JP5698001B2 - アミノ酸の製造法 - Google Patents
アミノ酸の製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5698001B2 JP5698001B2 JP2010550524A JP2010550524A JP5698001B2 JP 5698001 B2 JP5698001 B2 JP 5698001B2 JP 2010550524 A JP2010550524 A JP 2010550524A JP 2010550524 A JP2010550524 A JP 2010550524A JP 5698001 B2 JP5698001 B2 JP 5698001B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- sequence
- dna
- aspartate aminotransferase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 79
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 claims description 75
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 63
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 38
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 11
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 10
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 9
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 8
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 4
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 280
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 128
- 101150005925 aspC gene Proteins 0.000 description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- 101100492609 Talaromyces wortmannii astC gene Proteins 0.000 description 28
- 101150116772 aatA gene Proteins 0.000 description 28
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 101150089004 argR gene Proteins 0.000 description 15
- 101150068263 putA gene Proteins 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 12
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 101100163308 Clostridium perfringens (strain 13 / Type A) argR1 gene Proteins 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 101150072344 argA gene Proteins 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 101150046501 proB gene Proteins 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000005133 Glutamate 5-kinase Human genes 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108700023479 Glutamate 5-kinases Proteins 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 5
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108010032178 Amino-acid N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 3
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- -1 ethanol and glycerol Chemical compound 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 3
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102000007610 Amino-acid N-acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 241001134763 Corynebacterium flavescens Species 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001013691 Escherichia coli BW25113 Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 101710198928 Gamma-glutamyl phosphate reductase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N N-Ethyl-N-nitrosourea Chemical compound CCN(N=O)C(N)=O FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 108010024239 aromatic amino acid aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N levan Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(CO[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011181 potassium carbonates Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
- C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
- C12Y206/01001—Aspartate transaminase (2.6.1.1), i.e. aspartate-aminotransferase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性が低下又は喪失し、かつアミノ酸を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を用いたアミノ酸の製造法に関する。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼはオキサロ酢酸とグルタミン酸からアスパラギン酸を生成する酵素である。大腸菌においてオキサロ酢酸とグルタミン酸からアスパラギン酸を合成する酵素としては他に芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼの存在が知られているが主としてアスパラギン酸の合成はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼにおいて行われていると考えられている（非特許文献１）。
エシェリヒア属の微生物のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、その生化学的性質が知られており、当該酵素をコードするaspC遺伝子も知られている（非特許文献２）。また、エシェリヒア属の微生物のaspC遺伝子を過剰発現させることによってＬ−アミノ酸の生産性を改善できることが知られている（特許文献１、２）。
生体のタンパク質はα−アミノ酸のポリマーであるが、基本的にＬ−アミノ酸が構成成分となっている。Ｌ−アミノ酸は、生体の構成成分としての重要性に加え、それ自体が生理活性又は薬理活性を示したり、呈味効果又は栄養効果を示すものも多く、医薬や食品などとして、さまざまな用途が開発されている。
しかし、これまでＬ−アミノ酸の発酵生産において、aspC活性を低下又は喪失させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産効率を向上させることができることを記載及び示唆した報告はない。
Escherichia coli and Salmonela, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C., 1996
Kondo K. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1984; 122(1):62-7
本発明が解決しようとする課題は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供すること等である。
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物では、Ｌ−アミノ酸の生産効率が向上されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［６］に関する。
［１］Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
［２］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを欠損した微生物である、［１］記載のＬ-アミノ酸の製造法。
［３］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（３）より選ばれる蛋白質である、［１］又は［２］記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
［４］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（３）より選ばれるＤＮＡにコードされる、［１］又は［２］に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］微生物がエシェリヒア属に属する微生物である、［１］〜［４］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
［６］Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸である［１］〜［５］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［６］に関する。
［１］Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
［２］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを欠損した微生物である、［１］記載のＬ-アミノ酸の製造法。
［３］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（３）より選ばれる蛋白質である、［１］又は［２］記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
