CN106434699A - Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用 - Google Patents

Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106434699A
CN106434699A CN201610560872.2A CN201610560872A CN106434699A CN 106434699 A CN106434699 A CN 106434699A CN 201610560872 A CN201610560872 A CN 201610560872A CN 106434699 A CN106434699 A CN 106434699A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sumo
ulp
gene
pet28b
pmf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610560872.2A
Other languages
English (en)
Inventor
范军
周旋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Agricultural University AHAU
Original Assignee
Anhui Agricultural University AHAU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Agricultural University AHAU filed Critical Anhui Agricultural University AHAU
Priority to CN201610560872.2A priority Critical patent/CN106434699A/zh
Publication of CN106434699A publication Critical patent/CN106434699A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种SUMO和SUMO蛋白酶基因及其编码蛋白和应用。本发明的一种酿酒酵母基因sumo(S)，其由序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列定义。本发明的一种酿酒酵母基因sumo(S)的编码蛋白，其由序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列定义。本发明的一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)，其由序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列定义。本发明的一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)的编码蛋白，其由序列表SEQ ID No.4的氨基酸序列定义。本发明能够实现酿酒酵母sumo基因和SUMO蛋白酶ulp基因在大肠杆菌中的高表达，具体的说是实现在大肠杆菌常用的表达菌株BL21(DE3)中实现高表达，并保证功能不受影响。

Description

SUMO与SUMO蛋白酶编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及SUMO和SUMO蛋白酶基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
大肠杆菌表达系统常被用来表达重组蛋白，但也存在一些缺陷，当过表达一些外源蛋白时常会形成不溶性无功能的包涵体沉淀[Villaverde A,Carrio M,M.2003.Proteinaggregation in recombinant bacteria:biological role of inclusionbodies.Biotechnol letters.25(17):1385-1395]，融合标签表达已被证明可以用来改善外源重组蛋白的产量和折叠[Esposito D,Chatterjee D,K.2006.Enhancement ofsoluble protein expression through the use of fusion tags.Curr.Opin.inBiotechnol.17(4):353-358]。传统的融合标签有麦芽糖结合蛋白MBP，谷胱甘肽S-转移酶GST，硫氧还蛋白Trx等，这些标签融合体系要求在标签和目的蛋白间加上一段可被某些蛋白酶识别的酶切序列，以便后来研究中除去标签。常用的蛋白酶有烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp，凝血酶，Xa因子等，这些蛋白酶酶切后会在酶切位点下游也就是目的蛋白N端留下若干氨基酸，残留的氨基酸可能会影响目的蛋白的生物学活性或者结晶，对于药用蛋白可能会产生新的免疫原活性[Terpe K.2003.Overview of tag protein fusions:frommolecular and biochemical fundamentals to commercial systems.Appl microbioland biotechnol.60(5):523-533]。
小泛素相关修饰蛋白SUMO与传统的标签蛋白不同，SUMO来源于真核生物，在大肠杆菌中并不存在，也没有对应的SUMO蛋白酶[Jeffrey G,M et al.2005.Comparison ofSUMO fusion technology with traditional gene fusion systems:Enhancedexpression and solubility with SUMO.Protein Science.15:182–189.]。在酵母中只含有一种SUMO基因(SMT3)，并存在严格空间构象专一性的SUMO蛋白酶Ulp1，因为是构象专一性蛋白酶，所以在SUMO标签C端可直接融合目的蛋白而无需添加酶切序列，酶切后目的蛋白N端不会有残留氨基酸[Kawabe,Y.,2000.Covalent modification of the Werner’ssyndrome gene product with the ubiquitin-related protein,SUMO-1.J.Biol.Chem.275:20963–20966.]。鉴于 SUMO标签优良的改善折叠和促进表达特性，加之Ulp1酶切特异性和活力均很高，所以近年来SUMO融合表达系统越来越受到人们的重视。
