CN114075272B - 一种人神经调节蛋白4的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及一种人神经调节蛋白4的制备方法,包括优人神经调节蛋白4编码基因的优化、合成、克隆、表达筛选、培养、纯化融合蛋白、酶切,得到人神经调节蛋白4蛋白。本发明目标蛋白表达量高,达到30%,表达产物具有正确的空间结构,纯化工艺采用的是常压柱层析技术和水溶液流动相,收率高于合成法,环境污染少。本发明获得的人神经调节蛋白4经过酶切去除了标签蛋白,产物具有天然氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,尤其涉及一种人神经调节蛋白4的制备方法。
背景技术
神经调节蛋白(neuregulin,NRG)是一类在神经系统、心脏、乳腺等组织和器官中介导细胞与细胞间信号转导的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF),是表皮生长因子受体(EGFR)络氨酸激酶家族的一个重要配体。哺乳类动物NRGs家族有四种NRG因子、即NRG1、NRG2、NRG3和NRG4,均可编码相应的EGF类似区域与酪氨酸激酶家族ErbBs(v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homologs) 胞外区域结合,引起ErbBs形成二聚体,激活细胞内的信号转导,如磷脂酰肌醇激酶 3(phosphatidyl inositol3 kinase,PI3K)和促细胞分裂蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路等,具有促进细胞生长、分化、迁移、凋亡和黏附的作用。
人神经调节蛋白4(neuregulin 4,NRG4)NRG4是NRG家族的成员之一,位于人类染色体15q24。和其它NRG家族成员(NRG1、2、3)一样,在神经系统均有表达,但仅NRG4表达在一些特定的外周组织,如肺、肝脏、心脏以及脂肪组织等,其中以棕色脂肪组织(brownadipose tissue,BAT)表达水平最高,主要在棕色脂肪组织细胞中表达和分泌。NRG4有5种基因产物,即NRG4A1、NRG4A2、NRG4B1、NRG4B2和 NRG4B3,这些表达产物有相同的翻译起始位点,其中两种变异体-NRG4A1和 NRG4A2有相同的跨膜区并且编码具有相同生物活性的片段。该片段包括了EGF结合位点,因而具有生物学活性。其余3种NRG4变异体(NRG4B1~3)由于缺失了用于跨膜的第6个外显子而只能存在于细胞内,并且因为缺失了C末端2个半胱氨酸而仅具有部分EGF结构,因此不能与相应受体结合而缺乏生物学活性。
NRG4在相应组织的细胞中生成,经蛋白水解后,具有EGF结合位点的胞外片段作为活性蛋白释放入血,以自分泌、旁分泌或者是内分泌形式作用于靶器官。不同的NRGs呈现出明显的特异性。与不同的ErbB受体有不同的亲和力,最终形成不同的二聚体、信号和细胞响应。NRG4只特异性地与ErbB4结合,ErbB4形成的同源二聚体是介导NRG4信号路径的有效受体,可通过下游PI3K/Akt、STAT5磷酸化等路径影响细胞凋亡和脂质代谢等功能。在蛋白酶小体抑制剂MG-132的存在下,两种蛋白的表达显著稳定,表明它们通常被该系统降解。
NRG4的N端包含带有胞外EGF类似区域的跨膜结构,可特异性地与细胞膜表面的EGF受体ErbB4结合,激活细胞内的信号传导,发挥其刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡以及改善细胞能量代谢等生理学功能。越来越多的研究表明NRG4在上皮细胞相关疾病、心血管疾病、多部位肿瘤以及糖脂代谢相关疾病中发挥重要的作用,因此有可能成为多种疾病潜在的治疗靶点。
NRG4处理可阻断TNF和IFN-γ诱导的小鼠结肠上皮细胞凋亡。在小鼠实验性结肠炎模型中也有保护作用。NRG4刺激ErbB4的磷酸化,而不是其他ErbB受体,表明这是一种特异性反应。此外,与相关配体相比,NRG4增强了细胞存活而不是增殖或迁移,并刺激了抗凋亡介质Akt的磷酸化而不是ERK-MAPK的磷酸化。药物抑制 PI3K/Akt信号转导逆转了NRG4的抗凋亡作用,证实了该级联反应在NRG4诱导的细胞存活中的作用。NRG4在人类炎症性肠病样本和小鼠结肠炎模型中的表达降低,表明ErbB的激活在疾病中发生了改变。因此,外源性NRG4可能有利于发生上皮细胞凋亡的疾病。用NRG4选择性激活erb4可能引起不同的细胞结果,这与其他EGF样或EGF受体调节蛋白家族分子刺激效应不同。
研究发现,在EGFR、ErbB2或ErbB3未检测到磷酸化的情况下,ErbB4的激活导致体外和体内抗凋亡信号的增强,细胞增殖或迁移没有改变。NRG4诱导的凋亡抑制依赖PI3K/Akt途径。因此,用NRG4选择性激活ErbB4似乎是一种特殊的细胞存活刺激。与其他生长因子相比,NRG4能够阻止细胞因子刺激的结肠上皮细胞凋亡,并降低了增殖障碍的风险,这使得它成为一种有吸引力的潜在治疗方法,用于治疗IBD等涉及小肠或结肠上皮细胞凋亡升高的疾病。
