CN1246467C - 右旋泛酸碱土金属盐的制备方法 - Google Patents
右旋泛酸碱土金属盐的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及右旋泛酸的碱土金属盐的制备，其中在碱土金属化合物的存在下进行发酵。
Description
本发明涉及从发酵液制备右旋泛酸的碱土金属盐的方法。
背景技术
泛酸是商业上的重要维生素，其用于化妆品、药品、人营养和动物营养中。
泛酸可由化学合成制备或通过生物技术由适宜的微生物在适宜的营养液中发酵制备。外消旋泛内酯是化学合成中的重要化合物，其由甲醛、异丁醛和氰化物经多步方法制备。在进一步的方法步骤中，将外消旋混合物分离，右旋泛内酯与β-丙氨酸缩合得到右旋泛酸。
用微生物发酵制备的优点是直接形成正确的立体异构形式，即不含左旋泛酸的右旋形式的泛酸。
如EP-A-0493060、EP-A-0590857及WO 97/10340所报导，多种类型的细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、产红棒状杆菌(Corynebacteriumerythrogenes)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)和酵母例如卡斯特尔氏德巴利氏酵母(Debaromyces castellii)，在适宜的发酵条件下产生右旋泛酸。在所引文献中所述的，特别适宜的微生物是大肠杆菌IFO3547的衍生物，例如FV5069/pFV31菌株或FV5069/pFV202菌株。
在如EP-A-0493060、EP-A-0590857及WO 97/10340所述的右旋泛酸的发酵制备中，在适宜的营养培养基中培养能够产生右旋泛酸的微生物，然后根据复杂且高成本的过程分离所形成的右旋泛酸，纯化，得到其钙盐。
适宜的营养培养基含有碳源如葡萄糖或淀粉水解产物，前体如β-丙氨酸、外消旋泛酸或外消旋泛内酯，氮源如硫酸铵，磷源如磷酸钾，以及其它盐类、微量元素、氨基酸和维生素，以及任选的复合培养基添加剂如酵母提取物或玉米浆。然后在适宜的pH值、适宜的通气及搅拌下，将该微生物在该培养基中培养，这样该微生物形成右旋泛酸。
例如，EP-A-0590857描述了用于在装有2.3升或2.5升培养基的5升反应器中制备泛酸的补料分批法。在该试验例中，估计地加入固体碳酸钙来调节pH值。然而在具有好几立方米的容积的大型反应器中预先添加或后续添加固体碳酸钙极为不利，因为搅拌桨、内表面及封口上的碳酸钙沉积增加装料量，培养液的流动性和无菌条件受到不利的影响。
根据WO 96/33283和EP-A-0590857概括的现有技术，从含有泛酸的发酵液开始，经复杂且高成本的分离和纯化方法得到右旋泛酸的钙盐。通过过滤或离心对生物质进行首次分离，通过活性碳或柱层析进一步纯化处理滤液。在预处理滤液或洗脱液中加入氢氧化钙后，然后通过结晶纯化该批产物。
WO 96/33283中描述的纯化方法如下进行。在第一柱中通过活性碳使滤液脱色。用浓盐酸将pH调节至3.0，然后将液体连续通过两根添有活性碳的柱进行纯化。用甲醇进行右旋泛酸的洗脱。在充分混合下以氢氧化钙粉末进行后续中和。通过在5℃下后续结晶得到右旋泛酸钙。
在EP-A-0590857中描述的纯化方法如下进行。首先用阳离子交换和阴离子交换柱对滤液进行纯化。用盐酸进行洗脱。然后用氢氧化钙中和洗脱液，之后加入活性碳并过滤混合物。将所得滤液以低分子量醇(甲醇、乙醇、异丙醇)提取，通过结晶得到右旋泛酸钙。
以上述方法制备的右旋泛酸钙用作动物营养的饲料添加剂。
发明目的
本发明提供了用于制备右旋泛酸的碱土金属盐，尤其是钙盐与镁盐的改进方法，所得产品适于用作动物营养的饲料添加剂。
发明内容
维生素右旋泛酸是商业上的重要产品，其用于动物营养、药品、人营养和化妆品。因此提供制备泛酸或其盐的新方法受到关注。
本发明提供从发酵液制备右旋泛酸或含有右旋泛酸的混合物的碱土金属盐的方法，其特征在于：
a)在碱土金属化合物的存在下进行发酵；
b)发酵完成后，将生物质任选地全部或部分除去；
c)浓缩这样处理的发酵液；以及
d)以纯品形式或以含有发酵液成分的混合物的形式从发酵液得到右旋泛酸的碱土金属盐。