酵母含有两种SUMO蛋白酶：Ulp1和Ulp2，两种酶共有一段约200氨基酸的催化结构域称为ULP即Ulp1(403～621)p，ULP显示了完整的蛋白酶活性[Mossessova,E.and Lima,C.D.2000.Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conservedinteractions and a regulatory element essential for cell growth inyeast.Mol.Cell.5:865–876.]。重组表达的SUMO蛋白酶就是Ulp1的C端结构域。
但因为大肠杆菌的密码子偏爱性，导致来源于酵母的SUMO和ULP在大肠杆菌中表达量比较低。已有研究表明提高宿主某些稀有tRNA丰度可以提高某些目的蛋白的表达量[Kane,J.F.1995.Effects of rare codon clusters on high-level expression ofheterologous proteins in Escherichia coli.Curr.Opin.in Biotechnol.6,494–500]，也有公司提供编码某些稀有tRNA基因的商品化大肠杆菌菌株。然而提高宿主菌的稀有tRNA丰度并非提高目的蛋白表达量的有效途径，首先，tRNA存在表达后修饰，有研究表明过表达某些稀有tRNA会出现仅部分tRNA发生修饰，导致翻译保真性的降低[Wilson,R.K.and Roe,B.A.1989.Presence of the hyper modified nucleotide N6-(delta 2-isopentenyl)-2-methyl thioadenosine prevents codon misreading by Escherichia coliphenylalanyl-transfer RNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,409–413]。其次，有研究表明稀有tRNA的过表达会加重宿主菌的代谢负担，菌株生长缓慢[Wahab,S.Z.etal.1993.Effects of tRNA(1Leu)overproduction in Escherichiacoli.Mol.Microbiol.7,253–263]。
一般来说，基因中含有宿主很少使用的密码子越多，目的蛋白的表达量越低，而在基因5’端存在稀有密码子，则情况尤甚[Gustafsson C,et al.2004.Codon bias andheterologous protein expression.TRENDS in Biotechnology.22,(7):346-353]。为了解决这种情况，早在八十年代就有科学家通过人工合成基因的方式更改外源基因的稀有密码子，实现蛋白的高水平表达[Nambiar,K.P.et al.1984.Total synthesis and cloningof a gene coding for the ribonuclease S protein.Science.223,1299–1301]，但鉴于合成基因的费用较高，此方法主要用于较短的基因，九十年代开始更多使用定点突变的方法进行密码子的优化[Kink J.A.et al.1991.Efficient expression of the Parameciumcalmodulin gene in Escherichia coli after four TAA-to-CAA changes through aseries of polymerase chain reactions.J.Protozool.38,441–447]，在已报道的密码子优化案例中与野生型相 比，优化的基因绝大多数都实现了蛋白表达量的显著提升[Gustafsson C,et al.2004.Codon bias and heterologous proteinexpression.TRENDS in Biotechnology.22,(7):346–353]。
目前，缺乏一种在大肠杆菌中的表达量高的SUMO和SUMO蛋白酶基因及其编码蛋白的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种在大肠杆菌中表达量高的SUMO与SUMO蛋白酶编码基因及其应用。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明的一种酿酒酵母基因sumo(S)，其由序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列定义。
本发明的一种酿酒酵母基因sumo(S)的编码蛋白，其由序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列定义。
本发明的一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)，其由序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列定义。
本发明的一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)的编码蛋白，其由序列表SEQ ID No.4的氨基酸序列定义。
本发明的所述的酿酒酵母基因sumo(S)的表达载体，权利要求3所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)的重组载体。
本发明的一种pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别人工合成序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因；
(2)分别构建pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；
(3)用步骤(2)所述重组表达质粒分别转化宿主菌构建对应的基因工程菌；
(4)利用步骤(3)所述基因工程菌分别表达pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；
(5)利用纯化技术，分别获取pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体。
进一步地，在步骤(2)中，所述酿酒酵母基因sumo(S)的表达载体为pET28b，所述SUMO蛋白酶基因ulp(S)的表达载体为pMF载体，宿主菌为大肠杆菌DH5α；
在步骤(2)中，采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：1所示的sumo(S)基因插入pET28b的Nde Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，将序列表SEQ ID NO：3所示的ulp(S)基因和pMF载体用BamHⅠ，HindⅢ酶切，切胶回收后将对应的基因和载体用T4DNA连接酶16℃连接5h，连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，孵育复性后涂布抗性平板37℃培养12h后挑取单菌落，在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养12h后提质粒，分别获得pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；
