepu AJ11082: p399AK9B (^), pDPRB (^), pLYSAB (Οι^), pOm, pCRCAB (Kmr), pAB (^), pCB (Cmr) i pCAB (Cm), w celu otrzymania transfonmantów. w któryrtć zmutowany gen lysC, dapA, dapB, lysA i aspC wzmocnione zostały pojedynczo, lub dwa lub trzy z tych genów zostały wzmocnione w kompozycji.

Przykład 11. Określanie aktywności aspC w transformantach

Aktywności aspC oznaczano w toansfzrmantajh AJ110827pCAB1, AJ11082/pCABL/pOm i AJ11082/pCABL/pORF1. Oznaczenia prowadzono tak, jak przedstawiono to w przykładzie 9 <3>. Jak przedstawia to tabela 3 zaobserwowano, iż promotor lac w plazmidzie pOm funkcjonuje w Boevibacterium lactofermentum i aktywność AJ11082/pCABL/pOm wzrasta około 3 razy. Dalszy wzrost aktywności do około 9 razy zaobserwowano dla AJ 11082/pCABL/pORF 1.

Ϊ90 430

Tabela 3

Szczep/plazmid	Aktywność aspC (wartości względne)
AJ 11082	1.0
AJ11082/pOm	3.2
AJ11082/pORFl	10.1
AJ11082/pCABL	0.9
AJ 11082 /pCABL/pOm	2.9
AJ 11082 /pCABL/pORF2	11.5

Przykład 12: Wytwarzanie L-lizyny

Każdy z otrzymanych w przykładzie 10 transformantów hodowany był w podłożu właściwym dla wytwarzania L-lizyny, w celu oceny produktywności L-lizyny. Pożywka odpowiednia dla wytwarzania L-lizyny posiada następujący skład:

[Pożywka odpowiednia dla wytwarzania L-lizyny]

Następujące składniki, poza węglanem wapniowym zostały rozpuszczone (w 1 litrze) i pH zostało ustalone na 8.0 (KOH). Pożywkę wysterylizowano przy 115°C przez 15 minut i dodano, wysterylizowany uprzednio gorącym powietrzem w stanie suchym, węglan wapniowy (50g).

Do pożywki dodano zatem:
glukozę	100 g
(NH4>SO4	55 g
KH2PÓ4	1 g
MgSO4 . 7H2O	1 g
biotynę	500 mikrog
tiaminę	2000 mikrog
FeSO4. 7H2O	0,01 g
MnSO4. 7H2O	0,01 g
amid kwasu nikotynowego	5 mg
hydrolizat białkowy (Mamenou)	30 ml
węglan wapniowy	50 g
Każdy z różnych typów transformantów i szczepów wyjściowych został zaszczepiony

w pożywce o składzie podanym powyżej i następnie hodowany przy 31.5°C z wytrząsaniem. Ilości uzyskanej po od 40 do 72 godzinach hodowli L-lizyny podano w tabeli 1. W tabeli zmutowany gen lysC oznaczono jako lysC*. Wzrost oceniany był ilościowo przez pomiar OD przy 562 nm po 101x rozcieńczeniu próbki.

Tabela 4

Akumulacja L-lizyny po okresie hodowli od 40 do 72 godzin

Szczep/plazmid	Gen wprowadzony	Ilość wytworzonej L-lizyny (g/L)	Wzrost (OD562/101)
po 40 h	po 72h
1	2	3	4	5
AJ 11082		22.0	29.8	0.450
AJ11082/p339AK9B	lysC*	16.8	24.5	0.398
AJ11082/pDPSB	dapA	18.7	33.8	0.410
AJ11082/pDPRB	dapB	19.9	29.9	0.445
AJ11082/pLYSAB	lysA	19.8	32.5	0 325
AJ11082/pOm	aspC(E) uwaga 1	21.8	30.9	0.475

190 430 cd. tabeli 4

I	2	3	4	5
AJ11082/pOm	aspC(B) uwaga 2	21.5	31.2	0.450
AJ 11082/pCRCAB	lysC*, dapA	19.7	36.5	0.360
AJ11082/pAB	dapA, dapB	19.0	34.8	0.390
AJ11082/pCB	lysC**, dapB	23.3	35.0	0.440
AJ11082/pCAB	lysC*, dapA, dapB	23.0	45.0	0.425
AJ11082/pCABL	lysC*, dapA, dapB, lysA	26.2	46.5	0.379
AJ11082/pCABL/pOm	lysC*, dapA, dapB, lysA, aspC(E)	26.7	47.6	0.415
AJ 11082/pCABL/pORF1	lysC*, dapA, dapB, lysA, aspC(B)	27.1	48.8	0.410

Uwaga 1: aspC z Escherichia roli

Uwaga 2: aspC z B^ibacterium lactofermentum

Jak podano powyżej, gdy zmutowany gen lysC, gen dapA, dapB, lysA lub aspC zostały wzmocnione w układzie pojedynczym ilość wytworzonej L--izyny była większa lub równa ilości wytworzonej przez szczep wyjściowy po 72 godzinach hodowli, jednak ilość wytworzonej L--izyny była mniejsza niż ilość wytworzonej L-lizyny przez szczep wyjściowy po 40 godzinach hodowli. Tzn. szybkość wytwarzania L-lizyny była mniejsza podczas hodowania przez czas krótszy. Podobnie, gdy zmutowany gen lysC i dapA lub dapA i dapB zostały wzmocnione w kompozycji, ilość wytworzonej Ldizyn była większa niż ilość L-lizyny wytworzona przez szczep wyjściowy po 72 godzinach hodowli, jednak ilość wytworzonej L-lizyny była mniejsza niż ilość wytworzonej L-lizyny przez szczep wyjściowy po 40 godzinach hodowli. Tzn. szybkość wytwarzania L--izyny była mniejsza.

Przeciwnie, w przypadku szczepów w których dapB został wzmocniony w kombinacji ze zmutowanym genem lysC, szczep w którym trzy geny: zmutowany lysC, dapA i dapB zostały wzmocnione, i szczep i w którym cztery geny: zmutowany lysC, dapA, dapB i lysA zostafy wzmocnione, ilość akumulowanej L-lizyny polepszyła się zarówno przy krótszym, jak i dłuższym okresie hodowli.

W przypadku szczepów w których pięć genów: zmutowany lysC, dapA, dapB, lysA i aspC z Escherichia coli zostało wzmocnione i szczep w którym pięć genów: zmutowany lysC, dapA, dapB, lysA i aspC z Brevibacterium lactofermentum zostało wzmocnione wytwarzanie L--izyny zostało polepszone w obu okresach czasu. Zakres polepszenia produktywności był większy w tym drugim przypadku, w porównaniu z pierwszym.

190 430

ZESTAWIENIE SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE.

(I) ZGŁASZAJĄCY: AJINOMCTO CO.. LTD (Li) NAZWA WYNALAZKU. SPOSÓB WYTWARZANIA L-LIZYNY (lli) ILOŚĆ SEKWENCJI 31 (IV) adres do korespondencji·

iA)	ADRES:
(3)	ULICA:
(C)	MIASTO
E)	KRAJ;
(Fł	KOD :

lv) FORMAT ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) TYP PODŁOŻA: Dyskiecka (Bi KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSYTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS

ID) SOFTWARE: Patentin Release M1.0, Version Ml.30 (VI) DANE ZGŁASZAJĄCEGO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(Vii, DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 8-325659 (Bi DATA ZGŁOSZENIA: 05.12.1996 '-'iii) INFORMACJI O PRAWNIKU:

(A) NAZWISKO:

(B) ..UMER REJESTRACYJNY:

(IX) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON:

•Zl ?AX.

(2) INFORMACJA DLA SEK ID NO:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (3) TY? CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C' ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (O) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TY? CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA liv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 1:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 2:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI: lA) DŁUGOŚĆ: 21 zasad (3) TY? CZĄSTECZKI: nucleic acid (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (□) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: mny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (IV) ANTYSENSOWNY. cak (XI) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 2 :

ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21 (2) INFORMACJA SEK ID NR 3 :

CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1643 zasad (3) TY? CZĄSTECZKI, kwas nukleinowy

190 430

TC(

TG'

GC

GT'

GG

AC<

GAi

CT'

GG

GGi

AA' tt,

GT'

AA'

TC

GT,

CC

GT

GC

GA

CT

CT

CG

AT

GG

TT,

CC

CC (2)

TC

TG

GC

GT

AA

Ly (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa , ii) TYP CZĄSTECZKI, genomowy DNA (VI) ZRÓDŁOÓDŁĆ:

(A) ORGANIZM: 9revibacterium lactoferrnencum (9) SZCZEP: ATCC 133S9 1XE> OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: i:

TCTG^CGAA^GTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAATCGAA.TATCAATATACGGTC TTGTTATTTG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGGACCCTGT GC^ACGAA^CSAAi AACACTCCTC TCCGTTGGTT GC.TGTGCCTT ACAAAGGTAG ΑΓΟΤΤΟΛΟΟΟΟ GGTAC:GTGTG GCAGCTAGAT GGATAGCTCG ACGTTCG^GGC CCCTCG^^ ACAGCTTTΓAT GCG:GGGTTGT CGCTTGAGAG TGGC·CTAGCG ATτACCACC::C TGGCTGAAGG CG.TCGTTGCC ACCGATCACG CTGGAAATGA TCTGGTGCTT GCTCTGGTGG GACCGCGACA CGTGACGGAτ cyC.CGTTCAT AACTTGCAGC GCGAGTGCAT CGGCGTTGG: GACCτCGTGA ^TCT<CCCTATG CGCCCCCT::GT CTGGTGAGCG TATTTCT.CAG GICTGTGCTG GGTTGCGTAT TCGAGTCCCTT GGC:CGACGAT CTCAATCTTT GACTCCGTGT TCCTCAGCAC 0000500X0

GCCTTC::GCG.T GCATTGTTGA GCTCACACGC Ο^ΤΏΤ^ CTCTCCCACT αΟΓΓΟΟΟσΟ ;TT:CATCTCGA TTGTTCCTGG TTTTCACGCT GCTTTTTCTCΪ ΑΑΑ^ΰ^ΟΑ TGTCACCACG TTCKGGTGGG GTGGTTCTGA CAGCACTCGA ΘΉ^ΟΤΤΟΞί CAGCTGCTTT CGACZGCCCC^:τΓ GGGCGGTACA GTTACTCGGA GGTTCT^CCCT GTGTATACCG ^GACCCG^ KTCGTTCCT ?TCT<CACAGA AGCTCGAAAA GGTCAGGTTG GCACGTA.TCC: TCCTCCτTGC TGCTGTTGGC TCOC.TAT^CΓ TGGTGCTGGC CACTGTTGCA TACGCTCGTG CTTCGTTTGT GC<CACZT!CGC GGACCC:GCGT CTTATAGTAA TCATCCCGCG ACTTGOiTTG GGCGCTGTAT GGGGATATT CCTGTGCCACG ATGGTGTGGT TAGGCGTGTG 'GGTT:CGT:GC ACTGGGTTCG CGCTTGTAACC GTTCTGGSTA TTTGGGATAA CGGACCC:CTC TCTTGGCTCG GTTGGCTGAT

GCGCOTTCTCGT ACATTGAGAT CGTTGTCCAC JAiCGTCTCCT GTGTCGAAGA ΟΟΟΟΓΟΟΌΟ GCTGTTACGGC TGACGTGGCC TGGCGCTCAC GOACGCCGTG GGTTCCTGTT CTTGAAGAAG CTTOAGTTC AGCCGATGTC CACGCATGTG CTTTACCGCG AGGTGGTCGC <GTTCGTCTCC CTCGTGCGGTG GTGGGATCAT GTCTCT.GGGA GGTGTTACCG GAGTCTTGTT GGAAGCTCTG ΟίΧ^ΤσΤζΑ ACGTGTACAT CCTATTCTT:T' TCCACCTCTG TCATGGGGAT TTCCGTGCTG ATCCGTOAXG ATGTTGTGCA TCCTG0TGGT ΟΟΤΚΑΤΤ^ ATCACGACTT CGAGCTGGGC <G:ccoτcAGCG cτc:GOCGτcGT ttatccaggc α^ο^ο^τ ττACττττAA agoggtagtt TTACTTTΓOGC GCGCCTT?CCGTC GTTGTTGGTG ΟΓΓΟ&^ΟΟΑ GGTGCGGGAG GTTATGCGCAC CC(ZT^^C^C:C3CCC AOCGCCCATCT Tr^AACCGO A<GAGΓGTTCG TTTGTTTCGT TCCCCGCGTT (C(C¢G:T^CCGC<CG T;TG:TTL^,TCTTC TTC (2) INFORMACJA DLA KEK ID NR : S:

li) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1643 zasad (S) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: DWUNICIOWA (D) TOPOLOGIA: LINIOWA (Li) TYP CZĄSTECZKI: GENOMOWY DNA (vi) ZRÓDŁO (A) ORGANIZM: 9revibaccerium laccolerrnencum (B) SZCZEP: ATCC 13969 (ix) CEHCHY:

(A) NAZWA: CDS (sekwencja kodująca) (SEKWENCJA KODUJĄCA) (3) POŁOŻENIE: 217..1482 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR. 4.

TCGCOAGGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC ]CACC1C'C'C1CCC ^ΟΆΤΑΤΟΑ CC;:CTCCG:;GGTC TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGCCTGAG A^AACCGO, TTTTCG;CCC:A GOOCCOTCT GGAGATAGAT TTGAGTGCTC TGGCTAGGTA GTGACTGTTT TCACTCCTAG TGTTCAGCCG GTAAGTGTGA CCAGCTTGAT GCAATCGTCG TGACAC GTG GCC CTG GTC GTA CAG

Met Ala Leu Val Val Gln 1 5

AAA TAC GGC GGA TCA TCG CTT GAA ATA GCA <TCA CGA ATT AGA AAC GTA

Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val

120

188

200

300

360

400

408

540

600

660

720

798

880

900

960

1200

1288

1220

1800

1200

1200

1200

1200

1500

1560

1620

1643

100

280

000

280

190 430

10

15

20

GCT

GAA

CGG

CTC

GTT

CGA

AAC

JAG

CAG

GCT

GGA

CAG

GAG

GGC

CGG

CGC

333

Ala

Glu

Arg 25

Ile

Val

Ala

Thr

Lys 30

Lys

Ala

Gly

Asn

Asp 33

Val

Val

Val

GTC

TGC

TCC

CGA

ATG

CGA

cag

ACC

ACG

CGAT

CGA

CAT

CTA

GGA

CTT

GCA

378

Val

Cys 40

Ser

Ala

Met

Gly

Asp 40

Chr

Thr

Asp

Glu

Leu 50

Leu

Glu

Leu

Ala

GCG

GCA

GTG

AAT

ccc:

GGC

CTG

CCA.

GGA

CGT

GJGA

AAG

GAT

AAG

CTG

CAG

422

Ala 55

Ala

Val

Asn

Pro

Val 60

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu 60

Met

Asp

Met

Leu

Leu 77

ACT

GCT

GGC

GAG

CGT

AAT

CCA

CAAC

GGT

CCC

GGC

GGA

ATG

GGC

AGT

CGA

477

Thr

Ala

Gly

Glu

Arg 7S

Ile

Ser

Asn

Ala

Leu 80

Val

Ala

Met

Ala

Ile 85

Glu

TCC

CTT

GGC

GAA

GJA

GCA

CAA

CCT

ACC

ACT

CGG

TCA

CAG

GGC

CGG

CGG

552

Ser

Leu

Gly

Ala 90

Glu

Ala

Gln

Ser

Phe 95

Chr

Gly

Ser

Gln

Ala 100

Gly

Val

CTC

ACC

ACC

CGG

CCG

CAC

CGGA

CAC

CGAC

CCG

AAC·

GGA

GAC

GTC

ACTA

CCG

570

Leu

Thr

Thr 105

Glu

Arg

His

Gly

Asn 110

Ala

Arg

Ile

Val

Asp 115

Val

Thr

Pro

GGT

CGT

GTG

AGT

GJA

CGA

CTC

GGG

GGA

GGC

.WAG

ATC

tcg

AGC

ATT

ΑTT

661

Gly

Arg 120

Val

Arg

Glu

Ala

Leu 112

Asp

Glu

Gly

Lys

Ile 113

Ays

Ile

Val

Ala

GGT

TTT

CAG

CGG

GGT

CGAC

CAAC

CGA

ACC

CGC

GGA

GGA

ACC

AC CG

TTG

GGT

666

Gly 135

Phe

Gln

Gly

Val

Asn 110

Lys

Glu

Thr

Arg

Asp 110

Val

Thr

Thr

Leu

Gly 115

CGT

GGT

GGG

TTC

CGA

ACC

AGT

CGA.