本发明还提供一种方法，其特征在于将期望量的右旋泛酸的一种或多种不同的碱土金属盐加入发酵液的成分和含有右旋泛酸的一种或多种碱土金属盐的混合物中。
本发明进一步提供用于制备右旋泛酸碱土金属盐的方法，其特征在于：
a)将生物质和含有右旋泛酸的碱土金属盐的发酵液分离；
b)浓缩无细胞的发酵液；
c)将亲水有机溶剂，特别是乙醇、甲醇或丙酮加入这样得到的浓缩物中；然后
d)分离泛酸的碱土金属盐，任选地用亲水有机溶剂洗涤，然后，若需要；
a)在亲水有机溶剂的水溶液中重结晶，任选地加入活性碳，以高纯度获得产物。
所有能够产生右旋泛酸的微生物和在适宜的发酵条件下产生右旋泛酸的微生物都适用于本发明的方法。所述微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇生产泛酸。
所述微生物可以是真菌或酵母，例如卡斯特尔氏德巴利氏酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或革兰氏阳性细菌，例如棒状杆菌属，或者也可以是革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科。在肠杆菌科中，以大肠杆菌为代表的埃希杆菌属尤应提及。在大肠杆菌中，应该提及所谓的K-12菌株，例如MG1655或W3110菌株(Neidhard等：Escherichia coli and Salmonella.Cellular and Molecular Biology(ASMPress，Washington D.C.))或大肠杆菌野生型菌株IFO3547(Institutefor Fermentation，Osaka，Japan)及其突变株。在从IFO3547获得的菌株中，应该依次提及FV5069/pFV31(EP-A-0590857、US-A-5518906)和FV5069/pFV202(WO 97/10340、US-A-5932457)。在棒状杆菌属中尤应提及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
可以在分批法中或者在补料分批法或重复补料分批法中连续或不连续地培养上述微生物，以生产右旋泛酸的碱土金属盐。对已知培养方法的总结见Chmiel编写的手册(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrungin die Bioverfahrenstechnik[Introduction to Biotechnology](GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas编写的手册(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))。
所用培养基必须适宜地满足相应微生物的需求。用于各种微生物的培养基参见美国细菌学协会(American Society for Bacteriology)的“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)。糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪，例如豆油、葵花油、花生油和椰子油，脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇，例如甘油和乙醇，还有有机酸，如乙酸，可以用作碳源。这些物质可以单独或以混合物使用。作为氮源，例如可以使用有机含氮化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独或以混合物使用。作为磷源，可以使用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。培养基还必须含有金属盐，如硫酸镁或硫酸铁，它们对细菌生长是必需的。最后，必需的生长因子如氨基酸和维生素可以和上述物质一起使用。可以在培养基中进一步加入前体如β-丙氨酸或任选地它们的盐。上述物质可以一次性添加到培养物中，也可以在培养过程中适宜地定量添加。