在步骤(4)中，ulp(S)和sumo(S)基因诱导表达的条件，28℃诱导12h，诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.5mmol/L。
本发明的一种含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体的制备方法，包括如下步骤：
将dnaK、mbp、gst、tig、groEL、trx六种标签蛋白和pET28b-tevS用Nde Ⅰ，Bgl Ⅱ酶切后连接转化入DH5α感受态细胞中，提质粒酶切验证正确后，再将这六种标签载体和ulp(S)用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切后连接，转化、酶切验证成功后将六种质粒转入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，在平板中挑取单菌落，在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养，细菌生长到OD600至0.6时加终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导12h，然后收集菌体超声破碎，冷冻离心后将上清蛋白样品，制得含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体。
本发明的所述的酿酒酵母基因sumo(S)、所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)、所述的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体和所述的含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体在酶工程中的应用。
有益效果：本发明能够实现酿酒酵母sumo基因和SUMO蛋白酶ulp基因在大肠杆菌中的高表达，具体的说是实现在大肠杆菌常用的表达菌株BL21(DE3)中实现高表达，并保证功能不受影响。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)改善来源于酿酒酵母的sumo和ulp基因在大肠杆菌中表达量低的缺陷，实现在大肠杆菌中的高表达，从而拓广SUMO融合标签系统在蛋白质工程中的应用。本发明利用大肠杆菌密码子偏爱性人工合成的酿酒酵母小泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier)sumo基因(sumo(S))和SUMO蛋白酶ulp基因(ulp(S))的全序列，通过筛选表达载体实现了两种基因在大肠杆菌中的高表达，利用构建的融合蛋白底物进行酶切实验证明合成的ulp基因不影响其功能。
(2)本发明的合成基因sumo(S)和ulp(S)通过筛选发现，分别构建在pET28b和pMF载体中(N端均含His6标签)，在BL21(DE3)菌株中可以实现可溶表达，表达量较野生型相比有很大 提升。用密码子偏爱性，在大肠杆菌同义突变库筛选替换了sumo和ulp基因中的稀有密码子，人工合成了两段基因sumo(S)和ulp(S)。
(3)本发明同时构建了含六种融合标签(DnaK、MBP、GST、Tig、GroEL、Trx)的ulp(S)重组载体，在BL21(DE3)中表达均良好。对含六种融合标签和只含His6标签的ULP(S)测定酶活显示，融合标签不能再进一步提高ULP(S)的酶活力。定量检测ULP(S)酶活性的eDAL底物融合系统为本实验室早前发明[Zhou C.et al.2014.A new fusion protein platformfor quantitatively measuring activity of multiple proteases.Microbial CellFactories.13(1):44.]。
(4)本发明将酶与底物在大肠杆菌胞内进行共表达，通过设置野生型对照，证明野生型与合成的ULP均可以有效切除野生型SUMO标签，但均不能有效切除合成的SUMO标签。对H6-ULP(S)进行大量蛋白纯化，1L Luria-Bertani培养基经Ni柱亲和层析得到的目的蛋白超滤后得到约62mg H6-ULP(S)蛋白酶。
附图说明
图1中A图为H6-SUMO(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表达及H6-SUMO(S)在BL21(DE3)表达的蛋白电泳图谱，B图为H6-SUMO(WT)和H6-SUMO(S)His抗体印迹图谱，C图为H6-SUMO(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表达及H6-SUMO(S)在BL21(DE3)表达时ELISA测定的细胞破碎液中含His6标签的蛋白浓度；
图2中A图为H6-ULP(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表达及H6-ULP(S)在BL21(DE3)表达的蛋白电泳图谱，B图为H6-ULP(WT)和H6-ULP(S)His抗体印迹图谱，C图为H6-ULP(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表达及H6-ULP(S)在BL21(DE3)表达时ELISA测定的细胞破碎液中含His6标签的蛋白浓度；
图3为含六种融合标签的ULP(S)表达的蛋白电泳图谱；
图4为含六种融合标签的ULP(S)和只含His6标签的ULP(S)的酶切电泳图谱和酶活测定的柱状图；其中左图是以SUMO(WT)-eDAL为底物，按1:100等蛋白量比例添加融合蛋白酶的酶切电泳图谱，右图为对应的DAL酶活测定柱状图；
图5为H6-ULP(WT)和H6-ULP(S)与底物SUMO(WT)-eDAL和SUMO(S)-eDAL在大肠杆菌BL21(DE3)胞内共表达的电泳图谱；
图6为H6-ULP(S)蛋白纯化图谱；泳道1为H6-ULP(S)在BL21(DE3)的表达电泳条带，泳 道2为Ni柱纯化后Elution Buffer洗脱下流出样的电泳条带。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
