WO2015039904A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von gamma-glutamylcystein und derivaten dieses dipeptids - Google Patents

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WO2015039904A1
WO2015039904A1 PCT/EP2014/069029 EP2014069029W WO2015039904A1 WO 2015039904 A1 WO2015039904 A1 WO 2015039904A1 EP 2014069029 W EP2014069029 W EP 2014069029W WO 2015039904 A1 WO2015039904 A1 WO 2015039904A1
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WO
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glutamylcysteine
fermentation
glutamylcystine
production
fermentation medium
Prior art date
Application number
PCT/EP2014/069029
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English (en)
French (fr)
Inventor
Marcel THÖN
Markus Brunner
Original Assignee
Wacker Chemie Ag
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Application filed by Wacker Chemie Ag filed Critical Wacker Chemie Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids

Definitions

  • the invention relates to a process for the fermentative production of ⁇ -glutamylcysteine (yGC) and the derivatives of this dipeptide, ⁇ -glutamylcystine and bis- ⁇ -glutamylcystine.
  • yGC ⁇ -glutamylcysteine
  • DE 102013209274 describes various E. coli strains which all have a reduced glutathione synthetase activity and additionally have a higher ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity than a comparable strain with a likewise reduced one Glutathione synthetase activity.
  • This application further describes that ⁇ -glutamylcysteine titers of 5.7 g / l up to 21.8 g / l can be achieved by fermentation of the E. coli strains disclosed therein (see DE10201320927, Examples 3 and 4).
  • the object of the present invention is therefore to provide an improved process for the fermentative production of ⁇ -glutamylcysteine and its derivatives bis- ⁇ -glutamylcystine and ⁇ -glutamylcystine.
  • the object is achieved in that the fermentation medium at the beginning of the process has a pH of pH 6.8 to pH 7.3 and the pH from the beginning of the production phase over a period of 0.5 h to 2.5 h is adjusted to an acidic pH between 5.0 and 6.5.
  • pH values of the fermentation medium are given in the range of 4 to 10 (see paragraph [0036] in FIG.
  • a pH of the fermentation medium in the acidic range between 5.0 and 6.5 is maintained during the entire production phase.
  • Preferred is a pH in the range of 5.0 to 5.5.
  • the pH is lowered automatically to the stated pH values at the beginning of the production phase (preferably 0.5 pH units per 0.5 h).
  • the pH thus achieved is then kept until the end of the fermentation.
  • the cells of the microorganism strain are removed from the fermentation medium and the desired products are purified from the culture medium.
  • All prokaryotic microorganism strains which can be cultured by fermentation and have the biosynthesis pathway for ⁇ -glutamylcysteine are suitable for the process according to the invention, and the ⁇ -glutamylcysteine and its derivatives release ⁇ -glutamylcystine and ⁇ -glutamylcystine into the medium.
  • Examples of such strains are disclosed in US 20100203592 A1 and DE 102013209274, wherein the strains mentioned in DE 102013209274 are preferably used.
  • the cultivation (fermentation) of the microorganism strains is preferably carried out on an industrial scale according to the usual, the
  • the fermentation preferably takes place in a conventional bioreactor, for example a stirred tank, a bubble column fermenter or an airlift fermenter. Particularly preferred is a stirred tank fermentor.
  • a fermenter size of at least 2 l should be understood. Preference is given to fermenters having a volume of more than 5 l, more preferably fermenters having a volume of
  • the cultivation of the cells for ⁇ -glutanyl cysteine production is carried out under aerobic growth conditions, the oxygen content being set during fermentation at a maximum of 50% saturation.
  • the regulation of the oxygen saturation in the culture takes place automatically via the gas supply and the stirring speed.
  • the carbon source used are preferably sugars, sugar alcohols, organic acids or sugar-containing plant hydrolysates.
  • glucose, fructose, lactose, glycerol or mixtures containing two or more of these compounds are particularly preferably used as the carbon source.
  • the carbon source of the culture is preferably metered in such that the content of the carbon source in the fermenter does not exceed 10 g / l during the production phase. Preferred is a maximum concentration of 2 g / l.
  • the production phase of the fermentation process according to the invention begins with the time from which ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine or ⁇ -glutamylcystine can be detected in the culture broth for the first time and lasts until the end of the cultivation.
