CN1072211A - 反式-2-羟基脯氨酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

在含有胶原水解物的培养基中培养实质上不使 反式-L-羧基脯氨酸分解，而对其它氨基酸有分解能 力的微生物，从培养液中提取反式-L-羧基脯氨酸的 制备方法。

Description

本发明涉及用做医药合成原料的反式-L-羟基脯氨酸的制备方法。

羟基脯氨酸的制备方法，已知有从胶原蛋白质提取的方法和化学合成的方法。化学合成法，已知有从烯丙基溴化物和二乙基乙酰胺丙二酸合成的方法[《日本化学学会通报》（Bull.Chem.Soc.Japan），46，2924，（1973）];由D-谷氨酸合成的方法[《日本化学学会通报》，47，1704，（1974）]以及乙二醛和乙二酸一酰醋酸合成的方法[《有机化学杂志》（J.Org.Chem.），42，3440（1977）]。

这些化学合成方法，收率都低，而且因为生成物是四种异构体的混合物，不适用于工业制造。因此，从动物组织中的胶原蛋白，弹性硬朊等含有很多反式-L-羟基脯氨酸的蛋白质水解后，提取、分离来制备。在此水解液中，除了反式-L-羟基脯氨酸外，还含有甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸等各种中性氨基酸，这些中性氨基酸和反式-L-羟基脯氨酸需要多步精制分离过程。

本发明者的专心研究的结果，已完成用含有胶原蛋白水解物的培养基培养微生物，使其它夹杂的氨基酸分解，确定能够容易地精制、分离反式-L-羟基脯氨酸的方法。

本发明提供实质上不分解反式-L-羟基脯氨酸，而对其它氨基酸有分解能力的微生物在含有胶原水解物的培养基中培养，并从培养物提取反式-L-羟基脯氨酸的制备方法。

本发明中，氨基酸的分解，包括菌体内代谢、同化、分解为其它化合物。本发明采用的微生物，如果实质上不使反式-L-羟基脯氨酸分解而对其它氨基酸有分解能力，则均能使用。例如：变形杆菌属.普罗威登斯菌属，戴列亚菌属以及属于柠檬色动性球菌属的微生物。

更适用的微生物可列举如下：奇异变形杆菌、普罗威登斯.阿尔卡里法新菌（providencia    alcalifaciens）、戴列亚.文挪斯塔（De-leya    Venusta）菌、柠檬色球菌等。

具体的菌株，可列举如下：奇异变形杆菌IFO3849、普罗威登斯.阿尔卡里法新菌ATCC9886、戴列亚.文挪斯塔菌ATCC27125菌，柠檬色动性球菌ATCC14404。

其它的氨基酸，可列举如下：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、α-氨基异戊酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、羟基赖氨酸和α-氨基丁酸。

本发明用的培养基，包括单一的做为碳源、氨源的胶原蛋白水解物的培养基。或者进一步用通常的微生物同化得到含有碳源、氮源、维生素等的培养基，如果是对培养实质上不使反式-L-羟基脯氨酸分解，而对其它氨基酸有分解能力的微生物有效的培养基，无论是天然培养基、合成培养基均佳。

培养基中的胶原蛋白水解物其氨基酸的总浓度是10-300克/升（反式-L-羟基脯氨酸1.5-45克/升），更理想的是调整为40-200克/升（反式-L-羟基脯氨酸6-30克/升），并且培养时，可添加胶原蛋白水解物。

培养可采用适用于微生物培养的方法，通常可以在通风搅拌条件下进行。培养温度25-45℃，优选30-40℃，培养中保持pH7.5-8.0，pH值的调节可用盐酸、硫酸等无机酸或乙酸等有机酸。

培养时，当反式-L-羟基脯氨酸以外的氨基酸分解时，即为培养的终点。通常培养时间为30-80小时。

由此得到的培养液，经过离心分离除去菌体后，用使用离子交换树脂等的色谱法或结晶法等常规的精制方法，从培养液中分离回收反式-L-羟基脯氨酸。

以下通过实施例说明本发明。

实施例中使用的胶原蛋白水解液，通过以下方法制备。

牛皮25公斤，加入12N硫酸5.1升，在120℃，进行水解反应12小时，反应后，反应液中加入氢氧化钾1公斤和水8升，悬浊液过滤，浓缩过滤液，用氨基酸分析仪分析氨基酸，此浓缩液中含氨基酸630克/升。其中反式-L-羟基脯氨酸93克/升，甘氨酸158克/升，L-脯氨酸98克/升。此浓缩液做为胶原蛋白水解液使用。

实施例1

A培养基[胨10克/升，内浸液7克/升，氯化钠3克/升，酵母浸液5克/升（pH7.0）]，将其分注入试管中5毫升，在120℃，在高压釜中加压灭菌20分钟，做为种子培养基。在此培养基中接种1铂环量的表1中所示微生物，在30℃振荡培养一天，做为种子培养液。