CTT

GCG

TTG

CGAA

CGT

GCC CC

TTG

CAC

714

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp 155

Thr

Chr

Ala

Val

Gla 160

Leu

Ala

Ala

Gla

Leu 110

Csn

GCT

GAT

GTG

GAG

CAG

ATT

CTC

TCG

CGAC

GTT

GAC

CGG

GTG

TAT

ACC

GCT

7 62

Ala

Asp

Val

Cys 170

Glu

Ile

Tyr

Ser

Asp 1-75

Val

Asp

Gly

Val

Cyr 110

Thr

Ala

GAC

CCG

CGC

ATC

GTG·

CCA

JAT

GGA

CAG

CAG

CTG

CGA

CAG

CCG

CGG

CCC

380

Asp

Pro

Arg 185

Ile

Val

Pro

Asn

Ala 190

Gln

Lys

Leu

Glu

Lys 115

Leu

Ser

Phe

GAA

GAA

AT <3

CCG

CGA

CTT

CGA

GGA

GTT

GGC

TCC

CAG

ATT

TTG

GTG

CTG

1558

Glu

Glu 200

Met

Leu

Glu

Leu

Ala 220

Ala

Val

Gly

Ser

Lys 221

Ile

Leu

Val

Leu

CGC

AGT

GTT

GGA

CAG

CGT

CTT

CGA

TTC

AAT

GTG

CCA

CTT

CGC

GTA

CGC

90 6

Arg 215

Ser

Val

Glu

Tyr

Ala 220

Arg

Gla

Phe

Asn

Val 225

Pro

Leu

Crg

Val

Arg 220

TCG

TCT

TAT

CGT

AATA

GGA

CCC

GGG

ACA

TTG

ATT

CGC

GCG

TGT

AAG

CGA

954

Ser

Ser

Tyr

Ser

Asn 235

Asp

Pro

Gly

Thr

Leu 240

Ile

Ala

Gly

Ser

Met 220

Glu

GAT

ATT

CCT

GGG

GM

CGA

CGAA

GGC

CAT

ACC

GGT

GTC

GAA

ACC

gga:

CCA

Asp

Ile

Pro

Val 250

Glu

Glu

Ala

Val

Leu 255

Thr

Gly

Val

Ala

Thr 260

Asp

Lys

TCC

GAA

GCC

GAC

GTA

ACC

GTT

CAG

CGG

ATT

TCC

CGAC

AAG

CCA

CGC

CAG

1050

Ser

Glu

Ala 265

Lys

Val

Chr

Val

Leu 270

Gly

Ile

Ser

Asp

Lys 275

Pro

Gly

Glu

GCT

GCC

AAG

GTC

TTC

CGT

CGG

TTG

GCA

GGT

GCA

CGAA

ATC

JAC

ATT

GAC

1098

Ala

Ala 280

Lys

Val

Phe

Arg

Gla 225

Leu

Gla

Asp

Gla

Glu 220

Ile

Csn

Ile

Asp

1100

ATG

GTT

TTG

TCG

AAC

GTC

TCC

tc:^^

GGA

CGAC

CGC

ACT

ACC

GAC

ATC

Met 295

Val

Leu

Gln

Asn

Val 300

Ser

Ser

Val

Glu

Asp 305

Gly

Thr

Thr

Asp

Ile 330

1190

ACG

TTC

ACC

CGA

ccc:

C CGC

GCT

CAC

GGA

CGC

CGT

GCG

ACG

GAG

ATC

TTG

Thr

Phe

Thr

Cys

Pro 315

Arg

Gla

Asp

Gly

Arg 320

Arg

Gla

Met

Glu

Ile 332

Leu

190 430

AAG

AAG

CTT

AGT TTC

TTT

CGC

AAC

Td ACC

PAT

GTG CTT

TAC

GAC

GAC

12 42

Lys

Lys

Leu

Gln Val

Gln

Gly

Asn

Trp Thr

Asn

Val Leu

Tyr

Asp

Asp

330

335

340

CAG

GTC

GCT

AAT GTC

TC C

CT C

GTG

GGG GCT

GGC

ATG AAG

TCT

TAT

CCA

12 90

Gln

Val

Gly

Lys Val

Ser

Leu

Val

Gly Ala

Gly

Met Lys

Ser

His

Pro

345

350

355

GGT

GTT

AC T

CAT CAG

TT C

AG T

GGA

TGT CTG

CGC

CAT GTC

AJAC

GTG

.AAA

1338

Gly

Val

Thr

Ala Glu

Phe

Met

Glu

Ala Leu

Arg

Asp Val

Asn

Val

Asn

360

365

370

ATC

GAA

TTT

TTT CCA

CT’

T TT

GAG

AA’ CGC

ATT

TCC GTG

CTG

ATC

CCG

13 8 6

Ile

Glu

Leu

Ile Ser

Thr

Ser

Glu

Ile Arg

Ile

Ser Val

Leu

Ile

Arg

375

380

385

390

GAA

GAT

ATT

TGT GAT

CTT

CTT

GGA

TCG GCA

TTG

CAT TAG

CAG

TTC

CAG

1434

Glu

Asp

Asp

Leu Asp

Ala

Ala

Ala

Arg Ala

Leu

His Glu

Gln

Phe

Gln

395

400

405

CTG

GGC

GCC

AAT GAC

AAA

(XC

GGT

GT^T’ TAT

GCA

GCGC ACC

GGA

TTT

IIA.

1482

Leu

Gly

Gly

Glu Asp

Glu

Ala

Val

Val Tyr

Ala

Gly Thr

Gly

Arg

410

415

420

AGTTTTAAAG (

TGGCGTTCCC GCAGCGATTG CCGTCGAGGC

TGCTGGCGCA GTTTGCTGGG

1542

TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT

TTCGGTCGAC ATCGTCTGTT

1602

TCTTTGCTTC i

TTTGTGTCTT GTATGTCGCG ATATTCGATC

C

1643

(2) INFORMACJA DLA SEK ID NO : 5:

(i) CCRAKTERYSTTKA SEiKWETCJI:

CA) DŁUGOŚĆ: 421 aminokwasów (B) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas ID) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENJJI: SEK ID NR: 5:

Met 1

Ala

Leu

Val

Val 5

Gln

Lys

Tyr

Gly

Gly IT

Ser

Ser

Leu

Glu

Ser 15

Ala

Glu

Arg

Ile

Arg 20

Asn

Val

Ala

Glu

Arg 25

Ile

Val

Ala

Thr

Lys 33

Lys

Ala

Gly

Asn

Asp 35

Val

Val

Val

Val

Cys 44

Ser

Ala

Met

Gly

Asp 44

Thr

Thr

Asp

Glu

Leu 50

Leu

Glu

Leu

Ala

Ala 55

Ala

Val

Asn

Pro

Val 60

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu 65

Met

Asp

Met

Leu

Leu 70

Thr

Ala

Gl y

Glu

Arg 75

Ile

Ser

Asn

ALa

Leu 80

Val

Ala

Met

Ala

Ile 85

Glu

Ser

Leu

Gly

Ala 90

Glu

Ala

Gln

Ser

Phe 95

Thr

Gly

Ser

Gln

Ala 100

Gly

Val

Leu

Thr

Thr 105

Glu

Arg

His

Gly

Asn 110

Ala

Arg

Ile

Val

Asp 115

Val

Thr

Pro

Gly

Arg 120

Val

Arg

Glu

Ala

Leu 11S

Asp

Glu

Gly

Lys

Ile 130

Cys

Ile

Val

Ala

Gly 115

Phe

Gln

Gly

Val

Asn 110

Lys

Glu

Thr

Arg

Asp 145

Val

Thr

Thr

Leu

Gly 150

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp 155

Thr

Thr

Ala

Val

Ala L60

Leu

Ala

Ala

Ala

Leu 165

Asn

Ala

Asp

Val

Cys 117

Glu

Ile

Tyr

Ser

Asp 175

Val

Asp

Gly

Val

Tyr 180

Thr

Ala

Asp

Pro

Arg 185

Ile

Val

Pro

Asn

Ala 190

Gln

Lys

Leu

Glu

Lys 195

Leu

Ser

Phe

Glu

Glu 200

Met

Leu

Glu

Leu

Ala 205

Ala

Val

Gly

Ser

Lys 210

Ile

Leu

Val

Leu

Arg 215

Ser

Val

Glu

Tyr

Ala 220

Arg

Ala

Phe

Asn

Val

Pro

Leu

Arg

Val

Arg

Ser

Ser

Tyr

Ser

Asn

Asp

Pro

Gly

Thr

Leu

190 430

225

30 1

2335

240

Ile

Ala

Gly

Ser

Met

Glu

Asp

Ile

Pro

Val

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

245

250

255

Gly

Val

Ala

Thr

Asp

Lys

Ser

Glu

da

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Ile

290

295

220

Ser

Asp

Lys

Pro

Gly

Glu

da

da

Lys

Val

Phe

Arg

da

Leu

da

Asp

275

280

285

Ala

,Glu

Ile

Asn

Ile

Asp

Met

Val

Leu

Gln

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

290

2 95

3 00

Asp

Gly

Thr

Thr

Asp

iee

Tho

hho

TAo

Cy o

ro o

Aro

Alo

sso

GCo

dg

305

300

311

320

Arg

Ala

Met

Glu

Ile

Leu

Lys

Lys

Leu

Gln

Val

Gln

Gly

Asn

Trp

TTa

325

330

335

Asn

Val

Leu

Tyr

Asp

Asp

Gln

Val

Gly

Lys

Val

Ser

Leu

Val

Gly

Ala

340

345

330

Gly

Met

Lys

Ser

His

Pro

Gly

Val

Thr

Ala

Glu

Phe

Met

Glu

da

Leu

355

360

365

Arg

Asp

Val

Asn

Val

Asn

Ile

Glu

Leu

Ile

Ser

TTa

Ser

Glu

Ile

Arg

370

335

380

Ile

Ser

Val

Leu

Ile

Arg

Glu

Asp

Asp

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

385

390

339

499

Leu

His

Glu

Gln

Phe

Gln

Leu

Gly

Gly

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val

Tyr

405

410

-115

Ala

Gly

Thr

Gly

Arg

420

12) INFORMACJA DAL SEK ID NR: 5.

(1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 1643 zasad !B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ. dwumciowy ⁽D) TOPOLOGIA: liniowa •ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Brevibacterium lactofermencum (3) SZCZEP: ATCC 13869 (ix) CECHY:

(A) NAZWA- CDS (sekwencja kodująca) (3) POZYCJA: 964..1432 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEk ID Nr. 6:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60

TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACCGATCCGC TJAAAG;CCCC\ GGAACCCTGT 12 0

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TtGGCTACGOTA GACACAGTTT ATTAAGGTAG AGTTGAGCGG ISO

GTAACTGTCA GGCGGTCGCT C<CACCCCT<:CG ACGAC<Cc3TCG TGCGCGCCGG ACAGAAATAT 24 0

GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGC007^0GC ATTAAGAACC GATCG^GCC 3300

CGCCCCCCGC GTGGACCTGC TCGTCGTCGGrT GGGGCCGCCG GAGGCGGGAT 3300

GCACTTGTCG CCGTTGCAGG <CCG^GT<CCCT CCCGGTCGCG: TAAGTCGTCG TMGGATftTG 42 0

CTCCTGCGTG CTGGTGAGCG ΤΑΊΤΤΟΤΛε GCCCGCGTCG TGACGGCGAC TGAGTCCCTT 48 0

GGGGGAGCCG CTGACTGTTT aw:TGGCTCT CGCCC:GCC;CG T CGC ΟΛΟΙΣΟ GCCCCCGGCC 354 0

GGAAACGGCG GCCTTGTTGC CGGCG GGCGGCGCCC TTGACCCGCG CGCTGCGGGC 60 0

CCGATCTGGC TTGTTGGTGG GTTTCAGtGGT GCTGC.CGAAC 0Ac\CCCGC<C TGTGAGCACG 66 0

TTGGGTCGTG GTGGTTCTGC ¢GCCCGCCT(CGC GGTGCGTTGG 0ACCGCC:TTT GACCGGTGCT 72 0

CGCGGGCCCA TTGACTCGGC CGTT¢GCCGGT GCGG'GCGC;CG TGGGC:CCGCG GAGGCGTCCT 760

CCGCGAGCGC CCGGCCAACA GCTCGVCGTTC GCACGCCC(C: TCCCCC:GGGC GCGTCGGCCC 860

GGGACCCGTG TCCTGGTCCG <GCGTGTT<CCC TGCGCTCGCG TACGCGAGGC CGGCGGTCGC 960

GTAGCGGGCG GGGAGCCTCA GC^GC^G^ ACGGTCCCTGG 0GGGCGCTAT GGACCCTAGG 9 00

CCT GTG GAG GAA GCA GTC CTT ACC CCT GTC GCA ACC GAC AAG GGG GAA 100 8

Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu

190 430

	1	5	10	15
GCC	AAA GTA ACC	GTT CTG GGT ATT TCC	GAT AAG CCA	GGC GAG GCT GCC 1056
Ala	Lys Val Thr	Val Leu Gly Ile Ser 20	Asp Lys Pro 25	Gly Glu Ala Ala 30
AAG	GTT TTC CGT	GCG TTG GCT GAT GCA	GAA ATC AAC	ATT GAC ATG GTT 1104
Lys	Val Phe Arg 35	Ala Leu Ala Asp Ala 40	Glu Ile Asn	Ile Asp Met Val 45
CTG	CAG AAC GTC	TCC TCT GTG GAA GAC	GGC ACC ACC	GAC ATC ACG TTC 1152
Leu	Gln Asn Val 50	Ser Ser Val Glu Asp 55	Gly Thr Thr	Asp Ile Thr Phe 60
ACC	TGC CCT CGC	GCT GAC GGA CGC CGT	GCG ATG GAG	ATC TTG AAG AAG 1200
Thr	Cys Pro Arg 65	Ala Asp Gly Arg Arg 70	Ala Met Glu 75	Ile Leu Lys Lys
CTT	CAG GTT CAG	GGC AAC TGG ACC AAT	GTG CTT TAC	GAC GAC CAG GTC 1248
Leu 30	Gln Val Gln	Gly Asn Trp Thr Asn 85	val Leu Tyr 90	Asp Asp Gln Val 95
GGC	AAA GTC TCC	CTC GTG GGT GCT GGC	ATG AAG TCT	CAC CCA GGT GTT 1296
Gly	Lys Val Ser	Leu Val Gly Ala Gly 100	Met Lys Ser 105	His Pro Gly Val 110
ACC	GCA GAG TTC	ATG GAA GCT CTG CGC	GAT GTC AAC	GTG AAC ATC GAA 13 44
Thr	Ala Glu Phe 115	Het Glu Ala Leu Arg 120	Asp Val Asn	Val Asn Ile Glu 125
TTG	ATT TCC ACC	TCT GAG ATC CGC ATT	TCC GTG CTG	ATC CGT GAA GAT 1392
Leu	Ile Ser Thr 130	Ser Glu Ile Arg Ile 135	Ser Val Leu	Ile Arg Glu Asp 140
GAT	CTG GAT GCT	GCT GCA CGT GCA TTG	CAT GAG CAG	TTC CAG CTG GGC 1440
Asp	Leu Asp Ala 145	Ala Ala Arg Ala Leu 150	His Glu Gln 155	Phe Gln Leu Gly
GGC Gly 160	GAA GAC GAA Glu Asp Glu	GCC GTC GTT TAT GCA Ala Val Val Tyr Ala 165	GGC ACC GGA Gly Thr Gly 170	CGC TAAAGTTTTAA 1490 Arg
AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550
GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR. 7:

(l) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 172 aminokwaaćw ;st TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

(111 (XI)

TYP OPIS

CZĄSTECZKI: SEKWENCJI:

białko

: 7:

SEk

ID Nr

Met

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

Gly

Val

Ala

Thr

Asp

Lys

Ser

Glu

Ala

1

5

10

15

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Ile

Ser

Asp

Lys

Pro

Gly

Glu

Ala

Ala

Lys

20

25

30

val

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

Ala

Glu

Ile

Asn

Ile

Asp

Met

Val

Leu

35

40

45

Gln

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Asp

Gly

Thr

Thr

Asp

Ile

Thr

Phe

Thr

50

55

60

Cys

Pro

Arg

Ala

Asp

Gly

Arg

Arg

Ala

Met

Glu

Ile

Leu

Lys

Lys

Leu

65

70

75

80

Gln

Val

Gln

Gly

Asn

Trp

Thr

Asn

Val

Leu

Tyr

Asp

Asp

Gln

Val

Gly

85

90

95

Lys

Val

Ser

Leu

Val

Gly

Ala

Gly

Met

Lys

Ser

His

Pro

Gly

Val

Thr

100

105

110

Ala

Glu

Phe

Met

Glu

Ala

Leu

Arg

Asp

Val

Asn

Val

Asn

Ile

Glu

Leu

115

120

125

Ile

Ser

Thr

Ser

Glu

Ile

Arg

Ile

Ser

Val

Leu

Ile

Arg

Glu

Asp

Asp

190 430

130	135	140
Leu	Asp	Ala	Ala	Ala	Arg	Ala	Leu	His	Glu	Gln	Phe Gln Leu Gly Gly
145					150					155	160
Glu	Asp	Glu	Ala	Val	Val	Tyr	Ala	Gly	Thr	Gly	Arg
				165					170

(2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 3:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI · (A) DŁUGOŚĆ. 23 zasad (Qi TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ; jednoniciowy (D) TOPOLOGIA; liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI. inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (IV) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 3:

GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 2 3 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 9:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ; 23 zasad (9) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA- liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (Ci) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR. 9.