Hayes N.V.等在一组前列腺癌的研究(Endocr Relat Cancer.2010 Dec 13;18(1):39-49. Expression of neuregulin 4 splice variants in normal human tissuesand prostate cancer and their effects on cell motility)中发现,每种形式都有不同程度的表达,主成分分析表明有三种表达模式。一些异构体与前列腺特异性抗原水平呈正相关,其他异构体与 Gleason评分呈负相关。在伤口愈合实验中表达ErbB4(CTa)受体的细胞,合成复性的NRG4 A型促进片足和丝状足形成,并刺激细胞运动。数据表明,不同的形态有不同的表达和功能位点,这包括对细胞结构和运动的影响。
Steven J.等的研究(The American Journal of Pathology,Vol.184,No.10,October 2014,The ErbB4 Ligand Neuregulin-4 Protects against ExperimentalNecrotizing Enterocolitis)显示NRG4及其受体ErbB4分别存在于母乳和发育中的小肠,这些发现与小肠疾病具有潜在临床相关性。NRG4-ErbB4信号可能是坏死性小肠结肠炎(NEC治疗干预或预防的新途径。
Chengfu Cai1等通过对1212名男性腰围大于90厘米或女性腰围大于80厘米的肥胖成人(40岁或40岁以上)的血清Nrg4测定研究(BMC Medicine(2016)14:165,Association of circulating neuregulin 4 with metabolic syndrome in obeseadults:a cross-sectional study)发现,循环中Nrg4浓度与肥胖中国成年人发生代谢综合征MetS 的风险呈负相关,提示循环Nrg4浓度可能是MetS发生的保护性因素。另一项研究也发现循环Nrg4浓度与肥胖人群亚临床动脉粥样硬化呈负相关,提示循环NRG4可能在确定心血管病高危患者中起作用。
EGF家族成员neuregulin(NRG)4在淋巴瘤细胞株中高表达。恶性淋巴瘤临床标本的免疫组化分析显示,NRG4和HER4主要表达于黏膜相关淋巴组织(MALT)和滤泡性淋巴瘤。Raji和Daudi细胞株的免疫沉淀显示重组NRG4诱导HER4酪氨酸磷酸化。此外,重组NRG4还激活了淋巴瘤细胞株的增殖。这些结果表明,NRG4-HER4 在胃肠道恶性淋巴瘤细胞的增殖中起重要作用,有望成为恶性淋巴瘤分子靶向治疗的候选分子。成人胰腺中可检测到NRG-4mRNA的表达,肌肉组织中有弱表达,其余组织均未检测到表达。NRG-4的一级结构和表达模式,以及该生长因子对ErbB-4的高度特异性,表明其具有不同于已知ErbB配体的生理作用。
Jinbao Shi等研究了人神经调节蛋白4(Nrg4)在肥胖相关疾病(包括2型糖尿病(T2DM)和非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病中的作用(Am J Transl Res 2019;11(9):5501-5513,Neuregulin 4 attenuate tubulointerstitial fibrosis and advancedglycosylation end products accumulation in diabetic nephropathy rats viaregulating TNF-R1 signaling)。该研究探讨了NRG4在糖尿病肾病(DN)肾小管间质纤维化(TIF)发生发展的病理生理机制中的作用。NRG4在糖尿病肾病大鼠血清和肾组织中表达不足。 NRG4可减轻肾功能损伤、肾小管间质纤维化、炎症和抑制体内外晚期糖基化终产物(AGEs)的表达水平。此外,研究结果还表明NRG4通过TNF-R1信号而不是TNF-R2 信号来减轻HK-2细胞的纤维化,减轻AGEs和炎症的表达。总之,这些结果表明NRG4 可能通过TNF-R1信号而不是TNF-R2信号有效地改善了DN的TIF和减弱AGEs的表达。这些结果表明NRG4对DN的TIF有治疗作用。
成人功能性棕色脂肪组织(BAT)与体脂质量呈负相关,并可能反映代谢健康,这一发现刺激了脂肪组织研究,以探索BAT的激活作为潜在的减肥治疗靶点。除了棕色脂肪组织增加能量消耗和糖脂摄取的能力外,棕色脂肪组织还分泌可能有助于调节全身代谢的因子。在棕色脂肪组织释放的信号中,人神经调节蛋白4(NRG4)最近被认为是一种内分泌因子,它可能将棕色脂肪组织的激活与防止饮食引起的肥胖、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性联系起来。NRG4可直接减少肝细胞内的脂肪生成,并可通过交感神经元或通过旁分泌方式诱导白色脂肪细胞内棕色脂肪细胞样信号间接激活 BAT。然而,NRG4作为治疗肥胖相关疾病的诊断工具或靶点的潜在相关性仍有待探索(Matthias Blüher,Neuregulin 4:A“Hotline”Between Brown Fat and Liver,Obesity (2019)27,1555-1557)。超重及肥胖T2DM患者的血清NRG4水平是降低的;血清NRG4 可能参与了糖尿病患者胰岛素抵抗的发生,并与T2DM患者超重及肥胖的发生有关。