  • the detection of ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine or ⁇ -glutamylcystine in the culture broth takes place as described in Ex. Typically, this phase begins about 8-12 hours after inoculation of the production fermenter with a preculture.
  • the nitrogen source used in the process according to the invention is preferably ammonia, ammonium salts or protein hydrolyzates. When using ammonia as a correction agent for pH stabilization, this nitrogen source is regularly replenished during the fermentation.
  • As further media additives can salts of the elements phosphorus, chlorine, sodium, magnesium, nitrogen, potassium, calcium, iron and in traces (ie in ⁇ concentrations) salts of the elements Molybdenum, boron, cobalt, manganese, zinc and nickel are added.
  • organic acids e.g., acetate, citrate
  • amino acids e.g., L-glutamic acid, L-cysteine
  • vitamins e.g., Bl, B6
  • L-glutamic acid can either be used directly as acid or in the form of one of its salts, e.g. Potassium or sodium glutamate, used singly or as a mixture. The use in the form of potassium glutamate is preferred.
  • the incubation temperature for mesophilic microorganisms e.g. E. coli is preferably 15-45 ° C, more preferably 30-37 ° C.
  • Microorganisms that are fermented according to the process described secrete in a batch or fed-batch process.
  • Example 1 yGC production (fermenter)
  • a portion of the respective preculture 1 was inoculated into a fermenter filled with fermentation medium type Sixfors (Infors AG, Bottmingen, CH), so initially an optical density of about 0.01 in the fermenter was present (measured at 600 nm).
  • the fermenter used had a total volume of 1 1 and an initial working volume of 0.7 1.
  • the fermentation medium contained the following components: 3 g / 1 (NH 4 ) 2 S0 4 , 1.7 g / 1 KH 2 P0 4 , 0.25 g / 1 NaCl, 0.6 g / 1 MgS0 4 x 7 H 2 0 , 0.03 g / l CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O, 0.15 g / 1 FeS0 4 ⁇ 7 H 2 O, 1 g / 1 Na 3 citrate ⁇ 2 H 2 0, 5 g / 1 Cornsteep Dry (CSD ) and 3 ml / 1 trace element solution (consisting of 2.5 g / 1 H 3 B0 3 , 0.7 g / 1 CoCl 2 ⁇ 6 H 2 O, 0.25 g / 1 CuS0 4 ⁇ 5 H 2 0, 1 , 6 g / 1 MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O, 0.3 g / 1 ZnS0 4 ⁇ 7 H 2 O, 0.15 g / 1 Na 2
  • the following constituents were added under sterile conditions: 40 g / 1 glucose, 0.018 g / 1 vitamin B1, 0.09 g / 1 vitamin B6 and 15 mg / 1 tetracycline.
  • the pH in the pre-fermenter was adjusted to 7.0 by addition of a 25% NH 4 OH solution.
  • the pH was maintained at a value of 7.0 by automatic correction with a 25% NH 4 OH solution.
  • the cultures were initially stirred at 400 rpm and gassed at a gassing rate of 0.7 volume per volume per minute (vvm) of compressed air deaerated by a sterile filter. Under these starting conditions, the oxygen probe was calibrated to 100% saturation prior to inoculation.
  • the target value for the 0 2 saturation during the fermentation was set to 50%. After lowering the 0 2 saturation below the target value, a regulatory cascade was started to bring the 0 2 saturation back to the target value.
  • the gas supply was initially increased continuously (to a maximum of 1.4 vvm) and then the stirring speed was increased continuously to a maximum of 1,200 rpm.
  • Main culture main fermenter
  • the fermentations were carried out in fermenters of the BIOSTAT B-DCU type from Sartorius Stedim GmbH (Göttingen, Germany). A culture vessel with 2 l total volume at an initial working volume of 1 l was used.
  • the fermentation medium contains the following components: 3 g / 1 (NH 4 ) 2 S0 4 , 1.7 g / 1 KH 2 P0 4 , 0.25 g / 1 NaCl, 0.6 g / 1 MgS0 4 x 7 H 2 0 , 0.03 g / l CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O, 0.15 g / 1 FeS0 4 ⁇ 7 H 2 O, 1 g / 1 Na 3 citrate ⁇ 2 H 2 O, 15 g / 1 Cornsteep Dry (CSD ) and 3 ml / 1 trace element solution (consisting of 2.5 g / 1 H 3 B0 3 , 0.7 g / 1 CoCl 2 ⁇ 6 H 2 O, 0.25 g / 1
  • the pH value in a so-called "ramp function" was automatically lowered slowly to values between 6.5 and 4.5 (0.5 pH units per 0.5 h) .
