DE10104722A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cystein, Cystin und Glutathion - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cystein, Cystin und GlutathionInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, die für Serin-Acetyltransferase kodieren, sowie Verfahren zur Auffindung neuer SAT-Gene. Weiter betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung schwefelhaltiger Verbindungen wie Cystein, Cystin und Glutathion in Bakterien und anderen Organismen mittels Überexpression von SAT-Genen, wobei der Wirtsorganismus in seiner Glutathionsynthese gestört ist.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, die für das Enzym Serin-Acetyl
transferase (SAT) kodieren, sowie Verfahren zur Auffindung neuer SAT-Gene. Weiter betrifft
die Erfindung Verfahren zur Herstellung schwefelhaltiger Verbindungen wie Cystein, Cystin
und Glutathion in Bakterien und anderen Wirtsorganismen mittels Überexpression von SAT-
Genen, wobei der Wirtsorganismus in seiner eigenen Glutathionsynthese gestört ist.
Die schwefelhaltige Aminosäure Cystein stellt das Endprodukt der assimilatorischen
Sulfatreduktion in Bakterien, Pilzen und Pflanzen dar. Über seine Rolle in Proteinen hinaus
fungiert Cystein essentiell und ubiquitär in allen Organismen als Donor von reduziertem
Schwefel für die Biosynthese weiterer Verbindungen wie Methionin, Fe/S-Cluster und
Vitaminen (z. B. Biotin). Direkte Verwandte des Cysteins sind sein Oxidationsprodukt Cystin
und das Tripeptid Glutathion (γ-Glutamylcysteinylglycin).
Die Cystein-Biosynthese erfolgt in Bakterien wie in Pflanzen in einem zweistufigen Prozeß.
Serin-Acetyltransferase (SAT) sorgt für die Bildung des aktivierten Thioesters O-Acetylserin
(OAS) aus Serin und Acetyl-Coenzym A. Freies Sulfid wird in O-Acetylserin eingefügt, um
Cystein und Acetat mittels enzymatischer Katalyse durch O-Acetylserin (Thiol)-Lyase zu
erhalten. SAT stellt hierbei den geschwindigkeitslimitierenden Schritt dar, wobei die Aktivität
dieses Enzyms ausschließlich in Verbindung mit O-Acetylserin (Thiol)-Lyase (OAS-TL) in
dem Cysteinsynthase-Komplex gefunden wird. OAS-TL ist bedingt durch die Aktivität SAT-
freier Homodimere in großem Überschuß vorhanden (Kredich et al. (1969) J. Biol. Chem.
244, 2428-2439; Saito (2000) Curr. Opin. Biol. 3, 188-195). Cystein ist beinahe die einzige
Verbindung, in der reduzierter Schwefel in den Zellstoffwechsel Eingang findet, obwohl
Schwefel für die Biosynthese essentieller Verbindungen, einschließlich Methionin, Biotin und
Fe/S-Cluster, benötigt wird. Die Herstellung von Cystein ist daher von großem
biotechnologischem Interesse für pharmakologische Prozesse und für die
Nahrungsergänzung.
Die Produktion von Cystein in Mikroorganismen im Großmaßstab wird hauptsächlich durch
regulatorische Mechanismen des cys-Regulons (Kredich (1996) In Escherichiacoli and
Salmonella tyhpimurium. Cellular and molecular biology (Neidhardt et al., Eds.), pp. 514-
527. ASM Press, Washington D. C., USA) und seine Toxizität bei höheren Konzentrationen
(Harris (1983) J. Bacteriol. 145, 115-132) erschwert. Verschiedene Ansätze wurden verfolgt,
um diese Beschränkungen zu umgehen. So kann eine hohe Ausbeute an Cystein in dem
Wachstumsmedium durch Überexpression einer Exportpumpe für verschiedene Metabolite
des Cystein-Stoffwechsels erreicht werden, wie für das ydeD-Genprodukt von E. coli gezeigt
werden konnte (Daszlar et al. (2000) Mol. Microbiol. 36, 1101-1112).
Die Inhibition der SAT durch Cystein hat eine Inhibitionskonstante (Ki) von ungefähr 10-6 M
in Salmonella typhimurium und E. coli (Kredich et al. (1969) vide supra) und kontrolliert
somit effektiv die Reaktionsgeschwindigkeit in einer Feedback-Schleife (Endprodukt
hemmung). Es sind Versuche unternommen worden, diesen Mechanismus durch Screenen
nach Cystein-insensitiven Serin-Acetyltransferasen aus E. coli mittels zufälliger Mutagenese
(random mutagenesis) zu überwinden (Denk and Böck (1987) J. Gen. Microbiol. 133, 515-
525; Takagi et al. (1999) FEBS Lett. 452, 323-327). Alternativ wurde zielgerichtete
Mutagenese angewandt, wobei hierbei Aminosäurepositionen innerhalb des SAT-Enzyms
ausgetauscht wurden, die aus dem zufälligen Screenen erhalten wurden (Nakamori et al.
