CN115948359A - 蛋白融合标签及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白融合标签及其应用。该蛋白融合标签包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。该蛋白融合标签可以有效提高目的蛋白的表达量以及提高目的蛋白的水溶性，而且不会影响目的蛋白的活性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白融合标签及其应用。
背景技术
大肠杆菌表达系统是目前最常用的重组蛋白表达系统，广泛应用于医药、工业以及分子生物学等领域。在医药领域中，大肠杆菌用于小型重组抗体片段(scFv、Fab和双特异性抗体)的生产；在工业领域中，主要用于生产天冬氨酸酶、过氧化物酶等工业酶；在分子生物学领域中，用于制备酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒等。大肠杆菌作为原核生物，具有营养要求简单，传代时间短，遗传操作简单等优点，因此利用大肠杆菌表达系统用于表达外源蛋白时，其生产成本较低，且能有效表达外源蛋白。
但并不是每个外源基因都能在大肠杆菌中有效地表达，原核表达系统在表达异源蛋白时也有缺陷，如：密码子偏好导致一些稀有密码子多的基因在原核宿主中不表达；外源蛋白在细胞中容易被酶解；蛋白质的错误折叠导致外源蛋白以无生物活性的包涵体形式在细胞质内聚集等。而使用蛋白融合标签帮助外源基因表达，是目前解决包涵体问题的主要方案。目前，常见融合标签有：麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽转移酶(GST)和小分子泛素修饰蛋白(SUMO)等；不同融合标签都有优点，但也有一定局限性，没有一种通用的融合标签能解决所有蛋白的可溶性问题。
综上所述，寻找一种新的、更有效的融合标签帮助外源蛋白的大量表达和提高溶解度是有必要的。
发明内容
针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种蛋白融合标签，可以提高目的蛋白的表达和溶解度，而且不影响目的蛋白的活性。
为了达到上述目的，可以采用以下方案：
本发明一方面提供了一种蛋白融合标签，其包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。
本发明另一方面提供了一种编码基因，其表达上述的蛋白融合标签。
本发明再一方面提供了一种重组载体，其包括上述的编码基因。
本发明再一方面提供了一种重组菌，其包括上述的蛋白融合标签或上述的重组载体。
本发明再一方面提供了一种转基因细胞系，其包括上述的蛋白融合标签或上述的重组载体或上述的重组菌。
本发明再一方面提供了一种表达盒，其包括上述的蛋白融合标签或上述的重组载体或上述的重组菌或上述的转基因细胞系。
本发明再一方面提供了一种上述的蛋白融合标签在构建融合蛋白表达系统中的应用。
本发明有益效果至少包括：本发明提供的蛋白融合标签可以有效提高目的蛋白的表达量以及提高目的蛋白的水溶性，而且不会影响目的蛋白的活性。
附图说明
图1为pNLD融合标签载体构建示意图；
图2为目的蛋白EcFabG、eGFP的SDS-PAGE电泳检测；
图3为目的蛋白EcFabG、eGFP的灰度分析；
图4为EcFabG对C8-ACP的催化活性；
图5为EcFabG对C8-ACP底物的活性检测；
图6为eGFP的荧光强度检测；
其中，图2中，(a)：LD-EcFabG融合蛋白表达分析；(b)：LD-eGFP融合蛋白表达分析；S：蛋白表达后破碎液上清、P：蛋白表达后破碎沉淀物；从左至右依次为pET-28(b)-EcfabG、pNLD-EcfabG、pET-28(b)-egfp、pNLD-egfp；图3中，(a)：LD-EcFabG与EcFabG灰度分析；(b)：LD-eGFP和eGFP灰度分析；从左至右依次为pET-28(b)-EcfabG、pNLD-EcfabG、pET-28(b)-egfp、pNLD-egfp的目的蛋白灰度值以及SRP/EP比值；图4中，1：以C8-ACP为底物的不带标签的脂肪酸反应；2：以C8-ACP为底物的带有LD标签的脂肪酸反应；图6中，从左至右为依次为eGFP蛋白、带标签LD-eGFP蛋白、融合标签LD被TEV酶切后的eGFP蛋白。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明一方面提供了一种蛋白融合标签，其包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。其解决大部分蛋白在大肠杆菌表达系统中难表达、不可溶的问题，可以有效在大肠杆菌中大量表达目的蛋白过程中，能够有效增加目的蛋白表达量，并提高目的蛋白的溶解度。