  • the pH value thus obtained was subsequently
  • the cultures were initially stirred at 400 rpm and gassed with 2 vvm of compressed air sterilized by a sterile filter Under these starting conditions, the oxygen probe was calibrated to 100% saturation prior to inoculation 0 2 saturation during the fermentation was set to 50% After lowering the 0 2 saturation below the set value, a regulatory cascade was started to bring the 0 2 saturation back to the setpoint value, whereby the gas supply initially became continuous increased (to a maximum of 5 vvm) and then continuously increased the stirring speed to a maximum of 1,500 rpm.
  • the fermentations were carried out at a temperature of 32 ° C. As soon as the glucose content in the fermenter of had dropped 10 g / 1 to about 2 g / 1, a continuous addition of a 60% glucose solution was carried out. The feeding rate was adjusted so that the glucose concentration in the fermenter no longer exceeded 2 g / 1. The glucose determination was carried out with a glucose analyzer from YSI (Yellow Springs, Ohio, USA).
  • glutamate in the form of a sterile 2.3 M potassium glutamate stock solution was additionally added to the main culture at a rate of 7.4 mmol / l per hour.
  • the fermentation time was 72 hours. After 24 h, 48 h and 72 h, samples were taken and, after reduction with dithiothreitol, the proportion of "total ⁇ -glutamylcysteine" in the culture supernatant was determined by means of HPLC analysis The yield increases by lowering the pH value in comparison to fermentations with a consistently constant pH of 7.0 are summarized in Table 1.
  • total ⁇ -glutamylcysteine are ⁇ -glutamyl cysteine and the oxidation products formed therefrom
  • the microorganisms were separated from the fermentation broth by a centrifugation step and a subsequent sterile filtration.
  • the y-glutamylcysteine derivatives in the sample to be measured were incubated for 1 hour at room temperature (22 ° C.) with an reduced nine molar excess of dithiothreitol (DTT). Since the reducing action of DTT is complete only at neutral to alkaline pH, the pH of the sample was previously adjusted to pH> 7.0, if necessary, with concentrated potassium hydroxide (KOH).
  • DTT dithiothreitol
  • the HPLC analysis was carried out with the column Synergi 4 m Hydro-RP 250 x 4.6 mm (Phenomenex Ltd., Aillesburg, D) at 20 ° C.
  • the eluent used was 0.5% (v / v) phosphoric acid (A) or acetonitrile (B).
  • DAD diode array detector
  • the reference substance used to determine the retention time of ⁇ -glutamylcysteine and the final concentration in the samples to be measured was reduced ⁇ -glutamylcysteine from Sigma Aldrich GmbH (Steinheim, D).
  • the concentration of "total-y-glutamylcysteine” was calculated on the basis of the peak areas in the chromatogram (see FIG. 1).
  • Table 1 Influence of the pH on the final ⁇ -glutamylcysteine yields. Content of "total y-glutamylcysteine" (yGC) after neutralization of the fermenter broth and subsequent reduction of the oxidation products bis-y-glutamylcystine and

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von γ-Glutamylcystein und dessen Derivaten bis-γ-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin bei dem ein zur γ-Glutamylcystein-Produktion geeigneter prokaryotischer Mikroorganismenstamm in einem Fermentationsmediums kultiviert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium zu Beginn der γ-Glutamylcystein-Produktionsphase auf einen pH-Wert größer 5,0 und kleiner 6,5 eingestellt wird.

Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von Gamma-Glu amyl- cystein und Derivaten dieses Dipeptids
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Her- Stellung von γ-Glutamylcystein (yGC) und den Derivaten dieses Dipeptids, γ-Glutamylcystin und bis-y-Glutamylcystin .
Der Stand der Technik zur fermentativen Herstellung dieser Verbindungen ist in DE 102013209274 ausführlich beschrieben.