(1998) J. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1607-1611). Obwohl im Rahmen dieser
Untersuchungen keine kinetischen Inhibitionskonstanten bestimmt wurden, war es den
Autoren möglich, Mutanten mit einer 15-fach weniger sensitiven Feedback-Hemmung zu
identifizieren und die Akkumulation beträchtlicher Mengen von Cystein und Cystin im
Wachstumsmedium zu erzielen. Weitere Verbesserungen auf der Grundlage von
Aminosäureaustauschen scheinen allerdings kaum möglich, da weder die dreidimensionale
Struktur der SAT bekannt ist, noch ausreichende Sequenzdaten von Cystein-insensitiven
SAT-Formen aus anderen Organismen erhältlich sind.
In einem alternativen Ansatz werden natürlicherweise vorkommende SAT-Isoformen genutzt,
die in höheren Pflanzen zu finden sind und strukturell mit dem bakteriellen Enzym eng
verwandt sind. Pflanzen enthalten im allgemeinen mindestens drei Kern-kodierte SAT-
Isoformen, die in den Plastiden, dem Cytosol und in den Mitochondrien lokalisiert sind. Diese
SAT-Enzyme unterscheiden sich beträchtlich hinsichtlich ihrer Feedback-Sensitivität
gegenüber Cystein, was mittels heterologer Expression in E. coli gezeigt werden konnte (Noji
et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 32739-32745; Inoue et al. (1999) Eur. J. Biochem. 266, 220
-227; Saito (2000) vide supra). Trotz der relativ großen Unterschiede in der Cystein-
Empfindlichkeit sind sämtliche SAT-Enzyme in der Lage, einen aktiven Cysteinsynthase-
Komplex mit bakterieller OAS-TL zu bilden (Droux et al. (1998), Eur. J. Biochem. 255, 235
-245). Verschiedene Determinanten für die Cysteinhemmung wurden in Analogie zu SAT
aus E. coli gemappt (Noji et al. (1998) vide supra; Inoue et al. (1999) vide supra). Ein erster
Bericht zeigt, daß die heterologe Expression von SAT-kodierenden cDNA-Klonen aus
Arabidopsis thaliana (Bogdanova et al. (1995) FEBS Lett. 358, 43-47; Murillo et al. (1995)
Cell. Mol. Biol. Res. 41, 425-433) in einer effizienten Akkumulation von Cystein im
Wachstumsmedium von E. coli resultiert (Tagaki et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179,
453-459).
Angesichts des Bedarfs für effiziente Verfahren zur Herstellung von Cystein ist es eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Feedback-insensitive SAT-Gene und -Isoformen
bereitzustellen, die in leistungsstarken Verfahren zur Herstellung von großen Mengen von
Cystein und verwandten schwefelhaltigen Verbindungen in Bakterien und anderen
Organismen eingesetzt werden können.
Eine weitere Aufgabe liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Selektion Cystein-
insensitiver SAT-Gene sowie in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von
Cystein, Cystin und Glutathion in Mikroorganismen.
Die Lösungen dieser Aufgaben sind in den beigefügten unabhängigen Patentansprüchen
angegeben. Bevorzugt Ausführungsformen werden in den Unteransprüchen beschrieben.
Weitere Aufgaben und Lösungen ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.
Es ist überraschenderweise gelungen, einen neuen erfolgreichen Screening-Ansatz für cDNA-
Klone, die für Cystein-insensitive SAT-Isoformen kodieren, aufzuzeigen. Dabei wird ein
neuer E. coli-Stamm verwendet, in dem das cysE-Gen, welches für die bakterielle SAT
kodiert, durch Mutation inaktiviert ist. Mittels funktionaler Komplementation können unter
Einsatz einer solchen SAT-freien E. coli-Mutante SAT-Gene mit weniger ausgeprägter
Feedback-Hemmung selektioniert werden. Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur
Auffindung von DNA-Sequenzen, die für Cystein-insensitive Serin-Acetyltransferasen
kodieren, gekennzeichnet durch die Verwendung eines cysE--Bakterienstammes für
funktionale Komplementation.
Bei dem Bakterienstamm handelt es sich bevorzugt um einen Escherichia coli-Stamm.
Unter dem Begriff "Cystein-insensitive Serin-Acetyltransferase" wird im Rahmen dieser
Erfindung eine Serin-Acetyltransferase verstanden, die einen I50-Wert von mindestens
30 µM, bevorzugt von mindestens 40 µM und besonders bevorzugt von mindestens 45 µM,
50 µM aufweist.
Der I50-Wert ist hier als die Cystein-Konzentration definiert, bei der unter ansonsten
optimalen Bedingungen eine 50%-ige Hemmung der SAT-Aktivität eintritt. Der I50-Wert
wird durch Bestimmung der SAT-Aktivität unter steigenden Cystein-Konzentrationen
bestimmt. Durch Auftragung der Aktivität gegen die Cystein-Konzentration erhält man eine
hyperbolische Funktion, aus der durch curve-fitting oder manuell der I50-Wert ermittelt wird.
Die Inhibitorkonstante KI ist, unabhängig vom Hemmtyp, zunächst als Dissoziationskonstante
eines Enzym-Inhibitor-Komplexes definiert (Ki = [E] [I]/[EI], nach A. L. Lehninger, Verlag
Chemie 1977) und hat keine direkte Beziehung zum I50-Wert. Prinzipiell korreliert aber ein
niedriger KI-Wert mit einem niedrigen I50-Wert für einen Inhibitor.