［４］アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（３）より選ばれるＤＮＡにコードされる、［１］又は［２］に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］微生物がエシェリヒア属に属する微生物である、［１］〜［４］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
［６］Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸である［１］〜［５］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
本発明により、従来よりもＬ−アミノ酸の生産効率が向上した微生物によるＬ−アミノ酸の効率的な生産が可能となり、医薬や健康食品などの分野で様々な用途が存在するＬ−アミノ酸を、効率よく提供することが可能となる。
１．アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性が親株に比べ低下又は喪失した微生物の作製
本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供する。したがって、本発明の製造法に用いられる微生物は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する微生物の、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることにより得ることができる。
本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供する。したがって、本発明の製造法に用いられる微生物は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する微生物の、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることにより得ることができる。
本発明における親株とは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する微生物であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された株でもよく、また親株はＬ−アミノ酸を生成する能力を有していてもよいし、有していなくてもよい。親株が有するＬ−アミノ酸を生成する能力は、該親株が元来有するものであっても良いし、後述する方法によって人工的に付与されるものであっても良い。親株がＬ−アミノ酸を生成する能力を有していない場合、該親株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることに加え、後述する方法によってＬ−アミノ酸を生成する能力を人工的に付与することにより、本発明の方法で用いられる微生物を取得することができる。
親株としては、例えば、Neidhardt, F.C.らにより記載されている細菌（Escherichia coli and Salmonella, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996, (1201ページ、Table 1)）をあげることができる。好ましくは、例えば、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属等に属する細菌を挙げることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラー又はストレプトミセス・リビダンスを挙げることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリを挙げることができる。
Ｌ-アミノ酸を生成する能力を有する微生物は、公知の方法により親株を改良し、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を人工的に付与することにより取得することができる。該公知の方法としては、
（ａ）Ｌ−アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）Ｌ−アミノ酸の生合成経路から該Ｌ−アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）親株に比べ、Ｌ−アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972)及びAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979)及びJ. Bacteriol., 110, 761-763 (1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993)及びAgric. Biol. Chem., 39, 371-377 (1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Microbiol., 38, 181-190 (1979)及びAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778 (1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684 (1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116 (1977)、Agric. Biol. Chem. , 37, 2013-2023 (1973)及びAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094 (1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を取得することができる。
（ａ）Ｌ−アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）Ｌ−アミノ酸の生合成経路から該Ｌ−アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）親株に比べ、Ｌ−アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972)及びAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979)及びJ. Bacteriol., 110, 761-763 (1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993)及びAgric. Biol. Chem., 39, 371-377 (1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Microbiol., 38, 181-190 (1979)及びAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778 (1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684 (1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116 (1977)、Agric. Biol. Chem. , 37, 2013-2023 (1973)及びAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094 (1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を取得することができる。
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか又は組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の育種方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の育種方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153 (1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283 (1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023 (1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092及び特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を取得することができる。
本発明におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、具体的には配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質であり得る。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列とは、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個、１〜５個、３個、２個又は１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり得る。
配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列とは、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％、９８％又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。アミノ酸配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とすることができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。
本発明の製造法に用いられる微生物において、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失していることは、当該分野で公知の方法にしたがって測定することができるが、例えば、本発明の製造法に用いられる微生物及び親株それぞれについて、J Bacteriol., 130(1), 429-40 (1977)に記載の方法によりアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性を測定し、それらを比較することにより確認できる。
本発明の製造法に用いられる微生物は、例えば、親株を通常の突然変異処理法、組み換えＤＮＡ技術等による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは、形質導入法等の、微生物に変異を導入することのできる方法、又はアンチセンス法等のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制できる方法等に供することよって製造することができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、エチルニトロソウレア、ベンゾピレン、アクリジン色素等による処理、及び紫外線照射法等をあげることができる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も変異原として用いることができる。変異原を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書店） 日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genet.), 314 (2000)等に記載の方法が用いられ得る。