Als prokaryotische Produzenten für γ-Glutamylcystein sind in US 20100203592 AI verschiedene Escherichia coli-Stämme beschrieben, welche alle eine erhöhte gshÄ- Expression aufweisen. Darüber hinaus besitzen diese Stämme eine normale oder sogar erhöhte Glutathionsynthetase-Aktivität im Vergleich zum entsprechenden Ausgangsstamm. Die Ausbeuten mit diesen Stämmen liegen bei maximal 262 mg/1.
Als weitere prokaryotische Produzenten für γ-Glutamylcystein sind in DE 102013209274 verschiedene E. coli-Stämme beschrieben, welche alle eine verminderte Glutathionsynthetase- Aktivität besitzen, und zusätzlich eine höhere y- Glutamylcystein-Synthetase-Aktivität aufweisen, als ein vergleichbarer Stamm mit einer ebenfalls verminderten Glutathion- Synthetase-Aktivität . Diese Anmeldung beschreibt darüber hinaus, dass durch Fermentation der dort offenbarten E. coli- Stämme γ-Glutamylcystein-Titer von 5,7 g/1 bis zu 21,8 g/1 erzielt werden können (siehe DE10201320927 , Beispiele 3 und 4) . Aufgrund laufend steigender Rohstoff- und Energiekosten ist es erstrebenswert, die Produkt -Ausbeute eines mikrobiellen Prozesses kontinuierlich zu steigern, um auf diese Weise die Wirtschaftlichkeit des entsprechenden Prozesses zu verbessern. Neben der gentechnischen Veränderung von Mikroorganismen, wel- che als Basis für die Herstellung eines bestimmten Naturstoffs genutzt werden, spielt auch die Optimierung des entsprechenden Fermentationsverfahrens, d.h. die Art und Weise der Kultivierung der Zellen, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Verbesserung eines Produktionsprozesses . Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von γ- Glutamylcystein und dessen Derivaten bis-y-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass das Fermentationsmedium zu Beginn des Verfahrens einen pH-Wert von pH 6,8 bis pH 7,3 hat und der pH-Wert ab Beginn der Produktionsphase über einen Zeitraum von 0,5 h bis 2,5 h auf einen sauren pH-Wert zwischen 5,0 und 6,5 eingestellt wird.
Generell ist es bekannt, prokaryotische Mikroorganismen bei unterschiedlichen pH-Werten zu kultivieren. So werden beispielsweise für E. coli pH-Werte des Fermentationsmediums im Bereich von 4 bis 10 angegeben (siehe Absatz [0036] in
EP 1191106 Bl) .
Laut Stand der Technik wird für die fermentative Herstellung von γ-Glutamycystein oder Glutathion mit einem prokaryotischen Mikroorganismus ein pH-Wert des Mediums im Bereich von 5,0 bis 9,0 genutzt, wobei ein pH Bereich von 6,0 bis 7,5 bevorzugt ist (siehe die Absätze [0173] und [0221] in US 20100203592A1) . Eine Korrelation zwischen pH-Wert und Produktausbeute (yGC und/oder Glutathion) ist in US 20100203592 AI jedoch nicht beschrieben .
Überraschenderweise wurde aber gefunden, dass die extrazellulären Ausbeuten an Gesamt-y-Glutamylcystein (γ-Glutamycystein + γ-Glutamycystin + bis-y-Glutamycystein) dadurch gesteigert werden können, wenn der pH-Wert des Fermentationsmediums, in dem der für die γ-Glutamylcystein-Produktion geeignete, prokaryoti- sehe Mikroorganismus kultiviert wird, zu Beginn der Produktionsphase von 7,0 schrittweise auf Werte zwischen 5,0 und 6,5 abgesenkt wird (siehe Tabelle 1) . Die höchsten Titer an Ge- samt-y-Glutamylcystein werden dabei bei einem recht sauren pH- Wert von 5,0 erzielt. Dies ist dahingehend ungewöhnlich, da der zur γ-Glutamylcystein- Produktion genutzte Mikroorganismus, E. coli, für ein optimales Wachstum, einen weniger sauren bis leicht basischen pH-Wert im Bereich von 6,4 bis 7,2 benötigt (Manderson et al . , 2006, J. Ind. Microbiol . Biotechnol . 33: 173-182) .