Der Begriff "funktionale Komplementation" bedeutet, daß eine bestimmte Enzymaktivität
eines bezüglich dieser Enzymaktivität defizienten Bakterienstammes durch Expression eines
heterologen Gens, das für diese Enzymaktivität kodiert, unter Kontrolle eines geeigneten
bakteriellen Promotors die Enzymaktivität in dem Bakterienstamm wiederherstellt.
Die Wiederherstellung der Enzymaktivität erlaubt unter geeigneten Bedingungen (im Rahmen
der vorliegenden Erfindung in Abwesenheit von Cystein) das prototrophe Wachstum des
ansonsten auxotrophen, defizienten Bakterienstammes.
Das bakterielle cysE-Gen kodiert, wie bereits oben erwähnt für die bakterielle Serin-
Acetyltransferase, die DNA-Sequenz des cysE-Gens ist im Stand der Technik beschrieben,
z. B. in Denk und Böck (1987) J. Gen. Microbiol. 133, 515-525.
Die Herstellung erfindungsgemäßer Bakterienstämme, die aufgrund der Inaktivierung im
cysE-Gen für das Screenen nach cys-insensitiven SAT-Genen mittels funktionaler
Komplementation geeignet sind, wird in den Beispielen beschrieben. Dem Fachmann sind die
für die Inaktivierung bakterieller Gene mittels Mutation erforderlichen Techniken bekannt,
z. B. aus dem Standardwerk von Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: Laboratory
Manual, 2. Auflage, Coldspring Harbour Laboratory Press, Coldspring Harbour, New York.
Darüber hinaus sind SAT-freie Bakterienstämme von Stammsammlungen erhältlich, z. B. die
E. coli-Stämme EC1801 und JM39, die vom E. coli Genetic Stock Center, Yale Univerity,
New Haven, CT, USA, bezogen werden können.
Wie in den nachfolgenden Beispielen erläutert, folgte die Erzeugung der SAT-freien E. coli-
Mutante MW1 einem mikrobiologischen Standardverfahren (Hamilton et al. (1989) J.
Bacteriol. 171, 4617-4622). Dieses und ähnliche Verfahren zur Insertionsmutagenese durch
homologe Rekombination sind vielfach beschrieben (z. B. Walkenhorst et al. (1995)
Microbiol. Res. 150, 347-361; Link et al. (1997) J. Bacteriol. 179, 6228-6237; Selbischka
et al. (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 615-618). Das biologische Prinzip ist in
Standardwerken beschrieben (H. A. Nash, In: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and
Molecular Biology, Vol. I. F. C. Neidhardt et al., eds., ASM Press, Washington DC, 1996,
Seiten 2363-2376).
Auch das Screening mittels funktionaler Komplementation ist dem Fachmann geläufig und
z. B. beschrieben in Howarth et al. (1997) Biochim. Biophys. Acta 1350, 123-127; Noji et al.
(1994) Mol. Gen. Genet. 244, 57-66, und Setya et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,
13383-13388.
Schließlich benötigt man für das Screening mittels funktionaler Komplementation eine
geeignete cDNA-Bibliothek aus dem Organismus, aus dem Cystein-insensitive SAT-
Gensequenzen isoliert werden sollen. Die Herstellung von cDNA-Bibliotheken ist dem
Fachmann ebenfalls geläufig und mittels molekularbiologischer Routinemethoden möglich.
Darüber hinaus sind cDNA-Bibliotheken heutzutage aus fast jedem Organismus kommerziell
erhältlich, z. B. von Firmen wie Stratagene, La Jolla, USA.
Die Erfindung betrifft auch Gene, die für Cystein-insensitive SAT-Enzyme und -Isoformen
kodieren und mittels des oben beschriebenen Screeningverfahrens auf der Grundlage der
funktionalen Komplementation isoliert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesen SAT-Gensequenzen um
Sequenzen aus Pflanzen, insbesondere aus Nicotiana tabacum.
Besonders bevorzugt sind dabei die cDNA-Sequenzen der Nicotiana tabacum SAT-Gene 1, 4
und 7, die als Sequenzen beigefügt sind: cDNA-Sequenz von SAT 1 als SEQ ID NO. 1, die
davon abgeleitete Aminosäuresequenz als SEQ ID NO. 2; die cDNA-Sequenz von SAT 4 als
SEQ ID NO. 3, die davon abgeleitete Aminosäuresequenz als SEQ ID NO. 4; die cDNA-
Sequenz von SAT 7 als SEQ ID NO. 5 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz als
SEQ ID NO. 6.
Die Erfindung betrifft somit auch eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der
enzymatischen Aktivität einer Serin-Acetyltransferase aus Nicotiana tabacum kodiert,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 6 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren,
- b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 5 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen,
- c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine
Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter
stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989), Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Coldspring Harbour, Laboratory Press,
Coldspring Harbour, New York, beschrieben sind.