組み換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、aspCのＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、又は付加を導入し、相同組み換え等により該ＤＮＡを親株の染色体に組み込み、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを置換する方法をあげることができる。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとしては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであればいずれでもよく、例えば、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。aspCのＤＮＡとしては例えば、GenBank/EMBL/DDBJ Accession NC000913. 2, gi:49175990の配列の983741から984931番目までの塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
あるいは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであり得る。ストリンジェント条件下とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡはまた、配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであってもよい。好ましくは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とし得る。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、公知のエシェリヒア・コリ由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列情報に基づいて、ＰＣＲ法等により取得することができる。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、又は付加を導入する方法としては、例えば、Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。
また、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）中に薬剤耐性を付与する遺伝子を挿入したＤＮＡ断片をＰＣＲ法により作製することもできる。
変異を有するＤＮＡ断片を親株へ導入する方法としては、例えば、ファージ由来のλRedリコンビナーゼを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640 (2000), Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]をあげることができる。
抗生物質耐性マーカーに応じた抗生物質に耐性を示す株を取得することにより、該組み換え体プラスミドが染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
さらに、変異体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法[Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]等を用いて、親株の染色体上のアスパラギン酸アミノトランフェラーゼをコードするＤＮＡが変異体ＤＮＡに置換された株を取得することができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることができる。
親株の染色体上のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに置換、欠失、又は付加を導入する方法としては、他にもバクテリオファージや接合を利用する方法をあげることができ、例えば、Bacterial and Bacteriophage Genetics, Springer-Verlag (1981-2000)に記載の方法をあげることができる。
変異を導入する塩基の数は、置換、欠失、又は付加によって、該ＤＮＡがコードするアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることができる数であれば限定されないが、例えば１〜３００個、好ましくは１〜１５０個、より好ましくは１〜１００個、さらにより好ましくは１〜５０個、最も好ましくは１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、３個、２個又は１個であり得る。
変異を導入する部位は、該変異によってアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させることができる部位であれば必ずしもアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの有する塩基配列中に限られないが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写・翻訳調節領域（以下、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子という）中であることが好ましく、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの有する塩基配列中であることがさらに好ましい。
塩基置換を導入してアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させる方法としては、例えば、ナンセンス変異の導入による方法があげられる。ナンセンス変異を導入する方法としては、例えば、終止コドンを含むプライマー及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られたナンセンス変異が導入されたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて親株の染色体上のaspCを置換する方法があげられる。
塩基配列の欠失を導入することによってアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下又は喪失させる方法としては、例えば、ＰＣＲを用いてアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の５’側と３’側を増幅し、得られた断片をＰＣＲにより結合させて得られるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を染色体に組み込む方法等をあげることができる。
塩基配列を欠失させたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の例としては、例えば、以下の方法により得られる遺伝子をあげることができる。まず、配列番号９、又は１０と１６のプライマーを用いて、大腸菌由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の５’側を、配列番号１１、又は１２と１５のプライマーを用いて３’側を増幅する。増幅された２つの断片を鋳型として、配列番号９、又は１０と１１、又は１２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより配列番号１記載の塩基配列の第１〜９８８番目の塩基が欠失したアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を得る。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子に変異を導入せずにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下させることもできる。このような方法として、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする標的ｍＲＮＡの有する塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含むオリゴヌクレオチド又はＲＮＡを該微生物に導入し、標的ｍＲＮＡと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制する、いわゆるアンチセンス法をあげることができる。
「標的ｍＲＮＡの有する塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部」とは、標的のｍＲＮＡに特異的に結合することができ、且つ該ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも１０塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上含むものである。
アンチセンスＲＮＡのほか、標的ｍＲＮＡに相補的なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ（いわゆるｓｉＲＮＡ）又は標的ｍＲＮＡに対するリボザイムを導入することによってもまた、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を低下させることができる。
上記の操作を行って得られた微生物の中から、前述のようにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を測定し、親株と比較することによって、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が低下又は喪失した微生物を得ることができる。
２．本発明の製造法
本発明はまた、上記１の方法で調製された、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することによる、Ｌ−アミノ酸の製造法を提供する。
本発明はまた、上記１の方法で調製された、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することによる、Ｌ−アミノ酸の製造法を提供する。
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発明の微生物の増殖、及びＬ−アミノ酸の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
炭素源としては、使用する微生物が資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などをあげることができる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。
ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。
培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は20〜50℃、好ましくは20〜42℃、より好ましくは28〜38℃である。培養pHは5〜9、好ましくは6〜7.5である。培養時間は、5時間〜5日間、好ましくは16時間〜3日間である。
培養物中に蓄積したＬ−アミノ酸は、通常の精製方法によって採取することができる。例えばＬ−アミノ酸は、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を欠失した菌株の造成
（１）ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの作製
クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むＤＮＡ断片は以下のようにして調製した。
ｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ社製）を鋳型として０．１μｇ、配列番号３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）、５μＬのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９６℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片を常法にて精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）（以下、ＤＮＡ断片精製キットと略す）を用いて精製し、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を得た。
