CN1236690C - 含有赖氨酸的含水动物饲料添加剂及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含L-赖氨酸的含水动物饲料添加剂，它还可含有灭活的来自发酵的微生物，其pH值＜7，本发明还涉及这种制品的生产方法。

Description

含有赖氨酸的含水动物饲料添加剂及其生产方法

本发明涉及含有L-赖氨酸的含水动物饲料添加剂及这种制品的生产方法，所述添加剂还可含有来自发酵方法中的优选失活的微生物。

必需氨基酸L-赖氨酸广泛用作动物饲料添加剂。

公知L-赖氨酸通过棒状杆菌特别是谷氨酸棒杆菌菌株发酵来生产。由于其巨大的重要性，人们不断努力来改进其生产方法。该方法的改进可涉及通过例如诱变和选择而表现的微生物内在性能特征，涉及发酵技术的措施如搅拌和供氧，涉及营养培养基的组成，例如在发酵过程中的糖浓度，或涉及通过例如离子交换色谱法或结晶加工为一定的产物形式。

按照现有技术，有三组不同的含L-赖氨酸的产物形式，它们是从含L-赖氨酸的发酵液体培养基制备的。

最为人们公知的产物组包括粉状或结晶产物形式，它们是由提纯过或纯L-赖氨酸获得的，它们通常以盐如L-赖氨酸单盐酸盐形态存在。

另一组如EP-B-0533039中叙述的固体产物形式除L-赖氨酸外还含有在发酵生产过程中使用的原料并可含有所使用的微生物的失活生物质。

粉状、结晶或实际是颗粒状的产物形式在操作性能和应用中表现出明显的缺点。所述产物的质量可在相当程度上受天气如高空气湿度影响，因为这种大气影响所导致发生的结块会影响到贮存寿命和当使用时产物的调配性能。加工干燥、粉状含L-赖氨酸的产物又会导致产生不希望的粉尘。

第三组含L-赖氨酸的产物包含浓缩、含水的碱性溶液，因而回避了上述问题(EP-B-0534865)。

对于各种产物形式，已公知从含L-赖氨酸的发酵培养液制备含L-赖氨酸产物的许多不同方法。

对于固体、纯L-赖氨酸的制备，目前已知有基本上两种不同的方法。

在通过适当方法分离出失活的生物质后，可从对应的发酵培养液中通过结晶获得呈单盐酸盐(Lys-HCl)的赖氨酸。在进一步浓缩之前，一般分若干阶段通过离子交换色谱法对滤液进行净化。首先，对分离出生物质的发酵培养液进行酸化，优选通过添加盐酸(HCl)或硫酸(H₂SO₄)来进行，以使赖氨酸易于在离子交换树脂上吸附。除发酵产生的L-赖氨酸外，在发酵培养液中还发现存在各种其它阳离子。一般，需要顺序相连的各种离子交换柱来获得纯的产物。然后优选通过氨溶液洗脱吸附的赖氨酸，并再生离子交换柱。然后将以这种方式获得的赖氨酸溶液浓缩，在用盐酸中和后获得呈结晶态的赖氨酸-HCl。

另一种方法使得在用活性炭净化后可获得呈结晶盐形态的赖氨酸(SU-183581)。含赖氨酸的发酵培养液使用湿热通过标准方法灭活，并通过过滤分离出生物质。在将滤液酸化至pH为5后，在50-55℃恒定搅拌的条件下添加4-5％的活性炭，以从滤液中分离掉不需要的杂质并防止结晶物变色。在此后的另一过滤阶段中，分离出活性炭，然后通过添加氢氧化钙使溶解的硫酸盐呈硫酸钙沉淀。将这种沉淀物滤出，在旋转蒸发器中在真空中除去氨成分，所述溶液浓缩直到在冷却时发生结晶。

这两种加工方法的缺点在于存在许多的单独的阶段并使用离子交换色谱法的复杂的净化方法。消除恼人的盐或使用不同的洗脱介质会产生附加的废弃物流，后者或者需通过复杂的方法净化或者需昂贵地排放掉。