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird daher während der ge~ samten Produktionsphase ein pH-Wert des Fermentationsmediums im sauren Bereich zwischen 5,0 und 6,5 eingehalten. Bevorzugt ist ein pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 5,5.
Vorzugsweise wird der pH Wert mit Beginn der Produktionsphase automatisch auf die genannten pH-Werte langsam (vorzugsweise 0,5 pH-Einheiten pro 0,5 h) abgesenkt. Der so erreichte pH- Wert wird anschließend bis zum Fermentationsende gehalten.
Vorzugsweise werden die Zellen des Mikroorganismenstammes aus dem Fermentationsmedium entfernt und die gewünschten Produkte aus dem Kulturmedium aufgereinigt .
Für das erfindungsgemäße Verfahren sind alle durch Fermentation kultivierbaren prokaryotisehen Mikroorganismenstämme geeig- net, die den Biosyntheseweg für γ-Glutamylcystein aufweisen, und die γ-Glutamylcystein und dessen Derivate bis-γ- Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin ins Medium ausschleusen. Beispiele solcher Stämme sind offenbart in US 20100203592 AI und DE 102013209274, wobei die in DE 102013209274 genannten Stämme bevorzugt eingesetzt werden.
Die Kultivierung (Fermentation) der Mikroorganismenstämme erfolgt bevorzugt im technischen Maßstab nach üblichen, dem
Fachmann bekannten Fermentationsverfahren.
Die Fermentation findet dabei vorzugsweise in einem üblichen Bioreaktor, beispielsweise einem Rührkessel, einem Blasensäulen-Fermenter oder einem Airlift-Fermenter statt. Besonders bevorzugt ist ein Rührkessel-Fermenter. Unter technischem Maß- stab ist dabei eine Fermentergröße von mindestens 2 1 zu verstehen. Bevorzugt sind Fermenter mit einem Volumen mehr als 5 1, besonders bevorzugt Fermenter mit einem Volumen von
> 50 1. Die Kultivierung der Zellen für eine γ-Glutanvylcystein- Produktion wird unter aeroben Wachstumsbedingungen durchgeführt, wobei der Sauerstoff-Gehalt während der Fermentation bei maximal 50 % Sättigung eingestellt wird. Die Regulation der Sauerstoff-Sättigung in der Kultur erfolgt dabei automatisch über die Gaszufuhr und die Rührgeschwindigkeit.
Als Kohlenstoffquelle dienen vorzugsweise Zucker, Zuckeralko- hole, organische Säuren oder zuckerhaltige Pflanzenhydrolysa- te . Besonders bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren als Kohlenstoffquelle Glukose, Fruktose, Laktose, Glycerin o- der Gemische, die zwei oder mehr dieser Verbindungen enthalten, eingesetzt. Bevorzugt wird die Kohlenstoffquelle der Kul- tur so zudosiert, dass der Gehalt der Kohlenstoffquelle im Fermenter während der Produktionsphase 10 g/1 nicht übersteigt. Bevorzugt ist eine maximale Konzentration von 2 g/1.
Die Produktionsphase des erfindungsgemäßen Fermentationsver- fahrens beginnt mit dem Zeitpunkt, ab dem erstmals γ-Glutamyl- cystein, bis-y-Glutamylcystin oder γ-Glutamylcystin in der Kulturbrühe nachgewiesen werden kann und dauert bis zum Ende der Kultivierung an. Der Nachweis von γ-Glutamylcystein, bis-γ- Glutamylcystin oder γ-Glutamylcystin in der Kulturbrühe erfolgt dabei wie in Bsp. 2 beschrieben. Typischerweise beginnt diese Phase ca. 8-12 h nach Inokulation des Produktionsfermenters mit einer Vorkultur.
Als Stickstoff-Quelle werden im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise Ammoniak, Ammoniumsalze oder Proteinhydrolysate verwendet. Bei Verwendung von Ammoniak als Korrekturmittel zur pH-Stabilisierung wird während der Fermentation regelmäßig diese Stickstoff-Quelle nachdosiert. Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d.h. in μΜ Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink und Nickel zugesetzt werden .
Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Acetat, Citrat) , Aminosäuren (z.B. L-Glutaminsäure , L-Cystein) und Vitamine (z.B. Bl, B6) dem Medium zugesetzt werden.