Die im Rahmen der Erfindung einsetzbaren SAT-Nukleinsäuremoleküle umfassen auch
Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die
für SAT kodieren oder ein biologisch, d. h. enzymatisch aktives Fragment davon. Unter
Fragmenten werden dabei Teile der Nukleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind,
um ein Polypeptid oder Protein mit der enzymatischen Aktivität einer SAT oder einer
vergleichbaren enzymatischen Aktivität zu kodieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in
diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der
oben genannten Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und
einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei
eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 80%, insbesondere eine Identiät von
mindestens 85% und 90%, vorzugsweise über 92% und besonders bevorzugt über 95%, 98%,
99%, oder daß die homologe Sequenz unter stringenten Bedingungen, die dem Fachmann
geläufig sind, mit den vorstehend genannten SAT-Sequenzen hybridisiert. Die Abweichung
zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen können dabei durch Dilition, Addition,
Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein. Homologie bedeutet ferner, daß
funktionelle und/oder strukutrelle Äquivalenz zwischen den betroffenen
Nukleinsäuremolekülen und den durch sie kodierten Proteinen besteht.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung Schwefelhaltiger Verbindungen,
insbesondere von Cystein, Cystin und Glutathion, in Wirtsorganismen, insbesondere
Mikroorganismen durch Überexpression der nach oben beschriebenem Screeningverfahren
mittels funktionaler Komplementation aufgefundenen Cystein-insensitiven SAT-Gene in den
Mikroorganismen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem
Mikroorganismus, der für die Überexpression der Cystein-insensitiven SAT-Gensequenzen
eingesetzt wird, um einen Glutathion-defizienten Stamm. Bevorzugt handelt es sich bei dem
Glutathion-defizienten Bakterienstamm um den E. coli-Stamm JTG10 mit dem
chromosomalen Marker gshA20::Tn10kan, der beispielsweise vom E. coli Genetic Stock
Center, Yale University, New Haven, CT, USA, bezogen werden kann (CGSC# 6926) und
ursprünglich beschrieben wurde von Greenberg & Demple (1986, J. Bacteriol. 168, 1026).
Ein weiterer geeigneter Glutathion-defizienter Bakterienstamm ist beispielsweise der E. coli-
Stamm 821, ID# 9836 mit der Mutation gshA2 (Apontoweil und Behrends (1975) Mol. Gen.
Genet. 141, 91-95), der ebenfalls vom E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New
Haven, CT, USA, bezogen werden kann.
Die Verwendung eines Glutathion-defizienten Stammes bietet den Vorteil, daß die
Abwesenheit von Glutathion als Kontrollmittel für die Akkumulation von Cystein in der
Bakterienzelle in der Sekretion von Cystein aus der Bakterienzelle in das Wachstumsmedium
resultiert. Dieser Effekt führt zu einer beträchtlichen Steigerung der insgesamten
Cysteinanreicherung.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Cystein, Cystin und
Glutathion in Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß in dem
Mikroorganismus eine DNA-Sequenz exprimiert wird, die für eine Cystein-insensitve Serin-
Acetyltransferase kodiert, und es sich bei dem Mikroorganismus um eine Glutathion
defiziente Zelle handelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein SAT-Gen, das unter
Verwendung des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Screeningverfahrens mittels
funktionaler Komplementation identifiziert wird. Bevorzugt handelt es sich hierbei um
pflanzliche SAT-Gene, besonders bevorzugt aus Nicotiana tabacum.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Mikroorganismus
um einen Glutathion-defizienten Bakterienstamm, insbesondere um einen Bakterienstamm,
der im ersten Glutathionsyntheseschritt (gsh1-) durch Mutation inaktiviert ist.
Der besonders bevorzugte Stamm JTG10 enthält ein durch Transposon Tn10kann
inaktiviertes gshA-Gen, welches für das erste Enzym der Glutathionsynthese, γ-
Glutamylcystein-Synthetase, kodiert. Jede Inaktivierung dieses Gens das zur vollständigen
oder teilweisen Reduktion der Enzymaktivität führt, ist für die erfindungsgemäße Cystein-
Überproduktion geeignet.
Die Expression der Cystein-insensitiven SAT-Gene in einem Glutathion-defizienten
Bakterienstamm führt dazu, daß das gebildete Cystein aus der Zelle ausgeschleust wird und
sich im umgebenden Kulturmedium in hohen Konzentrationen als Cystein und Cystin
anreichert. Die angereicherten Schwefel-haltigen Verbindungen können dann mittel
Standardverfahren aufgereinigt werden. Die Reinigung von Cystein aus wäßrigen Lösungen
ist z. B. in den Patentschriften JP 56140966 A2 (Preparation of purified cysteine) und
JP 61057549 (Method of purifying cysteine) beschrieben. Prinzipielle Verfahren zur
Reinigung von Aminosäure mit Kationen-Austauscher-Chromatographie sind z. B.
beschrieben bei T. G. Cooper (Biochemische Arbeitsmethoden, W. de Gryuter Verlag, Berlin,
1980).
Die für die Herstellung eines für die fermentative Herstellung von Cystein, Cystin und
Glutathion geeigneten Mikroorganismus erforderlichen Techniken, wie die Transformation
von Bakterien mit Plasmiden, die Selektion transformierter Bakterien, die Kultivierung von
Bakterien in geeigneten Wachstumsmedien, sind dem Fachmann bestens bekannt und
beschrieben, z. B. in Sambrook et al. (1989) vide supra.
