CN109971800A - 酶解法制l-羟基脯氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了酶解法制L‑羟基脯氨酸的方法，将L‑脯氨酸生产菌株接入培养罐内，在发酵过程的溶氧回升至10％‑30％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在10％‑30％，最终葡萄糖含量小于10g/L，菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L‑羟基脯氨酸，将L‑羟基脯氨酸发酵液微滤，得到微滤清液和微滤截留液，然后用强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液；得到L‑羟基脯氨酸的成品。采用DO‑stat流加培养控制方法，有效消除了L‑脯氨酸发酵生产过程中葡萄糖的阻遏作用，提高L‑脯氨酸的平均产量，将微滤截留液和多余的母液送回离子交换树脂吸附工序，有效的减少了原料的损失，提高了发酵水平，降低了生产成本，避免了三废污染。

Description

酶解法制L-羟基脯氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种L-羟基脯氨酸的方法，具体涉及一种酶解法制L-羟基脯氨酸的方法。
背景技术
羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸羟基化后的产物，其分子式为C5H9NO3。羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274℃，易溶于水，微溶于乙醇。L-羟基脯氨酸的生产方法主要有三种：化学法、水解提取法和微生物发酵法。其中，通过化学法以及水解提取法生产L-脯氨酸过程复杂，效益低，成本高，微生物发酵法以其成本低，污染少，杂质少，纯度高等优势在工业生产中日益占主导地位。
国内外报道的自发酵液中分离提取羟脯氨酸，通常将发酵液通过阴阳离子交换柱的方法，然后用洗脱液将羟脯氨酸从离子交换柱上洗脱，使得后期的洗脱过程中混浊物大大减少，得到羟脯氨酸溶液，再经过结晶和干燥，得到羟脯氨酸产品。该方法羟脯氨酸易氧化，收率不稳定；耗水量大，酸碱用量大，在生产过程中会产生大量的废渣和废水，对环境造成非常严重的污染。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供酶解法制L-羟基脯氨酸的方法。该方法能高效的分离出成品并提高纯度和提取率。
本发明提供如下技术方案：
酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、培养罐先进行灭菌操作，再将液体培养基投入培养罐中，然后进行接种；
S2、将L-脯氨酸生产菌株接入培养罐内，接种温度30-35℃，pH7.0～9.0，将接种瓶针头插入接种口，接种结束后，用浸过体积浓度75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，开始培养；
S3、培养：培养温度30-35℃、搅拌转速200～300rpm、培养时间8～24小时，在发酵过程的溶氧回升至10％-30％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在10％-30％，最终葡萄糖含量小于10g/L，菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；
S4、成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟基脯氨酸，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在30～90g/L、糖浓度≦2.0％；
S5、将L-羟基脯氨酸发酵液微滤，得到微滤清液和微滤截留液，调节微滤清液pH值为6～7，然后用强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液；
S6、将微滤清液用活性炭在温度30～40℃脱色后，50～70℃浓缩至体积为浓缩前的1/8～1/6，降温20～30℃离心得到L-羟基脯氨酸的成品，多余的母液进行多次强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液，重复操作，得到L-羟基脯氨酸的成品。
进一步的，步骤S4中，发酵培养基投入发酵罐中，蒸汽加热到100～105℃，压力0.1MPa，保温10-20分钟，冷却降温至35-37℃，调pH到6.5-7，备接种。
进一步的，L-脯氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌。
进一步的，所述强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有磺酸基的阳离子交换树脂。
进一步的，所述弱碱性阴离子交换树脂为聚丙烯酸系阴离子交换树脂。
进一步的，所述强酸性阳离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂的体积比为3:4-5。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用DO-stat流加培养控制方法，有效消除了L-脯氨酸发酵生产过程中葡萄糖的阻遏作用，提高L-脯氨酸的平均产量，将微滤截留液和多余的母液送回离子交换树脂吸附工序，有效的减少了原料的损失，采用本发明的微生物发酵生产L-羟脯氨酸，提高了发酵水平，降低了生产成本，避免了三废污染。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、培养罐先进行灭菌操作，再将液体培养基投入培养罐中，然后进行接种；
S2、将L-脯氨酸生产菌株接入培养罐内，接种温度30℃，pH7.0，将接种瓶针头插入接种口，接种结束后，用浸过体积浓度75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，开始培养；
S3、培养：培养温度30℃、搅拌转速200rpm、培养时间8小时，在发酵过程的溶氧回升至10％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在10％，最终葡萄糖含量小于10g/L，菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；
S4、成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟基脯氨酸，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在30g/L、糖浓度≦2.0％；
S5、将L-羟基脯氨酸发酵液微滤，得到微滤清液和微滤截留液，调节微滤清液pH值为6，然后用强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液，强酸性阳离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂的体积比为3:4；
S6、将微滤清液用活性炭在温度30℃脱色后，50℃浓缩至体积为浓缩前的1/8～1/6，降温20℃离心得到L-羟基脯氨酸的成品，多余的母液进行多次强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液，重复操作，得到L-羟基脯氨酸的成品。
步骤S4中，发酵培养基投入发酵罐中，蒸汽加热到100℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接种。
L-脯氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌。
强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有磺酸基的阳离子交换树脂。弱碱性阴离子交换树脂为聚丙烯酸系阴离子交换树脂。
实施例2
酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、培养罐先进行灭菌操作，再将液体培养基投入培养罐中，然后进行接种；
S2、将L-脯氨酸生产菌株接入培养罐内，接种温度32℃，pH8.0，将接种瓶针头插入接种口，接种结束后，用浸过体积浓度75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，开始培养；