L-Glutaminsäure kann dabei entweder direkt als Säure oder in Form eines ihrer Salze, wie z.B. Kalium- oder Natrium- Glutamat, einzeln oder als Gemisch, eingesetzt werden. Bevor- zugt ist der Einsatz in Form von Kalium-Glutamat .
Als komplexe Nährstoffquellen können z.B. Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojamehl oder Malzextrakt zum Einsatz kommen. Die Inkubationstemperatur für mesophile Mikroorganismen wie z.B. E. coli beträgt vorzugsweise 15 - 45 °C, besonders bevorzugt 30 - 37 °C.
Mikroorganismen, die nach dem beschriebenen Verfahren fermen- tiert werden, sezernieren in einem Batch- oder Fedbatch-
Prozess nach einer Anwachsphase in einem Zeitraum von mindestens 48 h Stunden γ-Glutamylcystein und die davon abgeleiteten Verbindungen γ-Glutamylcystin und Bis-y-Glutamylcystin mit hoher Effizienz in das Fermentationsmedium.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1: yGC-Produktion (Fermenter)
A. Vorkultur 1 (Schüttelkolben) :
100 ml LB-Medium mit 15 mg/1 Tetracyclin wurden in einem 1 1- Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit den in Tabelle 1 aufgelisteten E. coli-Stämmen von einer Agarkultur beimpft und für sieben Stunden auf einem Schüttler bei 130 rpm und 32°C inkubiert. Die Generierung der in Tabelle 1 aufgeführten E. coli- Stämme ist in DE 102013209274 beschrieben (siehe
DE102013209274 ; Beispiele 1 bis 7) . B. Vorkultur 2 (Vorfermenter) :
Ein Teil der jeweiligen Vorkultur 1 wurde in einen mit Fermentationsmedium gefüllten Fermenter des Typs Sixfors (Infors AG, Bottmingen, CH) überimpft, sodass zu Beginn eine optische Dichte von ca. 0,01 im Fermenter vorlag (gemessen bei 600 nm) . Der verwendete Fermenter hatte ein Gesamtvolumen von 1 1 und ein initiales Arbeitsvolumen von 0,7 1.
Das Fermentationsmedium enthielt folgende Bestandteile: 3 g/1 (NH4)2S04, 1,7 g/1 KH2P04, 0,25 g/1 NaCl, 0,6 g/1 MgS04 x 7 H20, 0,03 g/1 CaCl2 x 2 H20, 0,15 g/1 FeS04 x 7 H20, 1 g/1 Na3Citrat x 2 H20, 5 g/1 Cornsteep Dry (CSD) und 3 ml/1 Spurenelementlösung (bestehend aus 2,5 g/1 H3B03, 0,7 g/1 CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/1 CuS04 x 5 H20, 1,6 g/1 MnCl2 x 4 H20, 0,3 g/1 ZnS04 x 7 H20, 0,15 g/1 Na2Mo04 x 2 H20) . Nach Sterilisation dieses Grundmediums wurden unter sterilen Bedingungen folgende Bestandteile zudosiert: 40 g/1 Glukose, 0,018 g/1 Vitamin Bl, 0,09 g/1 Vitamin B6 und 15 mg/1 Tetracyclin. Der pH-Wert im Vorfermenter wurde durch Zugabe einer 25%-igen NHOH-Lösung auf 7,0 einge- stellt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische Korrektur mit einer 25%-igen NH4OH-Lösung auf einem Wert von 7,0 gehalten. Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit einer Begasungsrate von 0,7 Volumen pro Volumen pro Minute (vvm) einer über einen Sterilfilter ent- keimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingungen war die Sauersto f-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden. Der Soll-Wert für die 02-Sättigung während der Fermentation wurde auf 50% eingestellt. Nach Absinken der 02-Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die 02-Sättigung wieder an den Soll -Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max. 1,4 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit auf maximal 1.200 rpm kontinuierlich gesteigert.