可以适宜的方式使用碱性化合物如氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH，在本发明方法的范围内不包括其它措施。消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于控制泡沫形成。可以添加适宜的选择性作用的物质，例如抗生素，以保持质粒的稳定性。为了保持有氧条件，可以向培养物中通入氧或含氧气体混合物，例如空气。培养物的温度通常为20℃-50℃，优选为25℃-45℃。继续培养直至形成最大量的右旋泛酸。该目的通常在10-160小时内实现。
已发现，通过在发酵过程中向发酵液中连续加入含碱土金属的无机化合物或有机酸的碱土金属盐的溶液或悬浮液，可以简单的方式生产右旋泛酸的碱土金属盐，特别是其钙盐和镁盐，所添加的含碱土金属的无机化合物例如氢氧化钙、氢氧化镁，尤其是氢氧化钙，或氧化镁，所添加的有机酸的碱土金属盐例如乙酸钙、富马酸钙或天冬氨酸钙。分批定量加入含碱土金属的化合物也是可能的。以这种方式，将形成右旋泛酸碱土金属盐所需的阳离子直接引入发酵液中。
本发明的发酵方法通常特征在于，首先以将氨用作pH调节剂和氮源的已知方式培养能够产生右旋泛酸的微生物，在随后的生产阶段，优选通过使用含碱土金属化合物，例如氢氧化钙、氢氧化镁、氧化镁、乙酸钙、富马酸钙或天冬氨酸钙的溶液或悬浮液调节pH。如果使用有机酸的钙盐，则有机基通常被微生物用作碳源。
所使用的含碱土金属化合物，尤其是氢氧化钙和氢氧化镁的溶液或悬浮液的浓度是5-50％(重量)，优选是5-30％(重量)，最优选是10-25％(重量)。根据本发明，还可能使用在这些浓度范围内的各种含碱土金属化合物的混合物。
定量加入碱土金属化合物的方式使碱土金属化合物和形成的右旋泛酸的摩尔比为1∶0.5至1∶20，优选是1∶1.3至1∶10，更优选是1∶1.3至1∶2.5，最优选的化学计量范围是1∶1.8至1∶2.2。如果需要，为了保持碱土金属化合物和形成的右旋泛酸的比例的预期范围，在发酵过程中可以通过定量加入氨水，或者如果含羧基的副产物过量形成，则加入氨气调节pH。
可以在发酵1-70小时，优选10-40小时，最优选20-25小时后定量加入碱土金属化合物。在开始定量加入碱土金属化合物时，右旋泛酸的浓度通常为0.5-70g/l，优选是5-35g/l，特别优选是20-25g/l。在定量加入碱土金属化合物时，生物质的浓度通常为1-30g干重/l，优选是10-23g干重/l，特别优选是17-21g干重/l。
本发明还提供用于以快速且低成本的方式生产含有右旋泛酸的碱土金属盐，尤其是钙盐或镁盐的粉末或饲料添加剂的方法。为此目的，将根据本发明方法制备的含有特别是右旋泛酸的钙盐或镁盐的发酵液用已知方法浓缩，所述方法如使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器。然后将以这种方式浓缩的发酵液通过喷雾干燥或冷冻干燥技术，例如参见M.L.Shuler和F.Kargi的“Bioprocess Engineering，Basic Concepts”，(Prentice Hall Inc.，Englewood Cliffs，New Jersey，USA，1992))，或者通过其它适宜的方法转化成优选是易流动性粉末或饲料添加剂。为了达到预期的浓度水平，可以在适宜的方法阶段任选地加入含有右旋泛酸钙或镁的物质或制剂。所得产品中右旋泛酸钙或镁的浓度，以右旋泛酸表示，为20-80％(重量)，优选为30-75％(重量)。该产品适于用作动物营养的饲料添加剂。
本发明者还发现了另一种生产含有右旋泛酸钙或镁的粉末或饲料添加剂的方法。为此目的，首先通过已知的分离方法，例如离心、过滤、滗析或者是后者的组合，将如上所述制备的含有特别是右旋泛酸钙或镁的发酵液和生物质全部或部分地分离。然后将无细胞的发酵液通过已知方法，例如使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器进行浓缩。然后将以这种方式浓缩的悬浮液通过包括喷雾干燥或冷冻干燥的方法或通过其它适宜的方法处理成优选是易流动性粉末。为了达到预期的浓度值，在适宜的方法阶段任选地加入含有右旋泛酸钙或镁的物质或制剂。所得产品中右旋泛酸钙或镁的浓度，以右旋泛酸表示，为20-80％(重量)，优选为30-75％(重量)。该产品适于用作动物营养的饲料添加剂。