具体地，SEQ ID NO.1所示序列是大肠杆菌K-12基因组中的丙氨酸脱氢酶E2结构域转录翻译后的氨基酸序列(NCBI Protein ID：NP_414657.1)，由630个氨基酸组成；该蛋白质预测分子量为66096.07道尔顿，等电点为5.09；SEQ ID NO.2所示序列是SEQ ID NO.1所示序列中第1-34位氨基酸和第239-290位氨基酸进行重组的衍生氨基酸。
本发明另一方面提供了一种编码基因，其表达上述的蛋白融合标签。具体地，上述的蛋白融合标签应用在目的蛋白表达上，是通过蛋白融合标签的编码基因结合目的蛋白的编码基因一起发挥作用。
进一步地，在一些实施例中，上述编码基因可以包括如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示序列。具体地，SEQ ID NO.3所示序列是大肠杆菌K-12基因组中的丙氨酸脱氢酶E2结构域序列(NCBI Gene ID:944794)，由1893个核苷酸组成，即是编码如SEQ ID NO.1所示序列；SEQ ID NO.4所示序列是由SEQ ID NO.3所示序列经过替换一个或几个核苷酸，其表达的氨基酸与SEQ ID NO.1所示序列具有90％以上的同源性。
本发明再一方面提供了一种重组载体，其包括上述的编码基因。具体地，将上述的编码基因与目的基因插入到表达载体中，构成重组载体进行目的蛋白的表达，可以提高目的蛋白的表达量以及提高了溶解性。而且在本发明某些具体实施中，以3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)作为目的蛋白进行试验论证，提高了目的蛋白的表达量以及溶解性，而且目的蛋白的活性不受上述蛋白融合标签的影响。应当理解的是，目的基因不仅仅只适用于上述的3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)。
进一步地，在一些实施例中，上述重组载体还可以包括表达载体pET-28b(+)。具体地，上述重组载体中的表达载体可以是本领域所已知的载体，比如表达载体pET-28b(+)。
具体地，上述重组载体的构件方法可以按照以下步骤进行：将上述蛋白融合标签基因和带有TEV酶切位点的核苷酸序列经过小段Linker连接，插入到表达载体的NcoI和BamHI酶切位点之间，构成上述的重组表达载体；所示表达载体在完成目的蛋白表达后可对融合标签进行TEV蛋白酶切割，能够在有效增加目的蛋白表达量后，不影响目的蛋白的空间结构和后续活性，得到无标签的目的蛋白，减少后续下游成本。
本发明再一方面提供了一种重组菌，其包括上述的蛋白融合标签或上述的重组载体。具体地，目的蛋白一般会选择一些工程菌进行目的蛋白的表达，工程菌为本领域所已知的菌种，大肠杆菌是本领域所常用的目的蛋白表达工程菌。
本发明再一方面提供了一种转基因细胞系，其包括上述的蛋白融合标签或上述的重组载体或上述的重组菌。具体地，目的蛋白的表达也通常会借助一些工程细胞，将上述的蛋白融合标签与目的基因结合在工程细胞中进行表达。
本发明再一方面提供了一种表达盒，其包括上述的蛋白融合标签或上述的重组载体或上述的重组菌或上述的转基因细胞系。具体地，上述的蛋白融合标签协助目的蛋白编码基因通常会借助一些载体，方便操作与运输，比如会通过表达盒的方式，表达盒为本领域常规的表达盒形式。
本发明再一方面提供了一种上述的蛋白融合标签在构建融合蛋白表达系统中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种新型蛋白融合标签，用于增加目标蛋白在大肠杆菌中的表达和溶解度。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
以下实施例中，使用的大肠杆菌MG1655、DH5α、BL21(DE3)、质粒pET-28b(+)为申请人单位保藏；限制性内切酶和连接酶等试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司合成。
实施例1融合标签载体制备
本发明实施中，按照图1所示的pNLD融合标签载体构建示意图构建立pNLD融合标签载体，具体如下：
(1)引物设计
根据LD基因、EcfabG基因、egfp基因及上下游序列，设计引物(划线部分为酶切位点)，如下表1所示。
表1实施例1中设计的引物
(2)pNLD载体、实验组表达载体以及对照组载体的构建
本发明在设计引物时，预先在P2、P3、P4、P5、P6引物末端设计了短重叠延伸连接头，利用重叠延伸PCR方法，以P1为上游引物，可将下游片段拼接起来；
采用PCR技术，用P1和P2引物扩增LD标签基因(SEQ ID NO.4所示)，获得LD基因DNA片段258bp(50μl扩增体系：总DNA 1μl，P1/P2引物各2μl，1.1×MixGreen 45μl；扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s；程序循环数：35个循环)；