颈动脉内-中膜厚度CIMT增厚是早期动脉硬化发生的标记,也是发生心血管疾病和中风风险重要的决定因素。研究发现,2型糖尿病患者T2DM患者Nrg4降低,且 CIMT增厚者下降更明显,CIMT与Nrg4呈负相关,且Nrg4是CIMT的独立影响因素,提示Nrg4浓度升高会降低动脉硬化的风险,可能起到保护性作用。棕色脂肪组织能降低TC和调控动脉粥样硬化的发展,Nrg4可能为棕色脂肪组织干预心血管疾病的中间纽带。
有研究发现,肥胖者血清NRG4水平低于正常人,血清NRG4水平与肥胖人群发生代谢综合征的风险呈负相关。Dai等研究表明,血清NRG4水平与非酒精性脂肪肝的严重程度呈负相关。这些结果使得NRG4成为肥胖相关疾病的潜在治疗手段,包括 T2DM和非酒精性脂肪肝。
总的来说,人类和NRG4功能增加或减少小鼠的表型表明,NRG4减少可能与肥胖相关的脂肪肝和糖代谢受损有关。NRG4如何发挥这些有益作用的确切机制尚不完全清楚,但可能涉及NRG4(作为内分泌信号)对肝细胞的直接作用,以减少脂肪生成和饮食诱导的肝损伤,通过交感神经间接激活BAT,或在白脂肪细胞中诱导棕色脂肪细胞样信号自分泌/旁分泌方式。
NRG4是否有可能成为肥胖和相关疾病(包括2型糖尿病和非酒精性脂肪肝)药物治疗的靶点,还将取决于可能的“非靶点”效应。ErB/HER受体调节细胞增殖、存活和分化等关键过程,在肿瘤细胞生长和存活中发挥重要作用。研究表明,重组NRG4 诱导ErbB/HER4酪氨酸磷酸化,并激活淋巴瘤细胞系的增殖。然而,没有直接证据表明NRG4/ErbB4信号的激活促进了癌症的发展。相反,刘等人证实ErbB4的缺失与肝癌的发生发展有关,提示ErbB4可能是一个抑癌基因。
BAT是NRG4含量最为丰富的组织,NRG4主要由棕色脂肪细胞合成并分泌,而在BAT血管基质中NRG4含量较少甚至无法检测。BAT是体内一类较为特殊的脂肪组织,可通过解耦联蛋白-1(uncoupling protein 1,UCP1)产热释放多余的能量以调节机体糖脂代谢,但成人体内BAT已大面积退化,目前可检测的成人体内BAT,可能是白色脂肪组织(whiteadipose tissue,WAT)棕色化后形成的“米色脂肪组织(brite adipose tissue)”。WAT可分为皮下和内脏WAT,主要用于脂质积聚以及能量储存,可在冷刺激、药物等干预下发生棕色样变成为米色脂肪,米色脂肪拥有与BAT相似的形态与功能,而皮下WAT棕色化的能力高于内脏WAT。NRG4在不同脂肪组织中的分布与产热相关基因Cidea等类似,即BAT中表达最高,皮下WAT次之,内脏WAT最少,但都明显高于其它外周组织,如胰腺、肺和肝脏等。寒冷刺激是导致脂肪组织中 NRG4生成增多的有效干预方式,但在短期快速冷暴露情况下,只有BAT中NRG4升高明显,而在长期冷暴露条件下,BAT和皮下WAT中NRG4均有升高,这可能是BAT中交感神经分布较为密集,对环境刺激更为敏感所致。有研究指出,随着棕色脂肪细胞的分化成熟,NRG4生成也明显增多,提示NRG4的合成与脂肪细胞分化成熟水平密切相关;去甲肾上腺素干预已分化成熟的棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞,只有棕色脂肪细胞中的NRG4表达升高,但是在TNFα和IL-1β干预下,两种脂肪细胞中的 NRG4均减少。以上研究结果表明,NRG4在脂肪组织中的产生存在部位差异,并受到神经内分泌和免疫等多因素调控,进一步研究其分泌调控的机制,有助于阐明其生理功能及其在疾病中的作用。
NRG4的主要生物学功能表现在:
1、促进细胞增殖
细胞增殖是指细胞以分裂的方式进行增殖,包括有丝分裂、无丝分裂、减数分裂等,是生物体重要的生命特征,而肿瘤的主要特征就是细胞的恶性增殖,它与肿瘤的侵袭性密切相关。多项研究证实,NRG4可与其特异性受体ErbB4结合,引起细胞增殖,其中包括恶性淋巴瘤中的淋巴细胞和口腔黏膜白斑中的上皮细胞,并且可促进神经细胞突触形成,其引起细胞增殖的作用主要通过激活MAPK信号通路,但下游通路尚不明确。
2、抑制细胞凋亡
细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种形式,用于清除多余或者衰老的细胞,以维持细胞在数量、形态或者功能上的平衡,细胞凋亡调控异常可能会导致个体不能正常发育、严重畸形、不能存活或肿瘤的发生,与许多疾病的发生密切相关,凋亡最常见的就是炎症因子引起的细胞凋亡,其中常见的有肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF) 和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)。当细胞被IFN-γ和TNF干扰时,胞内核转录因子κB(nucleartranscription factorκB,NF-κB)被激活,引发“瀑布效应”,从而引起大量炎症因子释放,最终导致细胞凋亡,其中TNFα被认为是起始刺激因子。NRG4与其特异性受体ErbB4结合后,通过使Src磷酸化,激活下游PI3K/Akt途径,拮抗TNF 和IFN-γ引起的大量炎症因子释放,从而阻止细胞凋亡。