本发明者还发现了用于以快速且低成本的方式生产含右旋泛酸钙或镁的晶体的方法。为此目的，首先将如上所述制备的含有右旋泛酸钙或镁的发酵液如上所述和生物质分离。然后将无细胞的发酵液用已知方法，例如使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器浓缩。然后将亲水有机溶剂，例如乙醇、甲醇或丙酮加入以此方式浓缩的悬浮液中。通过将悬浮液冷却至0-8℃，优选为0-5℃，使剩余固体物质沉淀出。然后通过用右旋泛酸钙或镁晶体或含有右旋泛酸钙或镁晶体的物质接种使期望的盐结晶。结晶在0-8℃，优选在0-5℃下进行，持续1小时至12天，优选1小时至10天，特别优选为1小时至8天。然后优选将这样得到的结晶产物用甲醇洗涤并干燥。如果想获得更高纯度的产物，则在甲醇的含水溶液中处理结晶产物并结晶，任选地在加入活性碳的条件下进行。甲醇的含水溶液中甲醇含量为70-99％(体积)，优选为80-99％(体积)，特别优选为90-99％(体积)。
在以这种方式得到的结晶产物中，右旋泛酸钙或镁的浓度为60-99％(重量)，更优选为70-99％(重量)，特别优选为80-99％(重量)。该产物适于在动物营养中用作饲料添加剂。
右旋泛酸的浓度可以通过已知方法测定(Velisek；Chromatographic Science 60，515-560(1992))。纯右旋泛酸钙(＞99％(重量))中右旋泛酸的含量为91.16％(重量)。纯右旋泛酸镁(＞99％(重量))中右旋泛酸的含量为94.73％(重量)。
实施例
通过实施例，下文更详细地描述本发明。
为此目的，用产生右旋泛酸的大肠杆菌5069/pFV31菌株进行试验，所述菌株按布达佩斯条约以保藏号FERM-BP 4395保藏在Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science andTechnology，其地址为1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki(Japan)(US-A-5518906)。
还进行了发酵试验，其中将富马酸或天冬氨酸的钙盐加入发酵液中，从而直接形成右旋泛酸钙。
实施例1
包括定量加入氢氧化钙悬浮液的右旋泛酸的钙盐的制备
1.接种物(主细胞库)的制备
将大肠杆菌5069/pFV31样品平铺(plate out)在加有50μg/ml氨苄西林的LBG琼脂上。将该琼脂平板培养物在37℃下培养17小时，然后放置在4℃的冷藏柜中。将选择的单个菌落在LBG肉汤中进一步繁殖。LBG肉汤的成分如下：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠5G/l和葡萄糖1g/l。LBG琼脂还含有12g/l琼脂。备用的制剂可以LB肉汤基或LB琼脂从Gibco/BRL(Paisley，Scotland，UK)获得。然后加入1G/l葡萄糖得到特定的培养基。将在100ml的锥形瓶中获得的10ml培养物在Kuhner AG(Birsfelden，Switzerland)的ESR培养箱中在37℃和180rpm的条件下培养16小时。然后在Beckmann(Hanover，Germany)的J-6B离心机中在4000rpm下离心细胞悬浮液15分钟。将细胞沉淀重新悬浮在10ml加有20％甘油的LBG培养基中，在无菌条件下分成10等分，每份1ml，在-70℃冷冻。将这些培养物用作主细胞库。
为了制备工作细胞库，将10ml部分的加有50μg/ml的氨苄西林的LBG培养基加入100ml的锥形瓶中，然后和100μl上述主细胞库一起培养。所述培养在Kuhner AG(Birsfelden，Switzerland)的ESR培养箱中在37℃和180rpm的条件下进行16小时。
培养后，用Dr.Lange(Berlin，Germany)的LP2W光度计在660nm的测量波长下测定培养物悬浮液的光密度(OD)。光密度为3.5。然后在无菌条件下将细胞培养物加入Greiner(Frickenhausen，Germany)的无菌的30ml聚乙烯试管中，用Beckmann(Hanover，Germany)的J-6B型离心机在2500rpm下离心15分钟。将分离的生物质重新悬浮在10ml加有20％甘油的LBG培养基中。然后在无菌条件下，以500μl部分将细胞悬浮液加入Nalgene(New York，U.S.A)的1ml无菌试管中，并在-70℃冷冻。将以此方式制备的冷冻细胞悬浮液用作工作细胞库。