さらにｐＭＯＢ３（ＡＴＣＣ７７２８２由来）を鋳型として配列番号５の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーにして同様にＰＣＲ反応を行い、常法にて精製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｈＩとＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動とＤＮＡ精製キットを用いて精製し、レバンシュークラーゼ遺伝子断片を得た。ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで消化し、アガロース電気泳動とＤＮＡ断片精製キットを用いて精製した。上記３つのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換して、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することによりクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むｐＨＳＧｃａｔｓａｃＢが取得されていることを確認した。得られたプラスミドを鋳型に配列番号７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片精製キットにより精製して、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）が含まれるＤＮＡ断片（以下、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットと略す）を得た。
（１）ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの作製
クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むＤＮＡ断片は以下のようにして調製した。
ｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ社製）を鋳型として０．１μｇ、配列番号３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）、５μＬのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９６℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片を常法にて精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）（以下、ＤＮＡ断片精製キットと略す）を用いて精製し、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を得た。
さらにｐＭＯＢ３（ＡＴＣＣ７７２８２由来）を鋳型として配列番号５の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーにして同様にＰＣＲ反応を行い、常法にて精製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｈＩとＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動とＤＮＡ精製キットを用いて精製し、レバンシュークラーゼ遺伝子断片を得た。ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで消化し、アガロース電気泳動とＤＮＡ断片精製キットを用いて精製した。上記３つのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換して、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することによりクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むｐＨＳＧｃａｔｓａｃＢが取得されていることを確認した。得られたプラスミドを鋳型に配列番号７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片精製キットにより精製して、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）とレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）が含まれるＤＮＡ断片（以下、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットと略す）を得た。
（２）ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片の作製
各ＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００９２６Ｄ−５）を鋳型として０．１μｇ、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）、５μＬのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ製）、各４００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で７分間の工程を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行って、ａｓｐＣを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｓｐＣ遺伝子の５’側領域を、配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片と上記（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｓｐＣ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｓｐＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｓｐＣ遺伝子の５’側領域を、配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｓｐＣ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするａｓｐＣ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
各ＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００９２６Ｄ−５）を鋳型として０．１μｇ、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．５ｕｎｉｔｓのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）、５μＬのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ製）、各４００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む反応液５０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で７分間の工程を３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応を行って、ａｓｐＣを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｓｐＣ遺伝子の５’側領域を、配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片と上記（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｓｐＣ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｓｐＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｓｐＣ遺伝子の５’側領域を、配列番号１１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｓｐＣ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするａｓｐＣ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
（３）遺伝子置換法によるＢＷ２５１１３株へのａｓｐＣ欠失変異の導入
上記（２）で得られたａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片をＤａｔｓｅｎｋｏらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０（２０００）］に従って大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ＃７７３９としてYale 大学The Coli Genetic Stock Centerより入手可能）に導入し、染色体ＤＮＡとの相同組換えを起こさせた。クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択し、出現したコロニーを採取して、シュークロース６０ｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上で生育しない株を選抜した後、次にａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を同様に導入した。シュークロース非感受性、かつクロラムフェニコール感受性となった株を選抜して、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの削除に成功した株、ＢＷＣ／ｐＫＤ４６株を得た。また、確認のため、得られた株の染色体ＤＮＡを公知の方法で抽出し、これを鋳型として配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行ったところ、マーカー除去用ＤＮＡ断片と同じ長さのＤＮＡ断片が増幅された。
上記（２）で得られたａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片をＤａｔｓｅｎｋｏらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０（２０００）］に従って大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ＃７７３９としてYale 大学The Coli Genetic Stock Centerより入手可能）に導入し、染色体ＤＮＡとの相同組換えを起こさせた。クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択し、出現したコロニーを採取して、シュークロース６０ｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上で生育しない株を選抜した後、次にａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を同様に導入した。シュークロース非感受性、かつクロラムフェニコール感受性となった株を選抜して、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの削除に成功した株、ＢＷＣ／ｐＫＤ４６株を得た。また、確認のため、得られた株の染色体ＤＮＡを公知の方法で抽出し、これを鋳型として配列番号１０の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行ったところ、マーカー除去用ＤＮＡ断片と同じ長さのＤＮＡ断片が増幅された。
ＢＷ２５１１３株、及びａｓｐＣ欠失変異株によるＬ−グルタミン酸生産試験