NRG4作为一种新型的棕色脂肪分泌因子。冷刺激诱导下,棕色脂肪中NRG4合成后水解为活性蛋白,可分泌至肝脏,抑制肝脏脂肪合成并保持糖类和脂质代谢平衡,增加机体对胰岛素的敏感性。NRG4的高表达可有效减少慢性炎症过程中的巨噬细胞标记物及趋化因子的表达,从而增加胰岛素敏感性。动物实验发现,高表达的NRG4 小鼠可通过抑制脂质合成及过氧化物酶体增殖物激活受体诱导的脂质堆积,减轻高脂饮食所致的肝脏脂肪变性,并且可通过减少炎症因子表达,改善胰岛素敏感性,从而抵抗高脂饮食所致的肥胖。
中国专利申请号2007100463588公开了神经调节蛋白突变体及其用途,涉及一种包含EGF类似区的神经调节蛋白突变体,其在神经调节蛋白的第177-223位氨基酸残基发生突变,且所得突变体对ErbB2/ErbB4共表达的细胞中ErbB受体磷酸化的诱导活性高于神经调节蛋白,而对ErbB2/ErbB3共表达的细胞中ErbB受体磷酸化的诱导活性低于神经调节蛋白。该发明还公开了神经调节蛋白突变体的编码序列、表达载体、和宿主细胞及其用途。该发明公开的制备方法是NRG1,并且表达产物是包含体,需要经过复性才能得到有生物学活性的产品。
D Harari1等研究NRG-4的作用机理(Neuregulin-4:a novel growth factorthat acts through the ErbB-4 receptor tyrosine kinase,Oncogene(1999)18,2681±2689)时采用化学合成法合成NRG-4的类EFG的结构域。合成在Applied Biosystems(ABI)430A多肽合成仪上进行,采用t-BOC化学法,固相载体上合成的多肽经HF水解,RP-HPLC纯化后需要进行复性,再经过纯化,质谱分析获得了分子量5371.50的产品。此法不但合成的产率非常低,而且没有生物学活性,需要经过复性过程才能获得目标多肽。
通过生物工程的技术制备具有生物学活性的Nrg4蛋白,促进其在相关疾病中的治疗作用研究显得非常迫切和有意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种人神经调节蛋白4的制备方法,能够用基因工程的技术大量制备人神经调节蛋白4,为了实现本发明的目的,本发明采用了以下技术方案:
一种人神经调节蛋白4的制备方法,包括优化人神经调节蛋白4的编码基因,合成基因,构建表达载体及转化大肠杆菌工程菌,筛选出阳性克隆,工程菌培养和表达,收集大肠杆菌菌体,破菌,纯化融合蛋白,本发面特别采用了人神经调节蛋白4与标签蛋白相连的表达方法,纯化的融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切得到人神经调节蛋白 4蛋白。
本发明一种人神经调节蛋白4的制备方法,采用的表达基因是学列表SEQ.1的人神经调节蛋白4的DNA序列,该序列经过了密码子优化,适合在所用的表达宿主细胞进行高水平表达。编码的人NRG4蛋白的氨基酸序列见序列表SEQ.2。表达SUMO蛋白-人NRG4融合蛋白的编码基因见序列表SEQ.3。
本发明一种人神经调节蛋白4的制备方法,使用的表达载体是pET系列质粒表达载体。
本发明一种人神经调节蛋白4的制备方法,采用融合蛋白表达,N端是SUOM蛋白序列,C端是人神经调节蛋白4序列。
本发明一种人神经调节蛋白4的制备方法,工程菌的培养和诱导表达的温度控制在10℃~40℃,优选在10℃~20℃。
本发明一种人神经调节蛋白4的制备方法,SUMO蛋白酶酶切温度2~37℃,时间 1~16小时,pH 5.0~9.0,DTT浓度0.1~2mM,融合蛋白与SUMO蛋白酶的比例1mg∶10~500U。
本发明一种人神经调节蛋白4的制备方法,采用亲和层析技术、离子交换层析、分子筛层析、疏水层析一种或多种方法进行纯化。
本发明一种人神经调节蛋白4的制备方法,采用的是基因工程的方法,表达量高,达到30%,表达产物具有正确的空间结构,纯化工艺采用的是常压柱层析技术和水溶液流动相,收率高于合成法,环境污染少。本发明获得的人神经调节蛋白4经过酶切去除了标签蛋白,产物具有天然氨基酸序列。
附图说明
附图1、pET-32a-SUMO-NRG4质粒编码SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合表达全菌蛋白SDS-PAGE分析
M:标准蛋白质分子量(自上而下250、130、100、70、55、40、30、20 15、10kd);
1:未诱导菌体总蛋白;
2、3、4、5:诱导菌体总蛋白。
附图2、SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的金属螯合层析图谱
附图3、SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的酶切SDS-PAGE电泳分析
M:标准蛋白质分子量(自上而下97.4、66.2、43、31、20、14.4kd);
1、SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白;
2~4、SUMO酶酶切样品。
附图4、SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白酶切后的金属螯合层析图谱
附图5、人神经调节蛋白4的SP离子交换层析图谱
附图6、纯化人神经调节蛋白4的SDS-PAGE电泳法分析
1、纯化人神经调节蛋白4;