本发明基因合成由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物合成及测序由通用生物系统(安徽)有限公司完成，限制性核酸内切酶和DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司，大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，PCR产物纯化试剂盒、DNA胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axegen公司，FastPfu高保真DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker、蛋白印迹预染Marker、免疫印迹His6抗体和二抗等试剂购自北京全式金生物技术有限公司，蛋白电泳未预染Marker购自Fermentas公司，Ni-NTA层析树脂和Ni-NTA Spin Column购自QIAGEN公司，15mL蛋白超滤管购自Millipore公司，His Tag ELISA Detection Kit购自GenScript公司，其他生化试剂购自上海生工生物工程股份有限公司。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
本发明的一种酿酒酵母基因sumo(S)，其由序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列定义。
本发明的一种酿酒酵母基因sumo(S)的编码蛋白，其由序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列定义。
本发明的一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)，其由序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列定义。
本发明的一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)的编码蛋白，其由序列表SEQ ID No.4的氨基酸序列定义。
本发明的所述的酿酒酵母基因sumo(S)的表达载体，权利要求3所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)的重组载体。
本发明的一种pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别人工合成序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因；
(2)分别构建pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；所述的pMF-ulp(S)重组载体对载体是有选择的，本发明证明ulp(S)构建在pET28b载体中表达绝大多数是包涵体沉淀，而在pMF载体中可以实现可溶表达。
所述酿酒酵母基因sumo(S)的表达载体为pET28b，所述SUMO蛋白酶基因ulp(S)的表达载体为pMF载体，宿主菌为大肠杆菌DH5α；
采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：1所示的sumo(S)基因插入pET28b的Nde Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，将序列表SEQ ID NO：3所示的ulp(S)基因和pMF载体用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切，切胶回收后将对应的基因和载体用T4DNA连接酶16℃连接5h，连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，孵育复性后涂布抗性平板37℃培养12h后挑取单菌落，在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养12h后提质粒，分别获得pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；
(3)用步骤(2)所述重组表达质粒分别转化宿主菌构建对应的基因工程菌；
(4)利用步骤(3)所述基因工程菌分别表达pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；ulp(S)和sumo(S)基因诱导表达的条件，28℃诱导12h，诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.5mmol/L。
(5)利用纯化技术，分别获取pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体。
本发明的一种含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体的制备方法，包括如下步骤：
对于ULP(S)可溶表达和酶活力的促进作用的纯化标签蛋白，所述标签蛋白包括如下六种：DnaK、MBP、GST、Tig、GroEL、Trx。
将dnaK、mbp、gst、tig、groEL、trx六种标签蛋白和pET28b-tevS用Nde Ⅰ，Bgl Ⅱ酶切后连接转化入DH5α感受态细胞中，提质粒酶切验证正确后，再将这六种标签载体和ulp(S)用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切后连接，转化、酶切验证成功后将六种质粒转入到大肠杆菌常用的表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，在平板中挑取单菌落，在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养，细菌生长到OD600至0.6时加终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导12h，然后收集菌体超声破碎，冷冻离心后将上清蛋白样品，制得含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体。
本发明的所述的酿酒酵母基因sumo(S)、所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)、所述的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体和所述的含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体在酶工程中的应用。
本发明能够实现酿酒酵母sumo基因和SUMO蛋白酶ulp基因在大肠杆菌中的高表达，具体的说是实现在大肠杆菌常用的表达菌株BL21(DE3)中实现高表达，并保证功能不受影响。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)改善来源于酿酒酵母的sumo和ulp基因在大肠杆菌中表达量低的缺陷，实现在大肠杆 菌中的高表达，从而拓广SUMO融合标签系统在蛋白质工程中的应用。本发明利用大肠杆菌密码子偏爱性人工合成的酿酒酵母小泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier)sumo基因(sumo(S))和SUMO蛋白酶ulp基因(ulp(S))的全序列，通过筛选表达载体实现了两种基因在大肠杆菌中的高表达，利用构建的融合蛋白底物进行酶切实验证明合成的ulp基因不影响其功能。