2.含右旋泛酸钙的发酵液的制备
为了制备含右旋泛酸钙的发酵液，首先将工作细胞库在摇瓶培养箱中繁殖，然后用于接种预发酵罐。接着来自预发酵罐的培养物用于接种生产发酵罐。
将SKA培养基用于摇瓶培养物(表1)。SKA培养基如下制备：称量硫酸铵7.0g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾1.0g、七水硫酸镁0.5g、一水硫酸锰0.01g、七水硫酸锌0.001g、硫酸铁0.005g和预先用25％氨水调节pH至6.8的玉米浆20g、加入1升烧杯中、然后补充蒸馏水至825g。将该含有玉米浆的盐溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。将由25g葡萄糖和0.002g盐酸硫胺素组成并用蒸馏水补充至125g的溶液通过过滤灭菌。称取10g碳酸钙放入100ml烧瓶中，在高压灭菌器中在123℃下灭菌20分钟。通过将前述两种成分与含有玉米浆的盐溶液混合得到SKA培养基。
将该SKA培养基以12.5ml部分加入100ml锥形瓶中，然后用0.5ml细胞悬浮液接种。将已经用无菌生理盐水以1∶100的比例稀释的工作细胞培养物的冷冻样品用作细胞悬浮液。培养在Infors AG(Bottmingen，Switzerland)的RC-1-TK培养箱中在32℃和150rpm的条件下进行20小时。随后在660nm的测量波长处测定的光密度为12.5。
为了接种20kg预培养基A1-102，其是在Bioengineering(Wald，Switzerland，LP-42型)的42升容量的搅拌的反应器发酵罐得到的，将0.5ml SKA培养基以1∶100稀释，将50ml所得的悬浮液加入发酵罐中。预培养基A1-102含有表2所列的成分。在37℃的温度，0.5vvm的体积通气，20％大气饱和的氧分压和pH 6.5下，将培养物培养15.5小时，直至OD660达到11.3。
为了接种5830g主培养基M1-425，其是在B.Braun(BBI，Germany，Melsungen，Biostat E/ED型)的14升容量的搅拌的反应器发酵罐中获得的，将423ml第二预培养物加入培养基A1-102中。主培养基M1-425含有表3所列的成分。首先在37℃的温度，0.75vvm的体积通气，400rpm的最小转速，20％大气饱和的氧分压和pH 6.5下，将培养物培养6.5小时，直至OD660达到18.6。然后在37℃的温度、2％大气饱和的氧分压和pH 6.0下，将培养物进一步培养41小时，直至OD660达到66.8。在发酵13小时后，在34.5小时内添加β-丙氨酸，其浓度为152.7g/570ml水。在发酵21.5小时后，在26小时内添加10％氢氧化钙溶液，从而稳定pH。在41小时内，定量添加3.43kg葡萄糖浓度为650.8g/l，盐酸硫胺素浓度为35.7mg/l的M2-257培养基。
然后用Dr.Bruno Lange GmbH(Berlin，Germany)的LPlW型数字光度计在660nm的测量波长处测定光密度(OD)，所形成的右旋泛酸的浓度通过HPLC(Hypersil APS 25μm，250×5mm，RI检测)测定。
在47.5小时后，测定发酵样品中右旋泛酸钙的浓度为49.8g/l，浓度以右旋泛酸测定。
表1
SKA培养基的成分
| 成分 | 浓度(每升) |
| 葡萄糖 | 25克 |
| 玉米浆 | 20克 |
| 硫酸铵 | 7克 |
| 磷酸二氢钾 | 0.5克 |
| 磷酸氢二钾 | 1克 |
| 七水硫酸镁 | 0.5克 |
| 硫酸铁 | 5毫克 |
| 一水硫酸锰 | 10毫克 |
| 七水硫酸锌 | 1毫克 |
| 碳酸钙 | 10克 |
| 盐酸氯化硫胺素 | 2毫克 |
| structol | 0.7克 |
表2
A1-102培养基的成分
| 成分 | 浓度(每升) |