EP-B-0533039克服这些缺点的方法是，将也可包括生物质的全部发酵原料浓缩并在提高的温度下喷雾干燥。

US-A-5990350叙述了不含生物质的含L-赖氨酸颗粒的制备方法。在这种方法中，首先通过超滤从发酵培养液中分离出生物质并丢弃。然后将以这种方式回收的滤液通过大量蒸发水分而浓缩。最终将以这种方式获得的浓缩物干燥并通过流化床喷雾造粒的复杂方式加工以制备出颗粒。

由EP-B-0534865公知一种从发酵培养液制备含水、碱性、含L-赖氨酸溶液的方法。在其中叙述的方法中，从发酵培养液中分离出生物质并丢弃。使用如氢氧化钠、钾或氨的碱使pH达到9至11的数值。通过在浓缩后结晶并冷却从培养液中分离出矿物质组分(无机盐)，用作肥料或丢弃(垃圾掩埋)。

本发明的目的在于提供L-赖氨酸及其适于用作饲料添加剂的盐的新颖的含水制品。

此外，本发明的另一目的是提供比目前公知方法更经济有效的生产方法。

必需氨基酸L-赖氨酸广泛用作动物饲料添加剂。

棒状杆菌属微生物的突出特点在于其在较短的时间内向对应的发酵介质中分泌高浓度的L-赖氨酸的能力。所述生产方法一般是以分批加料的方法来进行。由发酵产生的L-赖氨酸目前绝大多数进行加工以制备出结晶产物、粉末或颗粒。

本发明提供一种基于发酵培养液的动物饲料添加剂，其特征在于它含有：

a)L-赖氨酸和/或其盐，

b)在发酵过程中形成的生物质，其数量为0至100％，优选为50至100％，特别优选为90至100％，

c)至少大多数的其它溶解和悬浮的发酵培养液组分

d)呈液体形态，也可呈悬浮液，且

e)pH小于7。

所述动物饲料添加剂的赖氨酸含量(以赖氨酸计)相对于添加剂的总量为10重量％至35重量％，优选为15重量％至35重量％，特别优选18重量％至35重量％，更特别优选21重量％至34重量％。其pH小于7，优选为2至6.5，特别优选2.5至6，更特别优选为2.5至5。

所述添加剂的总固体成分占10重量％至55重量％，优选为20重量％至55重量％，特别优选35重量％至55重量％，更特别优选45重量％至54重量％。所述固体成分除赖氨酸外还含有

—优选生产微生物的生物质，

—发酵培养液的无机和其它有机组分，和

—在发酵过程中产生的副产物，只要它们未通过适当方法如分离或过滤来分离掉。

如所述生物质完全或部分存在于所述添加剂中，所述添加剂所含的微生物蛋白质浓度最大高达4重量％。

所述添加剂含有的无机组分尤其包括钙、镁、呈磷酸盐形态的磷和呈硫酸盐形态的硫，含有的有机组分尤其包括维生素如维生素H和维生素B1、或糖如异麦芽糖。

在发酵过程中少量形成的有机副产物包括选自L-丙胺酸、L-天冬酰胺酸、L-谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸的L-氨基酸。此外还包括载有一至三个羧基的有机酸，如乳酸、乙酸和苹果酸。最后，它们还包括糖，如海藻糖。