(2)本发明的合成基因sumo(S)和ulp(S)通过筛选发现，分别构建在pET28b和pMF载体中(N端均含His6标签)，在BL21(DE3)菌株中可以实现可溶表达，表达量较野生型相比有很大提升。用密码子偏爱性，在大肠杆菌同义突变库筛选替换了sumo和ulp基因中的稀有密码子，人工合成了两段基因sumo(S)和ulp(S)。
(3)本发明同时构建了含六种融合标签(DnaK、MBP、GST、Tig、GroEL、Trx)的ulp(S)重组载体，在BL21(DE3)中表达均良好。对含六种融合标签和只含His6标签的ULP(S)测定酶活显示，融合标签不能再进一步提高ULP(S)的酶活力。定量检测ULP(S)酶活性的eDAL底物融合系统为本实验室早前发明[Zhou C.et al.2014.A new fusion protein platformfor quantitatively measuring activity of multiple proteases.Microbial CellFactories.13(1):44.]。
(4)本发明将酶与底物在大肠杆菌胞内进行共表达，通过设置野生型对照，证明野生型与合成的ULP均可以有效切除野生型SUMO标签，但均不能有效切除合成的SUMO标签。对H6-ULP(S)进行大量蛋白纯化，1L Luria-Bertani培养基经Ni柱亲和层析得到的目的蛋白超滤后得到约62mg H6-ULP(S)蛋白酶。
实施例1
sumo(S)和ulp(S)重组载体的构建、表达、检测和表达量测定
sumo(S)基因和pET28b载体用Nde Ⅰ，BamH Ⅰ酶切，ulp(S)基因和pMF载体用BamHⅠ，HindⅢ酶切，切胶回收后将对应的基因和载体用T4DNA连接酶16℃连接5h，连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，孵育复性后涂布抗性平板37℃培养12h后挑取单菌落，在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养12h后提质粒，酶切验证正确后测序。
将测序正确的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)质粒转入到BL21(DE3)感受态细胞中，对照质粒分别为pET28b-sumo(wt)和pET28b-ulp(wt)，对照质粒转化到BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞中，在平板中挑取单菌落，在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇 菌培养，细菌生长到OD600至0.6时加终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导12h，然后收集菌体超声破碎，4℃12000rpm离心后将上清蛋白样品进行SDS-PAGE电泳和His6抗体的免疫印迹检测。
结果如图1A、B和图2A、B所示：SDS-PAGE分离胶的丙烯酰胺浓度均为12％，His6抗体印迹的一抗为Anti-His6Mouse mAb，二抗为Goat Anti-Mouse lgG，HRP。从图中可看出H6-SUMO(S)和H6-ULP(S)表达量明显提高，但两种蛋白与野生型相比在聚丙烯酰胺中的迁移率均发生改变。
验证表达后我们用His Tag ELISA Detection Kit测定细胞破碎液离心后上清液含His6标签的蛋白浓度，检测合成基因与野生型基因表达量的区别。
测定的方法：从H6-SUMO(S)、H6-ULP(S)的BL21(DE3)平板和H6-SUMO(WT)、H6-ULP(WT)的BL21(DE3)、Rosetta(DE3)平板分别挑取单菌落摇菌过夜至OD值稳定，再取10μL菌液在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养，每组3个平行。细菌生长到OD600至0.6时加终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导12h后收菌2mL，PBS清洗菌体后再加800μLPBS悬浮菌体，超声破碎至细胞裂解完全，4℃12000rpm离心后取上清混匀。对H6-SUMO(WT)和H6-SUMO(S)，将上清用PBS稀释100倍后测定含His6标签的蛋白浓度，对H6-ULP(WT)和H6-ULP(S)，将上清用PBS稀释200倍后测定含His6标签的蛋白浓度。测定方法具体见ELISA试剂盒说明书。结果如图1C和图2C所示，其中：
H6-SUMO(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表达及H6-SUMO(S)在BL21(DE3)表达的His6标签蛋白浓度分别为：203pmol/mL，262pmol/mL，889pmol/mL，H6-SUMO(S)在BL21(DE3)菌株中的表达量分别是前者的4.38倍和3.39倍。
H6-ULP(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表达及H6-ULP(S)在BL21(DE3)表达的His6标签蛋白浓度分别为：568pmol/mL，802pmol/mL，1160pmol/mL。H6-ULP(S)在BL21(DE3)菌株中表达量分别是前者的2.04倍和1.45倍。
实施例2
含六种融合标签的ulp(S)重组载体的构建和表达
dnaK、mbp、gst、tig、groEL、trx六种标签和pET28b-tevS用Nde Ⅰ，Bgl Ⅱ酶切后连接转化入DH5α感受态细胞中，提质粒酶切验证正确后，再将这六种标签载体和ulp(S)用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切后连接，转化、酶切验证成功后将六种质粒转入到BL21(DE3)感受态细胞中，在平板中挑取单菌落，在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养， 细菌生长到OD600至0.6时加终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导12h，然后收集菌体超声破碎，冷冻离心后将上清蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。如图3所示。结果显示标签融合的ULP(S)表达均良好。
实施例3
只含His6标签的ULP(S)和含六种融合标签的ULP(S)的酶活测定