Gleiches gilt für die Herstellung bakterieller Expressionsvektoren mittels herkömmlicher
Techniken; darüber hinaus sind geeignete Expressionsvektoren für die Überexpression
heterologer Gene in Bakterien kommerziell erhältlich, z. B. von der Firma Qiagen, Hilden
Deutschland.
Die Nutzung des synthetisierten und akkumulierten Cysteins liegt insbesondere in der
Supplementierung der Nahrung für Mensch und Tier. Weiter können hieraus Derivate wie
z. B. N-Acetylcystein auf einfache Weise hergestellt werden, die pharmazeutische und
kosmetische Anwendung haben.
Die Erfindung wird im folgenden in den nachfolgenden Beispielen erläutert, die nur der
Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen
sind.
Allgemeine Klonierungs- und PCR-Verfahren wurden nach Sambrook et al. (1989, vide
supra) durchgeführt. DNA-Sequenzen wurden mit einem 373A-Sequencer (Perkin-Elmer,
Boston, USA) erhalten.
Die verwendete cDNA-Bibliothek aus N. tabacum cv. Samsun wurde in λ-ZAPII nach
Angaben und mit Materialien des Herstellers, Stratagene, erstellt.
In vivo-Excision erfolgte ebenfalls nach Herstellerangaben (Stratagene), um rekombinante
Plasmide aus der Phagenbank zu erhalten. Diese können zur Transformation des SAT
defizienten E.co/i-Stammes verwendet werden.
Southern Blot-Analyse von genomischer DNA von E. coli wurde, wie in Hell et al. (1994,
FEBS Lett. 351, 257-262) beschrieben, mit dem unten angegeben 2, 2 kb cysE-Fragment als
Hybridisierungssonde durchgeführt.
Die insertionelle Inaktivierung des Wildtyp cysE-Gens von E. coli C600 (thr leu thi lac (λ)-
P1 + F'; Clontech, Heidelberg, Deutschland) wurde wie von Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol.
171, 4617-4622 beschrieben, durchgeführt. Hierdurch sollte ein SAT-defizienter Stamm
erzeugt werden, der im Vergleich zu gegenwärtig erhältlichen Stämmen eine erhöhte
Stabilität aufweist. Das Wildtyp cysE-Gen wurde einschließlich seiner flankierenden Bereiche
mittels PCR mit genomischer DNA vom Stamm C600 und den Primern
ECS155 5'-CGTGGATCCTTAGGCGATCAAATTCC-3' und
ECS156 5'-GGGGAGTCGACGGCGCTGTATGTACTCCCT-3'
amplifiziert.
ECS155 5'-CGTGGATCCTTAGGCGATCAAATTCC-3' und
ECS156 5'-GGGGAGTCGACGGCGCTGTATGTACTCCCT-3'
amplifiziert.
Das PCR-Protokoll war wie folgt:
In 50 µl Reaktionsvolumen befanden sich:
20 µmol der beiden Primer, 10 ng genomische DNA, 1 U Taq-Polymerase (Promega, Heidelberg, Deutschland), Polymerase-Puffer von Promega nach Herstellerangaben. Nach 5 Min. bei 94°C folgten 35 Zyklen mit 30 Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 58°C, 60 Sek. bei 72°C, gefolgt von 10 Min. bei 72°C.
In 50 µl Reaktionsvolumen befanden sich:
20 µmol der beiden Primer, 10 ng genomische DNA, 1 U Taq-Polymerase (Promega, Heidelberg, Deutschland), Polymerase-Puffer von Promega nach Herstellerangaben. Nach 5 Min. bei 94°C folgten 35 Zyklen mit 30 Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 58°C, 60 Sek. bei 72°C, gefolgt von 10 Min. bei 72°C.
Das resultierende 2,2 kb DNA-Fragment wurde in die Restriktionsschnittstellen SalI und
BamHI von linearisiertem pUC18 ligiert. Innerhalb dieses Plasmids wurde das cysE-Gen mit
ClaI bei Position 522, bezogen auf den offenen Leserahmen, geschnitten und durch Insertion
eines 2,2 kb ClaI/ClaI-Fragments von pACYC 184-Gm inaktiviert. Dieses Fragment aus dem
Plasmid pACYC184-Gm (Chang and Cohen (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1156) trägt ein
Gentamycin-Resistenzgen; das resultierende pUC-Plasmid wurde pUC18cysE-Gm genannt.
In diesem Plasmid können somit maximal 174 Aminosäuren des E. coli-SAT-Enzyms
translatiert werden. Das inaktivierte cysE-Gen wurde durch homologe Rekombination nach
der Methode von Hamilton et al. (1989, vide supra) gegen das Wildtypallel ausgetauscht. Die
cysE-Gm-Kassette wurde mit SalI und BamHI ausgeschnitten und als 4,4 kB Fragment in die
gleichen Schnittstellen des Plasmids pMAK705 ligiert, welches ein Kanamycin-Resistenzgen
und einen Temperatursensitiven Replikationsursprung trägt (pHO1; Hashimoto-Gotoh and
Sekiguchi (1977) J. Bacteriol. 131, 405-412). Das resultierende Plasmid pMWI wurde für
anschließend für den Genaustausch mittels homologer Rekombination eingesetzt. Zu diesem
Zweck wurde der Stamm C600 mit pMW 1 transformiert, um Kanamycin-resistente Kolonien
bei 44°C (non-permissive Temperatur) zu selektionieren. Cointegrate wurden von dem
Plasmid durch Kultivierung bei 30°C (permissive Temperatur), gefolgt von non-permissiven
Bedingungen gereinigt und der resultierende Cystein-auxotrophe Stamm wurde MW1
genannt (thr leu thi lac (λ)-P1 + F' cysE). Auf diese Weise wurde das inaktivierte cysE-Gen in
das Genom von E. coli C600 via homologe Rekombination eingeführt.