実施例１で得たａｓｐＣ欠損株ＢＷＣ／ｐＫＤ４６株からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＣ株を得た。具体的には８ｍＬのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌して４２℃一晩振とう培養を行い、得られた培養液をＬＢ寒天培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕にストリークし、出現したコロニーの中からアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地で生育できなくなったものを選抜した。
ａｓｐＣ変異株ＢＷＣ株、及び親株であるＢＷ２５１１３株（ＣＧＳＣ＃７７３６）をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養した後、それぞれをＬＢ液体培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕３５０ｍＬの入った三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間培養した。
得られた種培養液２０ｍＬを、本培養培地〔グルコース４５ｇ、酵母エキスパウダー（ＡＹ−８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２７８ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、チアミン塩酸塩８ｍｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整。〕７８０ｍＬの入ったジャーファーメンターに植菌し、攪拌回転数毎分８００回転、通気毎分１Ｌ、３０℃で１６時間培養した。
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−アミノ酸の蓄積量をＢａｎｋらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４０，１６７（１９９６）]に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を表１に示す。
実施例１で得たａｓｐＣ欠損株ＢＷＣ／ｐＫＤ４６株からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＣ株を得た。具体的には８ｍＬのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌して４２℃一晩振とう培養を行い、得られた培養液をＬＢ寒天培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕にストリークし、出現したコロニーの中からアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地で生育できなくなったものを選抜した。
ａｓｐＣ変異株ＢＷＣ株、及び親株であるＢＷ２５１１３株（ＣＧＳＣ＃７７３６）をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養した後、それぞれをＬＢ液体培地〔トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕３５０ｍＬの入った三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間培養した。
得られた種培養液２０ｍＬを、本培養培地〔グルコース４５ｇ、酵母エキスパウダー（ＡＹ−８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２７８ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、チアミン塩酸塩８ｍｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整。〕７８０ｍＬの入ったジャーファーメンターに植菌し、攪拌回転数毎分８００回転、通気毎分１Ｌ、３０℃で１６時間培養した。
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−アミノ酸の蓄積量をＢａｎｋらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４０，１６７（１９９６）]に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を表１に示す。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｓｐＣを欠損させたＢＷＣ株では、Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）の生産量が親株ＢＷ２５１１３株に比べて明らかに向上していた。
プロリン生産菌及び当該菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子欠失株の造成
（１）プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片、ｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片、ｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片の作製
各ＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｐｕｔＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にｐｕｔＡの５’領域を配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２１の配列を有する合成ＤＮＡで、ｐｕｔＡの３’領域を配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２２の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号１８の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｕｔＡ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたｐｕｔＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いｐｕｔＡ遺伝子の５’側領域を、配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号１８の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｕｔＡ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、ｐｕｔＡ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
次に大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｏＢを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にｐｒｏＢの５’’領域を配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２９の配列を有する合成ＤＮＡで、ｐｒｏＢの３’領域を配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３０の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号２６の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｒｏＢ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号２５、及び２７の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたｐｒｏＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いｐｒｏＢ遺伝子の５’側領域を、配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号２６の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｒｏＢ遺伝子の３１９番目の塩基がＡからＧに置換されている。この変異が導入されたｐｒｏＢ７４がコードするγグルタミルキナーゼはプロリンによるフィードバック阻害が解除されていることが報告されている［Ｇｅｎｅ，６４，１９９（１９８８）］。この操作によって得られたＤＮＡ断片をｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片として用いた。
（１）プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片、ｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片、ｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片の作製
各ＤＮＡ断片は以下のようにして作製した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｐｕｔＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にｐｕｔＡの５’領域を配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２１の配列を有する合成ＤＮＡで、ｐｕｔＡの３’領域を配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２２の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号１８の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｕｔＡ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたｐｕｔＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号１７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いｐｕｔＡ遺伝子の５’側領域を、配列番号１９の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号１８の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｕｔＡ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、ｐｕｔＡ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
次に大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｐｒｏＢを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にｐｒｏＢの５’’領域を配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２９の配列を有する合成ＤＮＡで、ｐｒｏＢの３’領域を配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３０の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号２６の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｒｏＢ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号２５、及び２７の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたｐｒｏＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号２５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３２の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いｐｒｏＢ遺伝子の５’側領域を、配列番号２７の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３１の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号２６の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号２８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はｐｒｏＢ遺伝子の３１９番目の塩基がＡからＧに置換されている。この変異が導入されたｐｒｏＢ７４がコードするγグルタミルキナーゼはプロリンによるフィードバック阻害が解除されていることが報告されている［Ｇｅｎｅ，６４，１９９（１９８８）］。この操作によって得られたＤＮＡ断片をｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片として用いた。