本发明以SUMO(WT)-eDAL为底物测定只含His6标签的ULP(S)和含六种融合标签的ULP(S)的酶活。经过预实验，酶切条件定为七种标签蛋白的细胞破碎液与底物SUMO-eDAL的蛋白量比例为1∶100,30℃水浴酶切0.5h，酶切反应处在20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0缓冲液体系中，冰浴终止反应后过Ni-NTA Spin Column，流出液测DAL酶活。DAL酶活测定反应体系为：
立即加入终止液2M HCl(含0.03w/v 2,4-DNP，即2,4-二硝基苯肼)500μL，冰浴放置10min。
加入显色液2M NaOH 1mL，混匀，静置5min，测520nm处吸光度值A520。
酶切电泳图谱和七种融合蛋白的酶活测定柱状图如图4所示。显示标签蛋白对ULP(S)酶活力没有明显的促进作用。
实施例4
ULP(WT)和ULP(S)与底物SUMO(WT)-eDAL和SUMO(S)-eDAL在胞内共表达的酶切效果
本发明通过胞内共表达探究ULP(WT)和ULP(S)是否可以分别酶切含SUMO(WT)和SUMO(S)标签的底物。首先构建了四种重组载体：pACYC-ulp(wt)(Cm+)，pMF-ulp(S)(Amp+)，pSUMO(WT)-edal(Kan+)，pSUMO(S)-edal(Kan+)，不加酶的对照组设置为底物与不含ulp(wt)和ulp(S)的空载体共表达。得到以下四对组合：
将四种酶-底物组合转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，诱导表达后蛋白电泳，电泳图谱如图5所示。结果显示ULP(WT)和ULP(S)均可以有效的切除底物的SUMO(WT)标签，但两种酶均不能有效切除SUMO(S)标签。
实施例5
ULP(S)蛋白纯化与产量测定
本发明将ULP(S)进行大量蛋白纯化。在pMF-ulp(S)BL21(DE3)平板中挑取单菌落至6mL Luria-Bertani培养基中，添加终浓度为100mg/L的氨苄青霉素，37℃，220rpm过夜摇菌，再按1:200比例扩繁至1L含氨苄青霉素的LB培养基中，细菌生长到OD600至0.6时加终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导12h，然后收集菌体超声破碎，破碎功率300W，超声破碎3s，间隔9s，破碎1h后8000rpm冷冻离心30min，上清液过5mL Ni-NTA亲和层析树脂，分别用Lysis Buffer和Wash Buffer洗除杂蛋白，最后用Elution Buffer洗脱下目的蛋白。目的蛋白用截留大小为10kDa的蛋白超滤管浓缩，再将Elution Buffer置换为蛋白储存液，浓缩至1mL左右加体积分数为25％的甘油混匀分装后放－80℃超低温冰箱保存。三种Buffer和蛋白储存液的组分分别为：
Lysis Buffer：50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0。
Wash Buffer：50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，40mmol/L咪唑，pH 8.0。
Elution Buffer：50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0。
蛋白储存液：20mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，pH 8.0。
纯化的蛋白电泳检测为较纯的一条带。如图6所示。
用Bradford法测定超滤后得到的ULP(S)蛋白浓度，1L LB培养基可得到约62mg的蛋白酶，远高于已报道的野生型ULP产量(约20mg)[Lee C,D.et al.2008.An improvedSUMO fusion protein system for effective production of nativeproteins.Protein Sci.17(7):1241-1248.]。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种酿酒酵母基因sumo(S)，其特征在于：其由序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列定义。
2.一种酿酒酵母基因sumo(S)的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列定义。
3.一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)，其特征在于：其由序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列定义。
4.一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQ ID No.4的氨基酸序列定义。
5.权利要求1所述的酿酒酵母基因sumo(S)的表达载体，权利要求3所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)的重组载体。
6.一种pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)分别人工合成序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因；
(2)分别构建pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；
(3)用步骤(2)所述重组表达质粒分别转化宿主菌构建对应的基因工程菌；
(4)利用步骤(3)所述基因工程菌分别表达pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；
(5)利用纯化技术，分别获取pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体。
7.根据权利要求6所述的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述酿酒酵母基因sumo(S)的表达载体为pET28b，所述SUMO蛋白酶基因ulp(S)的表达载体为pMF载体，宿主菌为大肠杆菌DH5α；
在步骤(2)中，采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：1所示的sumo(S)基因和pET28b载体用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，将序列表SEQ ID NO：3所示的ulp(S)基因和pMF载体用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切，切胶回收后将对应的基因和载体用T4DNA连接酶16℃连接5h，连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，孵育复性后涂布抗性平板37℃培养12h后挑取单菌落，在5mLLuria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养12h后提质粒，分别获得pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；