2、标准蛋白质分子量(自上而下97.4、66.2、43、31、20、14.4kd);
3、SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白;
4、SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的SUMO酶酶切样品。
附图7、缓冲液空白的RP-HPLC分析结果
附图8、NRG4样品的RP-HPLC分析结果
附图9、纯化NRG4样品的质谱分子量分析结果
附图10、pET-32a-TRX-NRG4质粒编码TRX蛋白-人神经调节蛋白4融合表达全菌蛋白SDS-PAGE分析
M:标准蛋白质分子量(自上而下250、130、100、70、55、40、30、20 15、10kd);
1:未诱导菌体总蛋白;
2~5:诱导菌体总蛋白。
附图11、TRX蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的金属螯合层析图谱
附图12、TRX蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的肠激酶酶切SDS-PAGE电泳分析
1、TRX蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白;
2、肠激酶酶切样品(肠激酶0.1U/50μg融合蛋白);
3、肠激酶酶切样品(肠激酶0.5U/50μg融合蛋白);
4、肠激酶酶切样品(肠激酶1U/50μg融合蛋白)。
附图13、TRX-NRG4融合蛋白酶切纯化后NRG4的质谱分子量分析结果
附图14、NRG4直接表达的SDS-PAGE电泳分析结果
M:标准蛋白质分子量(自上而下97.4、66.2、43、31、20、14.4kd);
1:未诱导菌体总蛋白;
2~6:诱导菌体总蛋白。
具体实施例
下面结合具体实施例进一步说明本发明,但是并非限定本发明。
实施例一 人神经调节蛋白4基因的优化和合成
根据文献报道(GenBank:CAL35829.1)的人神经调节蛋白4基因序列,进行非跨膜区域部分基因表达序列优化,优化后序列见序列表SEQ.1,编码的人神经调节蛋白4 的氨基酸序列见序列表SEQ.2。合成8段互补的寡核苷酸,按分子克隆的常规方法,首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30min,磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩尔混合,94℃变性5min,立即65℃退火10min,然后加入T4连接酶,16℃连接过夜,获得目的基因模板片段。取4个灭菌的微量离心管,加入:
上述混合物轻轻震荡混匀后再短暂离心,然后置于15℃水浴中保温连接过夜(12~16h)。取5μl连接产物加入到50μl冰上解冻的大肠杆菌TOP10感受态细胞中,轻旋几次混匀,冰上放置30分钟后放入预热至42℃的水浴中,热激90秒。然后迅速置于冰上,使细胞冷却10分钟。每管中加800μl LB培养基(不含抗生素),37℃振荡培养1小时。室温3,500rpm离心3分钟,弃去800μl上清后,用剩余50μl培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板表面,再在平板上滴加40μl 20mg/ml X-gal、7μl 200mg/ml IPTG。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿37℃培养,12-16小时后可出现菌落,白色菌落即为获得阳性菌落。
实施例二 SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合基因的克隆表达
设计一对引物进行基因扩增,并且与SUMO蛋白的基因序列连接获得融合蛋白基因。见序列表SEQ.3。再设计基因5‘端引物带有Nde I酶切位点,3’端引物带有终止密码和Bam H I酶切位点。
人神经调节蛋白4的基因扩增按下面的方法进行,在0.2ml PCR微量离心管中配制25μl反应体系:
质粒模板用小枪头粘一下选中的白色菌落,再伸入PCR混合液中洗一洗即可,Taq酶的加入量2U。94℃预变性5min,设置94℃1min、56℃1min、72℃2min,共35个循环,最后72℃15min。PCR结束后取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳,片段大小与设计的大小约180bp片段大小一致,其编码的氨基酸序列见序列表序列2。
pET-32a质粒用Nde I、BamH I双酶切回收大片段,与融合基因片段连接,20μL 反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1,加T4 DNA连接酶300单位,16℃连接过夜,取5μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,获得工程菌进行进一步筛选。
氨苄青霉素做抗性筛选,得到阳性克隆pET-32a-SUMO-NRG4。提取质粒,用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析,结果克隆序列与设计序列完全一致。