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 32 °C so lange durchgeführt, bis eine optische Dichte von 30 bis 40 erreicht wurde (gemessen bei 600 nm) . Dies war in der Regel nach ca. 17 h der Fall. C. Hauptkultur (Hauptfermenter) :
Die Fermentationen wurden in Fermentern des Typs BIOSTAT B-DCU der Firma Sartorius Stedim GmbH (Göttingen, D) durchgeführt. Es wurde ein Kulturgefäß mit 2 1 Gesamtvolumen bei einem ini- tialen Arbeitsvolumen von 1 1 verwendet. Das Fermentationsmedium enthält folgende Bestandteile: 3 g/1 (NH4)2S04, 1,7 g/1 KH2P04, 0,25 g/1 NaCl, 0,6 g/1 MgS04 x 7 H20, 0,03 g/1 CaCl2 x 2 H20, 0,15 g/1 FeS04 x 7 H20, 1 g/1 Na3Citrat x 2 H20, 15 g/1 Cornsteep Dry (CSD) und 3 ml/1 Spurenelementlösung (bestehend aus 2,5 g/1 H3B03, 0,7 g/1 CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/1 CuS04 x 5 H20, 1,6 g/1 MnCl2 x 4 H20, 0,3 g/1 ZnS04 x 7 H20, 0,15 g/1 Na2Mo0 x 2 H20) . Nach Sterilisation dieses Grundmediums wurden unter sterilen Bedingungen folgende Bestandteile zudosiert: 10 g/1 Glukose, 0,018 g/1 Vitamin Bl, 0,09 g/1 Vitamin B6 und 15 mg/1 Tetracyclin.
Zum Animpfen der Hauptkultur wurden 100 ml der Vorkultur 2 in das Fermentergefäß überführt. Der pH-Wert im Hauptfermenter wurde zu Beginn durch Zugabe einer 25%-igen NH4OH-Lösung auf 7,0 eingestellt und durch automatische Korrektur mit einer 25%-igen NH4OH-Lösung auf diesem Wert gehalten. Mit Beginn der Produktionsphase wurde der pH-Wert in einer sogenannten „Rampenfunktion" automatisch auf Werte zwischen 6,5 und 4,5 langsam abgesenkt (0,5 pH-Einheiten pro 0,5 h) . Der so erreichte pH-Wert wurde anschließend bis zum Fermentationsende gehalten. Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit 2 vvm einer über einen Sterilfilter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingungen war die Sauerstoff-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden. Der Soll- Wert für die 02-Sättigung während der Fermentation wurde auf 50% eingestellt. Nach Absinken der 02-Sättigung unter den Soll- Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die 02- Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max. 5 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit auf maximal 1.500 rpm kontinuierlich gesteigert.
Die Fermentationen wurden bei einer Temperatur von 32 °C durchgeführt. Sobald der Glukose-Gehalt im Fermenter von an- fanglich 10 g/1 auf ca. 2 g/1 abgesunken war, erfolgte eine kontinuierliche Zudosierung einer 60%-igen Glukose-Lösung . Die Fütterungsrate wurde so eingestellt, dass die Glukosekonzentration im Fermenter 2 g/1 fortan nicht mehr überstieg. Die Glukose-Bestimmung wurde mit einem Glukose-analysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA) durchgeführt.
Nach 5 h Fermentationszeit erfolgte die Zufütterung einer Schwefelquelle in Form einer sterilen 1,5 M (NH4)2S04- Stammlösung (Ammoniumsulfat) mit einer Rate von 8-17 mmol/1 pro Stunde (Durchschnitt = 11 mmol/1 pro Stunde) .
Nach 16 h wurde der Hauptkultur zusätzlich Glutamat in Form einer sterilen 2,3 M Kaiiumglutamat-Stammlösung mit einer Rate von 7,4 mmol/1 pro Stunde zugesetzt.
Die Fermentationsdauer betrug 72 Stunden. Nach 24 h, 48 h und 72 h wurden Proben entnommen und nach Reduktion mit Dithioth- reitol der Anteil an „Gesamt-y-Glutamylcystein" im Kulturüberstand mittels HPLC-Analytik bestimmt. Die Ausbeutesteigerungen durch Absenkung des pH-Wertes im Vergleich zu Fermentationen mit einem durchweg konstanten pH-Wert von 7,0 sind in Tabelle 1 zusammengefasst .