（２）遺伝子置換法によるＢＷ２５１１３株へのｐｕｔＡ欠失変異の導入
プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡ／ｐＫＤ４６株を得た。
プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｕｔＡ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡ／ｐＫＤ４６株を得た。
（３）遺伝子置換法によるＢＷＡ株へのａｓｐＣ欠失変異の導入
ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＡ／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株を得た。
ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＡ／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株を得た。
（４）遺伝子置換法によるｐｒｏＢ７４変異の導入
ｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＡ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡＰ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣＰ／ｐＫＤ４６株をそれぞれに得た。
ｐｒｏＢ破壊用ＤＮＡ断片、及びｐｒｏＢ７４変異導入用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＡ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＡＰ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣＰ／ｐＫＤ４６株をそれぞれに得た。
ＢＷＡＰ株、及びＢＷＡＣＰ株によるＬ−プロリン生産試験
実施例３で得たＢＷＡＰ／ｐＫＤ４６株及びａｓｐＣ欠損株ＢＷＡＣＰ／ｐＫＤ４６からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させ、ＢＷＡＰ株及びＢＷＡＣＰ株をそれぞれ得た。ＢＷＡＰ株、及びＢＷＡＣＰ株をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養し、菌株をそれぞれＬＢ液体培地８ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で１６時間培養した。
得られた種培養液０．４ｍＬを、それぞれ、本培養培地〔グルコース２０ｇ、酵母エキスパウダー（ＡＹ−８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２７８ｍｇ、炭酸カルシウム２５ｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整。〕８ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で３０時間培養した。
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−アミノ酸の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を表２に示す。
実施例３で得たＢＷＡＰ／ｐＫＤ４６株及びａｓｐＣ欠損株ＢＷＡＣＰ／ｐＫＤ４６からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させ、ＢＷＡＰ株及びＢＷＡＣＰ株をそれぞれ得た。ＢＷＡＰ株、及びＢＷＡＣＰ株をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養し、菌株をそれぞれＬＢ液体培地８ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で１６時間培養した。
得られた種培養液０．４ｍＬを、それぞれ、本培養培地〔グルコース２０ｇ、酵母エキスパウダー（ＡＹ−８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２７８ｍｇ、炭酸カルシウム２５ｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整。〕８ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で３０時間培養した。
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−アミノ酸の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を表２に示す。
ＢＷＡＰ株に比べてａｓｐＣを欠損させたＢＷＡＣＰ株では、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）の生産量が明らかに向上していた。
アルギニン生産菌及び当該菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子欠失株の造成
（１）Ｎ―アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子ａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片、ａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片、ａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片の作製
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ａｒｇＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にａｒｇＡの５’’領域を配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３７の配列を有する合成ＤＮＡで、ａｒｇＡの３’領域を配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３８の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号３４の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＡ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｒｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｒｇＡ遺伝子の５’側領域を、配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号３４の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＡ遺伝子の５６番目の塩基がＡからＧに置換されている。この変異が導入されたａｒｇＡ２１５がコードするＮ−アセチルグルタミン酸合成酵素はアルギニンによるフィードバック阻害が解除されていることが報告されている［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１８０５（１９９８）］。この操作によって得られたＤＮＡ断片をａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片として用いた。
次に大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ａｒｇＲを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にａｒｇＲの５’領域を配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４５の配列を有する合成ＤＮＡで、ａｒｇＲの３’領域を配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４６の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号４２の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＲ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｒｇＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｒｇＲ遺伝子の５’側領域を、配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４７の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号４２の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＲ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、ａｒｇＲ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
（１）Ｎ―アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子ａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片、ａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片、ａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片の作製
大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ａｒｇＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にａｒｇＡの５’’領域を配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３７の配列を有する合成ＤＮＡで、ａｒｇＡの３’領域を配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３８の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号３４の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＡ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｒｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号３３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４０の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｒｇＡ遺伝子の５’側領域を、配列番号３５の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３９の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。