Die Komplementations- und Auxotrophie-Tests wurden auf festem M9-Minimalmedium,
ergänzt mit IPTG (1 mM), Ampicillin (100 µg/ml), Gentamycin (50 µg/ml), Thiamin
(0,1 mM) und 1 mM sämtlicher Aminosäuren mit Ausnahme von Methionin und Cystein
durchgeführt. Einzelne Plasmide oder die cDNA-Bibliothek aus Tabak wurden mittels
Elektroporation (BioRad, München, Deutschland) in den Stamm MW1 eingeführt und
Kolonien wurden durch Inkubation bei 37°C für bis zu 48 Stunden selektioniert.
Die Expression von SAT-Enzymen wurde in sämtlichen Konstrukten mit Isopropyl-
Thiogalaktosid in Vollmedium (LB) oder Minimalmedium ergänzt mit Ampicillin oder
Gentamycin oder beidem induziert (Bogdanova et al. (1995) vide supra). Die Zellen wurden
geerntet und durch Ultraschallbehandlung (Sonicator Bandelin, Berlin, Deutschland)
aufgeschlossen, anschließend wurde der lösliche Überstand (10 Min. bei 30.000 × g) durch
Gelfiltration auf einer PD 10-Säule (Amersham, Freiburg, Deutschland) entsalzt und bei
-80°C gelagert. Die Proteingehalte wurden nach Bradford (1976) bestimmt. Die SAT-
Aktivität von gereinigten Fraktionen und Rohfraktionen wurde in 250 µl, enthaltend 50 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 0,2 mM Acetyl-CoA, 2 mM Dithiothreitol und 5 mM Serin in Gegenwart
oder Abwesenheit variierender Cystein-Konzentrationen untersucht. Die Absorption bei
232 nm wurde für mehrere Minuten nach Kredich and Becker (1971, In Methods in
Enzymology (Tabor H. and Tabor C. W., eds) Seiten 459-469, Acadamic Press, New York,
USA) dokumentiert.
Für die Quantifizierung der Thiole wurde der Gehalt an Cystein und Glutathion im Medium
bzw. in den Zellen nach Extraktion mit 0,1 N HCl in einem 1 : 5-Verhältnis bestimmt. Nach
Reduzierung mit Dithiothreitol wurden die Sulfhydryl-Gruppen mit Monobromobiman
(Calbiochem, Darmstadt, Deutschland) derivatisiert. Die Auftrennung, Detektion und
Quantifizierung der fluoreszierenden Addukte wurde mittels HPLC durchgeführt (reversed
phase-Säule Waters Nova-Pak C18, 4,6 × 250 mm; Waters HPLC-System; Hell and
Bergmann (1990) Planta 180, 630-612).
Identifizierung von cDNA-Klonen, die für Cystein-insensitive SAT kodieren, durch
Komplementation von MW 1
Elektroporations-kompetente Zellen von MW1 wurden mit einer Plasmid-cDNA Bank
(erhalten durch in vivo-Excision der λZAPII-Bank) von Nicotiana tabacum var. SNN
transformiert. Die Regeneration der Zellen erfolgte in 1 ml LB-Vollmedium bei 37°, 220 rpm
für 1 Stunde. Das Volumen wurde auf 2 Petrischalen ausplattiert, die M9-Minimalmedium
(Sambrook et al. (1989), vide supra) mit 100 µg/ml Ampicillin, 50 µg/ml Gentamycin und
1 mM Isopropylthiogalaktosid enthielten sowie je 1 mM aller proteinogenen Aminosäuren
außer Cystein und Methionin. Die Schalen wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die
erhaltenen Kolonien wurden danach weiter kultiviert und zur Überprüfung der Cystein-
Sensitivität der selektierten SAT bzw. Plasmidisolierung herangezogen.
Die Überprüfung der Cystein-Sensitivität erfolgte auf zweierlei Art:
- 1. Selektierte Kolonien wurden in 4 ml LB-Medium vermehrt. Ein Aliquot entsprechend einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,05 wurde zur Inoculation einer Schüttelkultur mit 20 ml C1-Medium (Minimalmedium nach Nakamori et al. (1998) Appl. Environm. Microbiol. 64, 1607-1611, ergänzt mit 0,1 mM Thiamin und je 1 mM Threonin und Leucin als einzige Aminosäuren, verwendet. Nach 48 Stunden wird die Cysteinakkumulation im Medium als Maß der Cysteininsensitivität der jeweiligen Plasmid-kodierten pflanzlichen SAT bestimmt.