接种阳性克隆进行培养,经1mmol/L的IPTG诱导,表达结果见附图1,与对照相比,SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的表达量达到菌体总蛋白30%以上。
实施例三 SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的分离纯化
1、菌体培养
配制1升LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L,pH 7.0),培养基配好后于121℃温度下湿热消毒灭菌40min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为50μg/mL,冷却后置4℃冰箱中备用。
无菌操作条件下在平板中挑取含质粒pET-32a-SUMO-NRG4的工程菌单菌落于100ml LB培养基(含Amp)中,然后置于37℃下,250rpm摇床培养过夜。从培养过夜的种子培养物按0.5%接种量转接于LB培养基中,于37℃、250rpm培养4小时,培养液的OD600约为0.6~0.8,然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L。继续培养5 小时,离心收集菌体(5,000rpm×10min)。菌体用洗涤液20mM PB,pH7.0,0.15M NaCl 洗涤2-3次。
2、菌体破碎
取诱导表达5h的10g湿菌体,按1g湿菌体加10ml破菌缓冲液(50mM Tris-HClbuffer,0.1M NaCl,1mM EDTA,pH 8.5)悬浮菌体,即用100mL破菌缓冲液悬浮菌体,然后冰浴超声破碎(超声功率5000W,每次超声5s,间歇5s,即占空比50%,共进行 30个循环),4℃,10,000rpm离心15min,收集沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳分析,离心上清中含高浓度融合蛋白。
3、分离纯化
将含SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的破菌上清进行金属螯合层析纯化,其过程为用pH值为8.0的20mmol/L Tris.CL缓冲液适当稀释,层析柱:XK26,平衡缓冲液:20mMTris-HCl,洗脱缓冲液:20mM Tris-HCl,0.5M咪唑,用缓冲液平衡IMAC 柱,上样后用平衡缓冲液洗至基线,用2%、15%、50%的洗脱缓冲液分别洗脱,收集目标蛋白峰,层析图谱见附图2,经电泳分析目标蛋白在15%的洗脱峰中。
金属螯合层析获得的目标蛋白峰经Sephadex G-25脱盐,平衡液为20mmol/L PB,pH7.4。样品脱盐进行SUMO蛋白酶酶切,酶切条件:50mmol/L TRIS,pH8.0,酶DTT 浓度0.1mM,融合蛋白与SUMO蛋白酶的比例1mg/200U,酶切时间15小时,酶切温度2~8℃。酶切样品电泳分析结果见附图3。从电泳结果看,融合蛋白被SUMO酶酶切为2条蛋白条带,分别是SUMO标签蛋白和目标蛋白NRG4。
酶切结束后进行金属螯合层析纯化,平衡缓冲液:20mM Tris-HCl,pH8.0,洗脱 缓冲液:20mM Tris-HCl,pH8.0,0.5M咪唑。收集流出,层析结果见附图4。收集的 目标蛋白进一步进行SP离子交换层析进行纯化,金属螯合层析收集的流出稀释调 pH4.5,层析柱XK16,平衡缓冲液20mM NaAC-HAC,pH4.5,洗脱缓冲液20mM NaAC-HAC 0.5M NaCl,pH4.5,上样后平衡缓冲液液洗脱,然后用5%~100%洗脱缓冲 液梯度洗脱,收集目标蛋白峰,层析图谱见附图5,电泳分析结果见附图6,纯度达 到95%以上。
纯化的人神经调节蛋白4(NRG4)进一步进行HPLC分析。反相柱Agilent EclipseXDB-C18,2.1x150mm,流动相A:0.1%TFA,ACN-水(5∶95)。流动相B:0.1%TFA, ACN-水(95∶5),梯度20%B 10min,10~60min流动相B升至70%,上样量100μl。缓冲液空白RP-HPLC结果见附图7,NGR4样品RP-HPLC结果见附图8,样品纯度达到95%以上,达到97.4%。
NRG4样品的精确分子量分析,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(5800MALDI-TOF/TOF)方法进行样品的相对分子质量分析,将样品点至样品靶上,自然干燥后,再取CHCA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥,用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品。在正离子模式下选择线性方法对样品测试范围进行校准测试。线性中分子量校准物质校准范围为:5737.609±50、12362±50、16952±50。在正离子模式下选择线性方法测试样品分子量。5800 MALDI-TOF/TOF产生的原始数据及图谱由4000 Series ExplorerV3.5软件导出。样品的MS相对分子质量为:6667.80Da,结果见附图9,与理论分子量:6662.59Da一致,误差0.078%。进一步的生物学活性分析表明纯化的 NRG4可刺激表达ErbB-4受体的32D细胞增殖。