次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号３４の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号３６の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＡ遺伝子の５６番目の塩基がＡからＧに置換されている。この変異が導入されたａｒｇＡ２１５がコードするＮ−アセチルグルタミン酸合成酵素はアルギニンによるフィードバック阻害が解除されていることが報告されている［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１８０５（１９９８）］。この操作によって得られたＤＮＡ断片をａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片として用いた。
次に大腸菌ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ａｒｇＲを含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を鋳型にａｒｇＲの５’領域を配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４５の配列を有する合成ＤＮＡで、ａｒｇＲの３’領域を配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４６の配列を有する合成ＤＮＡでそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片と実施例１の（１）で得られたｃａｔ−ｓａｃＢカセットを混合してこれを鋳型とし、配列番号４２の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い３断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＲ遺伝子の５’側配列と３’側配列の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子とレバンシュークラーゼ遺伝子が挿入された構造をもっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片として用いた。
さらに配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡ、及び配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応で増幅されたａｒｇＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４１の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４８の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いａｒｇＲ遺伝子の５’側領域を、配列番号４３の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４７の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い３’側領域をそれぞれＰＣＲ反応で増幅し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片精製キットで精製した。次にこの２断片を混合してこれを鋳型とし、配列番号４２の配列を有する合成ＤＮＡと配列番号４４の配列を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い２断片の連結と増幅を行った。この操作により得られたＤＮＡ断片はａｒｇＲ遺伝子の５’側領域と３’側領域が直接つながっており、ａｒｇＲ遺伝子の大部分が欠損した構造になっている。このＤＮＡ断片をａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片として用いた。
（２）遺伝子置換法によるＢＷ２５１１３株へのａｒｇＡ２１５変異の導入
Ｎ―アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子ａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行って目的の株を得た。
Ｎ―アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子ａｒｇＡ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＡ２１５変異導入用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷ２５１１３／ｐＫＤ４６株に実施例１の（３）と同様の操作を行って目的の株を得た。
（３）遺伝子置換法によるａｒｇＲ欠失変異の導入
ａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、上記（２）で得られた株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＲ／ｐＫＤ４６株を得た。
ａｒｇＲ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｒｇＲ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、上記（２）で得られた株に実施例１の（３）と同様の操作を行ってＢＷＲ／ｐＫＤ４６株を得た。
（４）遺伝子置換法によるＢＷＲ株へのａｓｐＣ欠失変異の導入
ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＲ株に実施例１の（３）と同様の操作を行って目的の株、ＢＷＲＣ／ｐＫＤ４６株を得た。
ａｓｐＣ破壊用ＤＮＡ断片、及びａｓｐＣ領域に挿入したマーカーの除去用ＤＮＡ断片を用い、ＢＷＲ株に実施例１の（３）と同様の操作を行って目的の株、ＢＷＲＣ／ｐＫＤ４６株を得た。
ＢＷＲ株、及び当該菌株のａｓｐＣ欠失株によるＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−オルニチン生産試験
実施例５で得たＢＷＲ／ｐＫＤ４６株、及びａｓｐＣ欠損株ＢＷＲＣ／ｐＫＤ４６からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＲ株、及びＢＷＲＣ株を得た。実施例４と同じ方法で、ＢＷＲ、ＢＷＲＣの各菌株のアミノ酸の生産試験を行った。
結果を表３に示す。
実施例５で得たＢＷＲ／ｐＫＤ４６株、及びａｓｐＣ欠損株ＢＷＲＣ／ｐＫＤ４６からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＲ株、及びＢＷＲＣ株を得た。実施例４と同じ方法で、ＢＷＲ、ＢＷＲＣの各菌株のアミノ酸の生産試験を行った。
結果を表３に示す。
ａｓｐＣを欠損させたＢＷＲＣ株では、Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）の生産量が親株ＢＷＲ株に比べて明らかに向上していた。またＬ−シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｌ−オルニチン（Ｏｒｎ）に関しても親株ＢＷＲ株に比べてＢＷＲＣ株が高い生産性を示した。
ヒドロキシプロリン生産菌及び当該菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子欠失株の造成
実施例３の（２）、及び（３）にて作製したＢＷＡ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＡ株、及びＢＷＡＣ株を得たのち、文献［Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０，５２２（２０００）］記載のプラスミドｐＷＦＰ１をＤｏｗｅｒらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）］にしたがってエレクトロポレーション法により導入し、アンピシリン耐性を指標にそれぞれの形質転換体を得た。
実施例３の（２）、及び（３）にて作製したＢＷＡ／ｐＫＤ４６株、及びＢＷＡＣ／ｐＫＤ４６株からｐＫＤ４６プラスミドを脱落させＢＷＡ株、及びＢＷＡＣ株を得たのち、文献［Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０，５２２（２０００）］記載のプラスミドｐＷＦＰ１をＤｏｗｅｒらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）］にしたがってエレクトロポレーション法により導入し、アンピシリン耐性を指標にそれぞれの形質転換体を得た。
ＢＷＡ／ｐＷＦＰ１株、及び当該菌株のａｓｐＣ欠失株ＢＷＡＣ／ｐＷＦＰ１株によるＬ−プロリン及びＬ−ヒドロキシプロリン生産試験
実施例４と同じ方法で、実施例７で作製したＢＷＡ／ｐＷＦＰ１、ＢＷＡＣ／ｐＷＦＰ１の各菌株のアミノ酸生産試験を行った。
結果を表４に示す。
実施例４と同じ方法で、実施例７で作製したＢＷＡ／ｐＷＦＰ１、ＢＷＡＣ／ｐＷＦＰ１の各菌株のアミノ酸生産試験を行った。
結果を表４に示す。
ａｓｐＣを欠損させたＢＷＡＣ／ｐＷＦＰ１株では、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）、及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の生産量がＢＷＡ／ｐＷＦＰ１株に比べて明らかに向上していた。
本発明により、従来よりもＬ−アミノ酸の生産効率が向上した微生物によるＬ−アミノ酸の効率的な生産が可能となり、医薬や健康食品などの分野で様々な用途が存在するＬ−アミノ酸を、効率よく提供することが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２００９−０２８６９３（出願日：２００９年２月１０日）を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
Claims (3)
- Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失したエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、
前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
より選ばれる蛋白質であり、かつ、
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニンおよびＬ−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸であることを特徴とする、製造法（ただし、D−アミノ酸が添加された培地を用いる方法を除く）。 - アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が親株に比べて低下又は喪失したエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを欠損したエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である、請求項１記載のＬ-アミノ酸の製造法。
- アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（２）より選ばれるＤＮＡにコードされる、請求項１又は２に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010550524A JP5698001B2 (ja) | 2009-02-10 | 2010-02-09 | アミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009028693 | 2009-02-10 | ||