在步骤(4)中，重组载体pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)均为T7启动子，lac操纵子，诱导表达条件经优化后选择28℃诱导12h，诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.5mmol/L。
8.一种含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
将dnaK、mbp、gst、tig、groEL、trx六种标签蛋白编码基因和pET28b-tevS用Nde Ⅰ，BglⅡ酶切后连接转化入DH5α感受态细胞中，提质粒酶切验证正确后，再将这六种标签载体和ulp(S)用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切后连接，转化、酶切验证成功后将六种质粒转入到大肠杆菌的表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，在平板中挑取单菌落，在5mL Luria-Bertani培养基中37℃，220rpm摇菌培养，细菌生长到OD600至0.6时加终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导12h，然后收集菌体超声破碎，冷冻离心后将上清蛋白样品，制得含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体。
9.权利要求1所述的酿酒酵母基因sumo(S)、权利要求1所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)、权利要求8所述的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体和权利要求8所述的含六种融合标签的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重组载体在酶工程中的应用。
CN201610560872.2A 2016-07-15 2016-07-15 Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用 Pending CN106434699A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610560872.2A CN106434699A (zh) 2016-07-15 2016-07-15 Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610560872.2A CN106434699A (zh) 2016-07-15 2016-07-15 Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106434699A true CN106434699A (zh) 2017-02-22

Family

ID=58184559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610560872.2A Pending CN106434699A (zh) 2016-07-15 2016-07-15 Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106434699A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108774634A (zh) * 2018-07-02 2018-11-09 通用生物系统（安徽）有限公司 重组sumo蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法
CN111748505A (zh) * 2019-03-28 2020-10-09 上海医药工业研究院 一种表达羧肽酶g2的基因工程菌及其制备方法和应用
CN114075272A (zh) * 2020-08-10 2022-02-22 杭州俊丰生物工程有限公司 一种人神经调节蛋白4的制备方法
CN114836448A (zh) * 2022-05-19 2022-08-02 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种密码子优化的t4多聚核苷酸激酶的核酸分子及其表达方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140094589A1 (en) * 2010-11-25 2014-04-03 Vladimir Grigorievich Bogush Method for producing web protein, a fused protein, recombinant dna, an expression vector, a host cell and strain-producers

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140094589A1 (en) * 2010-11-25 2014-04-03 Vladimir Grigorievich Bogush Method for producing web protein, a fused protein, recombinant dna, an expression vector, a host cell and strain-producers

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI,S.J. AND HOCHSTRASSER,M.: "Chain A, X-Ray Structure Of The C-Terminal Ulp1 Protease Domain In Complex With Smt3, The Yeast Ortholog Of Sumo", 《PDB: 1EUV_A》 *
STROPE,P.K. ET AL.: "Smt3p [Saccharomyces cerevisiae YJM248]", 《GENBANK: AJU61058.1》 *
ZHOU C ET AL.: "A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases", 《MICROB CELL FACT》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108774634A (zh) * 2018-07-02 2018-11-09 通用生物系统（安徽）有限公司 重组sumo蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法