玉米浸渍液40克/升及含胶原蛋白水解物150毫升/升的培养基（pH7.5），将5毫升加入试管中，在120℃高压釜中加压灭菌。做为主培养基。在此培养基中无菌接种0.5毫升种子培养液，在30℃，振荡培养48小时，此主培养液离心分离（1000转/分，10分钟）除去菌体后，用氨基酸分析仪分析上面清液中残存的氨基酸。

表1中示出相对于培养液中氨基酸总量的反式-L-羟基脯氨酸的含有率和残存率。

实施例2

A培养基（与实施例1组成相同）50毫升，加入1升容量的三角瓶中，于120℃，高压釜中加压灭菌15分钟，做为种子培养基，在此培养基中接种1铂环量的奇异变形杆菌IFO3849，在30℃振荡培养1天，做为种子培养液。

另一方面，将玉米浸渍液30克和含有胶原蛋白水解物的培养基（pH7.5）750毫升，加入2升容量的小发酵罐中，在120℃高压釜中加压灭菌30分钟，做为主培养基。在此培养基中无菌接种50毫升种子培养液，在37℃，通风搅拌30小时（转数1000转/分，通风量1速度矢量米）。并在培养中用5N硫酸调节培养基的pH到8.0。此时反式-L-羟基脯氨酸的残存率为94%，反式-L-羟基脯氨酸的含有率为培养液中氨基酸总量的94%。

此主培养液800毫升离心分离（10000转/分，10分钟）除去菌体后，上面清液通过200毫升离子交换树脂甲醛系树脂SK-1B（H⁺型）（三菱化成社制）吸收塔吸附氨基酸，离子交换树脂用水洗净后，用0.2N氢氧化铵水溶液分段溶出含有的反式-L-羟基脯氨酸。此时反式-L-羟基脯氨酸的残存率为90%，反式-L-羟基脯氨酸的含有率为氨基酸总量的96%。

溶出液减压浓缩后，用甲醇析出结晶，然后用水重结晶，得到反式-L-羟基脯氨酸10.5克（纯度99.9%）。

实施例3

用与实施例2相同的种子培养液和主培养基无菌接种50毫升种子培养液在37℃与实施例2同样的通风搅拌培养。培养开始20小时后，添加160毫升胶原白水解物，60小时后培养终止。此时反式-L-羟基脯氨酸的残存率为93%，反式-L-羟基脯氨酸的含有率为培养液中氨基酸总量的90%。

此主培养液用与实施例2相同的方法进行精制，得到反式-L-羟基脯氨酸20.8克（纯度99.0%）。

比较例

胶原蛋白水解物200毫升，稀释5倍，通过200毫升离子交换树脂甲醛系树脂SK-1B（H⁺型）（三菱化成社制）吸收塔，离子交换树脂用水洗净，用0.2N氢氧化铵水溶液分段溶出含有的反式-L-羟基脯氨酸，此时反式-L-基脯氨酸的残存率为76%，反式-L-羟基脯氨酸的含有率为氨基酸总量的30%。

溶出液通过200毫升强碱性离子交换树脂PA-412（OH^-型）（三菱化成社制），树脂用水洗净后，用0.075N盐酸将含有的反式-L-羟基脯氨酸分段溶出。此时反式-L-羟基脯氨酸的残存率为74%，反式-L-羟基脯氨酸的含率为氨基酸总量的61%。然后将此溶出液通过200毫升离子交换树脂甲醛系树脂SK-1B（H⁺型）吸收塔，树脂用水洗净后，用0.2N氢氧化铵水溶液分段出含有的反式-L-羟基脯氨酸。此时反式-L-羟基脯氨酸的残存率为77%，反式-L-羟基脯氨酸的含有率为氨基酸总量的82%。

根据以上三次色谱法得到的反式-L-羟基脯氨酸的总收率43%，反式-L-羟基脯氨酸的含有率为氨基酸总量的82%。

按照本发明的方法，能够提高反式-L-羟基脯氨酸的含有率（相对于胶原水解物中氨基酸的总量），据此，能够提高用于制造医药合成原料的反式-L-羟基脯氨酸的收率。

Claims (3)

1、在含有胶原水解物的培养基中培养实质上不使反式-L-羟基脯氨酸分解，而对其它氨基酸有分解能力的微生物，从其培养液中提取反式-L-羟基脯氨酸的制备方法。

2、权利要求1所述制备方法中的微生物，以变形杆菌属、普罗威登斯（providencia）菌属、戴列亚（deleya）菌属以及柠檬色动性球菌属为特征。

3、权利要求1所述制备方法，其中其它的氨基酸为：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、α-氨基异戊酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异白氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、羟基赖氨酸和α-氨基丁酸。