- 2. Es wurden selektierte Kolonien in 200 ml LB-Vollmedium (Sambrook et al., (1989), vide supra) mit 100 µg/ml Ampicillin wie oben beschrieben vermehrt. Die lösliche Proteinfraktion wurde wie oben beschrieben nach Ultraschallbehandlung isoliert und die SAT-Aktivität im Standardtest nach Kredich and Becker (1971, vide supra) mit 10 µM Cystein im Vergleich zur Abwesenheit von Cystein bestimmt.
Die Plasmide selektierter Kolonien wurden erneut in MW 1 wie oben transformiert und auf
Wachstum in Abwesenheit von Cystein überprüft. Wachstum aller jeweils plattierten Zellen
wurde als positive funktionale Komplementation interpretiert. Die cDNA-Insertionen der
betreffenden Plasmide wurden daraufhin der DNA-Sequenzierung unterzogen.
Zur Herstellung von Cystein, Cystin und Glutathion in MW 1 wurden 200 ml Schüttelkulturen
mit M9-Medium, ergänzt mit IPTG (1 mM), Ampicillin (100 µg/ml) und den 18
proteinogenen Aminosäuren außer Cystein und Methionin mit einem Inoculum von 0,05 OD
vom MW 1 mit einem Plasmid mit SAT-kodierendem cDNA-Insert angeimpft. Die Cystein-
und Glutathionbildung wurde im Kulturverlauf verfolgt. Die Werte nach 18 Stunden
Wachstum sind in Tab. 2 dargestellt. Cystin entstand als Oxidationsprodukt von Cystein im
Medium und wurde nicht gesondert bestimmt.
Die Herstellung von Cystein und Cystin in dem Glutathion-defizienten Stamm JTG10 wurde
genauso durchgeführt wie die Herstellung der Schwefel-haltigen Verbindung in MW1.
Das Screenen nach Genen mittels funktionaler Komplementation ist stark von der Stabilität
der entsprechenden Mutation in dem Wirtsorganismus abhängig. Dies ist insbesondere der
Fall bei heterologer Komplementation zwischen entfernten Taxa und dem Erfordernis einer
großen Anzahl von Transformanten, wenn der Organismus, aus dem das die Mutation
komplementierende Gen stammt, genetisch sehr komplex ist. Der oben beschriebene, für das
effiziente Screening von SAT-cDNAs hergestellte mutierte E. coli-Stamm MW1 war den
bereits bekannten cysE-E. coli-Mutanten EC1801 und JM39 dahingehend überlegen, daß
MW 1 keine Reversion des Phänotyps zeigte. Dies bedeutet, daß das Screenen nach SAT-
Genen aus heterologen Quellen ohne Beeinträchtigung durch unerwünschte genetische
Ereignisse bei beliebigen Bedingungen durchgeführt werden kann. Die funktionelle Identität
des Genotyps wurde verifiziert (i) biochemisch mittels Enzymassays, (ii) genetisch mittels
DNA-DNA-Hybridisierung und (iii) physiologisch mittels Komplementation mit bekannten
cDNA-Klonen aus Pflanzen.
Der Stamm MW1 zeigte keine nachweisbare SAT-Aktivität (siehe Tabelle 1).
Die Position der homologen Rekombination wurde durch Hybridisierung genomischer DNA
des Wildtyp-Stammes C600 mit dem cysE-Gen als Sonde bestätigt. Restriktionsverdau mit
EcoRV, welches außerhalb von cysE schneidet, und mit StuI, welches innerhalb des cysE-
Gens schneidet, ergab ein 4,6 kb-Signal bzw. 7,4 kb- und 1,0 kb-Signale, was der Voraussage
anhand der Karte des E. coli-Genoms bei 81,44 min. entspricht. Die Insertion der 2,2 kb-
Gentamycin-Kassette würde das genomische EcoRV-Fragment auf 6,8 kb vergrößern.
Dagegen führt eine interne EcoRV-Schnittstelle in der Kassette zu Signalen von 4,7 kb und
2,1 kb in der DNA-DNA-Hybridisierung, was die Position, Orientierung und Identität der
Insertion bestätigt. Abgesehen von der Gentamycinresistenz wurde die spezifische Identität
des MW1-Stammes mittels Komplementation mit einer für SAT aus Arabidopsis thaliana
kodierenden cDNA (Wirtz, Diplomarbeit 1998, Ruhr-Universität Bochum, Untersuchung der
Cysteinbiosynthese durch Mutagenese der pflanzlichen Serin-Acetyltransferase) auf
Minimalmedium ohne Cystein gezeigt. Die SAT-Defizienz in dem Stamm MW 1 wurde durch
niedrige und mittelstarke Expressionsraten von SAT A unter Verwendung von Vektoren mit
verschiedener Kopiezahl funktional komplementiert.
Die pflanzliche Cysteinsynthese wurde somit in E. coli ohne jeglichen endogenen
Hintergrund implementiert.
SAT7 und SAT1 aus Tabak entsprechen hinsichtlich ihrer Sensitivität gegenüber Cystein der
SAT-A aus E. coli mit einem I50-Wert von ungefähr 45 µM (Noji et al. (1998) vide supra),
wobei die Werte von SAT7 als auch SAT1 deutlich über der Inhibitionskonstante der
bakteriellen SAT liegen (KI 1, 1 µM, Kredich et al. (1969) vide supra). SAT4 ist im
wesentlichen insensitiv gegenüber Cystein, d. h. ein I50-Wert ist für SAT4 nicht meßbar (vgl.
Abbildungl). Eine derart vollständige Insensitivität gegenüber Cystein ist bislang noch nie für
eine klonierte oder biochemisch isolierte SAT aus irgendeinem Organismus beschrieben
worden.
E. coli-Zellen mit oder ohne pBS-SK-Plasmide mit Tabak-cDNA-Klonen für SAT wurden in
supplementiertem M9-Minimalmedium ohne reduzierte Schwefelquelle kultiviert; die
Cystein-Gehalte wurden nach 18 Stunden Wachstum, gerechnet von der Animpfung der
Kultur, bestimmt.
Der GSH-Gehalt im Medium von C600 und MW1 liegt im wesentlichen in der
Größenordnung der Cystein-Gehalte. Es ist davon auszugehen, daß auch Cystin im Medium
vorhanden ist, da das Medium durch Schütteln kontinuierlich belüftet wird, wodurch die
Cysteinoxidation gefördert wird.
Der Cystein-Gehalt im Medium ist für MW1, der die SAT-cDNA-Klone aus Tabak
exprimiert, im Vergleich zu C600, der das Wildtyp-cysE-Gen trägt, ungefähr 10-fach erhöht.
Ein weiterer 10-facher Anstieg in der Sekretion von Cystein wird durch Expression der
Tabak-SAT in dem E. coli-Stamm JTG10 erreicht. Das Fehlen von Glutathion als
Kontrollmittel für die Akkumulation von Cystein in der Bakterienzelle resultiert somit in der
Sekretion des Cysteins. Die Kombination von Feedback-insensitiven SAT-Enzymen mit
Glutathion-defizienten Zellinien erlaubt die Produktion von Cystein in 3- bis 10-fach höheren
Mengen als im Stand der Technik unter Einsatz anderer Strategien bislang erreicht wurde
(Daßler et al. (2000) vide supra; Takagi et al. (1999) vide supra; Nakamori et al. (1998) vide
supra).
Bei den nachfolgenden DNA- und Aminosäure-Sequenzen der SAT-Klone 1, 4 und 7 aus
Tabak fällt auf, daß die vollständig insensitive Tabakisoform SAT 4 eine Insertion von 2
Aminosäuren an Position 125/126 und Deletion von 1 bzw. 2 Aminosäuren an Position
316/18 relativ zu den anderen, weniger hemmbaren SAT-Isoformen aus Arabidopsis thaliana
und Nicotiana tabacum aufweist.
Abb. 1 zeigt die Hemmung pflanzlicher SAT-Enzyme durch Cystein.
Claims (14)
1. Verfahren zur Auffindung von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der
enzymatischen Aktivität einer Cystein-insensitiven Serin-Acetyltransferase kodieren,
dadurch gekennzeichnet, daß die Auffindung durch Expression der DNA-Sequenzen und
damit einhergehende funktionale Komplementation in einem Bakterienstamm erfolgt,
dessen endogene Serin-Acetyltransferase-Aktivität gestört ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bakterienstamm ein Escherichia coli-
Bakterienstamm ist und eine Mutation im cysE-Gen aufweist (cysE-).
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich um pflanzliche DNA-
Sequenzen handelt.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Cystein-
insensitive Serin-Acetyltransferase einen I50-Wert von mindestens 30 µM aufweist.
5. DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Serin-
Acetyltransferase aus Nicotiana tabacum kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus:
- a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 6 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren,
- b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 5 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen,
- c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen,
- e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
6. Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Schwefel-haltigen
Verbindungen wie Cystein, Cystin und Glutathion in einem Mikroorganismus, der eine
heterologe, für eine Cystein-insensitive Serin-Acetyltransferase kodierende DNA-Sequenz
enthält und Glutathion-defizient ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz pflanzlichen Ursprungs
ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die DNA-Sequenz in einem
Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 aufgefunden wurde.
9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die DNA-Sequenz eine DNA-
Sequenz nach Anspruch 5 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um einen
Escherichiacoli-Bakterienstamm handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 6 oder 10, wobei der Mikroorganismus im ersten
Glutathionsyntheseschritt inaktiviert ist.
12. Verwendung von Cystein-insensitiven Serin-Acetyltransferase-Genen zur
Herstellung und Gewinnung von Schwefel-haltigen Verbindungen wie Cystein, Cystin
und Glutathion in Glutathion-defizienten Mikroorganismen.
13. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Serin-Acetyltransferase-Gen
pflanzlichen Ursprungs ist.
14. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei die von dem Gen kodierte
Serin-Acetyltransferase einen I50-Wert von mindestens 30 µM aufweist.
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| DE10104722A DE10104722A1 (de) | 2001-02-02 | 2001-02-02 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cystein, Cystin und Glutathion |
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Publications (1)
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ID=7672632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE10104722A Withdrawn DE10104722A1 (de) | 2001-02-02 | 2001-02-02 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cystein, Cystin und Glutathion |
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| DE19539952A1 (de) * | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
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Patent Citations (1)
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| DE19539952A1 (de) * | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
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