CN111748505A (zh) * 2019-03-28 2020-10-09 上海医药工业研究院 一种表达羧肽酶g2的基因工程菌及其制备方法和应用
CN111748505B (zh) * 2019-03-28 2022-12-30 上海医药工业研究院 一种表达羧肽酶g2的基因工程菌及其制备方法和应用
CN114075272A (zh) * 2020-08-10 2022-02-22 杭州俊丰生物工程有限公司 一种人神经调节蛋白4的制备方法
CN114075272B (zh) * 2020-08-10 2023-09-22 杭州俊丰生物工程有限公司 一种人神经调节蛋白4的制备方法
CN114836448A (zh) * 2022-05-19 2022-08-02 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种密码子优化的t4多聚核苷酸激酶的核酸分子及其表达方法
CN114836448B (zh) * 2022-05-19 2023-12-05 浙江安诺优达生物科技有限公司 一种密码子优化的t4多聚核苷酸激酶的核酸分子及其表达方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Guerrero et al. Tandem SUMO fusion vectors for improving soluble protein expression and purification
De Marco et al. The solubility and stability of recombinant proteins are increased by their fusion to NusA
Malhotra Tagging for protein expression
CN106434699A (zh) Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用
Nikghalb et al. Expanding the scope of Sortase‐mediated ligations by using Sortase homologues
Takakura et al. Tamavidins–novel avidin‐like biotin‐binding proteins from the Tamogitake mushroom
WO2000047750B1 (en) Metalloproteases of the neprilysin family
Coolbaugh et al. High-throughput purification of recombinant proteins using self-cleaving intein tags
Jeon et al. Analysis of selective, high protein–protein binding interaction of cohesin–dockerin complex using biosensing methods
Fang et al. An improved strategy for high-level production of TEV protease in Escherichia coli and its purification and characterization
CN111269322B (zh) 链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用
CN111269323B (zh) 单体链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用
Yuan et al. Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli
Fang et al. Engineering soluble tobacco etch virus protease accompanies the loss of stability
Landrieu et al. Characterization of the Arabidopsis thaliana Arath; CDC25 dual-specificity tyrosine phosphatase
Kulmala et al. Improvement of Fab expression by screening combinatorial synonymous signal sequence libraries
Naumann et al. Generation of artificial N-end rule substrate proteins in vivo and in vitro
WO2000040706A1 (fr) Procede de production de transglutaminase
CN114574471A (zh) 一种重组SortaseA酶及其固定化方法和应用
Mitra et al. High level expression of peptides and proteins using cytochrome b5 as a fusion host
Lin et al. Cleavable self-aggregating tags (cSAT) for protein expression and purification
Lin et al. Enzyme kinetics of tobacco Rubisco expressed in Escherichia coli varies depending on the small subunit composition
Rodriguez et al. A cytotoxic ribonuclease variant with a discontinuous nuclear localization signal constituted by basic residues scattered over three areas of the molecule
Tripathi et al. Molecular determinants of temperature-sensitive phenotypes
CN102757501A (zh) 蛋白标签的联合应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170222

RJ01 Rejection of invention patent application after publication