实施例四 人神经调节蛋白4蛋白的纯化
配制1升LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L,pH 7.0),培养基配好后于121℃温度下湿热消毒灭菌30min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为100μg/mL,冷却后置4℃冰箱中备用。
无菌操作条件下在平板中挑取含质粒pET-32a-SUMO-NRG4的工程菌单菌落于100ml LB培养基(含Amp)中,然后置于37℃下,250rpm摇床培养过夜。从培养过夜的种子培养物按0.5%接种量转接于LB培养基中,于37℃、250rpm培养4小时,培养液的OD600约为0.6~0.8,然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol/L。继续培养 5小时,离心收集菌体(5,000rpm×10min)。菌体用洗涤液20mM TRIS,PH7.0,0.15M NaCl洗涤3次。
取诱导表达5h的10g湿菌体,按1g湿菌体加10ml破菌缓冲液(50mM Tris-HClbuffer,0.1M NaCl,1mM EDTA,PH 8.5)悬浮菌体,即用100mL破菌缓冲液悬浮菌体,然后冰浴超声破碎(超声功率5000W,每次超声5s,间歇5s,即占空比50%,共进行 30个循环),,4℃,10,000rpm离心15min,收集破菌上清。
将含SUMO蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的破菌上清进行金属螯合层析纯化,其过程为用PH值为7.4的20mmol/L PB缓冲液适当稀释,层析柱:XK26,平衡缓冲液:20mM PB,洗脱缓冲液:20mM PB,0.5M咪唑,用缓冲液平衡IMAC柱,上样后用平衡缓冲液洗至基线,用2%、15%、50%的洗脱缓冲液分别洗脱,收集目标蛋白峰。
金属螯合层析获得的目标蛋白峰经透析,外透液为20mmol/L PB,pH7.4。样品脱盐进行SUMO蛋白酶酶切,酶切条件:50mmol/L TRIS,pH7.4,酶DTT浓度0.5mM,融合蛋白与SUMO蛋白酶的比例1mg/300U,酶切时间2小时,酶切温度25℃。经电泳分析融合蛋白被SUMO酶酶切为2条蛋白条带,分别是SUMO标签蛋白和目标蛋白NRG4。
酶切样品进行金属螯合层析纯化,平衡缓冲液:20mM PB,pH7.4,洗脱缓冲液:20mM PB1,pH7.4,0.5M咪唑。收集流出进一步进行CM离子交换层析进行纯化,金属螯合层析收集的流出稀释调pH4.8,层析柱XK16,平衡缓冲液20mM NaAC-HAC, pH4.8,洗脱缓冲液20mM NaAC-HAC 0.5M NaCl pH4.8,上样后平衡液洗脱,然后用 5%~100%洗脱缓冲液梯度洗脱,收集目标蛋白峰,电泳分析结果纯度达到95%以上。 1升培养液可以获得人NRG4蛋白15mg。
实施例五 TRX蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的表达和分离纯化
设计含有Kpn I和BamH I酶切位点的引物PCR扩增NRG4基因片段,pET-32a 质粒用Kpn I、BamH I双酶切回收大片段,20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1,加T4 DNA连接酶300单位,16℃连接过夜,取5μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,获得工程菌进行进一步筛选。
氨苄青霉素做抗性筛选,得到阳性克隆pET-32a-TRX-NRG4。提取质粒,用限制性内切酶进行鉴定。种阳性克隆进行培养,经1mmol/L的IPTG诱导,表达结果见附图10,与对照相比,TRX-人神经调节蛋白4的表达量达到菌体总蛋白25%以上。此方法的表达的融合蛋白N端是硫氧还蛋白标签TRX,标签蛋白与人NRG4蛋白通过肠激酶的酶切位点DDDDK相连。通过肠激酶酶切可以得到不附加其他氨基酸的人NRG4 蛋白。
配制1升LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L,pH 7.0),培养基配好后于121℃温度下湿热消毒灭菌40min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为50μg/mL,冷却后置4℃冰箱中备用。
无菌操作条件下在平板中挑取含质粒pET-32a-TRX-NRG4的工程菌单菌落于100mlLB培养基(含Amp)中,然后置于37℃下,250rpm摇床培养过夜。从培养过夜的种子培养物按0.5%接种量转接于LB培养基中,于37℃、250rpm培养4小时,培养液的OD600约为0.6~0.8,然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L。继续培养5 小时,离心收集菌体(5,000rpm×10min)。菌体用洗涤液20mM TRIS,pH7.0,0.15M NaCl 洗涤2-3次。