CGGTTCATCGCCAAGTTTTT CTT 2 3 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR:10:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2001 zasad (3) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (Di TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO· (A) ORGANIZM: 3revibacterium Lactofermentum (3) SZCZEP: ATCC 13359 dx) CECHY:

Ά) NAZWA: CDS (sekwencja kodująca) (3) POZYCJA: 730 .1473 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR. 10:

GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTCAATTGG ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC2 TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CCGALGTCAACC AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG TCACAA.CTGG AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAlGTAA AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGG-CCAACTT AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GCAACJAACCT GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT

Mec Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg 1 5 10

12 0 18 0 240 300 3 60 452 0 45 8 0 54 0 600 600 72 0 •768

190 430

GTT

GGT

CAA

ACT

ATT

GTG

GCA

GCA

GTC

AAT

GAG

TCC

GAC

GAT

CTG

GAG

816

Val

Gly

Gln

Thr

Ile

Val

Ala

Ala

Val

Asn

Glu

Ser

Asp

Asp

Leu

Glu

15

20

25

CTT

GTT

GCA

GAG

ATC

GGC

GTC

GAC

GAT

GAT

TTG

AGC

CTT

CTG

GTA

GAC

864

Leu

Val

Ala

Glu

Ile

Gly

Val

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Val

Asp

30

35

40

45

AAC

GGC

GCT

GAA

GTT

GTC

GTT

GAC

TTC

ACC

ACT

CCT

AAC

GCT

GTG

ATG

912

Asn

Gly

Ala

Glu

Val

Val

Val

Asp

Phe

Thr

Thr

Pro

Asn

Ala

Val

Met

50

55

60

GGC

AAC

CTG

GAG

TTC

TGC

ATC

AAC

AAC

GGC

ATT

TCT

GCG

GTT

GTT

GGA

960

Gly

Asn

Leu

Glu

Phe

Cys

Ile

Asn

Asn

Gly

Ile

Ser

Ala

Val

Val

Gly

65

70

75

ACC

ACG

GGC

TTC

GAT

GAT

GCT

CGT

TTG

GAG

CAG

GTT

CGC

GCC

TGG

CTT

1008

Thr

Thr

Gly

Phe

Asp

Asp

Ala

Arg

Leu

Glu

Gln

Val

Arg

Ala

Trp

Leu

80

85

90

GAA

GGA

AAA

GAC

AAT

GTC

GGT

GTT

CTG

ATC

GCA

CCT

AAC

TTT

GCT

ATC

1056

Glu

Gly

Lys

Asp

Asn

Val

Gly

Val

Leu

Ile

Ala

Pro

Asn

Phe

Ala

Ile

95

100

105

TCT

GCG

GTG

TTG

ACC

ATG

GTC

TTT

TCC

AAG

CAG

GCT

GCC

CGC

TTC

TTC

1104

Ser

Ala

Val

Leu

Thr

Met

Val

Phe

Ser

Lys

Gln

Ala

Ala

Arg

Phe

Phe

110

115

120

125

GAA

TCA

GCT

GAA

GTT

ATT

GAG

CTG

CAC

CAC

CCC

AAC

AAG

CTG

GAT

GCA

1152

Glu

Ser

Ala

Glu

Val

Ile

Glu

Leu

His

His

Pro

Asn

Lys

Leu

Asp

Ala

130

135

140

CCT

TCA

GGC

ACC

GCG

ATC

CAC

ACT

GCT

CAG

GGC

ATT

GCT

GCG

GCA

CGC

1200

Pro

Ser

Gly

Thr

Ala

Ile

His

Thr

Ala

Gln

Gly

Ile

Ala

Ala

Ala

Arg

145

150

155

AAA

GAA

GCA

GGC

ATG

GAC

GCA

CAG

CCA

GAT

GCG

ACC

GAG

CAG

GCA

CTT

1248

Lys

Glu

Ala

Gly

Met

Asp

Ala

Gln

Pro

Asp

Ala

Thr

Glu

Gln

Ala

Leu

160

165

170

GAG

GGT

TCC

CGT

GGC

GCA

AGC

GTA

GAT

GGA

ATC

CCA

GTT

CAC

GCA

GTC

1296

Glu

Gly

Ser

Arg

Gly

Ala

Ser

Val

Asp

Gly

Ile

Pto

Val

His

Ala

Val

175

180

185

CGC

ATG

TCC

GGC

ATG

GTT

GCT

CAC

GAG

CAA

GTT

ATC

TTT

GGC

ACC

CAG

1344

Arg

Met

Ser

Gly

Met

Val

Ala

His

Glu

Gln

Val

Ile

Phe

Gly

Thr

Gln

190

195

200

205

GGT

CAG

ACC

TTG

ACC

ATC

AAG

CAG

GAC

TCC

TAT

GAT

CGC

AAC

TCA

TTT

1392

Gly

Gln

Thr

Leu

Thr

Ile

Lys

Gln

Asp

Ser

Tyr

Asp

Arg

Asn

Ser

Phe

210

215

220

GCA

CCA

GGT

GTC

TTG

GTG

GGT

GTG

CGC

AAC

ATT

GCA

CAG

CAC

CCA

GGC

1440

Ala

Pro

Gly

Val

Leu

Val

Gly

Val

Arg

Asn

Ile

Ala

Gln

His

Pro

Gly

225

230

235

CTA

GTC

GTA

GGA

CTT

GAG

CAT

TAC

CTA

GGC

CTG

TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC

1493

Leu

Val

Val

Gly

Leu

Glu

His

Tyr

Leu

Gly

Leu

240

245

GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG

1553

1613

1673

1733

1793

1853

1913

1973

2001 (2) INFORMACJA DLA SEK 10 NR· n.

(1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI. (A) DŁUGOŚĆ; 243 aminokwasów

190 430

IB) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii)

TYP CZĄSTECZKI:

białko

( Xi)

oois 3f:ewsncji:

SEE ID NR:

11 1

Met

Gly

Ile Lys Val

Gly Val

Leu

Gly

Ala

Lys

Gly

Arg

Val

Gly

Gln

1

5

10

11

Thr

Ile

Val Ala Ala

Val Asn

Glu

Ser

Asp

Asp

Leu

Glu

Leu

Val

Ala

20

22

33

Glu

Ile

Gly Val Asp

Asp Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Val

Asp

Asn

Gly

Ala

35

44

44

Glu

Val

Val Val Asp

Phe Thr

Thr

Pro

Asn

Al2

Val

Met

Gly

Asn

Leu

50

55

60

Glu

Phe

Cys Ile Asn

Asn Gly

Ile

Ser

Ala

Val

Val

Gly

Thr

Thr

Gly

65

70

77

86

Phe

Asp

Asp Ala Arg

Leu Glu

Gln

Val

Arg

Ala

Trp

Leu

Glu

Gly

Lys

65

90

90

Asp

Asn

Val Gly Val

Leu Ile

Ala

Pro

Asn

Phe

Ala

Ile

Ser

Ala

Val

100

110

110

Leu

Thr

Met Val Phe

Ser Lys

Gln

Ala

Ala

Arg

Phe

Phe

Glu

Ser

Ala

115

110

115

Glu

Val

Ile Glu Leu

His His

Pro

Asn

Lys

Leu

Asp

Ala

Pro

Ser

Gly

130

135

114

Thr

Ala

Ile His Thr

Ala Gln

Gly

Ile

Ala

Ala

Ala

Arg

Lys

Glu

Ala

145

150

115

110

Gly

Met

Asp Ala Gln

Pro Asp

Ala

Thr

Glu

Gln

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

165

110

117

Arg

Gly

Ala Ser Val

Asp Gly

Ile

Pro

Val

His

Ala

Val

Arg

Met

Ser

160

116

190

Gly

Met

Val Ala His

Glu Gln

Val

Ile

Phe

Gly

Thr

Gln

Gly

Gln

Thr

195

200

205

Leu

Thr

Ile Lys Gln

Asp Ser

Tyr

Asp

Arg

Asn

Ser

Phe

Ala

Pro

Gly

210

215

222

Val

Leu

Val Gly Val

Arg Asn

Ile

Ala

Gln

His

Pro

Gly

Leu

Val

Val

235

775 230

Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu

245 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 12:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (3) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA; liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 12:

GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 2 3 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 13:

(li CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (3) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa 3 TYP CZĄSTECZKI: inny kwa3 nukliinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA

240 (ⁱⁱ⁾ (iv) ANTYSENSOWi^: TAK (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR· :

190 430

GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR:14:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1411 zasad <B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy |D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Brevibacterium lactofermencum iB) SZCZEP: ATCC 13969 (ix) CECHY:

(Al NAZWA: CDS (sekwencja kodująca) (B) POZYCJA; 311...1213 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 14:

CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGACCCAC CGTTTTCC TCG.TTTTGAG ATTGAAACTT 663

TGGCAGACGG ATCGCAAATA GCAACAACCC CCTATGTCAT CAACTTTTAA CCGCAAAGCTC 12 0

ACACCCAC GA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGACTGTA WTACCAATACC 12 0

GTAAAAACCT CTTGCTCATG TCTCTTGTGC TTATCCGGAAT GT(AG:CTT(AAG CGATTGTTAT 240

GCAAAAGTTG TTTCACCCCC TCGCGGTTG TTTWACCCCC ATTTr<CT<GACT ACATGATAAC 300

TTCCATTCTC ATG AC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG (CAC 34 9

Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His

5 20

TTC

GGC

ACC

GTT

CGA

GTA

GC.

AAG

CTT

AACT

CCC

CTC

ACG

GTT

TCC

GGA.

349

Phe

Gly

Thr

Val

Gly

Val

Ala

Met

Val

Thr

Pro

Phe

Thr

Glu

Ser

Gly

25

20

25

GAC

ATC

GAT

ATC

CT

CT

GC

CC

GCTA

GGC

CC

CGC

CT

TTG

GTT

GAT

400

Asp

Ile

Asp

Ile

Ala

Ala

Gly

Arg

Glu

Val

Ala

Ala

Tyr

Leu

Val

Asp

40

34

44

05

AAG

GC

TTG

GAT

TCT

TtT <3

GTT

CCC

CG

GC

ACC

ACT

CT

OA

TCC

CCA

409

Lys

Gly

Leu

Asp

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Thr

thr

Gly

Glu

Ser

Pro

50

55

66

ACG

ACA

ACC

CC

CT

CGA

AA^

CTA

(ATA

CTG

CTC

AAAG

CC

GTT

CGT

GAAG

540

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Glu

Lys

Leu

Glu

Leu

Leu

Lys

Ala

Val

Arg

Glu

65

70

713

GAA

CTCT

CG

GAT

CC

CG

AAC

GGC

ATC

CC

CT

GGC

(ΓΓ

ACC

AAAC

WCC

555

Glu

Val

Gly

Asp

Arg

Ala

Asn

Val

Ile

Ala

Gly

Val

Gly

Thr

Asn

Asn

80

85

90

ACG

CGG

ACJA

TCT

GTG

CATA

CTT

CG

CCA

GCT

GCT

GCT

TCT

CT

GC

GCAc

634

Thr

Arg

Thr

Ser

Val

Glu

Leu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Ser

Ala

Gly

Ala

95

100

105

GAC

GGC

CTT

TTA

GTT

GTA

ACT

CCT

TAT

TAC

TCC

WAG

CCG

AC

(AAA

GAG

665

Asp

Gly

Leu

Leu

Val

Val

Thr

Pro

Tyr

Tyr

Ser

Lys

Pro

Ser

Gln

Glu—

220

125

120

205

GGA

TTG

CTG

GCG

(CAC

TTC

CT

GCA

ATT

CT

GCA

GCA

ACA

GAiG

GTT

CCAA

70 4

Gly

Leu

Leu

Ala

His

Phe

Gly

Ala

Ile

Ala

Ala

Ala

Thr

Glu

Val

Pro

240

1(35

120

ATT

TGT

CTC

TAT

GAC

ATT

CCT

Gd

CGG

TCCA

Gd

ATT

CCAA

ATT

GAG

TCT

781

Ile

Cys

Leu

Tyr

Asp

Ile

Pro

Gly

Arg

Ser

Gly

Ile

Pro

Ile

Glu

Ser

245

150

155

GAT

ACC

ATG

AGA

CC

CTG

AGT

(GWA

TTA

CCT

ACG

ATT

TTG

CG

GTC

WGG

852 9

Asp

Thr

Met

Arg

Arg

Leu

Ser

Glu

Leu

Pro

Thr

Ile

Leu

Ala

Val

Lys

260

165

270

877

GAC

GCC

AAG

GGT

(GAC

CTC

GTT

GCA

GCC

ACG

TCA

TTG

ATC

AAA

ACG

Asp

Ala

Lys

Gly

Asp

Leu

Val

Ala

Ala

Thr

Ser

Leu

Ile

Lys

Glu

Thr

275

180

185

925

GGA

CTT

GCC

TGG

TAT

TCA

GGC

GAT

GAC

CCA

CTA

AAC

CTT

GTT

CAG

CTT

190 430

Gly

Leu

Ala

Trp

Tyr

Ser

Gly

Asp

Asp

Pro

Leu

Asn

Leu

Val

Trp

Leu

200

204

200

204

GCT

TTG

GGC

GGA

TCA

GGT

TTC

AAC

ACC

GTA

ATT

GGA

CAT

GCA

GCC

CCC

903

Ala

Leu

Gly

Gly

Ser 020

Gly

Phe

Ile

Ser

Val 202

Ile

Gly

His

Ala

Ala 2^0

Pro

ACA

GCA

TTA

CGT

GAG

CTG

TAC

AACl

AGC

TTC

CGG

ΕΛ

CG3C

'GA:

CTC

GGC

1221

Thr

Ala

Leu

Arg 004

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ser 000

Phe

Glu

Glu

Gly

Asp 004

Leu

Val

CGT

GCG

CGG

CGAA

ATC

(GCC

JAAA

ATA

TCC.