以LD基因DNA片段做模板，用P1和设计包含KpnI位点到linker片段的P3引物扩增，获得LD-linker片段305bp(50μl扩增体系：P1P2片段1μl，P1/P3引物各2μl，1.1×MixGreen45μl；扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s；程序循环数：35个循环)；
再以LD-linker片段做模板，用P1和设计包含TEV蛋白酶酶切位点的P4引物扩增，获得LD-linker-TEV片段326bp(50μl扩增体系：P1P3片段1μl，P1/P4引物各2μl，1.1×MixGreen 45μl；扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s；程序循环数：35个循环)；
继而以LD-linker-TEV片段做模板，用P1和设计含六聚组氨酸编码序列的P5引物扩增，获得LD-linker-TEV-His片段342bp(50μl扩增体系：P1P4片段1μl，P1/P5引物各2μl，1.1×MixGreen 45μl；扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s；程序循环数：35个循环)；
然后用P1和设计含BamHI位点的P6引物扩增，获得完整的含NcoI和BamHI位点的LD-linker-TEV-His片段355bp(50μl扩增体系：P1P5片段1μl，P1/P6引物各2μl，1.1×MixGreen 45μl；扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s；程序循环数：35个循环)；
将pET-28b(+)载体序列的RBS区域到MCS区域进行改造，首先使用限制性内切酶NcoI和BamHI对pET-28b(+)进行消化(酶切条件为：片段或质粒60μl，10×酶切buffer 10μl，BamHI 2μl，NcoI 2μl，双蒸水补至100μl，37℃反应4h)，得到5271bp大片段；
LD-linker-TEV-His片段经NcoI和BamHI酶切，连接到同样双酶切的pET-28b(+)载体上(连接条件为：酶切后片段10μl，酶切后载体3μl，10×连接酶buffer 2μl，T4 DNA连接酶0.5μl，双蒸水补至20μl；16℃连接8h)，获得融合标签载体pNLD，进行热激转化(转化条件为：连接体系20μl，感受态细胞100μl，冰浴30min，热激90s，冰浴30min，LB培养液700μl培养45min)，菌落PCR筛选(10μl扩增体系：重组子菌液1μl，pET-T7上下游引物引物各0.5μl，2×DNA聚合酶Taq Mix10μl，双蒸水补至20μl；扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min；程序循环数：30个循环)，筛选获得阳性重组子并送生物公司测序验证；
测序无误后，提取重组质粒pNLD(质粒抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B110091-0100)，限制性核酸内切酶NdeI和SalI消化后纯化备用；再提取pET-28b(+)，以NdeI和SalI消化备用(胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B110092-0100)；得到线性化pNLD质粒、pET-28b(+)质粒。
以大肠杆菌MG1655总DNA做模板，用3-酮脂酰ACP还原酶基因上下游引物P7和P8进行扩增，获得EcfabG基因片段738bp(50μl扩增体系：总DNA 1μl，P7/P8引物各2μl，1.1×MixGreen 45μl；扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s；程序循环数：35个循环)；
以pET-egfp质粒做模板，用增强型绿色荧光蛋白基因上下游引物P9和P10进行扩增，获得egfp基因片段717bp(50μl扩增体系：质粒DNA 1μl，P9/P10引物各2μl，1.1×MixGreen 45μl；扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸10s；程序循环数：35个循环)；
EcfabG和egfp片段经NdeI和SalI酶切，连接到同样双酶切的pET-28b(+)载体上(连接条件为：酶切后片段10μl，酶切后载体3μl，10×连接酶buffer 2μl，T4 DNA连接酶0.5μl，双蒸水补至20μl。16℃连接8h)，获得融合标签载体pNLD-EcfabG、pNLD-egfp、pET-EcfabG、pET-egfp。
实施例2大肠杆菌蛋白表达及分析