如这些化合物能够改善所述添加剂的效价，则它们是需要的。

本发明还提供了制备含有赖氨酸和/或其盐的含水溶液/悬浮液的方法，该方法的特征在于：

a)通过发酵产生含L-赖氨酸的培养液，

b)可通过添加含L-赖氨酸的物质建立起所需的赖氨酸浓度，

c)将所述培养液的pH值调整至小于7，

d)可将以这种方式获得的培养液在真空中浓缩，

其中步骤b)，c)和d)的次序可改变。

最后，本发明还提供了制备含有赖氨酸和/或其盐的含水溶液/悬浮液的方法，该方法的特征在于：

a)通过发酵产生含L-赖氨酸的培养液，

b)将以这种方式获得的所述培养液的pH值调整至小于7，

c)可从所述溶液/悬浮液中完全或部分分离掉生物质，

d)可通过添加含L-赖氨酸的物质建立起所需的赖氨酸浓度，

e)可将以这种方式获得的培养液在真空中浓缩，

其中步骤b)，c)，d)和e)的次序可改变。

在现有技术如在US-A-4657860中详细地叙述了产生L-赖氨酸的突变体棒状杆菌。

为生产L-赖氨酸，可连续或使用分批方法或分批加料方法或重复分批加料方法不连续地培养这些菌株。在Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))或在Storhas的教科书(Bioreaktorenund peripHere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/wiesbaden，1994))中给出了公知培养方法的简要内容。

所要使用的培养介质必须适当地满足具体菌株的要求。可使用的碳源是糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪，例如豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇，例如甘油和乙醇，有机酸，例如乙酸。这些物质可单独或呈混合物使用。可使用的氮源是有机含氮化合物如蛋白胨、酵母抽提物、肉汁、麦芽浸出汁、玉米浆、大豆粉和尿素或无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。所述氮源可单独或呈混合物使用。可使用的磷源是硝酸二氢钾、或硝酸氢二钾或对应的含钠盐。所述培养介质此外还要含有金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁，它们是生长必需的。最后，除上述物质外，可使用必需的促生长物质，如氨基酸和维生素。还可向培养介质中添加适当的前体。所述的饲料原料物质可一批向培养基中添加，或在培养过程中适当地添加。

使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨，或使用酸性化合物如磷酸或硫酸来适当地控制培养基的pH。通过使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯可控制泡沫。通过向介质中添加适当选择性作用的物质如抗生素可保持质粒稳定性。可向培养基中引入氧或含氧气体混合物如空气并使用适当的搅拌系统或气流经混合来保持需氧条件。培养基温度通常为25℃至37℃。持续培养直到形成最大数量的L-赖氨酸。这一目标通过在10至160小时内实现。

适当的发酵介质可见于例如专利说明书EP-B-0532867、US-A-5840551和US-A-5990350中。

L-赖氨酸的分析可通过阴离子交换色谱法(水合)随后用茚三酮诱导(derivatisation)来进行，如Spackman等人所述(分析化学，30，(1958)，1190)，或可通过反相HPLC来进行，如Lindroth等人所述(分析化学(1979)51：1167-1174)。

对于小于5.0g/L的非代谢糖含量，用于本发明方法的发酵培养液优选所具有的L-赖氨酸含量大于60g/L(以赖氨酸计)。在大于10重量％的总固体含量中，所述生物质优选占1至4重量％。由发酵产生的副产物和维生素含量(氨基酸、有机酸)优选小于2重量％。

在本发明的方法中，在发酵培养液中存在的生物质一般在起始时通过例如热处理灭活或消灭。但也可免除灭活。然后通过无机酸如硫酸、盐酸或磷酸或有机酸如柠檬酸、乙酸或甲酸或不同酸的混合物在发酵培养液中达到小于7的pH值，优选为2至6.5，特别优选2.5至6，更特别优选为2.5至5。可在酸化之前或之后通过公知的分离或过滤方法完全或部分分离掉生物质。一般不必须分离掉矿物质组分。然后使用公知方法(如旋转蒸发器、膜蒸发器或降膜蒸发器)优选在真空条件下将含L-赖氨酸的溶液或悬浮液浓缩直到获得的液体产物对于10重量％至55重量％、优选20重量％至55重量％、特别优选35重量％至55重量％、更特别优选45重量％至54重量％的总固体含量，其赖氨酸含量(以赖氨酸计)为10重量％至35重量％，优选为15重量％至35重量％，特别优选20重量％至35重量％，更特别优选21重量％至34重量％。一般所述发酵液如此浓缩，使得所述发酵培养液优选不沉淀出矿物质组分(无机盐)，赖氨酸存在于溶液中。可在任何加工阶段通过添加含L-赖氨酸物质来使产物中L-赖氨酸达到所需的浓度。