| 葡萄糖 | 25克 |
| 玉米浆 | 20克 |
| 硫酸铵 | 7克 |
| 磷酸二氢钾 | 0.5克 |
| 磷酸氢二钾 | 1克 |
| 七水硫酸镁 | 0.5克 |
| 七水硫酸亚铁 | 10毫克 |
| 一水硫酸锰 | 10毫克 |
| 盐酸氯化硫胺 | 3毫克 |
| structol | 0.6克 |
表3
M1-425培养基的成分
| 成分 | 浓度(每升) |
| 葡萄糖 | 18克 |
| 玉米浆 | 40克 |
| β-丙氨酸 | 15克 |
| 氯化铵 | 6.8克 |
| 硫酸铵 | 3.3克 |
| 磷酸二氢钾 | 0.6克 |
| 磷酸氢二钾 | 1.2克 |
| 七水硫酸镁 | 0.67克 |
| 一水硫酸锰 | 10毫克 |
| 盐酸氯化硫胺 | 1.6毫克 |
| structol | 0.6克 |
实施例2
包括定量加入乙酸钙溶液的右旋泛酸的钙盐的制备
将大肠杆菌FV5069/pFV31菌株如实施例1所述在SKA摇瓶培养基(表1)中培养。然后将悬浮液以1∶100稀释，将该稀释液中的17.5ml悬浮液用于接种14升容量的搅拌的反应器发酵罐(BBI，Germany，Melsungen，Biostat E Model)中的7kg A1-102培养基(表2)。
在37℃的温度，0.5vvm的体积通气，20％大气饱和的氧分压和pH 6.5下将培养物培养15.5小时，直至OD660达到11.6。
在生产发酵罐(14升搅拌的反应器发酵罐，BBI，Germany，Melsungen，Biostat ED型)中接种后，建立与实施例1所述相同的培养条件。将25％(重量)的乙酸钙用于调节pH。24小时后完成用乙酸钙替换氨水。发酵的总操作时间为52小时。在40小时内定量加入3.4kg M2培养基。发酵结束时，测定的右旋泛酸钙的浓度为43.7g/l，浓度以右旋泛酸测定。
实施例3
含右旋泛酸钙产品的制备
首先将1.0升根据实施例1的方法制备的含右旋泛酸钙的发酵液在旋转蒸发器(Buchi Rotavapor RE-120实验室旋转蒸发器，Buchi-Labortechnik GmbH，Constance，Germany)中在60℃真空蒸发，将液体部分减少至固体含量约为50％。然后喷雾干燥(Buchi-190实验室喷雾干燥器，进口温度107℃，出口温度78℃，-40mbar，600NL/h，Buchi-Labortechnik GmbH，Constance，Germany)以此方式浓缩的发酵液，得到泛酸的钙盐。
以此方式制备的产品的含量为42％(重量)，以右旋泛酸测定。
实施例4
含右旋泛酸钙的无生物质的产品的制备
首先在1.0升根据实施例1所述的方法制备的含右旋泛酸钙的发酵液中通过离心(Biofuge-Stratos实验室离心机，Heraeus，Dusseldorf，Germany；20分钟，4000rpm)分离生物质。然后在旋转蒸发器(BuchiRotavapor RE-120实验室旋转蒸发器，Buchi-Labortechnik GmbH，Constance，Germany)中在60℃真空处理所得发酵液，将液体部分减少至固体含量约为50％。然后喷雾干燥以此方式浓缩的发酵液，形成泛酸的钙盐(Buchi-190实验室喷雾干燥器，进口温度107℃，出口温度78℃，-40mbar，600NL/h，Buchi-Labortechnik GmbH，Constance，Germany)。
如上所述制备的产品的含量为64％(重量)，以右旋泛酸测定。
实施例5
晶体右旋泛酸钙的制备
将3600g根据实施例1制备的含右旋泛酸钙的发酵液通过过滤分离生物质，通过在旋转蒸发器(Buchi Rotavapor RE-120实验室旋转蒸发器，Buchi-Labortechnik GmbH，Constance，Germany)中在60℃蒸发将所得滤液浓缩至700g。然后收集残余物并溶解在3200g甲醇中。将溶液冷却至室温后，通过离心(Biofuge-Stratos实验室离心机，Heraeus，Dusseldorf，Germany；20分钟，4000rpm)分离不溶物。将以此方式澄清的上清液再次在旋转蒸发器中浓缩至干，再次将残余物溶解在950g甲醇中。冷却至2℃后，通过用2.5g右旋泛酸钙晶体接种，泛酸的钙盐开始从所获得的浓缩溶液中结晶。