S3、培养：培养温度32℃、搅拌转速250rpm、培养时间15小时，在发酵过程的溶氧回升至20％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在20％，最终葡萄糖含量小于10g/L，菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；
S4、成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟基脯氨酸，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在60g/L、糖浓度≦2.0％；
S5、将L-羟基脯氨酸发酵液微滤，得到微滤清液和微滤截留液，调节微滤清液pH值为6.5，然后用强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液；
S6、将微滤清液用活性炭在温度35℃脱色后，60℃浓缩至体积为浓缩前的1/8～1/6，降温25℃离心得到L-羟基脯氨酸的成品，多余的母液进行多次强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液，重复操作，得到L-羟基脯氨酸的成品。
步骤S4中，发酵培养基投入发酵罐中，蒸汽加热到103℃，压力0.1MPa，保温15分钟，冷却降温至36℃，调pH到6.8，备接种。
L-脯氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌。
强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有磺酸基的阳离子交换树脂。弱碱性阴离子交换树脂为聚丙烯酸系阴离子交换树脂。
强酸性阳离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂的体积比为3:4-5。
实施例3
酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、培养罐先进行灭菌操作，再将液体培养基投入培养罐中，然后进行接种；
S2、将L-脯氨酸生产菌株接入培养罐内，接种温度35℃，pH9.0，将接种瓶针头插入接种口，接种结束后，用浸过体积浓度75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，开始培养；
S3、培养：培养温度35℃、搅拌转速300rpm、培养时间24小时，在发酵过程的溶氧回升至30％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在30％，最终葡萄糖含量小于10g/L，菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；
S4、成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟基脯氨酸，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在90g/L、糖浓度≦2.0％；
S5、将L-羟基脯氨酸发酵液微滤，得到微滤清液和微滤截留液，调节微滤清液pH值为7，然后用强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液，强酸性阳离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂的体积比为3:4-5；
S6、将微滤清液用活性炭在温度40℃脱色后，70℃浓缩至体积为浓缩前的1/8～1/6，降温30℃离心得到L-羟基脯氨酸的成品，多余的母液进行多次强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液，重复操作，得到L-羟基脯氨酸的成品。
步骤S4中，发酵培养基投入发酵罐中，蒸汽加热到105℃，压力0.1MPa，保温20分钟，冷却降温至37℃，调pH到7，备接种。
L-脯氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌。
强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有磺酸基的阳离子交换树脂。弱碱性阴离子交换树脂为聚丙烯酸系阴离子交换树脂。
本发明在接种的过程中，将L-脯氨酸生产菌株接入培养罐，控制合适的温度和pH，有利于后续培养，采用DO-stat流加培养控制方法：在发酵过程的溶氧回升至30％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在30％，最终葡萄糖含量小于10g/L，将葡萄糖浓度维持在一个较低的恒定水平，有效消除了L-脯氨酸发酵生产过程中葡萄糖的阻遏作用，提高L-脯氨酸的平均产量
将微滤截留液和多余的母液送回离子交换树脂吸附工序，有效的减少了原料的损失，用离子交换树脂吸附的是少量杂质而不是传统的吸附大部分L-羟脯氨酸，树脂的用量大大减少。采用本发明的微生物发酵生产L-羟脯氨酸，提高了发酵水平，降低了生产成本，避免了三废污染。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、培养罐先进行灭菌操作，再将液体培养基投入培养罐中，然后进行接种；
S2、将L-脯氨酸生产菌株接入培养罐内，接种温度30-35℃，pH7.0～9.0，将接种瓶针头插入接种口，接种结束后，用浸过体积浓度75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，开始培养；
S3、培养：培养温度30-35℃、搅拌转速200～300rpm、培养时间8～24小时，在发酵过程的溶氧回升至10％-30％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在10％-30％，最终葡萄糖含量小于10g/L，菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；
S4、成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟基脯氨酸，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在30～90g/L、糖浓度≦2.0％；
S5、将L-羟基脯氨酸发酵液微滤，得到微滤清液和微滤截留液，调节微滤清液pH值为6～7，然后用强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液；
S6、将微滤清液用活性炭在温度30～40℃脱色后，50～70℃浓缩至体积为浓缩前的1/8～1/6，降温20～30℃离心得到L-羟基脯氨酸的成品，多余的母液进行多次强酸性阳离子交换树脂吸附，接着用弱碱性阴离子交换树脂吸附得到离子交换液，重复操作，得到L-羟基脯氨酸的成品。
2.根据权利要求1所述的酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，其特征在于：步骤S4中，发酵培养基投入发酵罐中，蒸汽加热到100～105℃，压力0.1MPa，保温10-20分钟，冷却降温至35-37℃，调pH到6.5-7，备接种。
3.根据权利要求1所述的酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，其特征在于：所述L-脯氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌。
4.根据权利要求1所述的酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，其特征在于：所述强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯-二乙烯苯共聚体上带有磺酸基的阳离子交换树脂。
5.根据权利要求1所述的酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，其特征在于：所述弱碱性阴离子交换树脂为聚丙烯酸系阴离子交换树脂。
6.根据权利要求1所述的酶解法制L-羟基脯氨酸的方法，其特征在于：所述强酸性阳离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂的体积比为3:4-5。
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