以这种方式获得的溶液/悬浮液具有酸性pH，易于运输，易于调配，微生物稳定，并相对于碱性溶液具有更长的贮存寿命。

在浓缩之后或其进行过程中也可进行酸化。甚至在发酵之前，可向介质中添加呈市售盐形态的具有硫酸根、氯离子、磷酸根、柠檬酸根等作用的阴离子。

术语悬浮液所涉及的事实是优选灭活的微生物呈非溶解形态存在于本发明的产物中。

                           实施例

以下借助于实际的实施例更详细地对本发明进行说明。

实施例1

生产含L-赖氨酸的发酵培养液

按本发明所采用的生产含L-赖氨酸的培养液的发酵方法已在各种现有技术专利(EP-B 0532867和US-A 5840551)中有详细叙述。

实施例2

制备不含生物质的产物

按照实施例1制备出20kg含量(以赖氨酸计)约为9.5重量％的发酵培养液。在所述发酵培养液中存在的生物质先通过80℃热处理30分钟灭活。然后通过在4000rpm下离心20分钟(Biofuge-Stratos实验离心机，Heraeus，Düsseldorf,Germany)来将所述灭活的生物质分离掉。通过逐渐添加浓硫酸将以这种方式净化的1.0升上清液的pH调整至约为4。然后使用旋转蒸发器(Büchi Rotavapor RE-120实验旋转蒸发器，Büchi-Labortechnik GmbH，Konstanz，Germany)在真空下将所述离心分离物的液体含量减少至干物质含量约为50％。

以这种方式获得的液体产物的L-赖氨酸含量为31.5重量％(以赖氨酸计)，pH值为4。总固体合计达49.3重量％。

实施例3

生产含生物质的产物

按照实施例1制备出20kg含量(以赖氨酸计)约为9.5重量％的发酵培养液。在所述发酵培养液中存在的生物质直接在生物反应器中通过80℃热处理30分钟灭活。通过逐渐添加浓硫酸将1.0升这种含生物质的发酵培养液的pH调整至约为4。然后使用旋转蒸发器(Büchi Rotavapor RE-120实验旋转蒸发器，Büchi-LabortechnikGmbH，Konstanz，Germany)在真空下将这种酸性含赖氨酸的发酵培养液的液体含量减少至干物质含量约为50％。

以这种方式获得的液体产物的L-赖氨酸含量为21.8重量％(以赖氨酸计)，pH值为4。总固体合计达50.7重量％。在20℃下贮存16个月后未观察到含量有明显改变。

Claims (5)

1.基于发酵培养液的动物饲料添加剂，其特征在于它由下列组分组成：

a)相对于所述动物饲料添加剂溶液或悬浮液的总量，以赖氨酸计为18-35重量％的L-赖氨酸和/或其盐，

b)在发酵过程中形成的生物质，其量为50至100重量％，

c)至少大多数的其它溶解和悬浮的发酵培养液组分；

所述动物饲料添加剂呈液体形态或悬浮液状态，且pH小于7。

2.如权利要求1的动物饲料添加剂，其溶液或悬浮液的pH值为2至6.5。

3.如权利要求1的动物饲料添加剂，其中所述的L-赖氨酸是硫酸盐形式的L-赖氨酸。

4.一种制备如权利要求1所述的基于发酵培养液的动物饲料添加剂的方法，其特征在于：

a)通过发酵产生含L-赖氨酸的培养液，

b)任选通过添加L-赖氨酸或含L-赖氨酸的溶液达到所需的浓度，

c)将由上述步骤所获得的培养液的pH值调整至小于7，

d)任选进行浓缩，

其中步骤b)、c)和d)的次序可以改变，以及

e)分离出如权利要求1所述的产品。

5.如权利要求4所述的制备含有赖氨酸和/或其盐的动物饲料添加剂的方法，其特征在于，所述含L-赖氨酸的培养液中的生物质任选被部分分离，并将所获得的培养液在真空中浓缩。