将实施例1中的pNLD-EcfabG、pNLD-egfp、pET-EcfabG、pET-egfp质粒测序无误后转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株，进而挑取单菌落在含有卡那抗生素(Kan 30mg/ml)的LB液体培养基37℃培养过夜，称为种子液；
取100μl种子液加入5ml LB液体培养基中，加入5μl Kan，于37℃ 200rpm振荡培养至菌液OD600约0.8时，加入5μL异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG 200mg/ml)，继续培养4h；继而4000rpm，10min离心收菌，弃上清，收集菌体沉淀；将沉淀用1ml裂解液(lysis buffer)重新悬浮，冰浴超声波破碎悬液5min，结束后12000rpm，10min离心分别收集上清(S)和沉淀(P)；进行诱导表达时，需对实验组和对照组进行同等条件的诱导表达；
将所得实验组和对照组的上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，分析表达产物，SDS-PAGE的结果如图2所示，目的蛋白大小与预期相符；带有带有LD融合标签的表达载体的目的蛋白表达量以及可溶性的比例大大提高；
根据牛血清蛋白(BSA)进行SDS-PAGE灰度分析，结果如图3所示，根据浓度为2mg/ml的BSA，计算可得目的蛋白pET-28(b)-EcfabG共表达4.26μg、pNLD-EcfabG共表达9.01μg、pET-28(b)-egfp共表达15.16μg、pNLD-egfp共表达39.38μg；即带有LD融合标签的载体在表达目的蛋白时，能够提高表达量2.11-2.59倍；同时在表达eGFP蛋白时，pNLD-eGFP的载体对目的蛋白的可溶性，相较于pET-28(b)-egfp载体提高了1.61倍。
实施例3EcFabG和eGFP蛋白活性检测
本发明实施例中，EcFabG活性检测参照以下方法：3-酮基脂酰ACP还原酶(FabG)催化3-酮基脂酰ACP还原为3-羟基脂酰ACP，是细菌脂肪酸合成反应的关键酶之一；将EcFabG表达后纯化，进行活性测定；以3-酮基癸酰ACP为底物，测定EcFabG氧化NADPH的活性：反应体积100μl，其中含有0.1M磷酸钠(pH 7.4)；5mM二硫苏糖醇；200μM NADPH；200μM丙二酸单酰CoA；1μg辛酰ACP；1μg holo-ACP；0.2μg FabD和0.2μg FabB；在添加20μM Tag-FabG后，25℃使用紫外可见分光光度计测定340nm吸光度的下降速率；
本发明实施例中，eGFP活性检测参照以下方法：以不带标签的eGFP蛋白为对照，取相同浓度的蛋白量，稀释到1pM后加到1ml石英比色皿中，在荧光分光光度计中进行荧光发光检测，所使用的最大激发波长489nm，最大发射波长511nm，在该吸收峰下比较所带本发明标签的eGFP蛋白荧光强度；
(1)EcFabG蛋白活性分析
将10mM辛酸-ACP与丙二酸单酰ACP混合后，加入0.2μg FabB、0.2μg FabA、0.2μgFabI和0.2μg FabG，放入37℃反应1h，用0.5M尿素的No SDS-PAGE进行电泳。结果如图4所示，生成癸酸能够进行正常反应；以辛酸-ACP为底物进行反应，结果图5如示，带有LD标签的，FabG蛋白活性未受到影响；
(2)eGFP蛋白活性分析
将稀释至1pM的蛋白溶液加入到1mL全透明石英皿中，在激发波长489nm，发射波长511nm下，带有标签的eGFP以及用TEV酶切后的eGFP蛋白的荧光强度没有发生明显的变化，结果如图6所示。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (9)
1.蛋白融合标签，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。
2.编码基因，其特征在于，表达权利要求1所述的蛋白融合标签。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列。
4.重组载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，包括表达载体pET-28b(+)。
6.重组菌，其特征在于，包括权利要求1所述的蛋白融合标签或权利要求4或5所述的重组载体。
7.转基因细胞系，其特征在于，包括权利要求1所述的蛋白融合标签或权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6所述的重组菌。
8.表达盒，其特征在于，包括权利要求1所述的蛋白融合标签或权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6所述的重组菌或权利要求7所述的转基因细胞系。
9.权利要求1所述的蛋白融合标签在构建融合蛋白表达系统中的应用。
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