| JP2009028693 | 2009-02-10 | ||
| JP2010550524A JP5698001B2 (ja) | 2009-02-10 | 2010-02-09 | アミノ酸の製造法 |
| PCT/JP2010/051905 WO2010092959A1 (ja) | 2009-02-10 | 2010-02-09 | アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2010092959A1 JPWO2010092959A1 (ja) | 2012-08-16 |
| JP5698001B2 true JP5698001B2 (ja) | 2015-04-08 |
Family
ID=42561801
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010550524A Active JP5698001B2 (ja) | 2009-02-10 | 2010-02-09 | アミノ酸の製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9023622B2 (ja) |
| EP (1) | EP2397545B1 (ja) |
| JP (1) | JP5698001B2 (ja) |
| WO (1) | WO2010092959A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5951968B2 (ja) * | 2011-11-24 | 2016-07-13 | 協和発酵バイオ株式会社 | Ｌ−アスパラギンの製造法 |
| CN109971800A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-07-05 | 南通普悦生物医药有限公司 | 酶解法制l-羟基脯氨酸的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5316943A (en) * | 1988-06-14 | 1994-05-31 | Kidman Gene E | Racemic conversion of using a transaminase |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5618596A (en) | 1979-07-23 | 1981-02-21 | Ajinomoto Co Inc | Production of l-lysine through fermentation process |
| JPS56144092A (en) | 1980-04-14 | 1981-11-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-methionine by fermentation |
| DE3127361A1 (de) | 1981-07-08 | 1983-02-03 | Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen | Herstellung und anwendung von plasmiden mit genen fuer die biosynthese von l-prolin |
| GB8301700D0 (en) | 1983-01-21 | 1983-02-23 | Searle & Co | Cloning and utilisation of aminotransferase genes |
| GB8403244D0 (en) | 1984-02-07 | 1984-03-14 | Searle & Co | Aminoacids via bioconversion |
| JPH06102028B2 (ja) * | 1985-10-04 | 1994-12-14 | 協和醗酵工業株式会社 | アミノ酸の製造法 |
| JPS6394985A (ja) | 1986-10-09 | 1988-04-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−チロシンの製造法 |
| JPH06102028A (ja) | 1992-09-22 | 1994-04-12 | Nikon Corp | 光学式非接触距離測定機及び測定方法 |
| DE19539952A1 (de) | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
| JP4168463B2 (ja) * | 1996-12-05 | 2008-10-22 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| SK285201B6 (sk) | 1996-12-05 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7 |
| DE69838768T2 (de) * | 1997-09-19 | 2008-10-30 | Metabolix, Inc., Cambridge | Biologische Systeme zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat-Polymeren die 4-Hy droxysäure enthalten |
| ATE458040T1 (de) * | 1998-04-13 | 2010-03-15 | Univ Georgia | Pyruvate carboxylase überexpression zur verstärkten produktion von oxalacetat abgeleiteten verbindungen in mikrobiellen zellen |
| DE19949579C1 (de) | 1999-10-14 | 2000-11-16 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten |
| RU2230114C2 (ru) | 2001-11-30 | 2004-06-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот |
| RU2244007C2 (ru) * | 2002-02-27 | 2005-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты) |
| JP4836440B2 (ja) * | 2004-03-10 | 2011-12-14 | センター・フォー・ディーエヌエイ・フィンガープリンティング・アンド・ダイアグノスティックス | 微生物を用いたアルギニン産生の方法 |
| JP2009028693A (ja) | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Nippon Paint Co Ltd | 塗膜形成方法 |
-
2010
- 2010-02-09 US US13/148,625 patent/US9023622B2/en active Active
- 2010-02-09 WO PCT/JP2010/051905 patent/WO2010092959A1/ja active Application Filing
- 2010-02-09 EP EP10741236.3A patent/EP2397545B1/en active Active
- 2010-02-09 JP JP2010550524A patent/JP5698001B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5316943A (en) * | 1988-06-14 | 1994-05-31 | Kidman Gene E | Racemic conversion of using a transaminase |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6014026501; Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｖｏｌ．１３０， Ｎｏ．１, 1977, ｐｐ．４２９-４４０ * |
| JPN6014026503; Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．２７, 1962, ｐｐ．４１-５０ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010092959A1 (ja) | 2010-08-19 |
| US9023622B2 (en) | 2015-05-05 |
| US20110312042A1 (en) | 2011-12-22 |
| EP2397545A1 (en) | 2011-12-21 |
| JPWO2010092959A1 (ja) | 2012-08-16 |
| EP2397545B1 (en) | 2015-07-29 |
| EP2397545A4 (en) | 2012-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4881739B2 (ja) | Ｌ−アルギニン、ｌ−オルニチンまたはｌ−シトルリンの製造法 | |
| WO2020208842A1 (ja) | 遺伝子組換え微生物及びこれを用いた目的物質の生産方法 | |
| JP2017023147A (ja) | 発酵法による目的物質の製造法 | |
| WO2022017223A1 (zh) | 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用 | |
| JP5698001B2 (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| KR102527895B1 (ko) | GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 | |
| ZA200507688B (en) | TDCBC/PCKA gene-inactivated microorganism and met hod of producing I-threonine using the same | |
| JP5064396B2 (ja) | Ｌ‐グルタミンの製造法 | |
| JP2022001049A (ja) | 新規なポリペプチド及びこれを用いたオルニチン系産物の生産方法 | |
| JP5297804B2 (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| US20210070800A1 (en) | Method of producing a tripeptide gamma-glu-val-gly using enterobacteriaceae | |
| JPWO2013154182A1 (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| JP5827131B2 (ja) | Ｌ−グルタミンまたはｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| JP2022001556A (ja) | 蛋白質及び３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121221 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140701 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140829 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150203 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150212 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5698001 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |