WO2005014570A1 - ZELLEN UND VERFAHREN ZUR FERMENTATIVEN HERSTELLUNG VON R-α-LIPONSÄURE - Google Patents

ZELLEN UND VERFAHREN ZUR FERMENTATIVEN HERSTELLUNG VON R-α-LIPONSÄURE Download PDF

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WO2005014570A1
WO2005014570A1 PCT/EP2004/007487 EP2004007487W WO2005014570A1 WO 2005014570 A1 WO2005014570 A1 WO 2005014570A1 EP 2004007487 W EP2004007487 W EP 2004007487W WO 2005014570 A1 WO2005014570 A1 WO 2005014570A1
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lipoic acid
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acid
polypeptide
plasmid
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PCT/EP2004/007487
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Tobias Dassler
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Consortium für elektrochemische Industrie GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds

Definitions

  • the invention relates to cells and a method for the fermentative production of R- ⁇ -lipoic acid.
  • R- ⁇ -lipoic acid is an essential cofactor of certain multienzyme complexes in a large number of pro and eukaryotes.
  • the R- ⁇ -lipoic acid and its carboxyl group are each covalently bound to the ⁇ -amino group of a specific lysine residue of the corresponding enzyme to form a so-called lipoamide.
  • R- ⁇ -lipoic acid is part of the E2 subunit of pyruvate dehydrogenase (PDH) [EC 2.3.1.12] and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3.1.61] and plays there as Redox partners and acyl group carriers play a crucial role in the oxidative decarboxylation of ⁇ -keto acids.
  • PDH pyruvate dehydrogenase
  • KGDH ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase
  • R- ⁇ -lipoic acid also acts as an aminomethyl carrier in glycine-cleavage enzyme systems.
  • the physiologically and genetically best characterized ⁇ -keto acid dehydrogenase is the pyruvate dehydrogenase multi-enzyme complex from Escherichia coli.
  • the three subunits El (pyruvate dehydrogenase), E2 (dihydrolipoamide acetyltransferase) and E3 (dihydrolipoamide dehydrogenase) are encoded by an operon consisting of the genes aceE, aceF and lpd and form a multienzyme complex which consists of 24 El, 24 E2 and 12 E3 subunits.
  • the 24 E2 subunits form the core of the complex.
  • the E2 monomer of the PDH (E2p) is in turn constructed modularly from different domains which are connected to one another via flexible linker regions (see FIG. 1).
  • the N-terminus of the protein contains three so-called lipoyl domains, each consisting of approximately 80 amino acid residues, each of which can bind exactly one molecule of R- ⁇ -lipoic acid as described above. These three lipoyl domains of the PDH each have a very high sequence identity (> 66%).
  • the small central E3 binding domain connects to the N-terminal region of the protein, which in turn binds with the C-terminal rich, which contains the catalytic domain (acetyl transferase).
  • E2 subunit of ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase (E2o) is encoded by the su ⁇ B gene and also has a modular structure, but in contrast to the PDH E2 protein, it has only one lipoyl domain.
  • the sequence of the E2o-Lipoyl domain shows with only about 22% a relatively weak identity to the E2p-Lipoyl domains, but the spatial structure of the Lipoyl domains of both E2 proteins is very similar (Reche and Perham, 1999, EMBO J 18: 2673-2682).
  • biotinyl domain of biotin is a protein that is only moderately homologous with regard to the sequence to the lipoyl domains of the E2 proteins, but is also structurally very similar.
  • BCCP Carboxyl Carrier Protein
  • the BCCP is normally biotinylated post-translationally using the biotinyl protein ligase BirA on a specific lysine residue.
  • BCCP variants which can now be alternatively or even exclusively lipoylated on this special lysine residue by means of a lipoyl protein ligase (Reche and Perham, 1999, EMBO J. 18: 2673-2682).
  • ⁇ -Lipoic acid is an optically active molecule with a chiral center at the carbon atom C6.
  • the R configuration of ⁇ -lipoic acid is the naturally occurring enantiomer. Only this form shows physiological activity as a cofactor of the corresponding enzymes.
  • ⁇ -Lipoic acid can occur both in an oxidized (5- [1, 2] -dithiolan-3-yl-pentanoic acid) and in a reduced form (6, 8-dimercapto-octanoic acid).
  • ⁇ -lipoic acid such as. B. to understand the calcium, potassium, magnesium, sodium or ammonium salt.
  • R- ⁇ -lipoic acid was particularly intensively investigated on the bacterium Escherichia coli (see FIG. 2). This is where octanoic acid, which is covalently linked to the acyl carrier protein (ACP) is bound as a specific precursor in lipoic acid synthesis.
  • ACP acyl carrier protein
  • two sulfur atoms are transferred to the octanoic acid (octanoyl-ACP) activated in this way, producing R- ⁇ -lipoyl-ACP.
  • This reaction is catalyzed by lipoic acid synthase [EC 2.8.1.-], the ÜpA gene product.
  • the amino acid L-cysteine ultimately serves as the sulfur donor.
  • R- ⁇ -lipoic acid from R- ⁇ -lipoyl-ACP to the E2 subunit of ⁇ -keto acid dehydrogenases is carried out by Lipoyl protein ligase B [EC 6.-.-.-], the 1st ipB gene product, catalyzed, but without R- ⁇ -lipoyl-ACP or R- ⁇ -lipoic acid occurring as free intermediates (Miller et al., 2000, Biochemistry 39: 15166-15178).
  • E. coli can also take up free R- ⁇ -lipoic acid from the surrounding medium and use it for the formation of functional ⁇ -keto acid dehydrogenases.
  • R- ⁇ -lipoic acid is first activated by ATP to R- ⁇ -lipoyl-AMP and then transferred to the corresponding enzyme subunits (see FIG. 3). Both activities are catalyzed by Lipoyl protein ligase A [EC 6.-.-.-], the IplA gene product.
  • this LplA activity is not essential for wild-type strains of E. coli if the endogenous lipoic acid synthesis and the transfer of the lipoyl group takes place via the LipA / LipB route.
  • Ipl ⁇ mutants have been described which no longer have any detectable lipoyl protein ligase A activity, but whose phenotype cannot be distinguished from a wild-type cell under normal growth conditions (Morris et al., 1995, J. Bacteriol. 177 : 1-10).
  • ⁇ -lipoic acid Due to its two thiol groups, ⁇ -lipoic acid has a pronounced effectiveness as an antioxidant and can therefore protect the organism from harmful processes that are induced by oxidative stress.
  • ⁇ -dihydro-lipoic acid the reduced form of ⁇ -lipoic acid, is able, due to its property as a strong reducing agent, to regenerate other oxidized natural antioxidants in the body, such as ascorbic acid or ⁇ -tocopherol, directly or indirectly or, if they are deficient, to do so replace.
  • ⁇ -lipoic acid plays a central role in interaction with ascorbic acid, ⁇ -tocopherol and glutathione, the so-called “network of antioxidants”.
  • ⁇ -Lipoic acid is also used for the prevention and control of type II diabetes mellitus and its consequential damage, such as. B. polyneuropathy, cataract or cardiovascular disease.
  • Lipoic acid has clear advantages over the S form. It was shown in the in vitro experiment that only natural R- ⁇ -lipoic acid leads to the formation of functional ⁇ -keto acid dehydrogenases. In contrast, the S enantiomer even had an inhibitory effect on the stimulation of enzyme activity by R- ⁇ -lipoic acid. The reduction of ⁇ -lipoic acid and thus the regeneration of the antioxidative ⁇ -dihydroliponic acid in the mitochondria is essential for the cell. The mitochondrial NADH-dependent lipoamide reductase of mammals shows an almost 20-fold higher activity with the R enantiomer than with the S form.
  • R- ⁇ -lipoic acid has a significantly stronger effect on the insulin-mediated glucose uptake and the glucose metabolism of skeletal muscle cells in insulin-resistant rats.
  • the R-shape also showed in animal experiments an anti-inflammatory effect, while the S-shape had an analgesic effect. In order to avoid undesirable side effects, it is therefore extremely desirable to apply ⁇ -lipoic acid only in the enantiomerically pure form.
  • ⁇ -lipoic acid is carried out exclusively by means of chemical processes, the racemate always being formed from the R and S forms as the end product (Yadav et al., 1990, J. Sei. Ind. Res. 49: 400 -409).
  • Various processes have been developed to obtain enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid.
  • the racemate of ⁇ -lipoic acid or one of the synthesis intermediates can either be chemically by means of chiral auxiliary substances (Walton et. Al. 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76: 4748; DE 4137773) or enzymatically (Adger et al., 1995, J. Chem.
  • a cell which secretes enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid in a culture medium characterized in that it has an increased lipoyl protein ligase B activity compared to a wild-type strain and, at the same time, one compared to the wild-type strain has increased concentration of a lipidizable polypeptide.
  • E. coli wild-type strains are normally all lipoyl binding sites of the E2 proteins (specific lysine residues) saturated with R- ⁇ -lipoic acid, i.e. modified with lipoic acid,
  • the cells according to the invention Due to the overexpression of the lipB gene, the cells according to the invention have an increased lipoyl protein ligase B activity, but sufficient substrate for the lipoyl protein ligase reaction would be available through the simultaneous provision of unloaded lipoylizable polypeptides that all de novo formed R- ⁇ -lipoic acid should be able to be fixed intracellularly on these proteins. Nevertheless, surprisingly the R- ⁇ -lipoic acid is excreted under these conditions.
  • the lipoyl protein ligase B activity is preferably the lipoyl-encoded by the lipB gene
  • a lipoyl protein ligase B activity which is increased compared to a wild-type strain is preferably to be understood to mean that this activity is increased by at least a factor of 2, preferably at least a factor of 5.
  • the lipB gene is preferably a gene with the sequence SEQ ID NO: 1, which codes for a protein with the sequence SEQ ID NO: 2, or a gene coding for a functional variant of the ÜpB gene product a sequence identity to SEQ ID NO: 2 greater than 35%.
  • Functional variants of the lipB gene product with a sequence identity to SEQ ID NO: 2 greater than 55% are particularly preferred, very particularly preferred with a sequence identity to SEQ ID NO: 2 greater than 80%.
  • a functional variant of the -ZipB gene product is preferably a protein with an amino acid sequence which is derived from the sequence shown in SEQ ID NO: 1 by deletion, insertion or substitution of nucleotides, the enzymatic activity of the lipoyl protein ligase B encoded by this gene is retained.
  • a “lipolyzable polypeptide” means peptides or proteins to which at least one molecule of R- ⁇ -lipoic acid can be covalently bound. This bond is preferably carried out between the carboxyl group of R- ⁇ -lipoic acid and the ⁇ -amino group of a lysine residue of the polypeptide to form a so-called lipoamide. The formation of such a lipoamide bond is preferably catalyzed in the cell by a lipoyl protein ligase.
  • an increased concentration of a lipolyzable polypeptide in comparison to the wild-type strain is preferably to be understood to mean that the amount of this polypeptide in a cell is increased by at least a factor of 2, preferably at least a factor of 5.
  • a gene encoding a polypeptide lipoylierbares environmentally summarizes preferably a DNA fragment having the sequence of SEQ ID NO: 4 or encodes a DNA fragment encoding a: which codes for a polypeptide having the sequence SEQ ID NO 3, ' functional variant of this polypeptide encoded with a sequence identity to SEQ ID NO: 4 greater than 20%.
  • Genes coding for variants of a lipolyzable polypeptide with a sequence identity to SEQ are particularly preferred ID NO: 4 greater than 40%, genes coding for polypeptide variants with a sequence identity to SEQ ID NO: 4 greater than 70% are very particularly preferred.
  • genes which originally code for a biotinylatable polypeptide e.g. BCCP
  • a biotinylatable polypeptide e.g. BCCP
  • a lipoylatable polypeptide e.g. BCCP-DASMEP
  • Such a gene comprises a DNA fragment with the sequence SEQ ID NO: 5, which codes for a polypeptide with the sequence SEQ ID NO: 6, or a DNA fragment which is for a functional variant of this polypeptide with a sequence identity to SEQ ID NO: 6 greater than 75% coded.
  • a functional variant of a lipolyzable polypeptide is to be understood as a protein with an amino acid sequence which is derived from the deletion, insertion or substitution of nucleotides from those in SEQ ID NO: 3 or in SEQ ID NO: 5 derived sequences derived, the property of lipoylability is maintained by a lipoyl protein ligase.
  • Cells according to the invention which, in addition to an increased lipoyl protein ligase B activity, have an increased concentration of a lipolyzable polypeptide compared to the wild type can be produced using standard techniques in molecular biology.
  • the increase in the level of a lipoylatable polypeptide in cells according to the invention is achieved, for example, by an increased expression of a gene which codes for a lipoylizable polypeptide.
  • the number of copies of such a gene in the cells can be increased and / or the expression of this gene can be increased by suitable promoters.
  • Increased expression should preferably be understood to mean that the gene for a lipolyzable polypeptide is expressed at least by a factor of 2, preferably at least a factor of 5, in comparison to the respective wild-type cell from which this gene was obtained.
  • an increase in the number of copies of the gene coding for a lipolyzable polypeptide in cells can be carried out using methods known to the person skilled in the art.
  • a gene can be cloned into plasmid vectors with multiple copy numbers per cell (for Escherichia coli e.g. pUC19, pBR322, pACYC184 or derivatives thereof) and inserted into the cells.
  • plasmid vectors with multiple copy numbers per cell for Escherichia coli e.g. pUC19, pBR322, pACYC184 or derivatives thereof
  • such a gene can be integrated several times into the chromosome of the host organism.
  • the known systems with temperate bacteriophages, integrative plasmids or the integration via homologous recombination can be used as the integration method (e.g. Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622).
  • Corresponding promoter systems such as the constitutive promoter of the gapA gene or the inducible lac, tac, trc, ⁇ , ara or tet promoters in Escherichia coli are known to the person skilled in the art (Makrides S. C, 1996, Microbiol. Rev 60: 512-538). Constructs containing a gene for a lipolyzable polypeptide under the control of one of the promoters mentioned above can be used in a manner known per se on plasmids or chromosomally.
  • cells according to the invention contain a plasmid which contains a gene for a lipoylatable polypeptide under the control of a promoter, selected from the group gapA-, lac-, tac-, trc-, ⁇ -, ara- or tet- Promoter.
  • a promoter selected from the group gapA-, lac-, tac-, trc-, ⁇ -, ara- or tet- Promoter.
  • such a gene is under the control of the isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside / IacI-regulatable tac promoter.
  • translation start signals such as. B. the ribosome binding site or the start codon of the gene are present in an optimized sequence on the respective construct or that, according to the “codon usage”, rare codons are exchanged for more frequently occurring codons.
  • a gene that codes for a lipolyzable polypeptide in plasmid vectors is cloned, for example, by amplification of the gene by means of the polymerase chain reaction using specific primers which are the complete gene, or at least the part of the gene which encoded for a lipoylatable polypeptide (eg the lipoyl domain of a protein), record, and subsequent ligation with vector DNA fragments.
  • the generation of a gene for a lipolyzable hybrid polypeptide which z. B. composed of parts of two different lipoyl domains of the E2 protein, and its cloning into a plasmid vector is possible with standard methods of molecular biology and described for example in Miles and Guest (1987, Biochem. J.245: 869-874) ,
  • plasmids are used which already contain promoters for enhanced expression, for example the heat-inducible ⁇ P L P R promoter or the isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside / lacI- Escherichia coli adjustable synthetic tac promoter.
  • the above-mentioned measures which lead to overexpression of a single gene can also be combined with one another.
  • the two relevant genes can be contained on different plasmids and the expression can be controlled by different promoter systems.
  • both genes it is also possible for both genes to lie on the same plasmid as an artificial operon and for the expression of both genes to be regulated synchronously by the same promoter.
  • the lipB gene and the gene for a lipolyzable polypeptide can also be located on the same plasmid, each gene being regulated by its own promoter.
  • the two promoters can either belong to the same or a different type.
  • Plasmids which contain both a lipB gene and a gene for a lipolyzable polypeptide are also the subject of the present invention.
  • the two genes on the same plasmid are each under the control of their own isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside / lacI-regulatable tac promoter.
  • the invention thus also relates to a plasmid which is characterized in that it carries a lipB gene and a gene which codes for a lipidizable polypeptide, in each case under the control of a promoter.
  • the plasmids which contain a lipB gene and / or a gene for a lipolyzable polypeptide are introduced into a starting cell and, for example, selected for plasmid-bearing clones by means of antibiotic resistance.
  • the invention thus also relates to a method for producing a cell according to the invention, characterized in that a plasmid which contains a lipB gene and a plasmid which contains a gene for a lipidizable polypeptide or a plasmid according to the invention are introduced into a starting cell.
  • genes coding for polypeptides that can be lipolyzed e.g. aceF, sucB
  • genes required for the de novo synthesis of R- ⁇ -lipoic acid could be found (e.g. lip ⁇ , lipB).
  • Cells according to the invention can thus preferably be produced from cells of pro- or eukaryotic organisms which are able to synthesize R- ⁇ -lipoic acid themselves (starting cell), which are accessible to recombinant processes and which can be cultured by fermentation. Plant or animal cells that can be grown in cell culture are thus also suitable for producing cells according to the invention.
  • those starting lines can be used which have not been subjected to any manipulation so far.
  • the cells according to the invention are also possible to combine the cells according to the invention with measures which already lead to improved production of R- ⁇ -lipoic acid.
  • those cells are particularly suitable which are characterized by an increased expression of the li - pA gene already have an increased lipoic acid synthase activity and / or only have an attenuated, preferably completely switched off, lipoyl protein ligase A activity.
  • Methods for producing cells with an increased lipoic acid synthase activity and / or a weakened lipoyl protein ligase A activity are described in patent applications DE 10235270 and DE 10258127.
  • the cells are preferably microorganisms, such as, for example, yeast or bacterial strains.
  • the strains of the Enterobacteriaceae family are particularly preferred, and strains of the type Escherichia coli are very particularly preferred.
  • the invention further relates to a method for the fermentative production of enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid.
  • This method is characterized in that a cell according to the invention is cultivated in a culture medium, the cell secreting enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid into the culture medium and the enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid being separated from the culture medium.
  • R- ⁇ -lipoic acid from the cells according to the invention into the culture medium allows simple isolation of the product from the culture medium after separation of the biomass, without the cells having to be broken up beforehand or without the R- ⁇ -lipoic acid being separated by a complex and lossy hydrolysis step from the carrier protein bound to it (ACP or the E2 subunit of ⁇ -keto acid dehydrogenases) must be split off.
  • R- ⁇ -lipoic acid can be obtained from the culture medium by methods known to those skilled in the art, such as, for example, centrifuging the cell-containing culture medium to separate the cells and by subsequent extraction and / or precipitation of the product.
  • the cells according to the invention for the production of R- ⁇ -lipoic acid are cultivated in common culture media, preferably wise in a minimal salt medium known from the literature (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).
  • all usable sugars, sugar alcohols or organic acids or their salts can be used as the carbon source.
  • Aspartic acid, malic acid, succinic acid, pyruvic acid, fumaric acid, glutamic acid, glucose, glycerol or oxaloacetic acid are preferably used.
  • Succinic acid and oxaloacetic acid are particularly preferred.
  • Combined feeding of several different carbon sources is also possible.
  • short-chain fatty acids with a chain length of C2-C8, preferably with a chain length of C6-C8 (hexanoic or octanoic acid) can be added to the medium as specific precursors for the ⁇ -lipoic acid synthesis.
  • the concentration of the carbon source added is preferably 0.1-30 g / l.
  • the cells according to the invention are preferably incubated under aerobic cultivation conditions over a period of 16-150 h and in the range of the optimal growth temperature for the respective cells.
  • 15 - 55 ° C is preferred as the optimal temperature range.
  • a temperature between 30 and 37 ° C. is particularly preferred.
  • the detection and quantification of the R- ⁇ -lipoic acid produced in the method according to the invention is carried out, for example, by means of a bioassay using a lipoic auxotrophic indicator strain (lip ⁇ mutant).
  • lipoic auxotrophic indicator strain lip ⁇ mutant
  • This type of turbidimetric quantification of R- ⁇ -lipoic acid is known from the literature (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).
  • the indicator strain W14851ip2 (ATCC 25645) used in the context of the present invention would, however, also grow without supplemented R- ⁇ -lipoic acid if the medium also contains acetate and succinate in addition to glucose.
  • the R- ⁇ -lipoic acid producer is preferably grown with succinate as the only carbon source.
  • This strain is supplemented with the culture supernatant of a cell culture according to the invention; The lipoic acid content in the culture medium can then be determined on the basis of the growth of the indicator strain.
  • the plasmid pGS331 was used for the expression of the gene coding for a lipolyzable polypeptide (Ali et al., 1990, Biochem. J. 271: 139-145).
  • this plasmid contains a subgenic fragment of the aceF (E2p) gene from Escherichia coli which codes for a lipoyl domain and which is under the expression control of the tac promoter.
  • the gene for this lipoyl domain is in this case a hybrid, composed of the codons for amino acid residues 1-33 of the first lipoyl domain and residues 238-289 of the third lipoyl domain of the E2p protein.
  • the plasmid vector pACYC184 was first cut with the restriction endonuclease Aval under the conditions specified by the manufacturer. The 5-overhanging ends of the restricted vector generated in this way were filled in according to the manufacturer's instructions using Klenow polymerase, the vector was then cut with the restriction endonuclease Clal and then dephosphorylated by treatment with alkaline phosphatase. The entire restriction mixture was then electrophoresed in an agarose gel. The 2.8 kb DNA fragment, which in addition to the origin of replication pl5A also contains the chloramphenicol resistance gene, was then isolated and purified from the agarose gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden) according to the manufacturer's instructions.
  • QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen GmbH, Hilden
  • the lipB gene under the control of the arabinose-inducible ara-BAD promoter was obtained from the plasmid pBAD-lipB, which was first cut with the restriction endonuclease Xfoal under the conditions specified by the manufacturer. The resulting 5-overhanging ends of the restricted vector were then filled in according to the manufacturer's instructions using Klenow polymerase and the vector was then cut with the restriction endonuclease Clal. The entire restriction mixture was then electrophoresed in an agarose gel. The 2 kb DNA fragment that contains the regulatory sequences of the arabinose operon from E. coli (araC gene, araB ⁇ D promoter region) and also contains the lipB gene under the control of the araB ⁇ D promoter was then isolated from the agarose gel and purified as described for the vector fragment of pACYC184.
  • the araC-pBAD-lipB fragment was ligated with the 2.8 kb vector fragment of pACYC184 using the T4 DNA ligase.
  • the transformation of E. coli cells of the DH5 ⁇ strain with the ligation batch was carried out by electroporation in a manner known to the person skilled in the art.
  • the transformation mixture was then applied to LB chloramphenicol agar plates (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 10 g / 1 NaCl, 15 g / 1 agar, 20 mg / 1 chloramphenicol) and incubated at 37 ° C.
  • Example 2 Production of R- ⁇ -lipoic acid producers
  • the -ZipB overexpression plasmid pKP560 and the lipoyl domain plasmid pGS331 were transformed by electroporation into the E. coli strains W3110 and W3110 ⁇ lp2A and after selection on LB agar plates with 20 mg / 1 chloramphenicol or 100 mg / 1 ampicillin the plasmids were reisolated from one of the transformants, cleaved with restriction endonucleases and checked.
  • the control plasmid pACYCl84 was used in an analogous manner.
  • the strains generated in Example 2 by transformation with the corresponding plasmids were used for the fermentative production of R- ⁇ -lipoic acid.
  • 5 ml of LB liquid medium containing 100 mg / 1 ampicillin and / or 20 mg / 1 chloramphenicol to stabilize plasmids were inoculated with the respective strain as a preculture for the production cultivation and inoculated for 16 h at 37 ° C. and 160 rpm incubated on a shaker.
  • the cells were then harvested by centrifugation and washed twice with the appropriate volume of sterile saline (0.9% NaCl).
  • Chloramphenicol contained, inoculated in a ratio of 1: 100.
  • the production cultures were incubated at 37 ° C. and 160 rpm on a shaker.
  • the expression of the lipoyl protein ligase B gene in the strains which contained the plasmid pKP560 was induced by adding 2 g / 1 L-arabinose after about 4 h of incubation.
  • expression of the E2 domain in the strains with the plasmid pGS331 was also induced by adding 0.05 g / l of isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside. ed. After 24 h of incubation, samples were taken and the cells were separated from the culture medium by centrifugation.
  • R- ⁇ -lipoic acid contained therein was quantified using the known turbidimetric bioassay (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A: 269-272).
  • Table 1 shows the levels of R- ⁇ -lipoic acid achieved in the respective culture supernatant after 24 h of incubation:
  • microorganism identified under I above was receivcd by this International Depositary Autho ⁇ ty on (datc of original deposit) and a request to convcrt the original deposit to a deposit under the Budapest Troaty was rcccived by it on (dato of rcceipt of request for conversion)

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von R-α-Liponsäure mittels Fermentation, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zelle, die gegenüber einem Wildtyp-Stamm eine erhöhte Aktivität der Lipoyl-Protein-Ligase B besitzt und gleichzeitig eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweist, in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-α-Liponsäure in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-α-Liponsäure von dem Kulturmedium abgetrennt wird.

Description

Zellen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von R-α- Liponsäure
Die Erfindung betrifft Zellen und ein Verfahren zur fermenta- tiven Herstellung von R-α-Liponsäure.
R-α-Liponsäure ist in einer Vielzahl von Pro- und Eukaryonten ein essentieller Cofaktor bestimmter Multienzymkomplexe . Dabei ist die R-α-Liponsäure mit seiner Carboxylgruppe unter Bildung eines so genannten Lipoamids jeweils kovalent an die ε-Amino- gruppe eines spezifischen Lysin-Rests des entsprechenden Enzyms gebunden. Auf diese Weise ist die R-α-Liponsäure ein Teil der E2-Untereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) [EC 2.3.1.12] bzw. der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3.1.61] und spielt dort als Redoxpartner und Acylgruppen- überträger eine entscheidende Rolle bei der oxidativen Decar- boxylierung von α-Ketosäuren. Außerdem fungiert R-α-Liponsäure als Aminomethyl-Carrier in Glycin-Cleavage Enzymsystemen.
Die physiologisch und genetisch am besten charakterisierte α- Ketosäure-Dehydrogenase ist der Pyruvat-Dehydrogenase-Multi- enzymkomplex von Escherichia coli . Die drei Untereinheiten El (Pyruvat-Dehydrogenase) , E2 (Dihydrolipoamid-Acetyltrans- ferase) und E3 (Dihydrolipoamid-Dehydrogenase) werden von ei- nem Operon bestehend aus den Genen aceE, aceF und lpd codiert und formen einen Multienzymkomplex, welcher sich aus 24 El-, 24 E2- und 12 E3-Untereinheiten zusammensetzt. Dabei bilden die 24 E2-Untereinheiten das Kernstück des Komplexes. Das E2-Monomer der PDH (E2p) ist wiederum modular aus ver- schiedenen Domänen aufgebaut, die über flexible Linkerregionen miteinander verbunden sind (s. Fig. 1) . Der N-Terminus des Proteins enthält drei so genannte Lipoyl-Domänen bestehend aus jeweils ca. 80 Aminosäureresten, wobei jede dieser Domänen genau ein Molekül R-α-Liponsäure wie oben beschrieben binden kann. Diese drei Lipoyl-Domänen der PDH weisen untereinander jeweils eine sehr hohe Sequenzidentität (> 66 %) auf. An die N-terminale Region des Proteins schließt sich die kleine zentrale E3-Bindedomäne an, die wiederum mit dem C-terminalen Be- reich, der die katalytischen Domäne (Acetyl-Transferase) enthält, verbunden ist.
Die E2-Untereinheit der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (E2o) wird vom suαB-Gen codiert und ist ebenfalls modular aufgebaut, besitzt aber im Gegensatz zum E2-Protein der PDH nur eine Li- poyl-Domäne. Die Sequenz der E2o-Lipoyl-Domäne zeigt mit nur etwa 22 % eine relativ schwache Identität zu den E2p-Lipoyl- Domänen, die räumliche Struktur der Lipoyl-Domänen beider E2- Proteine ist allerdings sehr ähnlich (Reche und Perham, 1999, EMBO J. 18: 2673-2682) .
Ein bezüglich der Sequenz zu den Lipoyl-Domänen der E2- Proteine auch nur mäßig homologes, strukturell aber ebenfalls sehr ähnliches Protein ist die Biotinyl-Domäne des Biotin-
Carboxyl-Carrier-Proteins (BCCP) . Das BCCP wird normalerweise posttranslational mittels der Biotinyl-Protein-Ligase BirA an einem spezifischen Lysin-Rest biotinyliert . Es gibt allerdings verschiedene spezifisch mutierte BCCP-Varianten, die mittels einer Lipoyl-Protein-Ligase an diesem speziellen Lysin-Rest nun auch alternativ oder sogar ausschließlich lipoyliert werden können (Reche und Perham, 1999, EMBO J. 18: 2673-2682).
α-Liponsäure ist ein optisch aktives Molekül mit einem Chira- litätszentrum am Kohlenstoffatom C6. Dabei stellt die R-Konfi- guration der α-Liponsäure das natürlich vorkommende Enantiomer dar. Nur diese Form zeigt physiologische Aktivität als Cofak- tor der entsprechenden Enzyme. α-Liponsäure kann sowohl in einer oxidierten (5- [1, 2] -Dithiolan-3-yl-Pentansäure) als auch in einer reduzierten Form (6, 8-Dimercapto-Oktansäure) vorkommen. Im Folgenden sind unter der Bezeichnung "α-Liponsäure" beide Formen sowie die jeweiligen Salze der α-Liponsäure, wie z. B. das Calcium-, Kalium-, Magnesium-, Natrium- oder das Ammoniumsalz zu verstehen.
Die Biosynthese von R-α-Liponsäure wurde besonders an dem Bak- teriu Escherichia coli intensiv untersucht (s. Fig. 2) . Hier dient Oktansäure, die an das Acyl-Carrier-Protein (ACP) kova- lent gebunden ist, als spezifische Vorstufe bei der Lipon- säure-Synthese . In einer komplexen Reaktion werden zwei Schwefelatome auf die derart aktivierte Oktansäure (Oktanoyl-ACP) übertragen, wobei R-α-Lipoyl-ACP entsteht. Diese Reaktion wird von der Liponsäure-Synthase [EC 2.8.1.-], dem ÜpA-Genprodukt, katalysiert. Als Schwefeldonor dient dabei letztendlich die Aminosäure L-Cystein. Der anschließende Transfer der R-α- Liponsäure von R-α-Lipoyl-ACP auf die E2-Untereinheit der α- Ketosäure-Dehydrogenasen wird von der Lipoyl-Protein-Ligase B [EC 6.-.-.-], dem 1 ipB-Genprodukt , katalysiert, ohne dass dabei jedoch R-α-Lipoyl-ACP oder R-α-Liponsäure als freie Zwischenprodukte auftreten (Miller et al . , 2000, Biochemistry 39:15166-15178) .
E. coli kann aber auch freie R-α-Liponsäure aus dem umgebenden Medium aufnehmen und für die Bildung funktioneller α-Keto- säure-Dehydrogenasen verwenden. Dazu wird R-α-Liponsäure zunächst mittels ATP zu R-α-Lipoyl-AMP aktiviert und anschließend auf die entsprechenden Enzym-Untereinheiten übertragen (s. Fig. 3) . Beide Aktivitäten werden von der Lipoyl-Protein- Ligase A [EC 6.-.-.-], dem IplA-Genprodukt , katalysiert. Diese LplA-Aktivität ist für Wildtypstämme von E. coli allerdings nicht essentiell, wenn die endogene Liponsäure-Synthese und der Transfer der Lipoyl-Gruppe über den LipA/LipB-Weg erfolgt. So wurden beispielsweise IplΛ-Mutanten beschrieben, die keine nachweisbare Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität mehr besitzen, deren Phänotyp aber unter normalen Wachstumsbedingungen nicht von einer Wildtyp-Zelle zu unterscheiden ist (Morris et al . , 1995, J. Bacteriol. 177: 1-10).
Über die Biosynthese von R-α-Liponsäure in Eukaryonten ist wenig bekannt. Es wird aber vermutet, dass die R-α-Liponsäure- Synthese sowie der Transfer auf die entsprechenden Enzyme in den Mitochondrien eukaryontischer Zellen auf ähnliche Weise wie in Bakterien erfolgt.
Neben ihrer Relevanz als essentieller Bestandteil von Enzymen mit einer zentralen Rolle im Stoffwechsel, wurde schon früh die Bedeutung der α-Liponsäure für die Pharmakotherapie sowie für die Nahrungsmittelergänzung (Nutraceutical) erkannt: α-Liponsäure besitzt aufgrund ihrer beiden Thiolgruppen eine ausgeprägte Wirksamkeit als Antioxidans und kann deshalb den Organismus vor schädlichen Prozessen, die durch oxidativen Stress induziert werden, schützen. Außerdem ist α-Dihydro- liponsäure, die reduzierte Form der α-Liponsäure, aufgrund ihrer Eigenschaft als starkes Reduktionsmittel in der Lage, andere oxidierte natürliche Antioxidationsmittel im Körper wie Ascorbinsäure oder α-Tocopherol direkt oder indirekt zu regenerieren oder bei deren Mangel diese auch zu ersetzen. Entsprechend kommt der α-Liponsäure im Zusammenspiel mit Ascorbinsäure, α-Tocopherol und Glutathion, dem so genannten "Netzwerk der Antioxidantien" , eine zentrale Bedeutung zu. α-Liponsäure wird außerdem zur Prävention und Bekämpfung von Diabetes mellitus Typ II und dessen Folgeschäden, wie z. B. Polyneuropathie, Cataract oder Kardiovaskularleiden eingesetzt .
Die unterschiedliche biologische Aktivität beider Enantiomere der α-Liponsäure ist derzeit Gegenstand intensiver Untersuchungen, wobei sich allerdings immer mehr herauskristallisiert, dass die Applikation des reinen R-Enantiomers der α-
Liponsäure deutliche Vorteile gegenüber der S-Form aufweist. So wurde im in vi ro-Versuch gezeigt, dass nur die natürliche R-α-Liponsäure zur Bildung funktioneller α-Ketosäure-Dehydro- genasen führt. Das S-Enantiomer hatte dagegen sogar einen inhibierenden Effekt auf die Stimulierung der Enzymaktivität durch R-α-Liponsäure. Die Reduktion von α-Liponsäure und damit die Regeneration der antioxidativ wirksamen α-Dihydrolipon- säure in den Mitochondrien ist für die Zelle von essentieller Bedeutung. Die mitochondriale NADH-abhängige Lipoamid- Reduktase von Säugern zeigt mit dem R-Enantiomer eine fast 20- fach höhere Aktivität als mit der S-Form. Des weiteren hat R- α-Liponsäure verglichen mit dem S-Enantiomer einen deutlich stärkeren Effekt auf die insulin-vermittelte Glucose-Aufnahme und den Glucose-Metabolismus von Skelettmuskelzellen insulin- resistenter Ratten. Im Tierversuch zeigte die R-Form außerdem einen antiphlogistischen Effekt, während die S-Form eher eine analgetische Wirkung hatte. Um unerwünschte Nebeneffekte zu vermeiden, ist es daher äußerst wünschenswert, α-Liponsäure jeweils nur in der enantiomerenreinen Form zu applizieren.
Derzeit erfolgt die großtechnische Herstellung von α-Liponsäure ausschließlich mittels chemischer Verfahren, wobei immer das Razemat aus R- und S-Form als Endprodukt gebildet wird (Y- adav et al., 1990, J. Sei. Ind. Res. 49: 400-409). Zur Gewin- nung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Beispielsweise kann das Razemat der α- Liponsäure oder eines der Syntheseintermediate entweder chemisch mittels chiraler Hilfssubstanzen (Walton et. al, 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76: 4748; DE 4137773) oder enzymatisch (Adger et al . , 1995, J. Chem. Soc, Chem. Commun . : 1563-1564) aufgespalten werden. In anderen Verfahren unterbleibt die Entstehung eines Razemats aufgrund eines enantioselektiven Syntheseschritts, wobei das neue Chiralitätszentrum entweder chemisch (DE 3629116; DE 19533881; Bringmann et al . , 1999, Z. Na- turforsch. 54b: 655-661; DE 10036516) oder durch eine stereospezifische Biotransformation mittels Mikroorganismen eingeführt werden kann (Gopalan und Jacobs, 1989, Tetrahedron Lett. 30: 5705-5708; Dasaradhi et al . , 1990, J. Chem. Soc, Chem. Commun. : 729-730; DE 10056025) . Andere Prozesse wiederum star- ten die chemische Synthese von enantiomerenreiner α-Liponsäure mit einem natürlich vorkommenden chiralen Edukt wie z. B. S- Maleinsäure oder D-Mannitol (Brookes und Golding, 1988, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I: 9-12; Rama Rao et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28, 2183-2186). Wegen z. T. aufwendiger Syn- theseschritte, geringer Ausbeuten und hoher Materialkosten sind alle bekannten Methoden zur Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure derzeit nicht wirtschaftlich.
Die großtechnische Herstellung vieler niedermolekularer Natur- stoffe, wie z.B. Antibiotika, Vitamine oder Aminosäuren erfolgt heute oftmals mittels eines fermentativen Verfahrens unter Verwendung verschiedener Stämme von Mikroorganismen. Die Patentanmeldungen am Deutschen Patent- und Markenamt mit den Aktenzeichen 10235270, 10245993 und 10258127 beschreiben verschiedene Zellen, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure sekretieren sowie Verfahren, bei denen die Produktion von e- nantiomerenreiner R-α-Liponsäure ausschließlich in einem Fermentationsprozeß erfolgt. Dabei werden Zellen eingesetzt, die entweder ein Liponsäure-Synthase-Gen bzw. ein Lipoyl-Protein- Ligase B-Gen einzeln oder auch in Kombination überexprimieren oder Zellen, die eine verminderte Lipoyl-Protein-Ligase A- Aktivität aufweisen. Die Produktion von enantiomerenreiner R- α-Liponsäure mit Hilfe dieser Zellen erfolgt allerdings in noch sehr beschränktem Ausmaß, so dass diese fermentativen Verfahren derzeit noch nicht mit der chemischen Synthese konkurrieren können.
Nur in seltenen Fällen führt eine einzige genetische Manipulation im Zuge des so genannten "metabolic engineering" eines Wildtypstammes zur Überproduktion der gewünschten Verbindung in ausreichendem Umfang. Vielmehr ist dazu eine Kombination von mehreren gezielten genetischen Manipulationen notwendig, oftmals noch ergänzt durch klassische Mutagenese/Screening-An- sätze .
Entsprechend ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, leistungsfähige Zellen, welche enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretieren, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Zelle, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine gegenüber einem Wildtyp-Stamm erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B Aktivität besitzt und gleichzeitig eine im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweist.
Aus physiologischen und biochemischen Daten geht hervor, dass Liponsäure in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in gebundener Form vorkommt, da bereits die Synthese der R-α-Liponsäure vollständig proteingebunden erfolgt (vgl. Fig. 1) (Herbert und Guest, 1975, Arch. Microbiol. 106: 259-266; Miller et al . , 2000, Biochemistry 39:15166-15178). Erstaunlicherweise ist die Verstärkung einer Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität einer Wildtyp-Zelle ausreichend, damit es zur Ausscheidung von R-α- Liponsäure in das Kulturmedium kommt (DE 10245993). Im Rahmen dieser Erfindung wurde nun völlig überraschend gefunden, dass eine Verstärkung der Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität kombiniert mit einer Erhöhung der intrazellulären Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids zu einer deutlich gesteigerten Anhäufung enantiomerenreiner R-α-Liponsäure im Kulturmedium dieser Zellen führt.
In einem E . coli Wildtyp-Stamm sind normalerweise alle Lipoyl- Bindestellen der E2-Proteine (spezifische Lysinreste) mit R-α- Liponsäure abgesättigt, d.h. mit Liponsäure modifiziert,
(Packman et al . , 1991, Biochem. J. 277: 153-158), da die de novo-Synthese der R-α-Liponsäure und der anschließende Transfer vom R-α-Lipoyl-ACP auf die entsprechenden Lipoyl-Domänen gut aufeinander abgestimmt sind. Die vermehrte Präsenz eines lipoylierbaren Polypeptids in einer Zelle hat nun verschiedene Konsequenze :
- Es kommt zur Akkumulation von unmodifizierten, d.h. nicht- lipoylierten Lipoyl-Akzeptorproteinen, da die Liponsäure- Synthese-Kapazität der Zelle nicht mehr für eine vollständi- ge Beladung aller potentiell lipoylierbaren Polypeptide ausreicht (Miles und Guest, 1987, Biochem. J. 245: 869-874; Ali und Guest, 1990, Biochem. J. 271: 139-145) .
- Zellen mit einer erhöhten Konzentration von unmodifizierten Lipoyl-Akzeptorproteinen können im Vergleich zu Wildtyp- Zellen extern Supplementierte R-α-Liponsäure vermehrt aufnehmen und an Lipoyl-Akzeptorproteine binden (Morris et al . , 1995, J. Bacteriol. 177: 1-10).
- Die Exkretion von R-α-Liponsäure wird bei einem Liponsäure- Produktionsstamm drastisch vermindert (siehe Stamm W311θΔlplÄ pGS331 in Beispiel 3) , wahrscheinlich deshalb, weil die de novo synthetisierte R-α-Liponsäure nun an die vermehrt zur Verfügung stehenden Lipoyl-Akzeptorproteine fi- xiert werden kann, wodurch eine Ausscheidung verhindert wird.
Entsprechend dieser Befunde würde der Fachmann a priori vermu- ten, dass durch eine erhöhte Präsenz eines unmodifizierten lipoylierbaren Polypeptids in der Zelle die Exkretion von R-α- Liponsäure auch bei anderen Liponsäure-Produktionsstammen, wie z. B. dem Stamm W3110 pBAD-lipB, der eine erhöhte Lipoyl- Protein-Ligase B-Aktivität aufweist (DE 10245993) , vermindert wird. Durch die Überexpression des lipB-Gens verfügen die erfindungsgemäßen Zellen zwar über eine erhöhte Lipoyl-Protein- Ligase B-Aktivität, aber durch eine gleichzeitige Bereitstellung von unbeladenen lipoylierbaren Polypeptiden wäre ausreichend Substrat für die Lipoyl-Protein-Ligase-Reaktion vorhan- den, so dass die gesamte de novo gebildete R-α-Liponsäure an diesen Proteinen intrazellulär fixiert werden können sollte. Dennoch wird erstaunlicherweise unter diesen Bedingungen die R-α-Liponsäure vermehrt ausgeschieden.
Unter der Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität ist im Rahmen dieser Erfindung vorzugsweise die vom lipB-Gen codierte Lipoyl-
Protein-Ligase-Aktivität einer Zelle zu verstehen, welche eine strikte Präferenz für R-α-Lipoyl-ACP gegenüber freier R-α- Liponsäure als Substrat aufweist (s. Fig. 2) .
Unter einer gegenüber einem Wildtyp-Stamm erhöhten Lipoyl- Protein-Ligase B-Aktivität ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zu verstehen, dass diese Aktivität mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 gesteigert ist.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem lipB-Gen um ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, das für ein Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 codiert oder um ein Gen codierend für eine funk- tionelle Variante des ÜpB-Genprodukts mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 größer 35 % . Besonders bevorzugt sind funktionelle Varianten des lipB- Genprodukts mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 größer 55 %, ganz besonders bevorzugt mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 größer 80 % .
Unter einer funktioneilen Variante des -ZipB-Genprodukts ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz zu verstehen, die sich durch Deleti- on, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz ableitet, wobei die enzymati- sche Aktivität der durch dieses Gen codierten Lipoyl-Protein- Ligase B erhalten bleibt.
Unter einem "lipoylierbaren Polypeptid" sind im Rahmen dieser Erfindung Peptide oder Proteine zu verstehen, an die mindestens ein Molekül R-α-Liponsäure kovalent gebunden werden kann. Dabei erfolgt diese Bindung bevorzugt zwischen der Carboxylgruppe der R-α-Liponsäure und der ε-Aminogruppe eines Lysin- Restes des Polypeptids unter Bildung eines so genannten Lipo- amids . Die Knüpfung einer solchen Lipoamid-Bindung wird in der Zelle vorzugsweise von einer Lipoyl-Protein-Ligase katalysiert .
Unter einer im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm erhöhten Kon- zentration eines lipoylierbaren Polypeptids ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zu verstehen, dass die Menge dieses Polypeptids in einer Zelle mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 gesteigert ist.
Ein Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, um- fasst vorzugsweise ein DNA-Fragment mit der Sequenz SEQ ID NO: 3,' welches für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 codiert oder ein DNA-Fragment, das für eine funktioneile Variante dieses Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 größer 20 % codiert.
Besonders bevorzugt sind Gene codierend für Varianten eines lipoylierbaren Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 größer 40 %, ganz besonders bevorzugt sind Gene codierend für Polypeptid-Varianten mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 größer 70 % .
Als Alternativen für Gene, die für ein lipoylierbares Polypeptid codieren, können auch Allele von Genen eingesetzt werden, die ursprünglich für ein biotinylierbares Polypeptid (z.B. BCCP) codieren, jedoch nach geringfügiger Sequenzvariation nun auch lipoyliert werden können (z.B. BCCP-DASMEP) . Ein derarti- ges Gen umfasst ein DNA-Fragment mit der Sequenz SEQ ID NO: 5, welches für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 codiert oder ein DNA-Fragment das für eine funktioneile Variante dieses Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 6 größer 75 % codiert.
Unter einer funktioneilen Variante eines lipoylierbaren Polypeptids ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz zu verstehen, die sich durch De- letion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus den in SEQ ID NO: 3 oder in SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenzen ableitet, wobei die Eigenschaft der Lipoylierbarkeit durch eine Lipoyl-Protein-Ligase erhalten bleibt.
In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle Werte zur Se- quenzidentität von DNA- und Aminosäure-Sequenzen auf Ergebnisse, die mit dem Algorithmus BESTFIT (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin) erhalten werden.
Erfindungsgemäße Zellen, die neben einer verstärkten Lipoyl- Protein-Ligase B-Aktivität eine gegenüber dem Wildtyp erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweisen, können mit Standardtechniken der Molekularbiologie erzeugt werden.
Verfahren zur Steigerung der Aktivität der Lipoyl-Protein- Ligase B in einer Zelle sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in der Patentanmeldung DE 10245993 beschrieben, auf die insoweit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Die Erhöhung des Spiegels eines lipoylierbaren Polypeptids in erfindungsgemäßen Zellen wird beispielsweise durch eine verstärkte Expression eines Gens, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, erreicht. Dabei kann die Kopienzahl eines solchen Gens in den Zellen erhöht sein und/oder es kann durch geeignete Promotoren die Expression dieses Gens verstärkt sein.
Unter verstärkter Expression ist dabei vorzugsweise zu verstehen, dass das Gen für ein lipoylierbares Polypeptid im Vergleich zur jeweiligen Wildtyp-Zelle, aus der dieses Gen gewon- nen wurde, mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 vermehrt exprimiert wird.
Eine Erhöhung der Kopienzahl des Gens codierend für ein lipoylierbares Polypeptid in Zellen kann mit dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen werden. So kann zum Beispiel ein solches Gen in Plasmid-Vektoren mit mehrfacher Kopienzahl pro Zelle (für Escherichia coli z.B. pUC19, pBR322, pACYC184 oder Derivaten davon) kloniert und in die Zellen eingebracht werden. Alternativ kann ein solches Gen mehrfach in das Chromosom des Wirtsorganismus integriert werden. Als Integrationsverfahren können die bekannten Systeme mit temperenten Bakteriophagen, integrative Plasmide oder die Integration über homologe Rekombination genutzt werden (z.B. Hamilton et al . , 1989, J. Bacte- riol. 171: 4617-4622) .
Bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung eines Gens codierend für ein lipoylierbares Polypeptid in einen Plasmid-Vektor unter Kontrolle eines Promotors. Besonders bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung eines solchen Gens in Plasmid-Vektoren aus der pUC-Familie oder der pBR322-Familie, wie z. B. ptac85 (Ali und Guest, 1990, Biochem. J. 271: 139-145) . Als Kontrollregion für die Expression eines Gens für ein lipoylierbares Polypeptid kann die natürliche Promotor- und Operatorregion dieses Gens dienen, die verstärkte Expression eines solchen Gens kann jedoch insbesondere auch mittels anderer Promotoren erfolgen. Entsprechende Promotorsysteme wie beispielsweise in Escherichia coli der konstitutive Promotor des gapA-Gens oder die induzierbaren lac-, tac-, trc-, λ-, ara- oder tet-Promotoren sind dem Fachmann bekannt (Makrides S. C, 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538). Konstrukte, die ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid unter der Kontrolle eines der oben genannten Promotoren enthalten, können in an sich bekannter Weise auf Plasmiden oder chromosomal verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten erfindungsgemä- ße Zellen ein Plasmid, das ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid unter der Kontrolle eines Promotors enthält, ausgewählt aus der Gruppe gapA-, lac-, tac-, trc-, λ-, ara- oder tet-Promotor . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich ein solches Gen unter der Kontrolle des Isopro- pyl-ß-D-Thiogalactosid/IacI-regulierbaren tac-Promotors .
Des weiteren kann eine verstärkte Expression dadurch erreicht werden, dass Translationsstartsignale, wie z. B. die Riboso- menbindestelle oder das Startcodon des Gens, in optimierter Sequenz auf dem jeweiligen Konstrukt vorhanden sind oder dass gemäß der „codon usage" seltene Codons gegen häufiger vorkommende Codons ausgetauscht werden.
Die Klonierung eines Gens, das für ein lipoylierbares Polypep- tid codiert, in Plasmid-Vektoren erfolgt beispielsweise durch Amplifikation des Gens mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion unter Einsatz von spezifischen Primern, die das komplette Gen, oder zumindest den Teil des Gens, der für ein lipoylierbares Polypeptid codiert (z.B. die Lipoyl-Domäne eines Proteins), erfassen, und anschließende Ligation mit Vektor-DNA-Fragmenten. Die Erzeugung eines Gens für ein lipoylierbares Hybridpolypep- tids, welches sich z. B. aus Teilen zweier verschiedener Lipoyl-Domänen des E2-Proteins zusammensetzt, sowie dessen Klonierung in einen Plasmid-Vektor, ist mit Standardmethoden der Molekularbiologie möglich und bei Miles und Guest (1987, Biochem. J.245: 869-874) beispielsweise beschrieben.
Als bevorzugte Vektoren für die Klonierung eines Gens codierend für ein lipoylierbares Polypeptid werden Plasmide verwen- det, die bereits Promotoren zur verstärkten Expression enthalten, beispielsweise den hitze-induzierbaren λPLPR-Promotor oder den Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid/lacI-regulierbaren synthetischen tac-Promotor von Escherichia coli .
Um eine synchrone Überexpression eines ÜpB-Gens mit einem
Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, zu erreichen, können oben genannte Maßnahmen, die zur Überexpression eines Einzelgens führen, auch miteinander kombiniert werden. So können die beiden relevanten Gene beispielsweise auf ver- schiedenen Plasmiden enthalten sein und die Expression jeweils unter der Kontrolle verschiedener Promotorsysteme liegen. Es ist aber auch möglich, dass beide Gene als künstliches Operon auf demselben Plasmid liegen und die Expression beider Gene somit synchron durch denselben Promotor reguliert wird. Des weiteren können das lipB-Gen und das Gen für ein lipoylierbares Polypeptid auch auf demselben Plasmid lokalisiert sein, wobei jedes Gen von einem eigenen Promotor reguliert wird. Dabei können die beiden Promotoren entweder demselben oder aber einem unterschiedlichen Typ angehören.
Plasmide, die sowohl ein lipB-Gen als auch ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die beiden Gene auf demselben Plasmid jeweils unter der Kontrolle eines eigenen Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid/lacI-regulierbaren tac- Promotors . Die Erfindung betrifft somit auch ein Plasmid, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein lipB-Gen sowie ein Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, jeweils unter Kontrolle eines Promotors trägt.
Durch eine gängige Transformationsmethode (z.B. Elektroporati- on) werden die Plasmide, die ein lipB-Gen und/oder ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthalten, in eine Ausgangszelle eingebracht und beispielsweise mittels Antibiotika-Resistenz auf plasmid-tragende Klone selektiert.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Ausgangszelle ein Plasmid, das ein lipB-Gen und ein Plasmid, das ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthält oder ein erfindungsgemäßes Plasmid eingebracht werden.
In einer Vielzahl von pro- und eukaryontischen Zellen bzw. Or- ganismen konnten Gene, die für lipoylierbare Polypeptide codieren (z. B. aceF, sucB) sowie Gene, die für die de novo- Synthese von R-α-Liponsäure benötigt werden (z. B. lipÄ, lipB) , identifiziert werden. Erfindungsgemäße Zellen lassen sich somit vorzugsweise aus Zellen von pro- oder eukaryonti- sehen Organismen herstellen, die in der Lage sind, R-α-Liponsäure selbst zu synthetisieren (Ausgangszelle) , die rekombi- nanten Verfahren zugänglich sind und die durch Fermentation kultivierbar sind. Auch pflanzliche oder tierische Zellen, die in Zellkultur züchtbar sind, sind somit zur Herstellung erfin- dungsgemäßer Zellen geeignet.
Zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen können solche Ausgangszeilen verwendet werden, die bisher noch keinerlei Manipulation unterzogen wurden. Des weiteren ist es jedoch mög- lieh, die erfindungsgemäßen Zellen auch mit Maßnahmen zu kombinieren, die bereits zu einer verbesserten Produktion von R- α-Liponsäure führen. So sind beispielsweise solche Zellen besonders geeignet, die durch eine verstärkte Expression des li - pA-Gens bereits über eine erhöhte Liponsäure-Synthase-Aktiviät verfügen und/oder nur noch eine abgeschwächte, vorzugsweise völlig ausgeschaltete Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweisen. Verfahren zur Herstellung von Zellen mit einer ver- stärkten Liponsäure-Synthase-Aktivität und/oder einer abgeschwächten Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität sind in den Patentanmeldungen DE 10235270 und DE 10258127 beschrieben.
Bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefe- oder Bakterienstämme. Besonders bevorzugt handelt es sich um Bakterienstämme aus der Familie der Enterobacteriaceae, ganz besonders bevorzugt um Stämme der Art Escherichia coli .
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Zelle in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-α-Liponsäure in das Kulturmedium ausschei- det und die enantiomerenreine R-α-Liponsäure vom Kulturmedium abgetrennt wird.
Die Ausscheidung von R-α-Liponsäure aus den erfindungsgemäßen Zellen in das Kulturmedium erlaubt eine einfache Isolierung des Produkts aus dem Kulturmedium nach Abtrennung der Biomasse, ohne dass die Zellen zuvor aufgebrochen werden müssen, bzw. ohne dass die R-α-Liponsäure durch einen aufwendigen und verlustreichen Hydrolyseschritt vom daran gebundenen Trägerprotein (ACP oder die E2 -Untereinheit der α-Ketosäure- Dehydrogenasen) abgespalten werden muss. Die Gewinnung von R- α-Liponsäure aus dem Kulturmedium kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie beispielsweise Zentrifugation des zell- haltigen Kulturmediums zur Abtrennung der Zellen und durch anschließende Extraktion und/oder Präzipitation des Produkts er- folgen.
Die Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellen zur Produktion von R-α-Liponsäure erfolgt in gängigen Kulturmedien, Vorzugs- weise in einem aus der Literatur bekannten Minimalsalzmedium (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272) .
Als Kohlenstoffquelle können prinzipiell alle verwertbaren Zu- cker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dabei werden bevorzugt Asparaginsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Bernsteinsäure und Oxalessigsäure. Auch ist eine kombinierte Fütterung mehrerer verschiedener Kohlenstoffquellen möglich. Des weiteren können kurzkettige Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit einer Kettenlänge von C6-C8 (Hexan- bzw. Oktansäure) als spezifische Vorstufen für die α-Liponsäure-Synthese dem Medium zu- gesetzt werden. Dabei beträgt die Konzentration der zugesetzten Kohlenstoffquelle vorzugsweise 0,1-30 g/1.
Die Inkubation der erfindungsgemäßen Zellen erfolgt vorzugsweise unter aeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeit- räum von 16 - 150 h und im Bereich der für die jeweiligen Zellen optimalen Wachtumstemperatur .
Als optimaler Temperaturbereich werden 15 - 55 °C bevorzugt. Besonders bevorzugt ist eine Temperatur zwischen 30 und 37 °C.
Der Nachweis und die Quantifizierung der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten R-α-Liponsäure erfolgt beispielsweise mittels eines Bioassays unter Verwendung eines liponsäure- auxotrophen Indikatorstammes (lipΛ-Mutante) . Diese Art der turbidimetrischen Quantifizierung von R-α-Liponsäure ist aus der Literatur bekannt (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272) . Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Indikatorstamm W14851ip2 (ATCC 25645) , würde allerdings auch ohne supplementierte R-α-Liponsäure wachsen, wenn das Medium neben Glucose auch noch Acetat und Succinat enthält. Um ein falschpositives Wachstum des Indikatorstammes im Bioassay bei der Bestimmung der produzierten R-α-Liponsäure zu vermeiden - beispielsweise verursacht durch einen Eintrag von Glucose und den vom Produktionsstamm zusätzlich zur R-α-Liponsäure ausgeschiedenen Säuren Acetat und Succinat - erfolgt bereits die Anzucht des R-α-Liponsäure-Produzenten bevorzugt mit Succinat als einziger Kohlenstoffquelle . Dieser Stamm wird mit dem Kulturüberstand einer erfindungsgemäßen Zellanzucht supplementiert; anhand des Wachstums des Indikatorstammes kann dann der Liponsäure-Gehalt im Kulturmedium bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Der Bakterienstamm Escherichia coli
W3110/pKP560/pGS331, der für die Ausführung der Beispiele verwendet wurde, wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 15661 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt. Der Stamm W3110ΔlplΛ, eine Deletionsmutante im IplA-Gen, welches für die Lipoyl-Protein-Ligase A codiert, ist in der Patentanmeldung DE 10258127 des gleichen Anmelders beschrieben. Das Plasmid pACYC184 ist bei Chang und Cohen (1978, J. Bacte- riol . 134: 1141-1156), das ÜpB-Expressionsplasmid pBAD-lipB ist in der Patentanmeldung DE 10245993 beschrieben.
Für die Expression des Gens, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, wurde das Plasmid pGS331 verwendet (Ali et al., 1990, Biochem. J. 271: 139-145). Dieses Plasmid enthält neben dem Ampicillin-Resistenzgen ein subgenes Fragment des aceF- (E2p) -Gens von Escherichia coli, welches für eine Lipoyl- Domäne codiert und das sich unter der Expressionskontrolle des tac-Promotors befindet. Das Gen für diese Lipoyl-Domäne ist in diesem Fall ein Hybrid, zusammengesetzt aus den Codons für die Aminosäurereste 1-33 der ersten Lipoyl-Domäne und den Resten 238-289 der dritten Lipoyl-Domäne des E2p-Proteins .
Beispiel 1: Konstruktion des lipB-Expressionsplasmids pKP560
Der Plasmidvektor pACYC184 wurde zunächst mit der Restriktion- sendonuklease Aval unter den vom Hersteller angegebenen Bedin- gungen geschnitten. Die dabei erzeugten 5 -überhängenden Enden des restringierten Vektors wurden nach Herstellerangaben mittels der Klenow-Polymerase aufgefüllt, der Vektor anschließend mit der Restrikionsendonuklease Clal geschnitten und danach durch Behandlung mit Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert . Der gesamte Restriktionsansatz wurde dann in einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Das 2,8 kb lange DNA-Fragment, das neben dem Replikationsursprung pl5A auch noch das Chlo- ramphenicol-Resistenzgen enthält, wurde anschließend mittels des QIAquick Gel Extraktion Kits (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben aus dem Agarosegel isoliert und gereinigt. Das lipB-Gen unter Kontrolle des arabinose-induzierbaren ara- BAD-Promotors (pBAD) wurde aus dem Plasmid pBAD-lipB gewonn- nen, welches zunächst mit der Restrikionsendonuklease Xfoal unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten wurde. Die dabei erzeugten 5 -überhängenden Enden des restringierten Vektors wurden dann nach Herstellerangaben mittels der Klenow-Polymerase aufgefüllt und der Vektor wurde anschließend mit der Restrikionsendonuklease Clal geschnitten. Der gesamte Restriktionsansatz wurde dann in einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Das 2 kb lange DNA-Fragment, das die Regulationssequenzen des Arabinose-Operons von E . coli ( araC- Gen, araBΛD-Promotorregion) und außerdem das lipB-Gen unter der Kontrolle des araBΛD-Promotors enthält, wurde anschließend wie für das Vektorfragment von pACYC184 beschrieben aus dem Agarosegel isoliert und gereinigt.
Die Ligation des araC-pBAD-lipB-Fragments mit dem 2,8 kb langen Vektorfragment von pACYC184 erfolgte mittels der T4-DNA- Ligase. Die Transformation von E. coli-Zellen des Stammes DH5α mit dem Ligationsansatz erfolgte durch Elektroporation in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. Der Transformationsansatz wurde dann auf LB-Chloramphenicol-Agarplatten (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar, 20 mg/1 Chloramphenicol) ausgebracht und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die gewünschten Transformanden wurden nach einer Plas- midisolierung mittels des GFX™ Micro Plasmid Prep Kits (Amers- ham Biosciences GmbH, Freiburg) durch eine Restriktionsanalyse identifiziert. Der so erhaltene Vektor trägt die Bezeichnung pKP560 (Fig. 4) .
Beispiel 2 : Herstellung von R-α-Liponsäure-Produzenten Das -ZipB-Überexpressionsplasmid pKP560 bzw. das Lipoyl- Domänen-Plasmid pGS331 wurden mittels Elektroporation in die E. coli-Stämme W3110 bzw. W3110Δlp2A transformiert und nach Selektion auf LB-Agarplatten mit 20 mg/1 Chloramphenicol bzw. 100 mg/1 Ampicillin wurden die Plasmide aus jeweils einer der Transformanden reisoliert, mit Restriktionsendonukleasen gespalten und überprüft. Mit dem Kontrollplasmid pACYCl84 wurde in analoger Weise verfahren.
Für die gemeinsame Überexpression des ÜpB-Gens mit dem Li- poyl-Domänen-Gen wurden die Stämme W3110 pKP560 bzw.
W3110ΔlplA pKP560 mit dem Plasmid pGS331 wie oben beschrieben transformiert und die erhaltenen Transformanden mittels Restriktionsanalyse überprüft.
Beispiel 3 : Fer entative Produktion von R-α-Liponsäure
Für die fermentative Produktion von R-α-Liponsäure wurden die in Beispiel 2 durch Transformation mit den entsprechenden Plasmiden erzeugten Stämme verwendet. Als Vorkultur für die Produktionsanzucht wurden zunächst 5 ml LB-Flüssigmedium, das zur Stabilisierung von Plasmiden 100 mg/1 Ampicillin und/oder 20 mg/1 Chloramphenicol enthielt, mit dem jeweiligen Stamm beimpft und für 16 h bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit dem entsprechenden Volumen steriler Saline (0,9 % NaCl) gewaschen. Mit den auf diese Weise vorbereiteten Zellen wurden schließlich 15 ml BS-Medium (7 g/1 K2HP04; 3 g/1 KH2P04; 1 g/1 (NH4)2S04; 0,1 g/1 MgS04 x 7 H20; 0,5 g/1 Na3Citrat x 3 H20; 1% säurehydrolysiertes Casein (vitaminfrei) ; 13,5 g/1 Na2Succinat x 6 H20; pH 6,8 mit HC1 einge- stellt) , das außerdem 100 mg/1 Ampicillin und/oder 20 mg/1
Chloramphenicol enthielt, im Verhältnis 1:100 angeimpft. Die Inkubation der Produktionskulturen erfolgte bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler. Die Expression des Lipoyl-Protein- Ligase B-Gens in den Stämmen, die das Plasmid pKP560 enthiel- ten, wurde durch Zugabe von 2 g/1 L-Arabinose nach ca. 4 h Inkubation induziert. Zum gleichen Zeitpunkt wurde auch die Expression der E2-Domäne in den Stämmen mit dem Plasmid pGS331 durch Zugabe von 0,05 g/1 Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid indu- ziert. Nach 24 h Inkubation wurden Proben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt. Die darin enthaltene R-α-Liponsäure wurde mittels des bekannten turbidimetrischen Bioassays (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A: 269-272) quantifiziert. Tabelle 1 zeigt die erzielten Gehalte von R-α-Liponsäure im jeweiligen Kulturüberstand nach 24 h Inkubation:
Tabelle 1
Figure imgf000022_0001
INTERNATIONAL FORM
Consortium für elektrochem Industrie GmbH Zielsta-tstr. 20-22 RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT lssued pursuant to Rule 7 1 by the 81379 München INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page
I IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM
Identification rcference given by the DEPOSITOR. Accession nuraber given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY W3110/pKP560/pGS331 DSM 15661
π SCIENTIFIC DESCPJPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION
The microorganism identified under I above was aecompanied by
( X ) a seientific dcscπption ( -ς) a proposed taxonomic designation
(Mark with a cross where applicable)
πi RECEIPT AND ACCEPTANCE
Tlus International Depositary Authoπty acccpts the microorganism identified under I above, which was receivcd by it on 2003-06-06 Pate of the original deposit)1
IV RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION
The microorganism identified under I above was receivcd by this International Depositary Authoπty on (datc of original deposit) and a request to convcrt the original deposit to a deposit under the Budapest Troaty was rcccived by it on (dato of rcceipt of request for conversion)
V INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Sιgnaturc(s) of person(s) havmg the power to repicsent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authoπty or of authoπzcd officιal(s)
Address Maschcroder Weg lb D-38 ! 24 Braunschwcιg
Figure imgf000023_0001
Dato 2003-06-10
' \\ Iiere Rulc 6 4 (d) apphes, such datc is the dat. on which the Status of international depositary authoπry was acquired Fo i DSMZ-BP/4 (solcpagc) 12/2001 -1 Formular PCT/RO/134 (SAFE) Angaben zu einem hinterlegten Mikroorganismus und/oder anderem hinterlegten biologischen Material -1-1 erstellt durch Benutzung von PCT- SAFE [EASY mode] Version 3 . 50 (Build 0002 . 162) -2 Internationales Aktenzeichen PCT/EP200 4 / 0 0 7 8 7 -3 Aktenzeichen des Anmelders oder Co 10314 Anwalts
Figure imgf000024_0001
VOM ANMELDEAMT AUSZUFÜLLEN
Figure imgf000024_0002
VOM INTERNATIONALEN BÜRO AUSZUFÜLLEN -5 Dieses Formular ist an folgendem Datum beim internationalen Büro eingegangen -5-1 Bevollmächtigter Bediensteter

Claims

Patentansprüche
1. Zelle, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine gegen- über einem Wildtyp-Stamm erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B Aktivität besitzt und gleichzeitig eine im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweist.
2. Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Mikroorganismus, wie zum Beispiel einen Hefe- oder Bakterienstamm handelt.
3. Zelle nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Bakterienstamm aus der Familie der Enterobacteriaceae, bevorzugt um einen Stamm der Art Escherichia coli handelt.
4. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich- net, dass die Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität mindestens um den Faktor 2 gesteigert ist.
5. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des lipoylierbaren Polypeptids mindestens um den Faktor 2 gesteigert ist.
6. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es sowohl ein Üpß-Gen als auch ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthält.
7. Plasmid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es ein lipB-Gen sowie ein Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, jeweils unter Kontrolle eines Promotors trägt.
8. Verfahren zur Herstellung einer Zelle gemäß Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Ausgangszelle ein Plasmid, das ein lipß-Gen enthält und ein Plasmid, das ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthält eingebracht werden, oder ein Plasmid gemäß Anspruch 6 oder 7 eingebracht wird.
9. Verfahren zur fermentativen Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in einem Kulturmedium kul- tiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-α-Liponsäure in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-α-Liponsäure vom Kulturmedium abgetrennt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Zellen in einem Minimalsalzmedium erfolgt, wobei als Kohlenstoffquelle Asparaginsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt werden und Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit einer Kettenlänge von C6-C8 (Hexan- bzw. Oktansäure) als spezifische Vorstufen für die α-Liponsäure-Synthese dem Medium zugesetzt werden.
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