真空分离有机相后，得到含量为84％(重量)右旋泛酸钙的晶体产品。
在进一步的重结晶步骤中，成功地将含量提高到96％(重量)。
实施例6
包括定量加入氢氧化镁悬浮液的右旋泛酸的镁盐的制备
用于预培养的接种物如实施例1所述制备。为了接种在B.Braun的14升容量的搅拌的反应器发酵罐(BBI，Germany，Melsungen，Biostat E/ED型)中得到的5830g初级培养基M1-425，加入处于培养基A1-102中的846ml第二预培养物。初级培养基M1-425含有如表3所列的成分。首先将培养物在37℃的温度，0.75vvm的体积通气，400rpm的最小搅拌速率和pH 6.5以及2％大气饱和的氧分压下培养6.5小时，直至OD660达到22.0。然后在37℃的温度，2％大气饱和的氧分压和pH 6.0下另外培养48小时，直至OD660达到67.6。发酵23小时后，在31.5小时的时间内定量加入15％Mg(OH)2悬浮液以稳定pH。在48小时内定量加入4.28kg葡萄糖浓度为584.7g/l)，β-丙氨酸浓度为50.7g/l，盐酸硫胺素浓度为35.7mg/l的培养基M2-261。
然后用(Dr.Bruno Lange GmbH(Berlin，Germany)的LP1W型数字光度计在660nm的测量波长处测定光密度(OD)，所形成的右旋泛酸的浓度用HPLC(Hypersil APS 25μm，250×5mm，RI检测器)测定。
54.5小时后，发酵样品中右旋泛酸镁的浓度为48.2g/l，浓度以右旋泛酸测定。
Claims (10)
1.从发酵液制备右旋泛酸的一种或多种碱土金属盐或含有右旋泛酸的一种或多种碱土金属盐的混合物的方法，所述方法包括：
a)发酵在发酵液中产生右旋泛酸的微生物，其中在1-70小时的发酵时间过去之后向发酵液中加入选自氧化钙、氢氧化钙、氢氧化镁和氧化镁的一种或多种碱土金属化合物以及有机酸的碱土金属盐；
b)发酵完成后，将生物质任选地全部或部分除去；
c)浓缩发酵液；以及
d)以纯品形式或以含有发酵液成分的混合物的形式得到右旋泛酸的一种或多种碱土金属盐。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
碱土金属化合物的添加在右旋泛酸浓度为0.5-70g/l时开始。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
碱土金属化合物的添加在右旋泛酸浓度为5-35g/l时开始。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
加入发酵液中的碱土金属化合物和右旋泛酸的摩尔比为1∶0.5至1∶20。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
加入发酵液中的碱土金属化合物和右旋泛酸的摩尔比为1∶1.3至1∶10。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
在发酵过程中，将含碱土金属的化合物分批或连续，单独或以混合物，至少以与右旋泛酸形成相同的化学计量比加入发酵液中。
7.如权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其特征在于：
加入一种或多种有机酸的钙盐。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
加入富马酸或天冬氨酸的钙盐。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
a)将生物质和含有右旋泛酸的碱土金属盐的发酵液分离；
b)浓缩无细胞的发酵液；
c)将亲水有机溶剂加入这样得到的浓缩物中；然后
d)右旋泛酸的碱土金属盐结晶，若需要则进一步纯化。
10如权利要求1-6和9之任一项所述的方法，其特征在于：
将右旋泛酸的一种或多种不同的碱土金属盐加入发酵液的成分和含有右旋泛酸的一种或多种碱土金属盐的混合物中。
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