CCG

CG

GGA

GCCC

CGCC

CCA

1269

Arg

Ala

Arg 000

Glu

Ile

Asn

Ala

Lys 004

Leu

Ser

Pro

Leu

Val 040

Ala

Ala

Gln

GGT

CGC

TTG

GGT

GGA

GTC

AGC

TTG

«Ca

CAAa

CGT

GGC

CCG

CGT

CTG

CCA

1217

Gly

Arg 044

Leu

Gly

Gly

Val

Ser 0 00

Leu

Ala

Lys

Ala

Ala 004

Leu

Arg

Leu

Gln

GGC

ATC

GC

GTA

GGA

GAT

CCT

CCG

ACT

CCCi

AAC

ATG

GGC

CCCA

CCT

GGA

1165

Gly 020

Ile

Asn

Val

Gly

Asp 024

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile 208

Met

Ala

Pro

Asn

Glu 285

CAG

GAA

CTT

GAG

GCT

CTC

CGA

CGA

AAC

ATG

ΑΓΑ

CAC

GC

'CCC

GTT

CA

1213

Gln

Glu

Leu

Glu

Ala 000

Leu

Arg

Glu

Asp

Met 2 05

Lys

Lys

Ala

Gly

Val 30(0

Leu

TCTATATCCA TCATTCGCGT CATCGTGGCT GTTG.CCΊ'TAA CCTCAG.CTG A GCGGACCG.CA V2.13

AGTTGCTTAC CATAACCATC TCCTTAGGCC CTGTTTGCCA GTGCTCTAG A CCTTCTCTJTC 13 3 3

TCAGAGTGCT CTAATAGGTC ACACGCGGCC ATGCTGTTTA CGCCATCCTA CGGGATGCGC 13 90

TTATCCATCT CAACATTC 1411 (2) INFORMACJA FOR SEQ ID NO:15:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DDUUGŚĆ: 301 Irninookaaów (9) TYP CZĄSTECZKI· aminokwas fDl TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

(Xi>

OPIS

SEKWENCJI :

SEK

ID NR

15 .

Met 2

Ser

Thr

Gly

Leu 5

Thr

Ala

Lys

Thr

Gly 12

Val

Glu

His

Phe

Gly 15

Thr

Val

Gly

Val

Ala 00

Met

Val

Thr

Pro

Phe 20

Thr

Glu

Ser

Gly

Asp 30

Ile

Asp

Ile

Ala

Ala 04

Gly

Arg

Glu

Val

Ala 40

Ala

Tyr

Leu

Val

Asp 40

Lys

Gly

Leu

Asp

Ser 40

Leu

VaA

Leu

Ala

Gly 515

Thr

Thr

Gly

G1 u

Ser 60

Pro

TUr

Thr

ThE

Ala 04

Ala

Glu

Lys

Leu

Glu 70

Leu

Leu

Lys

Ala

Val 72

Arg

Glu

Glu

Val

Gly 88

Asp

Arg

Ala

Asn

Val 84

Ile

Ala

Gly

Val

Gly 90

Chr

Asn

Asn

Thr

Arg 95

Thr

Ser

Val

Glu

Leu 200

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala 120

Ser

Ala

Gly

Ala

Asp 110

Gly

Leu

Leu

Val

Val 224

Thr

Pro

Tyr

Tyr

Ser 120

Lys

Pro

Ser

Gln

Glu 120

Gly

Leu

Leu

Ala

His 200

Phe

Gly

Ala

Ile

Ala 135

Ala

Ala

Thr

Glu

Val 120

Pro

Ile

Cys

Leu

Tyr 204

Asp

Ile

Pro

Gly

Arg 120

Ser

Gly

Ile

Pro

Ile 124)

Glu

Ser

Asp

Thr

Met 120

Arg

Arg

Leu

Ser

Glu 204

Leu

Pro

Chr

Ile

Leu UO

Ala

Val

Lys

Asp

Ala 1-7 5

Lys

Gly

Asp

Leu

Val 280

Ala

Ala

Thr

Ser

Leu 128

Ile

Lys

Glu

Chr

Gly 190

Leu

Ala

Trp

Tyr

Ser 204

Gly

Asp

Asp

Pro

Leu 200

Asn

Leu

Val

Trp

Leu 20 5

Ala

Leu

Gly

190 430

Gly

Ser 210

Gly

Phe

Ile

Ser

Val 215

Ile

Gly

His

Ala Ala 220

Pro

Thr

Ala

Leu

Arg

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ser

Phe

Glu

Glu

Gly

Asp

Leu

Val

Arg

Ala

Arg

225

230

235

240

Glu

Ile

Asn

Ala

Lys

Leu

Ser

Pro

Leu

val

Ala

Ala

Gln

Gly

Arg

Leu

245

250

255

Gly

Gly

Val

Ser

Leu

Ala

Lys

Ala

Ala

Leu

Arg

Leu

Gln

Gly

Ile

Asn

260

265

270

Val

Gly

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Met

Ala

Pro

Asn

Glu

Gln

Glu

Leu

275

280

285

Glu

Ala

Leu

Arg

Glu

Asp

Met

Lys

Lys

Ala

Gly

Val

Leu

290

295

300

121 INFORMACJA DLA SEK ID NR: 16:

(1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(At DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (Dl TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (At OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xil SEQUENC3 OPIS: SEK ID NR: 16:

GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 2 3 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 17:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A! DŁUGOŚĆ: 23 zasad (3·) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (Cl ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ll) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (At OPIS: syntetyczny DNA (IV) ANTYSENSOWNY: tak (XI) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 17:

CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 13:

(I) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A; DŁUGOŚĆ: 3579 zasad (3) TY? CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (II) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (VI' ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM- Brevibacterium lactofermentum (3) SZCZEP. ATCC 13869 (ul CECHY.

i A) NAZWA. CDS (sekwencja kodująca) (31 POZYCJA: 533..2132 (A) NAZWA. CDS (sekwencja kodująca) (3) POZYCJA: 2133 . .3522 (XI) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 18:

GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC

120

180

240

300

190 430

CCGCCCGCTT

GGCCCCCACC

GGGCGAAGAG

CCGATCGCTG ηΜΑΤΤΑΤΑΤ AGGGGCTGAG CGCΑCTCGΑC (CTGGCAGTGG GGCGGCGGCG GGGCCCCCCC GCGCACCTJC TCGGCnUkCG TTTGTTTTCT GCCGGACGGA Τ^ΜΑΤΑΤΑ GATCGGGTCT TGGGCTTCA AAAGGCGGG CGGGCTGAGA GGATGCGCGC CGACGGGTGT ACCTCGGCGA 0GCCrTTCTCC GG CGC

Met

9 440 490 555

ATG

TCA

GCT

ct

CTT

cnre

AC

TTG

ACT

cacc

CG

ACC

GCG

GTA

CTAG

GUT

558

Thr

Pro

Ala

JGp

Luu

da

Thr

Leu

IIl

Llc

GUu

Thr

da

Val

GCu

Wl

TTG

ACG

TCC

5 CCC

CT

ctc

CT

ACT

11 TCT

GUT

CCT

CCG

GTGG

11 CGTT

GTTC

GUT

69 3.

Leu

TTa

Ser

Arg

Glu

Leu

Asp

Thr

Ser

Vv1

Luu

Tro

GUu

Gln

Val

Wl

GTG

GAG

20 CGT

CGG

GCT

AAC

CC

22 cg

cc

GGG

CT

TAC

33 GCC

ACC

(ATC

ATT

697

Val

Glu

Arg

Ppo

Arg

Asn

Pro

Glu

HHs

Gly

Ass

Ttc

da

Thr

CGn

IIa

GGA

35 TTG

CAG

GTG

GCT

AJAe

40 AAG

GTC

GCT

CG

0GA

45 CCT

CGTT

GAT

TTG

GCC

772

Ala

Leu

Gln

Val

Ala

Lys

Lys

Val

Gly

GUn

Ass

Tpo

Arg

Asp

Luu

da

50 AGG

TGG

CTG

TTA

GAT

55 (Gre

TTG

(c:t

CTG

CC

60 CC

TGC

ATT

CT

TCT

69 GCC

77^

TTa

Trp

Leu

da

Glu

AL a

Leu

ALa

da

Ass

Ass

da

OIa

Asp

Ser

da

GGA

ATT

GCG

TCT

70 TC

GGC

ttt

TTG

TAC

70 ATT

TGT

CTT

GTT

GJGT

88 (TGT

GC

882

Glu

Ile

Ala

GGy

Pro

Gly

Phe

Leu

0An

He

Asr

Ali

Alu

ALa

da

CGn

CAG

TTT

GAA

85 ATT

GTG

GCC

CGG

ATT

99 CTG

GC

CG

onn:

CG

99 ACT

0TC

GTA

881,

Gln

Tly

Glu

PIn

Vil

ALa

Lys

He

Luu

dl

TUn

GUy

GUu

Thr

PPe

GUy

AAG

TGG

100 GAT

CG

ctt

TCC

CC

110 TTG

CC

gug

CGT

CCTC

111 CG

TTC

GUT

OTT

999

Asn

Ser

Asp

pii

Leu

Ser

His

Leu

CAp

vaa

Ass

Tuu

Glu

POt

Val

oee

GGA

115 AAC

CCA

ACC

TTA

CCT

110 ATT

CC

CTT

GUT

GC

125 CĄCC

ccc;

Ttnn

GCT

GCC

995 9

Ala

Asn

Pro

TTie

Gly

Pro

Ile

Hj.i

Luu

GUy

gcu

TTir

Arg

Trp

ALa

0G.U

130 GTG

GTT

GAC

TCT

TTG

135 (mr

CGT

GTG

CTG

(GAG·

1-40 GCG

TTC

tac:

GCG

CGAT

114 GTT TT

9095

Val

Gly

Asa

Ser

Leu

Gly

Arg

Val

Llu

GTU

da

Oe^u:

Gly

ALa

Ljc

0Vl

ACG

CGC

GACA

CAC

150 TAG

TTC

CGC

GAT

CC

115 GCG

CCT

CG

ATC

CT

119 CGT

TTC

10 63

TTa

Arg

Glu

utc

Tyr

Phe

Asn

Asp

Hhs

GTy

CGA

TUn

Ile

Asp

Arg

POt

GTT

TTG

TCC

195 GGT

CTT

cttg

(TCG

o GGG

110 AAG

GGC

GCG

OC

ACG

11!^ CGGT

(GAC

GAC

HH

Ala

Leu

SeS

Aur

Leu

ALa

ALa

da

Lyy

GUy

GUl

Opo

Thr

Pro

Glu

Asp

GGT

TAT

180 GGU

GGC

GAA

TAC

ATT

115 CGG

(TAC

ATT

GUC

CG

110 GTTG

ATC

GTC

(GAG

1159

Gly

Tyr

Gly

GGy

Clu

Tyr

Ile

Lys

Glu

Ha

da

GUu

da

Ile

Val

GUu

AAG

195 CAT

CCT

TTG.

GCG

TTG

200 GCT

TTG

CG

CGC

GTC

205 GC

ACC

CG

CG

CGT

1207

Lys

His

Pro

GTU

Ala

Leu

da

Leu

Glu

Ppo

da

OAa

Thr

Gln

Glu

Leu

210 TTC

CGC

GCT

TCG.

GGG

215 GTG

CG

ATG

ATG

TTC

220 CG

CC

ATC

(GAG

TCT

225 TCC

125 5

Phe

Arg

Ale

Hu

Gly

Val

Glu

Met

Met

POt

GTu

(Hi

IIe

Lys

Ser

Ser

GTT

GAT

GAT-

TTC

230 GGG

ACC

GAG

TTC

GAT

23 GTC

TAC

TAC

CC

(TAn

220 CGGC

TCC

13 03

Leu

His

Glu

POt

Gly

Thr

Asp

Phe

Asp

Val

Ttc

0yr

His

Glu

Asn

Ser

CTG

TTG

GAT

245 TCC

GGT

CTTG

GTG

CC

250 AAG

GCC

GUG

CG

GTG

255 CTG

AAG

CC

13 51

Leu

Phe

Glu

Per

Gly

da

Val

Asp

Llc

da

Vaa

GUn

Val

Leu

Lys

Asp

AAG

GGG

290 AAC

CCG

TAG

gjgc

CGC

265 CG

GGC

GCT

TGG

TGG

220 CTG

CGT

TCC

ACC

13 9 9

190 430

Asn

Gly Asn 275

Leu

Tyr

Glu

Asn 280

Glu

Gly

Ala

Trp

Trp 285

Leu Arg

Ser Thr

GAA

TTC

GGC

GAT

GAC

AAA

GAC

CGC

GTG

GTG

ATC

AAG

TCT

GAC

GGC

GAC

1447

Glu

Phe

Gly

Asp

Asp

Lys

Asp

Arg

Val

Val

Ile

Lys

Ser

Asp

Gly

Asp

290

295

300

305

GCA

GCC

TAC

ATC

GCT

GGC

GAT

ATC

GCG

TAC

GTG

GCT

GAT

AAG

TTC

TCC

1495

Ala

Ala

Tyr

Ile

Ala

Gly

Asp

Ile

Ala

Tyr

Val

Ala

Asp

Lys

Phe

Ser

310

315

320

CGC

GGA

CAC

AAC

CTA

AAC

ATC

TAC

ATG

TTG

GGT

GCT

GAC

CAC

CAT

GGT

1543

Arg

Gly

His

Asn

Leu

Asn

Ile

Tyr

Met

Leu

Gly

Ala

Asp

His

His

Gly

325

330

335

TAC

ATC

GCG

CGC

CTG

AAG

GCA

GCG

GCG

GCG

GCA

CTT

GGC

TAC

AAG

CCA

1591

Tyr

Ile

Ala

Arg

Leu

Lys

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Leu

Gly

Tyr

Lys

Pro

340

345

350

GAA

GGC

GTT

GAA

GTC

CTG

ATT

GGC

CAG

ATG

GTG

AAC

CTG

CTT

CGC

GAC

1639

Glu

Gly

Val

Glu

Val

Leu

Ile

Gly

Gln

Met

Val

Asn

Leu

Leu

Arg

Asp

355

360

365

GGC

AAG

GCA

GTG

CGT

ATG

TCC

AAG

CGT

GCA

GGC

ACC

GTG

GTC

ACC

CTA

1687

Gly

Lys

Ala

Val

Arg

Met

Ser

Lys

Arg

Ala

Gly

Thr

Val

Val

Thr

Leu

370

375

380

385

GAT

GAC

CTC

GTT

GAA

GCA

ATC

GGC

ATC

GAT

GCG

GCG

CGT

TAC

TCC

CTG

1735

Asp

Asp

Leu

Val

Glu

Ala

Ile

Gly

Ile

Asp

Ala

Ala

A_rg

Tyr

Ser

Leu

390

395

400

ATC

CGT

TCC

TCC

GTG

GAT

TCT

TCC

CTG

GAT

ATC

GAT

CTC

GGC

CTG

TGG

1783

Ile

Arg

Ser

Ser

Val

Asp

Ser

Ser

Leu

Asp

Ile

Asp

Leu

Gly

Leu

Trp

405

410

415

GAA

TCC

CAG

TCC

TCC

GAC

AAC

CCT

GTG

TAC

TAC

GTG

CAG

TAC

GGA

CAC

1831

Glu

Ser

Gln

Ser

Ser

Asp

Asn

Pro

Val

Tyr

Tyr

Val

Gln

Tyr

Gly

His

420

425

430

GCT

CGT

CTG

TGC

TCC

ATC

GCG

CGC

AAG

GCA

GAG

ĄCC

TTG

GGT

GTC

ACC

1879

Ala

Arg

Leu

Cys

Ser

Ile

Ala

Arg

Lys

Ala

GlU

Thr

Leu

Gly

Val

Thr

435

440

445

GAG

GAA

GGC

GCA

GAC

CTA

TCT

CTA

CTG

ACC

CAC

GAC

CGC

GAA

GGC

GAT

1927

GlU

Glu

Gly

Ala

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Thr

His

Asp

Arg

Glu

Gly

Asp

450

455

460

465

CTC

ATC

CGC

ACA

CTC

GGA

GAG

TTC

CCA

GCA

GTG

GTG

AAG

GCT

GCC

GCT

1975

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu

Gly

Glu

Phe

Pro

Ala

Val

Val

Lys

Ala

Ala

Ala

470

475

480

GAC

CTA

CGT

GAA

CCA

CAC

CGC

ATT

GCC

CGC

TAT

GCT

GAG

GAA

TTA

GCT

2023

Asp

Leu

Arg

Glu

Pro

His

Arg

Ile

Ala

Arg

Tyr

Ala

Glu

Glu

Leu

Ala

485

490

495

GGA

ACT

TTC

CAC

CGC

TTC

TAC

GAT

TCC

TGC

CAC

ATC

CTT

CCA

AAG

GTT

2071

Gly

Thr

Phe

His

Arg

Phe

Tyr

Asp

Ser

Cys

His

Ile

Leu

Pro

Lys

Val

500

505

510

GAT

GAG

GAT

ACG

GCA

CCA

ATC

CAC

ACA

GCA

CGT

CTG

GCA

CTT

GCA

GCA

2119

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Pro

Ile

His

Thr

Ala

Arg

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

515

520

525

GCA

ACC

CGC

CAG

ACC

CTC

GCT

AAC

GCC

CTG

CAC

CTG

GTT

GGC

GTT

TCC

2167

Ala

Thr

Arg

Gln

Thr

Leu

Ala

Asn

Ala

Leu

His

Leu

Val

Gly

Val

Ser

530

535

540

545

GCA

CCG

GAG

AAG

ATG

TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA

2214

Ala

Pro

Glu

Lys

Met

Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu

550

1

5

CTT

CCC

GCA

CAC

GTA

TGG

CCA

CGC

AAT

GCC

GTG

CGC

CAA

GAA

GAC

GGC

2262

Leu

Pro

Ala

His

Val

Trp

Pro

Arg

Asn

Ala

Val

Arg

Gln

Glu

Asp

Gly

10

15

20

25

GTT

GTC

ACC

GTC

GCT

GGT

GTG

CCT

CTG

CCT

GAC

CTC

GCT

GAA

GAA

TAC

2310

Val

Val

Thr

Val

Ala

Gly

Val

Pro

Leu

Pro

Asp

Leu

Ala

Glu

Glu

Tyr

190 430

GGA

ACC

CCA

CTT

30 GTT

GTA

GT T

GAS

gag

35 (A^C

GAT

TTC

CGT

TCC

40 CGC

TTT

2 3 5 8

Gly

Thr

Pro

Leu

Ghr

GVa

Vv1

Asp

Glu

Asp

Asp

Phe

CCrg

Ser

Arg

Ccs

CGC

GAC

ATG

45 GGC

ACC

GOS

TTT

GGT

50 GOS

CCA

GGC

CCST

GTG

55 OSC

TAC

GTT.

2406

Arg

Asp

Met

ASu

GTr

ASu

Phr

Glu

Gly

Pro

Gly

Asn

Val

His

Tyr

ASl

TCT

AAA

60 GCG

TTT

GCG

ACC

GAG

65 AAC

ATT

GOS

CGT

TGG

70 GTT

(AST

GTSS

GAC

2 45 4

Ser

Lys

Ala

Phe

Glu

GLS

ITr

Ile

Ala

Arg

Trp

Val

CCsp

GZLu

Glu

GTA

•75 CTG

GCA

CCT

CGS

ATT

80 GAA

ATC

ATC

AAC

GTSS

85 CTG

catc

ATT

GCC

CCT

2 5(02

Gly

Leu

Ala

Llu

Asp

Ul

AC u

Asi:

Ile

Asn

Glu

Leu

Gly

Ile

CSU a

Lee

90 GCC

GCT

GGT

TTT

GCC

95 gac

ASG

GCG

ATC

ACC

100 GCG

OSC

GGC

CSC

(CSC

110 ASC

25 5 0

Ala

Ala

Gly

Phe

PhO

GAl

Gse

aao

Ile

Thr

Ala

His

Gly

Asn

Asn

Lls

GGC

GTA

GAG

TTC

110 CTG

GTG

GAT

TTC

GTT

115 OCS

AAC

(ATT

GTG

(GGS

110 OSC

GTG

2 5.9.5

Gly

Val

Glu

Phe

Leu

CCrg

GAl

Geu

Val

Gln

Asn

Gly

Val

Gly

His

Val

GTG

CTG

GAC

125 TCC

(AO.

GOC

CCT

130 GCC

CTG

TTG

(AST

TAC

115 GTT

GCC

GCT

2 54 5

Val

Leu

Asp

Ser

AC.U

Glu

Glu

Aee

Glu

Leu

Leu

Asp

Tyr

Val

CSU a

Ala

GGT

GAA

140 GGC

OJCA

AST

COG

gas

145 AGT

TTG

ATC

Cd:

GTA

110 AAG

COS

Gd

ACT

2 594

Gly

Glu

Gly

Les

IUe

Glu

CSp

vv1

Leu

Ile

Arg

Val

Lys

Pro

Gly

IUe

GAA

155 GCA

CAC

ast

GAS

IGA

160 TTC

ATC

(CCC

ACT

AGT

165 (CSC

(ASA

(CSC

(TSG

ACC

2742

Glu

Ala

His

TTh

Gie

Glu

Ih^

Ile

Ala

Thr

Ser

His

Glu

Asp

Gln

Lls

170 TTC

GGA

TTC

TCC

GTG

1-75 (ATS

TCC

AGT

TCC

(GOS

180 TTC

(ACS

GOS

GOS

(CCS

115 GCA

:27 200

Phe

Gly

Phe

Ssu

Geu

AC u

Asu

Glu

Ser

Ala

Phe

Glu

Ala

Ala

Lys

ACl

GCC

AAC

AAC

CAO

190 CGA

CSC

c^i^g

GTC

CTG

195 (ATT

(GGC

(ATG

OSC

TGC

200 OSC

GCT

2 838

Ala

Asn

Asn

ASu

Glu

Asn

Geu

Asn

Leu

Val

Gly

Leu

His

cys

His

W1

GGT

TCC

CAG

205 GGG

GTC

GAA

GGT

CGA

210 (CAA

TTC

ACG

CTG

GOS

215 GOS

(CCS

CTC

2886

Gly

Ser

Gln

Vaa

Ihh

Asp

AAu

Glu

Gly

Phe

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

AAO

GTG

TTG

220 GOT

CC G

GAS

TCT.

GAA

225 ATC

CCC

AGC

GAA

ctg

230 GGC

GTT

GCC

CCT

2934

Val

Leu

Gly

Leu

Gyr

Sse

Glu

Ile

His

Ser

Glu

Leu

Gly

Val

Ala

Lee

CCT

235 GAA

CTG

GAS

GTT

GAT

240 GAA

GAG

TAC

(G^C

ATT

2Ί5 (ACC

TAT

ACC

GOS

GAC

298 2

Pro

Glu

Leu

ZGsp

Geu

Glu

GT y

Tyr

Gly

Ile

Ala

Tyr

Thr

Ala

ASu

250 GAA

GAA

CCC

CCC

(CSC

255 GTC

(GOS

CGCs

GTT

GCC

260 TCC

GCC

CTT

CTC

ACC

225 GCA

3030

Glu

Glu

Pro

Lee

Asn

Val

C^ć^

Glu

Val

Ala

Ser

Asp

Leu

Leu

Thr

ASu

GTC

GGA

AAA

ATG

270 CGG

GCG

GTSS

CTA

GGC

275 ATC

CSC

GCA

CCS

AAA

22)0 GTC

CTT

37I 8

Val

Gly

Lys

Mee

GCa

ASu

Glu

Leu

Gly

Ile

Asp

Ala

Pro

Thr

Val

Lee

GTT

GAG

CCC

285 GAG

CGG

gat

ATC

GCA

290 GGC

CCC

TCA

AAA

GTT

295 AAA

ATA

TAC

31I 6

Val

Glu

Pro

Gly

Arg

GA a

Ile

CCu

Gly

Pro

Ser

Thr

Val

Thr

Ile

Tyr

GAA

GTC

300 GGC

.GAC

ACC

JASS

gac

305 ΟΊΓ

(ACC

GTA

GCC

GAC

310 GAA

AAC

AAA

CGC

37I 4

Glu

Val

Gly

GTh

TTr

LLs

gap

Vv1

His

Val

Anp

Asp

Anp

Lys

Thr

Arg

CGT

315 TAC

ATC

GTA

GTG

GAS

320 GGA

GAG

ATG

TCC

GCA

325 ACA

ATA

CCA

ACC

GCA

3222

Arg

Tyr

Ile

ASu

Val

Gap

GGy

Gly

Met

Ser

Asp

Asn

Ile

Arg

Pro

AS.a

330

335

340

334

190 430

CTC

TAC

GGC

GTC

GAA

TAC

GAA

GGC

GCC

GTA

GTA

TCC

CGC

TTT

GGC

GJAA

322^0

Leu

Tyr

Gly

Ser

Glu 350

Tyr

Asp

Ala

Arg

Val 355

Val

Ser

Arg

Phe

Ala 336

Glu

GGA

GAC

CCA

GGT

A(GC

ACC

CGC

ATC

GTG

TCC

CAC

TGC

CGA

GCC

CG3C

3338

Gly

Asp

Pro

Val 365

Ser

Thr

Arg

Ile

Val 370

Gly

Ser

His

Cycs

Glu 375

Ser

Gly

GAT

ATC

CCT

ATC

GAC

GAT

GGA

GTC

GAC

CCCA

TCT

CdAC

ATC

AAC

AGC

GGC

3366

Asp

Ile

Leu 360

Ile

Asn

Asp

Glu

Ile 365

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile 300

Thr

Ser

Gly

GAC

TTC

CCT

GGC

CTC

GCA

GGC

ACC

GGC

GGA

TAC

TCGC

TAC

GGC

GTG

AGC

3314

Asp

Phe 305

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala 400

Thr

Gly

AL a

Tyr

Cys 405

Tyr

Ala

Met

Ser

TCC

CGC

TAC

GAC

CGCC

TTC

ACA

CCGj

CCC

CdC

GTC

GTG

TCC

GGO

GGC

<g:t

3362

Ser 410

Arg

Tyr

Asn

Ala

Phe 415

Thr

Arg

Pro

Ala

Val 420

Val

Ser

Val

Arg

Ala 425

GGC

AGC

TCC

CGC

CTC

ATG

CCG

ccgc

ccg:

GAA

ACG

CTC

GAC

GAA

ATC

CTC

3510

Gly

Ser

Ser

Arg

Leu

Met

Leu

Arg

Arg

Glu

Thr

Leu

Asp

Asp

Ile

Leu

430 435 444

TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 35 62

Ser Leu Glu Ala

445

GTGGAGGGCG GTTTTGG 3570 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 19:

(1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DŁUGOŚĆ. 550 aminokwasów (3) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

!xi)

OPIS

SEKWENCJI:

SEK

ID NR

: 19 :

Met 1

Thr

Pro

Ala

Asp 5

Leu

Ala

Thr

Leu

Ile H

Lys

Glu

Thr

Ala

Val lii

Glu

Val

Leu

Thr

Ser 20

Arg

Glu

Leu

Assp

Thr 22

Ser

Val

Lsu

Pro

Glu 33

Gln

Val

Val

Val

Glu 35

Arg

Pro

Arg

Asn

Pro 40

Glu

His

Gly

Asp

Tyr 44

Ala

Thr

Asn

Ile

Ala 50

Leu

Gln

Val

Ala

Lys 55

Lys

Val

Gly

Gln

Asn 66

Pro

Arg

Asp

Leu

Ala 65

Thr

Trp

Leu

Ala

Glu 77

Ala

Leu

Ala

Ala

Asp 75

Asp

Ala

Ils

Asp

Ser 8 0

Ala

Glu

Ile

Ala

Gly 65

Pro

Gly

Phe

Leu

Asn 90

Ile

Arg

Lsu

Ala

Ala 95

Ala

Ala

Gln

Gly

Glu 100

Ile

Val

Ala

Lys

Ile H5

Leu

Ala

Gln

Gly

Glu 110

Thr

Phe

Gly

Asn

Ser U5

Asp

His

Leu

Ser

His 112

Leu

Asp

Val

Asn

Leu 115

Glu

Phs

Val

Ser

Ala 130

Asn

Pro

Thr

Gly

Pro 135

Ile

His

Leu

Gly

Gly 110

Thr

Arg

Trp

Ala

Ala 145

Val

Gly

Asp

Ser

Leu HO

Gly

Arg

Val

Leu

Glu 155

Ala

Ssr

Gly

Ala

Lys 160

Val

Thr

Arg

Glu

Tyr 165

Tyr

Phe

Asn

Asp

His 110

Gly

Arg

Gln

Ile

Asp 1-75

Arg

Phe

Ala

Leu

SeG 180

Leu

Leu

Ala

A1g

Ala 116

LyG

Gly

Glu

Po

Thr 190

Pro

Glu

Asp

Gly

Tyr 105

Gly

Gly

Glu

Tyr

Ile 220

Lys

Glu

Ile

Ala

Glu 205

Ala

Ile

Val

Glu

Lys 210

His

Pro

Glu

Ala

Leu 215

Ala

Leu

Glu

Pro

Ala 220

Ala

Thr

Gln

Glu

190 430

Leu 225

Phe

Arg

Cla

Glu

Gly 230

Val

Glu

Met

Met

Phe 225

Glu

His

Ile

Lys

Ser 2 40

Ser

Leu

His

Glu

Phe

Gly

Thr

Asp

Phe

Asp

Val

Gyr

Tyr

His

Glu

Asn

000

225

225

Ser

Leu

Phe

Glu

Ser

Gly

Ala

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Gln

Val

Leu

Lys

260

225

220

Asp

Csn

Gly

Csn

Leu

Gyr

Glu

Asn

Glu

Gly

Ala

Grp

Trp

Leu

Arg

Ser

275

2 20

285

Thr

Glu

Phe

Gly

Csp

Asp

Lys

Asp

Arg

Val

Val

Ile

Lys

Ser

Asp

Gly

290

295

330

Asp

Cla

Ala

Tyr

Ile

Ala

Gly

Asp

Ile

Ala

Gyr

Val

Ala

Asp

Lys

Phe

305

310

331

330

Ser

Arg

Gly

His

Asn

Leu

Asn

Ile

Gyr

Met

Leu

Gly

Ala

Asp

His

His

325

33C0

333

Gly

Tyr

Ile

Ala

Arg

Leu

Lys

Ala

Ala

Gla

Ala

Ala

Leu

Gly

Tyr

Lys

300

335

335

Pro

Glu

Gly

Val

Glu

Val

Leu

Ile

Gly

Gln

Met

Val

Asn

Leu

Leu

Arg

355

33C0

3 65

Asp

Gly

Lys

Ala

Val

Arg

Met

Ser

Lys

Arg

Ala

Gly

Thr

Val

Val .

Ghr

370

375

3 30

Leu

Csp

Asp

Leu

Val

Glu

Ala

Ile

Gly

Ile

Asp

Ala

Ala

Arg

Gyr

Ser

385

390

339

4 00

Leu

Ile

Arg

Ser

Ser

Val

Asp

Ser

Ser

Leu

Csp

Ile

Asp

Leu

Gly

Leu

005

400

401

Grp

Glu

Ser

Gln

Ser

Ser

Asp

Asn

Pro

Val

Tyr

Gyr

Val

Gln

Tyr

Gly

020

402

403

His

Ala

Arg

Leu

Cys

Ser

Ile

Ala

Arg

Lys

Ala

Glu

Ghr

Leu

Gly

Val

200

400

445

Ghr

Glu

Glu

Gly

Ala

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Thr

His

Asp

Arg

Glu

Gly

050

4SS

46 0

Asp

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu

Gly

Glu

Phe

Pro

Ala

Val

Val

Lys

Ala

Ala

065

070

405

480

Ala

Csp

Leu

Arg

Glu

Pro

His

Arg

Ile

Gla

Arg

Gyr

Ala

Glu

Glu

Leu

085

400

405

Ala

Gly

Thr

Phe

His

Arg

Phe

Gyr

Asp

Ser

Tys

His

Ile

Leu

Pro

Lys

500

555

550

Val

Asp

Glu

Asp

Ghr

Ala

Pro

Ile

His

Ghr

Ala

Arg

Leu

Ala

Leu

Ala

515

55C0

525

Ala

Ala

Thr

Arg

Gln

Ghr

Leu

Ala

Asn

Ala

Leu

His

Leu

Val

Gly

Val

530

535

54(0

Ser

Ala

Pro

Glu

Lys

Met

505

550

(2) INFORMACJA DLA SEK ID

NR: 20:

(i)

CHEAKTERYSTYKA

SEKWENCJI :

(Α)

DŁUGOŚĆ: 445 aminokwasów

(3)

TYP CZĄSTe

czki ,

aminokwas

(D)

TOPOLOGIA.

l ini

owa

(ii)

TYP

cząsteczki

biał

.ko

(xi

i OPIS

; SEKWENCJI

: SEK

ID NR

.: 20:

Met

Ala

Thr

Val

Glu

Asn

Phe

Asn

Glu

Leu

Pro

Ala

His

Val

Grp

Pro

1

5

10

11

Crg

Asn

Ala

Val

Arg

Gln

Glu

Asp

Gly

Val

Val

Ghr

Val

Cla

Gly

Val

20

25

30

Pro

Leu

Pro

Asp

Leu

Ala

Glu

Glu

Tyr

Gly

Ghr

Pro

Leu

Phe

Val

Val

35

40

40

Asp

GGu

Asp

Asp

Phe

Arg

Ser

Arg

Cys

Arg

Asp

Met

TAL a

Thr

Ala

Phe

S5 60

190 430

Gly

Gly

Pro

Gly

Asn

Val

His

Tyr

Ala

Ser

Lys Ala

Phe

Leu

Thr

Lys

65

70

75

80

Thr

Ile

Ala

Arg

Trp

Val

Asp

Glu

Glu

Gly

Leu Ala

Leu

Asp

Ile

Ala

85

99

95

Ser

Ile

Asn

Glu

Leu

Gly

Ile

Ala

Leu

Ala

Ala Gly

Phe

Pro

Ala

Ser

100

115

111

Arg

Ile

Thr

Ala

His

Gly

Asn

Asn

Lys

Gly

Val Glu

Phe

Leu

Arg

Ala

115

110

125

Leu

Val

Gln

Asn

Gly

Val

Gly

His

Val

Val

Leu Asp

Ser

Ala

Gln

Glu

130

135

140

Leu

Glu

Leu

Leu

Asp

Tyr

Val

Ala

Ala

Gly

Glu Gly

Lys

Ile

Gln

Asp

145

150

115

116

Val

Leu

Ile

Arg

Val

Lys

Pro

Gly

Ile

Glu

Ala His

Thr

His

Glu

Phe

165

117

175

Ile

Ala

Thr

Ser

His

Glu

Asp

Gln

Lys

Phe

Gly Phe

Ser

Leu

Ala

Ser

180

118

119

Gly

Ser

Ala

Phe

Glu

Ala

Ala

Lys

Ala

Ala

Asn Asn

Ala

Glu

Asn

Leu

195

220

220

Asn

Leu

Val

Gly

Leu

His

Cys

His

Val

Gly

Ser Gln

Val

Phe

Asp

Ala

210

215

220

Glu

Gly

Phe

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Arg

Val

Leu Gly

Leu

Tyr

Ser

Gln

225

230

223

22^

Ile

His

Ser

Glu

Leu

Gly

Val

Ala

Leu

Pro

Glu Leu

Asp

Leu

Gly

Gly

245

225

255

Gly

Tyr

Gly

Ile

Ala

Tyr

Thr

Ala

Ala

Glu

Glu Pro

Leu

Asn

Val

Ala

260

226

220

Glu

Val

Ala

Ser

Asp

Leu

Leu

Thr

Ala

Val

Gly Lys

Met

Ala

Ala

Glu

275

220

228

Leu

Gly

Ile

Asp

Ala

Pro

Thr

Val

Leu

Val

Glu Pro

Gly

Arg

Ala

Ile

290

295

300

Ala

Gly

Pro

Ser

Thr

Val

Thr

Ile

Tyr

Glu

Val Gly

Thr

Thr

Lys

Asp

305

310

331

330

Val

His

Val

Asp

Asp

Asp

Lys

Thr

Arg

Arg

Tyr Ile

Ala

Val

Asp

Gly

325

333

335

Gly

Met

Ser

Asp

Asn

Ile

Arg

Pro

Ala

Leu

Tyr Gly

Ser

Glu

Tyr

Asp

340

334

350

Ala

Arg

Val

Val

Ser

Arg

Phe

Ala

Glu

Gly

Asp Pro

Val

Ser

Thr

Arg

355

336

336

Ile

Val

Gly

Ser

His

Cys

Glu

Ser

Gly

Asp

Ile Leu

Ile

Asn

Asp

Glu

370

375

380

Ile

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Thr

Ser

Gly

Asp

Phe Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

385

390

335

4(^0

Thr

Gly

Ala

Tyr

Cys

Tyr

Ala

Met

Ser

Ser

Arg Tyr

Asn

Ala

Phe

Thr

405

440

415

Arg

Pro

Ala

Val

Val

Ser

Val

Arg

Ala

Gly

Ser Ser

Arg

Leu

Met

Leu

420

44^

430

Arg

Arg

Glu

Thr

Leu

Asp

Asp

Ile

Leu

Ser

Leu Glu

Ala

435

440

445

(2) INFORMACJA DLA SEK ID NR. 21:

(i)	CHRAKTERYSTYKA	SEKWENCJI·
(A	DŁUGOŚĆ. 20 zasad
(B)	TYP CZĄSTECZKI	: kwas nukleinowy
(C)	ŁAŃCUCHOWOŚĆ:	jednoniciowy

.Dl TOPOLOGIA. liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI· inny kwas nukleinowy (A) OPIS· syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY nie

190 430 (X L ) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR. 21:

AACCTCGTCA TGTTTGAGAA 20 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 22:

(1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 zasad (3) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (Cl LAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (Dl TOPOLOGIA: liniowa (ni TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NH: 22:

CCGGCCTACA AAATCGTGCA 20 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 23:

(l) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1331 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Ęscherichia coli (B) SZCZEP: JM 109 (ix> CECHY:

(A) NAZWA: CDS (sekwencja kodująca) (B) POZYCJA: 10..1197 (XI) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 23:

AACCTCGTC ATG TTT GAG AAC ATT ACC GCC GCT CCT GCC GAC CCG ATT 4 8

Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile 15 10

CTG

GGC

CTG

GCC

GAT

CTG

TTT

CGT

GCC

GAT

GAA

CGT

CCC

GGC

AAA

ATT

96

Leu

Gly 15

Leu

Ala

Asp

Leu

Phe 20

Arg

Ala

Asp

Glu

Arg 25

Pro

Gly

Lys

Ile

AAC

CTC

GGG

ATT

GGT

GTC

TAT

AAA

GAT

GAG

ACG

GGC

AAA

ACC

CCG

GTA

144

Asn 30

Leu

Gly

Ile

Gly

Val 35

Tyr

Lys

Asp

Glu

Thr 40

Gly

Lys

Thr

Pro

Val 45

CTG

ACC

AGC

GTG

AAA

AAG

GCT

GAA

CAG

TAT

CTG

CTC

GAA

AAT

GAA

ACC

192

Leu

Thr

Ser

Val

Lys 50

Lys

Ala

Glu

Gln

Tyr 55

Leu

Leu

Glu

Asn

Glu 60

Thr

ACC

AAA

AAT

TAC

CTC

GGC

ATT

GAC

GGC

ATC

CCT

GAA

TTT

GGT

CGC

TGC

240

Thr

Lys

Asn

Tyr 65

Leu

Gly

Ile

Asp

Gly 70

Ile

Pro

Glu

Phe

Gly 75

Arg

Cys

ACT

CAG

GAA

CTG

CTG

TTT

GGT

AAA

GGT

AGC

GCC

CTG

ATC

AAT

GAC

AAA

288

Thr

Gln

Glu 80

Leu

Leu

Phe

Gly

Lys 85

Gly

Ser

Ala

Leu

Ile 90

Asn

Asp

Lys

CGT

GCT

CGC

ACG

GCA

CAG

ACT

CCG

GGG

GGC

ACT

GGC

GCA

CTA

CGC

GTG

336

Arg

Ala 95

Arg

Thr

Ala

Gln

Thr 100

Pro

Gly

Gly

Thr

Gly 105

Ala

Leu

Arg

Val

GCT

GCC

GAT

TTC

CTG

GCA

AAA

AAT

ACC

AGC

GTT

AAG

CGT

GTG

TGG

GTG

384

Ala 110

Ala

Asp

Phe

Leu

Ala 115

Lys

Asn

Thr

Ser

Val 120

Lys

Arg

Val

Trp

Val 125

AGC

AAC

CCA

AGC

TGG

CCG

AAC

CAT

AAG

AGC

GTC

TTT

AAC

TCT

GCA

GGT

432

Ser

Asn

Pro

Ser

Trp 130

Pro

Asn

His

Lys

Ser 135

Val

Phe

Asn

Ser

Ala 140

Gly

CTG

GAA

GTT

CGT

GAA

TAC

GCT

TAT

TAT

GAT

GCG

GAA

AAT

CAC

ACT

CTT

480

Leu

Glu

Val

Arg 145

Glu

Tyr

Ala

Tyr

Tyr 150

Asp

Ala

Glu

Asn

His 155

Thr

Leu

190 430

GAT

CCT

GAA'

GCA

TTG

ATT

«AC

AGC

CTG

CCT

GCC

GCT

CA.G

GCT

GCG CC

GAC

520

Asp

Phe

Asp

Ala

Leu

Ile

Asn

Ser

Leu

Asn

Glu

da

Gln

da

Cly

Asp

200

165

170

GTA

GCG

CTG

ATC

GATT

GC

TGC

TGC

CTAT

CCC

CCAA

ACC

GCT

ATC

GGA

CCT

572

Val

Val

Leu

Phe

His

Gly

Gys

Cys

His

Asn

Pro

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

824

128

188

ACG

CTC

GCAA

AAA

TGG

CAA

ACTA

CTG

G(AA

CAC

CTC

TCC

GTT

GJAG

GGC

600

Thr

Leu

Glu

Gln

Trp

Gln

Thr

Leu

Ala

Gln

Leu

Ser

Val

Glu

Lys

Gly

200

195

200

205

TGG

TTA

cc:g

ATT

..τ

GAG

TTC

GCT

TAC

CGAG

ggt

TTT

GTC

CGT

GGT

CTG

602

Trp

Leu

Pro

Leu

Phe

Asp

Pl-h

Ada

Tyr

Gln

Gly

^^A

dc

Arg

Gly

Leu

280

205

200

GAA

GAA

GGA

GCG

GAAA

CGAC

CTG

CC

CT

TTC

CG

GGC

ATG

CAA?

CAAA

CGAG

720

Glu

Glu

Asp

Ala

Glu

Gly

Leu

Arg

Ala

Phe

Ala

Ala

Met

His

Lys

Glu

004

200

205

CTG

ATT

CCT

CC

AGT

TCC

TAC

TCT

«AA

CCC

ttt

cgg:

CTA

AAC

«AC

CGAG

720

Leu

Ile

Val

Ala

Ser

Ser

Tyr

Ser

Lys

Asn

Phe

Gly

Leu

Ayr

Asn

Glu

000

245

250

GGT

GTT

ggg

CG

TGT

ACT

CTG

GTT

CT

CC

CGAC

AGT

GC

ACC

GTT

AGAT

88^

Arg

Val

Gly

Ala

Gys

Thr

Leu

Val

da

Ala

Asp

Ser

Glu

Thr

Val

Asp

044

200

200

GC

GGC

TTC

ATT

AGA

Α^

AAG

CA

GGA

JTTT

CGC

ACT

AAA

AAC

TCT

AK

800

Arg

Ala

Phe

Ser

Gln

Met

Lys

da

da

Ile

Arg

da

Asn

Tyr

Ser

Asn

020

275

2Θ0

285

GTA

TCA

GCA

AAA

CCC

CT

TCT

GTT

GTT

CC

ACC

ATC

CCG

AGC

CAAC

AGAT

902

Pro

Pro

Ala

His

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Ala

Thr

Ile

Leu

Ser

Asn

Asp

000

295

300

GCG

CTA

CGT

GCG

ATT

tgg

CGAA

CCC

GAG

CTG

Acr

AGAT

ATG

CC

CAG

CGT

900

Ala

Leu

Arg

Ala

Ile

Trp

Glu

Gln

Glu

Leu

Thr

Asp

Met

Arg

Gln

Arg

004

302

30^

ATT

CAG

CGT

ATG

CGT

CACG

TTG

TTC

GTC

CCT

ACG

CTG

CAAG

'GAA

«AA

AGCC

uo a

Ile

Gln

Arg

Met

Arg

Gln

Leu

Phe

Val

Asn

Thr

Leu

Gln

Glu

Lys

Gly

000

325

330

GCA

AAT

CGC

cgac

TTC

AC

TTT

ATC

ATC

AAA

CAG

AAC

CGCC

ATG

TTC

TCC

1056

Ala

Asn

Arg

Asp

Phe

Ser

Phe

Ile

Ile

Lys

Gln

Asn

Gly

Met

Phe

Ser

004

340

305

AAG

AGT

CGCC

CTG

ACAC

«AC

GCAA

CAA

GTG

CTG

CGT

CTG

CGC

GJAA

CGAG

ttt

1104

Phe

Ser

Gly

Leu

Thr

Lys

Glu

Gln

Val

Leu

Arg

Leu

Arg

Glu

Glu

Phe

350

35A

360

365

GGA

GTA

TAT

CC3G

GTT

CT

TCT

CCCT

CGC

CTA

AAT

GTG

cc

GC

ATG

AAA

1152

Gly

Val

Tyr

Ala

Val

Ala

Ser

Gly

Arg

Val

Asn

Val

Ala

Gly

Met

Thr

020

375

380

GTA

GAT

TCC

ATG

GCT

GCG

CTG

TGC

CAA

CGG

ATT

GGG

CGGA

GTG

CTG

6267

Pro

Asp

Asn

Met

da

Poc

Lec

Cys

Glu

da

Ile

Val

da

Val

Leu

284 300 305

TAACCATTAT TACTCATGAA TGTGTTGAAT ΑGCGCGTTGC CACTGCTCAT AAACCGCAACCA 12 A 7 ATGGTTGATG GCTCTGCTTA TTACCTCTAT CTCTTCTCTA TAATATTTTC AATATTGCACCG 1322 ATTTCGTAGG TTGG 1302 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 24:

() CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

'A) DŁUGOŚĆ 396 aminokwasów i9) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (n) TYP CZĄSTECZKI białko !xl) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR 24

Met Phe Glu Asn Ile Chr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu 15 10 12

190 430

Ala

Asp

Leu

Phe 20

Arg

Ala Asp

Glu

Arg 25

Pro

Gly

Lys

Ile

Asn 30

Leu

Gly

Ile

Gly

Val

Tyr

Lys

Asp Glu

Thr

Gly

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Thr

Ser

35

40

45

Val

Lys

Lys

Ala

Glu

Gln Tyr

Leu

Leu

Glu

Asn

Glu

Thr

Thr

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Leu

Gly

Ile

Asp

Gly Ile

Pro

Glu

Phe

Gly

Arg

Cys

Thr

Gln

Glu

65

70

75

80

Leu

Leu

Phe

Gly

Lys

Gly Ser

Ala

Leu

Ile

Asn

Asp

Lys

Arg

Ala

Arg

85

90

95

Thr

Ala

Gln

Thr

Pro

Gly Gly

Thr

Gly

Ala

Leu

Arg

Val

Ala

Ala

Asp

100

105

110

Phe

Leu

Ala

Lys

Asn

Thr Ser

Val

Lys

Arg

Val

Trp

Val

Ser

Asn

Pro

115

120

125

Ser

Trp

Pro

Asn

His

Lys Ser

Val

Phe

Asn

Ser

Ala

Gly

Leu

Glu

Val

130

135

140

Arg

Glu

Tyr

Ala

Tyr

Tyr Asp

Ala

Glu

Asn

His

Thr

Leu

Asp

Phe

Asp

145

150

155

160

Ala

Leu

Ile

Asn

Ser

Leu Asn

Glu

Ala

Gln

Ala

Gly

Asp

Val

Val

Leu

165

170

175

Phe

His

Gly

Cys

Cys

His Asn

Pro

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Leu

Glu

180

185

190

Gln

Trp

Gln

Thr

Leu

Ala Girl

Leu

Ser

Val

Glu

Lys

Gly

Trp

Leu

Pro

195

200

205

Leu

Phe

Asp

Phe

Ala

Tyr Gln

Gly

Phe

Ala

Arg

Gly

Leu

Glu

Glu

Asp

210

215

220

Ala

Glu

Gly

Leu

Arg

Ala Phe

Ala

Ala

Met

His

Lys

Glu

Leu

Ile

Val

225'

230

235

240

Ala

Ser

Ser

Tyr

Ser

Lys Asn

Phe

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu

Arg

Val

Gly

245

250

255

Ala

Cys

Thr

Leu

Val

Ala Ala

Asp

Ser

Glu

Thr

Val

Asp

Arg

Ala

Phe

260

265

270

Ser

Gln

Met

Lys

Ala

Ala Ile

Arg

Ala

Asn

Tyr

Ser

Asn

Pro

Pro

Ala

275

280

285

His

Gly

Ala

Ser

Val

Val Ala

Thr

Ile

Leu

Ser

Asn

Asp

Ala

Leu

Arg

290

2 95

300

Ala

Ile

Trp

Glu

Gln

Glu Leu

Thr

Asp

Met

Arg

Gln

Arg

Ile

Gln

Arg

305

310

315

320

Met

Arg

Gln

Leu

Phe

Val Asn

Thr

Leu

Gln

Glu

Lys

Gly

Ala

Asn

Arg

325

330

335

Asp

Phe

Ser

Phe

Ile

Ile Lys

Gln

Asn

Gly

Met

Phe

Ser

Phe

Ser

Gly

340

345

350

Leu

Thr

Lys

Glu

Gln

Val Leu

Arg

Leu

Arg

Glu

Glu

Phe

Gly

Val

Tyr

355

360

365

Ala

Val

Ala

Ser

Gly

Arg Val

Asn

Val

Ala

Gly

Met

Thr

Pro

Asp

Asn

370

375

380

Met

Ala

Pro

Leu

Cys

Glu Ala

Ile

Val

Ala

Val

Leu

385

390

395

(2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 25:

(1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

;A) DŁUGOŚĆ: 2571 zasad ;B! TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy :c> LAŃCUCHOWOŚĆ dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA l'/ i i ŹRÓDŁO:

,A) ORGANIZM: Brevibacterium lactofermencum

190 430 (B) SZCZEP. ATCC I3369 (XI) OPIS SEKWENCJI. SEQ ID NO: 25:

^•0^0··: TTTTTCTTAC TGGGTOGGAG ACGTAACTAT CCGACGTTGCG TATCΑTTTCG 6

GTGa.aa.GG.ag TTGTTGAGGT TCTGTGGGΑG GATGA·^ GTGTCTCCGCA OGGCTCGGTO HO

TCAGTTACΑA COGTCOTGTT GTΑGCΑTTTT AGTTTTATTG CTCTA«GCTT OOGC.GATTCT 110

AAOGACTAGG CGOTGTTTTG OOTTACCGAG TOCTGCΑAGT T GGT CC CGAC CCC GATACATGCA 2Ί0

OTTGACGATG GTAΑTΑGTTO TTGTAOACGG GTOAAGAOCG AACT<TTCT(GA CCGGAAATCT 330

GTCGTGTCAG OΑTTTGGTTG TATCGTGTGG CTGTTTTTA<TC CCTCIAAACCC ATCCGAGAGT 3 60 .00^^000 TCGACACTCC σ^ΤΑ^Αυ GTCGCCT<TGT TCGGTCTCGAA TGCCTTTCCG 42 o

AACTTAOGAT TOOOTGAGAO CCAAGCCGCC CGAATACATG AAGACACCTAG TTGOTCGTCG 4 8 0

ΑΑTGTATACT OTTGGGTCGC TTTGGGΑGGΑ CAGGTTACGT (GA^C^C^CC^C^C^A GTGATTGoTT S^O

CCAACCCGCT CTOAAGTGTC GTTATAGCTT CCGCGCTTCG JACTCCTCCAG OGCGAAGGGT 660

GGOAGCGTGG TGGTTOTGGG TTCTGTTTΑT CCGATGACCC ACAACGTCGTT GAGGAGTGOG 660

ΑCTTTTGTTT GAGTGGGGGT TTGCTGTTTC GTTTCCTCTΑ CATTACCCCG 772 0

GTGTTTGCGT ATOTGGTGCA CTCCTCCAGT TTΑGTCΑTTC A(TGAATTJTC GGTGAGGGOT 770 TΑCTTTTGCT OGTTTGOGTO GAACACTTCG AGAGTAGTGG CTT<TCGGTCCA OTGC^T^C^T^T^C^G 8 40 •••^^00· CTGGGGGTGO CG·:....·· «2 <ACC<AC<OAT (G:C(T:TCGGTAC GOGGTTGTGA 9 00

TGTGΑTGTGT G0GT0CGTAT GTGTCCGAAT AATTTAA'TAG TCGGGTCCAA GAGGACATTA 9 6 6 ACOTGAATGT CTCTGATGTT AAGTOACAAC AATTCTG.AGT CGCGGTΑΑTC 1020

GTTTGTOTGG TGCGTGGTAT ·T0TΑTGATT ΑACC·TC·GG ΑTCTTC0TGG AAGGGCGATT 108O ·CACGTTTTC TTATTGTGOT TATG·0TG·A AGTC^AC^GG (00··^.·^ ATTGTTCGATA 114 0 ••OGACAGA· CTTTTTTTGT TTTA·TTT·T C·T0·TCTTC 00.(^0^70 GAGGGGGATT 12 0 O

GTCTGATGGT GAAGGGTGGG ···TΑCT·GA GCA GOT GGT C GTACOCTTTTT GG·GGTAACT 12 6 O

GTTTGTTG<TA TTTGTGT·OT AAGGACGCAA CTTGGΑAATG GTAC·GTCOO GTTCOGGGAT 1320

GTGATOGGGC TTTGTTGCGG CTGTΑTOT·· TCOTTGTTGT TTGGTACCCG GTGCAAATGA 138 0 .•^^.0^ OOOGTGTΑTG GCGGCGT··G TTGCAGTTGG AGAGGATOTT CG.GGGGAGCGG 144 O

TOC·GCTTT· CT·TOTTT·A TTTGOGGATT TAΑTGTTCT T AΑTTGTCTT T GGgGaAGTOG 15 00

GATΑATTCGG TAΑAT·TCTT TOΑTTAO.CTT OTTGGTTTT T .0(^.0..06 15 60 TGTGOGTTTT CGATGCTCTG ACCGG.TGalGT TCCCT<TCC:CT CTCTCtACTCTC GTGGGGCTTG 1^2 O

T·GCTT0GG0 GGT·AAOTOT AGATG···:· G^^C^G^C?CA^C: CGCOAAOGCO AAGATCACTC 1680 ·TT0TGτGT0 GTTCTTT·TT GGTGGTATGA TTGTGGGGAA GAAOTTAATT TGGGACOTT T 17 4 0

TTOG·GCTTT CCTOTGTTTT CT·TGGGG·G AAGCAGG:^,GGC CTGGTTCGTT CΑTGTGGTC· 18 0 0

G0T··GTGGG CTGTGCGGTA G·GGGGTOGT TTGGCrGGAA TGOCAGGTGGG TTGTTTTTTT 1860

GGAGGCTGAC TAAGTTTG·T TAGA·OGTTT ATTCTCGGCG CGGOGTGTAG TTTGTOTOTO 1920

GG·TTAGTT· TOTTGGTTTG TTT·ATTTGG TTGCCCT·^ 0^.^..00 TTTGTGTGC· 19 0 0

GTOTTGTTTG TTAG··GTG· ACGGGAGGOT «ATTGG2GTT 0TATττT·CG TTTTOT·OCT 2 0 0 0

GOTTTTTGGT CGAGGATGGG ACCTCCGTTT 6^^00..0 TTGGTGTOCG 2100 ··TAGTAAGT TGAGTGTTGT GGTTGGTTGT TTGrTACGTG TGG’CGGCGTG TGGTTTTGTT 2160

GTGGTTCTTT TCTTTGTCTG TACGATTTGT GτCGCCTCGGCC ATTCGGGTTAc TTGGGTGGGG 222 0

GTGTGCTCTG TGGAGGGTGA GOGTTTTTTG «2GTTTCA.G TCGTCGTTGA GCGTGCTTAT 2280

GATGAGTGAG TTTGTGGGGT «JGCGGAGCA ACACCCCTT:JCJC:AC TTGTGOGGGG 2020

GGΑTTOTGTT AAATTGTGTG GGTTTTAGGT αΑαΑΤΤΤΤΑΓ. «AOGGGCAG TTTTGATGTG 2 000 • 000.^0^ TTTTGTOTGT TGTATGGTGT «AACQ.T«2 TGTOCGGCAGG TGTOOTGTOT 2 0 00

GTOCAAGTGT CTAOTGAGTO TCGGGGGCTT CCOCTGOATG CCCCACCGGG GOGGCTT 2517 (2) informacja dla sek ID NR 22(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ- 23 zasad

13) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ. jednoniciowy (D) TOPOLOGIA, liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI- inny kwas nukleinowy IA) OPIS· syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: sek ID NR 26:

gatcaacgga cggttggagc ATT 23 (2) INFORMACJA DLA sek ID NR: 27:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

190 430 (A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (3) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (□) TOPOLOGIA. Liniowa (ll) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (XI) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 270:

GGTATTCACT CTAGCTAGCG TAG 2 3 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 23:

(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (3) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (□) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS, syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEk ID Nr: 23:

GAGCTCAAGT CAAAAAATCT GAA 2 3 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 29:

(1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (3! TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (Xl) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 29:

GATCTGTCCC GGTTGGGCAT GCA 23 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 30:

(l) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI;

(A) DŁUGOŚĆ: 2517 zasad

IB) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Brevibactenum lactofermentum (B) SZCZEP: ATCC 13869 (XI) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 30:

GATCAGCTTC

TTTAAACGAC

GAAGCGATCA

AACCACTACA

CTCTAAAACA

TCAGGCCAAT

ACCGAAGCCC

AAACCACAAC

AAGTGAGAAG

CCAACCCGCG

TGCAACGCAT

GGGTGTTGAA

TTGGTGATGT

ACGGACGGTT

TTCTGCGGTG

GGAAGAGCCC

CAGTTTTGGT

GCGAAACTCT

GCCCCGAAAC

CTGGTTTAGT

TTCCAGGCGA

GGCTGCTTTG

GGGGCCGAAT

GTTGGCGTAT

GGAGCATTTG

CCTTATCCAT

CTTTACAAGC

CATATGGGAT

GTGTTCGTTG

CCAAAACTCC

TTGCGGAGGA

GCGACATAGG

TTCTGGGGAT

AAGGAACTCG

TTCGATGTTG

CGTGGGATTG

TCAGGGCAGT

GGCAAGACCA ggtttttaga

GTCGCCTGGT

CCAATACATG

TAGGGGATTT

CCGCTAGTCG

TAGATTACAC

CGCAGTTGGG

GTGTCTCCAA

CTCTAGGTTT

TGGTCCATAA

AACTGGGTGA

CCTCGAAACC

TCGGTCTCAA

AAAAAACCAG

GAACCCCTGA

AATCCTCCAG

AAAAGTCGTT

TCGTAGTTTG CGGTCCGGTC CCGTAATTTG GATCAATGCA CCGAAAATCT ATCCCATATG TGCCTTGCCG CTTCCCACCG GGGATTGCTC CTAGAACGGC TAGAAACTCA

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

190 430

AATCCGCTCG CAGTTGGCGT TTTCTGGGGC GGTTCAGCTA GAGTTATGCG AAGGATCCCG 720 TGCGGCGTTT ATCTTGTGAA CTCCCCCAGG GCAGGAATGC AGCAAGGGTC AGCGAGCTCT 780 GACGGGTGCG CGGGGTCCCC TAAAACGTCT AGAGTAGTGG CTTGAGGTCA CTGCTCTTTT 840 TTTGTGCCCT TTTTTTGGTC CGTCTATTTT GCCACCAC ATG CGG AGG TAC GCA 893

Met Arg Arg Tyr Ala 1 5

GTT

ATG

AGT

TCA

GTT

TCG

CTG

CAG

GAT

TTT

GAT

GCA

GAG

CGA

ATT

GGT

941

Val

Met

Ser

Ser

Val 10

Ser

Leu

Gln

Asp

Phe 15

Asp

Ala

Glu

Arg

Ile 20

Gly

CTG

TTC

CAC

GAG

GAC

ATT

AAA

CGC

AAG

TTT

GAT

GAG

CTC

AAG

TCA

AAA

989

Leu

Phe

His

Glu 25

Asp

Ile

Lys

Arg

Lys 30

Phe

Asp

Glu

Leu

Lys 35

Ser

Lys

AAT

CTG

AAG

CTG

GAT

CTT

ACT

CGC

GGT

AAG

CCT

TCG

TCG

GAG

CAG

TTG

1037

Asn

Leu

Lys 40

Leu

Asp

Leu

Thr

Arg 45

Gly

Lys

Pro

Ser

Ser 50

Glu

Gln

Leu

GAT

TTC

GCT

GAT

GAG

CTG

TTG

GCG

TTG

CCT

GGT

AAG

GGC

GAT

TTC

AAG

10 8.5

Asp

Phe 55

Ala

Asp

Glu

Leu

Leu 60

Ala

Leu

Pro

Gly

Lys 65

Gly

Asp

Phe

Lys

GCT

GCG

GAT

GGT

ACT

GAT

GTC

CGT

AAC

TAT

GGC

GGG

CTG

GAT

GGC

ATT

1133

Ala 70

Ala

Asp

Gly

Thr

Asp 75

Val

Arg

Asn

Tyr

Gly 80

Gly

Leu

Asp

Gly

Ile 85

GTT

GAT

ATT

CGT

CAG

ATT

TGG

GCG

GAT

TTG

CTG

GGT

GTT

CCT

GTG

GAG

1181

Val

Asp

Ile

Arg

Gln 90

Ile

Trp

Ala

Asp

Leu 95

Leu

Gly

Val

Pro

Val 100

Glu

CAG

GTG

CTG

GCG

GGG

GAT

GCT

TCG

AGC

TTG

AAC

ATC

ATG

TTT

GAT

GTG

1229

Gln

Val

Leu

Ala 105

Gly

Asp

Ala

Ser

Ser 110

Leu

Asn

Ile

Met

Phe 115

Asp

Val

ATC

AGC

TGG

TCG

TAC

ATT

TTT

GGT

AAC

AAT

GAT

TCG

GTT

CAG

CCT

TGG

1277

Ile

Ser

Trp 120

Ser

Tyr

Ile

Phe

Gly 125

Asn

Asn

Asp

Ser

Val 130

Gln

Pro

Trp

TCG

AAG

GAA

GAA

ACT

GTT

AAG

TGG

ATT

TGT

CCT

GTT

CCG

GGA

TAT

GAT

1325

Ser

Lys 135

Glu

Glu

Thr

Val

Ly3 140

Trp

Ile

Cys

Pro

Val 145

Pro

Gly

Tyr

Asp

CGC

CAT

TTC

TCC

ATC

ACG

GAG

CGT

TTC

GGC

TTT

GAG

ATG

ATT

TCT

GTG

1373

Arg 150

His

Phe

Ser

Ile

Thr 155

Glu

Arg

Phe

Gly

Phe 160

Glu

Met

Ile

Ser

Val 165

CCA

ATG

AAT

GAA

GAC

GGC

CCT

GAT

ATG

GAT

GCT

GTT

GAG

GAA

TTG

GTC

1421

Pro

Met

Asn

Glu

Asp 170

Gly

Pro

Asp'

Met

Asp 175

Ala

Val

Glu

Glu

Leu 180

Val

AAG

GAT

CCG

CAG

GTT

AAG

GGC

ATG

TGG

GTT

GTG

CCG

GTA

TTT

TCT

AAC

1469

Lys

Asp

Pro

Gln 185

Val

Lys

Gly

Met

Trp 190

Val

Val

Pro

Val

Phe 195

Ser

Asn

1517

CCG

ACT

GGT

TTC

ACG

GTG

TCG

GAG

GAC

GTC

GCA

AAG

CGT

CTG

AGC

ACG

Pro

Thr

Gly 200

Phe

Thr

Val

Ser

Glu 205

Asp

Val

Ala

Lys

Arg 210

Leu

Ser

Thr

ATG

GAA

ACT

GCG

GCG

CCG

GAC

TTC

CGC

GTG

GTG

TGG

GAT

AAC

GCT

TAC

1565

Met

Glu 215

Thr

Ala

Ala

Pro

Asp 220

Phe

Arg

Val

Val

Trp 225

Asp

Asn

Ala

Tyr

GCC

GTT

CAT

ACT

CTG

ACC

GAT

GAG

TTC

CCT

GAG

GTC

ATC

GAC

ATC

GTT

1613

Ala 230

Val

His

Thr

Leu

Thr 235

Asp

Glu

Phe

Pro

Glu 240

val

Ile

Asp

Ile

Val 245

GGG

CTT

GGT

GAG

GCG

GCG

GGT

AAC

CCG

AAC

CGT

TTC

TGG

GCG

TTC

ACT

1661

Gly

Leu

Gly

Glu

Ala 250

Ala

Gly

Asn

Pro

Asn 255

Arg

Phe

Trp

Ala

Phe 260

Thr

TCT

ACT

TCG

AAG

ATC

ACT

CTC

GCG

GGT

GCG

GGC

GTG

TCC

TTC

TTC

ATG

1709

Ser

Thr

Ser

Lys 265

Ile

Thr

Leu

Ala

Gly 270

Ala

Gly

Val

Ser

Phe 275

Phe

Met

ACT

TCT

GCG

GAG

AAC

CGT

AAG

TGG

TAC

TCC

GGT

CAT

GCG

GGT

ATC

CGT

1757

190 430

Thr

Ser

Ala 280

Glu

Asn

Arg

Lys

Trp 285

Tyr

Ser

Gly

His

Gla 290

Gly

Ile

Arg

GGC

ATT

GGC

CCT

AAC

GAG

GTC

AAT

CAG

TTG

CCT

CAT

Gd

GTC

GCC

TTT

Gly

Ile

Gly

Pro

Asn

Lys

Val

Asn

Gln

Leu

Ala

His

Gla

Arg

Tyr

Phe

295

300

305

GGC

GAT

GC’

GAG

GGA

GTG

CGC

GCG

GTG

ATG

GTC

AGG

CAT

CTC

CG C

TCG

Gly

Asp

Ala

Glu

Gly

Val

Arg

Ala

Val

Met

Arg

Lys

His

ALa

Ala

Ser

310

315

330

335

TTG

GCT

CCG

CGAG

TTC

AAC

AAG

GTT

CTG

GAG

ATC

CTG

GAT

TCC

Cd

CTT

Leu

Ala

Pro

Lst

Phe

Asn

Lys

Val

Leu

Glu

Ile

Leu

Asp

Ser

Arg

Llu

330

335

340

GCT

GAG

TAC

GG’

GTC

GCG

CCAG

TGG

ACT

GTC

CCT

dG

GGC

GTC

ACC

TTC

Ala

Glu

Tyr

Gly

Val

Ala

Gln

Trp

Thr

Val

Pro

Gla

Gly

Gly

Tyr

Phe

345

350

335

ATT

TCC

CTT

<GAT

GTG

GTT

CCT

GGT

ACG

GCA

TCT

CGT

TCT

dC

GGG

TTG

Ile

Ser

Leu

Asp

Val

Val

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Arg

Val

Ala

Glu

Leu

360

365

370

GCT

AAG

GAA

GCC

Gd

ATT

CCG

TTG

ACG

dT

CC CG

TGΓ

TCT

CTT

GCC

CCG

Ala

Lys

Glu

Ala

Gly

Ile

Ala

Leu

Thr

Gly

Ala

Gly

Ser

Ser

Tyr

Pro

375

330

385

CGT

CCAG

CGAT

CCG

GAG

AAC

AAG

AAC

(CTC

CTC

TTG

GCG

dC

CTC

CTG

Leu

Arg

Gln

Asp

Pro

Glu

Asn

Lys

Asn

Leu

Arg

Leu

Gla

PPr

Ser

Leu

390

395

400

405

CCT

CCT

GTT

(A^G

GGA

CTT

(GAG

GTT

(GCC

ATG

ATC

dC

GTG

dC

ACG

TGT

Pro

Pro

Val

Glu

Glu

Leu

Glu

Val

Ala

Met

Gsp

Gly

Val

Gla

Thr

Cys

410

415

420

GTT

TTG

CCG

cgc

dT

dG

AGG

CCC

GAC

GCT

Ad

CATGGTGGGC' GCCTCTGGG^A

Val

Llu

Leu

Ala

Ala

U1g

GGu

Gis

is c

Ala

Ser

425

430

TCTCATACCG TGTCGACTTC TTdTdCd GTCTGCC<TTT GT·C·C’TGC<::CGT TCCTTCTTTC TTAAGGCTTC TTGCTGTGTG CTTGATGATG AGTCAATTd GTGTTCTGTC AATCCCTTGT GCTCCGGTAT TGTCTCTGCT ACTATATCAA ddCCGGAAC CSTCCG.TGTG TTGGTCTGGG TCCCGATCTC TTTTGGGGCT GAGGTTTCTG T dCTGGdG CdCGTCGd TTTTTCTCGG CAGCGTTCTT TGGTTTTTTT CTCTCCTTCA AATCTATATC CCGGTCCCAGT GCTGTCTTCA CTCATGTCTA GTTTGGGTGT ATC i 2) INFORMACJA DLA SEK ID H: 31.

(1, CHRAKTERISTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 432 aminokwasów IB) TYP CZĄSTECZKI aminokwas (0> TOPOLOGIA: liniowa

1805

1853

1901

1949

1997

2045

2093

2141

2194

2254 2314 2 :37 4 2434 24 94 2 51.7

(11! (xi)

TY? OPIS

CZĄSTECZKI: SEKWENCJI:

białko

. 31

SEK

ID NR

Met

Arg

Arg

yr c

U 8

al 8

et c

ee c

er 8

Vu 8

er 8

eu c

ll c

ss c

pe c

spp

1.

5

11

11

Gla

Glu

Arg

Ile

Gly

Leu

Phe

His

Glu

Asp

Ile

Lys

Arg

Lys

Phe

Asp

20

22

30

Glu

Leu

Lys

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Leu

Gsp

Leu

Thr

Arg

Gly

Lys

Pro

35

44

44

Ser

Ser

Glu

Gln

Leu

Gsp

Phe

Gla

Gsp

Glu

Leu

Leu

Gla

Leu

Pro

Gly

50

55

66

Lys

Gly

Gsp

Phe

Lys

ALa

ALa

Asp

Gly

Thr

Asp

Val

Arg

Asn

Tyr

Gly

65

70

77

80

Gly

Leu

Gsp

Gly

Ile

Val

Asp

He

Arg

Gln

Ile

Trp

ALa

Asp

Leu

Leu

85

99

99

Gly

Val

Pro

Val

Glu

Gln

Val

Leu

Ala

Gly

Gsp

Ala

Ser

Ser

Leu

Asn

100

115

110

Ile

Met

Phe

Gsp

Val

Ile

Ser

Trp

Ser

Tyr

Ile

Phe

Gly

Asn

Asn

Gsp

190 430

995

112

125

Ser

aaa

GUn

Pro

Trp

Ser

Llc

Clu

nnu

Tho

Val

Llc

Tta>

Ile

Cys

Por

130

113

114

Val

Pro

GUy

Tyr

Asp

Arg

HHi

POt

Seo

IIa

UCh

Glu

Aog

POt

GUy

Oh.

905

110

115

119

Glu

Met

IIe

Ser

Val

Ppo

Met

Uas

Glu

Ass»

AUy

Pro

Asp

Met

Ass

AAn

960

m

175

VaU

Glu

Clu

Luu

Vil

Lys

Asp

Pro

Gln

viu

Lys

Gly

Met

Top

Val

Vil

980

118

119

Poo

Vil

Phe

Ser

Asn

Pro

GTo

Cly

Phr

TTh

Val

Ser

Clu

Asp

Val

Ali

195

200

205

Lys

Arg

Luu

Ser

Thr

Met

Glu

Thr

Ali

Cli

Pro

Ass

0he

Arg

Val

Val

299

221

222

Top

Asp

CGn

Cli

Tyr

ALa

Val

Ηί3

TTh

Luu

UCr

Asp

Glu

Phe

Poo

UTi

225

220

223

224

Val

Ilu

Ass

lie

Val

Gly

Leu

Gly

nau

AAa

UAa

nic

Asn

Pro

Ass

Arg

000

220

255

PTr

Top

JGa

Phe

Thr

Ser

Thr

Ser

Llc

Iie

Thr

Leu

AAa

ATy

AAn

U Tyr

290

229

227

ViU

Suh

Phe

Phe

Met

Thr

Ser

0Aa

GUu

Asn

AArg

Lys

Tta

Ttc

Ter

U Tyc

275

22σ

285

His

All

Giy

Ile

Arg

Gly

Ile

Gly

Pro

Asn

Lys

Vai

Asn

Gln

Leu

ALa

290

295

330

His

Ala

Arg

Tyr

Phe

Gly

Asp

CA.a

TUu

Gly

Val

Arg

Ali

Val

Met

Arg

305

310

331

330

Lys

His

ALa

GULa

Ser

Leu

Ala

Pro

Lys

Phe

(Am

Lys

Vil

Leu

GUu

Uli

325

330

335

Luu

Asp

Ser

Ghcg

Leu

(ALa

Glu

Tyr

Gly

ViU

Ala

Gln

Tta

TGr

Aal

Pro

340

335

335

All

TUc

Gly

Tyr

Phe

He

Ser

Leu

0A>p

Vil

aićil

Pro

Gly

UCr

TAll

Ser

355

360

365

Arg

Val

Ala

Glu

Luu

Ala

Lys

TUu

Ala

Gly

lie

Aa

Luu

TTh

Tly

ALa

370

375

330

nly

Sro

Ser

Tyr

Poo

Leu

Arg

Gln

Asp

Pro

Glu

Asn

Lys

Asn

Leu

Arg

385

390

395

40 0

Luu

All

Poo

Ser

Luu

Pro

Pro

Val

nnu

Glu

Leu

Glu

Vil

Ali

Met

Asp

005

410

415

Gly

Val

Ali

Thr

Cys

Vil

Leu

Leu

Ala

Ala

ALa

lUu

His

Tyr

Ala

Ser

OO0

44^5,

440

100 430

190 430

Miejsce klonowania dapB (pCRScrip

PCR

BamHI KpnI

Brevi.-ori

7ZZZZZZZZZ2 pHK4

Klonowanie typu TA

Trawienie KpnI

I

Tworzenie tępych końców

Ligacja linkera BamHI

Ψ

Trawienie BamHI

Trawienie BamHI

FIG. 2

190 430

Miejsce klonowania

Klonowanie typu TA

BamHI KpnI pHK4

I

Trawienie Smal

Trawienie BamHI, KpnI

I

Tworzenie tępych końców

I

Ligacja linkera Smal i

Trawienie Smal

FIG. 3

190 430

V

Trawienie BamHI, KpnI

Ϋ

Trawienie BamHI, KpnI

FIG. 4

190 430

FIG. 5

190 430

Tworzenie tępych końców

Ligacja linkera EcoRI

i

Trawienie EcoRI V

FIG. 6

190 430

EcoRV Sphl k p399DPR

FIG. 7

190 430

Trawienie BamHI ί

Tworzenie tępych końców i

BamHI KpnI

Brevi.-ori

FIG. 8

190 430

EcoRI

Sali lysC

p399AK9

Trawienie Sali

Trawienie EcoRI, SphL i

Ϋ Y EcoRI

Tworzenie tępych korófów ^{Tworzenie tępych końców}

T /' Saci

-KpnI

BamHI

Sacl

Brevi.-ori Trawienie Spel

Y

..... λ Tworzenie tępych końców pHK4 ) ψ .Trawienie Sacl

Trawienie EcoRI, ł

Tworzenie tępych końców j

Trawienie Sacl

Trawienie BamHI

Tworzenie tępych końców

Ligacja linkera KpnI

Ψ

Trawienie KpnI

Ligacja ψ Sacl

KpnI

FIG. 9

190 430

Hpal

BamHI *P^nl f p299LYSA J) dapA dapB / Brevi.-ori

lysC

Trawienie BamHI, KpnI

I

Tworzenie tępych końców

Trawienie Hpal

Y

Tworzenie tępych końców

dapA dapB 'ysA

Brevi.-ori

FIG. 10

190 430

I.

Trawienie HindIII

Tworzenie tępych końców

Trawienie Avall

I ..

Tworzenie tępych końców

Ligacja

FIG. 11

190 430

Klonowanie typu TA

I

EcoRI

3revi.-ori(pAM330) f pVK7

EcoRI_EcoRI

Trawienie EcoRI

Trawienie EcoRI

FIG. 12

190 430

ORF1 <ORF2

ATCC 13869 Chromosomalny DNA Fragment (2517 bp)

FIG. 13

I

Trawienie EcoRl

Trawienie EcoRl

FIG. 14

190 430

Ligacja ł

BamHI KpnI

Brevi. -ori pHKó

Smal/Nrul EcoRI Ba mH I-yJ ' K ( Ρ399ΑΚΫ t (p399AK9) ł

Trawienie BamHI ł

Trawienie BamHI, KpnI ł

Tworzenie tępych końców ł

Ligacja linkera BamHI i

BamHI-^-^^rna’^/Nru^ EcoRI

Trawienie BamHI

BamHI

FIG. 1

Bravi. -ori p399AKYB (p399AK9B)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zl.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, obejmujący sekwencję DNA kodującą aspartokinazę charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę, i sekwencję DNA kodującą reduktazę dihydrodipikolinianową sekwencję DNA kodującą syntezę dihydrodipikolinianową sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimeliniarową oraz sekwencję DNA kodującą aminotransferazę asparagimanową, przy czym aspartokinaza charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L--reoninę jest zmutowana. aspartokinazą pochodzącą z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasowa odpowiadająca 279 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 zmieniona jest na resztę treoninową w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasowa odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej przedstawionej nr 7 zmieniona jest na resztę treonmową w podjednostce beta.
2. 2. Zrekombinowany DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA kodująca reduktazę dihydrodipikolinianową koduje sekwencję aminokwasowa nr 11 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samąjak sekwencja aminokwasowa nr 11.
3. 3. Zrekombinowany DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA kodująca syntazę dihydrodipikolinianową koduje sekwencję aminokwasową nr 15 lub sekwencję aminokwasową. zasadniczo takąsamajak sekwencja aminokwasowa nr 15.
4. 4. Zrekombinowany DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA kodująca dekarboksylazę diaminopimelinianową koduje sekwencję aminokwasowi nr 20 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo takąsamąjak sekwencja aminokwasowa nr 20.
5. 5. Zrekombinowany DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA kodująca aminotransferazę aspeiragimanową koduje sekwencję aminokwasową nr 24 albo 31 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo takąsamajak sekwencja aminokwasowa nr 24 albo 31.
6. 6. Bakteria maczugowata niosąca aspartokinazę charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę oraz zawierająca wzmocnioną sekwencję DNA kodującą reduktazę dihydrodipikolinianową, wzmocnioną. sekwencję DNA kodującą syntazę dihydrodipikolinianową, wzmocnioną sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimelinianową oraz wzmocnioną sekwencję DNA kodującą aminotransferazę asparaginianową przy czym aspartokinaza charakteryzująca się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L- treoninę jest zmutowaną aspartokinazą pochodzącą z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasowa odpowiadająca 279 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 zmieniona jest na resztę tr^torni^no^^^ą w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasowa odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej przedstawionej nr 7 zmieniona jest na resztę treonmową w podjednostce beta.
7. 7. Bakteria maczugowata według zastrz. 6, znamienna tym, że jest stransfonnowana poprzez wprowadzenie zrekombinowanego DNA z zastrz. 1.
8. 8. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, że hoduje się bakterię maczugowata z zastrz. 6 w pożywce odpowiedniej do wytwarzania i akumulacji L-lizyny w hodowli bakteryjnej, a następnie wyodrębnia się L-lizynę z hodowli.
9. 9. DNA kodujący białko obejmujące sekwencję aminokwasową nr 31.
10. 10. DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową od pozycji 879 do pozycji 2174 w sekwencji nukleotydowej nr 30.

    190 430