Beispiel 2 : Analytik von γ-Glutamylcystein und den Derivaten
Unter dem Begriff „Gesamt-y-Glutamylcystein" sind y-Glutamyl- cystein und die daraus gebildeten Oxidationsprodukte
bis-y-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin, die während der Fermentation entstehen und im Kulturüberstand akkumulieren, zusammengefasst . Die Konzentrationen an „Gesamt-y-Glutamylcystein" wurden mittels HPLC-Analytik bestimmt.
A. Vorbehandlung der Proben
Für die zu vermessenen Fermenterproben wurden zunächst die Mikroorganismen durch einen Zentrifugationsschritt und eine anschließende Sterilfiltration von der Fermentationsbrühe ge- trennt.
Für die exakte Bestimmung der „ Gesamt-y-Glutamylcystein- Konzentration" wurden die y-Glutamylcystein-Derivate in der zu vermessenden Probe 1 Stunde bei Raumtemperatur (22 °C) mit ei- neun molaren Überschuss an Dithiothreitol (DTT) reduziert. Da die reduzierende Wirkung von DTT nur bei neutralem bis alkalischem pH-Wert vollständig erfolgt, wurde der pH-Wert der Probe, wenn nötig, zuvor mit konzentrierter Kalilauge (KOH) auf einen pH-Wert > 7,0 eingestellt.
B . HPLC-Analytik
Nach Ansetzen entsprechender Verdünnungen mit vollentsalztem Wasser erfolgte die HPLC-Analytik mit der Säule Synergi 4 m Hydro-RP 250 x 4,6 mm (Phenomenex Ltd., Aschaffenburg, D) bei 20 °C. Als Fließmittel dienten 0,5% (v/v) Phosphorsäure (A) bzw. Acetonitril (B) .
Zur Trennung von γ-Glutamylcystein aus einem zellfreien und reduzierten Substanzgemisch wurde folgende Methode für die HPLC genutzt .
• Flussrate = 0,5 ml/min
• Detektion bei 200 nm mit Diodenarray-Detektor (DAD)
· Die Trennung erfolgt isokratisch bei 100 % A. Durch einen Spülschritt bei 100% B wird die Säule nach jedem Lauf gereinigt .
Als Referenzsubstanz, zur Bestimmung der Retentionszeit von γ-Glutamylcystein und der finalen Konzentration in den zu vermessenen Proben, diente reduziertes γ-Glutamylcystein der Firma Sigma Aldrich GmbH (Steinheim, D) . Die Konzentration an „Ge- samt-y-Glutamylcystein" wurde anhand der Peakflächen im Chroma- togramm berechnet (siehe Fig. 1) . Tabelle 1: Einfluss des pH-Wertes auf die finalen γ-Glutamyl- cystein-Ausbeuten. Gehalt von „Gesamt-y-Glutamylcystein" (yGC) nach Neutralisation der Fermenterbrühe und anschließender Reduktion der Oxidationsprodukte bis-y-Glutamylcystin und
γ-Glutamylcystin mit Dithiothreitol :
Figure imgf000011_0001
*Einbruch der γ-Glutamylcystein-Ausbeuten aufgrund massiver Wachstumsprobleme, der für das erfindungsgemäße Verfahren genutzten Mikroorganismen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von γ-Glutamyl- cystein und dessen Derivaten bis -γ-Glutamylcystin und γ- Glutamylcystin in einer Produktionsphase, bei dem ein zur γ-Glutamylcystein-Produktion geeigneter prokaryotischer Mikroorganismenstamm in einem Fermentationsmediums kultiviert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium zu Beginn des Verfahrens einen pH-Wert von pH 6,8 bis pH 7,3 hat und der pH-Wert ab Beginn der Produktionsphase über einen Zeitraum von 0,5 h bis 2,5 h auf einen pH-Wert zwischen 5,0 und 6,5 eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium zu Beginn der γ-Glutamylcystein-
Produktionsphase auf einen pH-Wert von 5,0 bis 5,5 eingestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass der pH Wert des Fermentationsmediums mit Beginn der
Produktionsphase automatisch auf die genannten pH-Werte um 0,5 pH-Einheiten pro 0,5 h abgesenkt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekenn- zeichnet, dass der so erreichte pH-Wert anschließend bis zum Fermentationsende gehalten wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen des Mikroorganismenstammes aus dem Fermentationsmedium entfernt und die gewünschten Produkte aus dem Kulturmedium aufgereinigt werden.
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