取诱导表达5h的10g湿菌体,按1g湿菌体加10ml破菌缓冲液(50mM PB buffer,0.15M NaCl,1mM EDTA,pH 8.5)悬浮菌体,即用100mL破菌缓冲液悬浮菌体,然后冰浴超声破碎(超声功率5000W,每次超声5s,间歇5s,即占空比50%,共进行30 个循环),收集破菌上清,4℃,10,000rpm离心15min,收集沉淀和上清进行SDS-PAGE 电泳分析,TRX-NRG4融合蛋白主要在离心后上清中。
将含TRX蛋白-人神经调节蛋白4融合蛋白的破菌上清进行金属螯合层析纯化,其过程为用pH值为8.0的20mmol/L Tris.CL缓冲液适当稀释,层析柱:XK26,平衡缓冲液:20mMTris-HCl,pH8.0,洗脱缓冲液:20mM Tris-HCl,pH8.0,0.5M咪唑,用缓冲液平衡IMAC柱,上样后用平衡缓冲液洗至基线,用2%、15%、50%的洗脱缓冲液分别洗脱,收集目标蛋白峰,层析图谱见附图11,经电泳分析目标蛋白在15%的洗脱峰中。
金属螯合层析获得的目标蛋白峰经Sephadex G-25脱盐,平衡液为20mmol/LTRIS, pH7.5。样品脱盐进行肠激酶酶切,酶切条件:20mmol/L TRIS,pH7.5,酶与融合蛋白的比例为1U∶50μg,酶切时间16小时,酶切温度2~8℃。酶切样品电泳分析结果见附图12。从电泳结果看,融合蛋白经过肠激酶酶切为2条蛋白条带,分别是TRX标签蛋白和目标蛋白NRG4。
酶切结束后进行金属螯合层析纯化,平衡缓冲液:20mM Tris-HCl,pH8.0,洗脱缓冲液:20mM Tris-HCl,pH8.0,0.5M咪唑。收集流出获得的样品电泳法分析纯度大于95%。此样品进行MS相对分子量分析,结果见图13。样品的MS相对分子质量为:6349.62Da,与理论分子量:6662.59Da相差312.94Da,经过氨基酸序列分析计算,发现肠激酶除了在DDDDK酶切融合蛋白之外,在本发明表达的人NRG4蛋白C端第 4个氨基酸处也产生了非特异性酶切,C端第4个氨基酸是K(赖氨酸),可能由于空间结构的影响,肠激酶在此也识别为酶切位点。去掉C端3个氨基酸后的理论分子量为6348.25Da,与检测结果在误差范围内符合。
由于含肠激酶位点的融合蛋白在酶切是出现非特异性酶切,虽然N端不增加其他氨基酸,可以获得NRG4的天然序列,但由于C端的非特异酶切,无法获得基因序列 1编码的完整蛋白。
实施例六 人神经调节蛋白4的直接表达
设计含有Nde I和BamH I酶切位点的引物PCR扩增NRG4基因片段,pET-22b 质粒用Nde I、BamH I双酶切回收大片段,20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1,加T4 DNA连接酶300单位,16℃连接过夜,取5μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,获得工程菌进行进一步筛选。
氨苄青霉素做抗性筛选,得到阳性克隆pET-22b-NRG4。提取质粒,用限制性内切酶进行鉴定。种阳性克隆进行培养,经1mmol/L的IPTG诱导,表达结果见附图14,与对照相比,人神经调节蛋白4的表达量达到菌体总蛋白15%以上。
配制10升LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L,pH 7.0),培养基配好后于121℃温度下湿热消毒灭菌30min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为50μg/mL,冷却后置4℃冰箱中备用。
无菌操作条件下在平板中挑取含质粒pET-22b-NRG4的工程菌单菌落于100ml LB培养基(含Amp)中,然后置于37℃下,250rpm摇床培养过夜。从培养过夜的种子培养物按0.5%接种量转接于LB培养基中,于37℃、250rpm培养4小时,培养液的 OD600约为0.6~0.8,然后加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L。继续培养5小时,离心收集菌体(5,000rpm×10min)。菌体用洗涤液20mM TRIS,pH7.0,0.15M NaCl洗涤 2-3次。
取诱导表达5h的50g湿菌体,按1g湿菌体加10ml破菌缓冲液(50mM PB buffer,0.15M NaCl,1mM EDTA,pH 8.5)悬浮菌体,即用100mL破菌缓冲液悬浮菌体,然后冰浴超声破碎(超声功率5000W,每次超声5s,间歇5s,即占空比50%,共进行30 个循环),收集破菌上清,4℃,10,000rpm离心15min,收集沉淀和上清进行SDS-PAGE 电泳分析,NRG4蛋白主要在离心后包涵体中。
用蛋白质变性液(8mol/L尿素、100mmol/LBME、50mmol/L Tris.Cl,pH 8.0)重悬所得到的人神经调节蛋白4包含体。充分悬浮后于37℃,250rpm的摇床上振荡裂解1小时。然后于10 000rpm,4℃离心15min,取离心上清液测蛋白质浓度约为 18mg/mL。将人神经调节蛋白4包含体裂解液稀释于50mM Tris,1mM GSH,0.1mmol/L GSSG,,1mM EDTA,0.5M L-Arg,1MUrea,pH8.5溶液中,变性蛋白裂解液在冰浴环境下滴加于预冷的复性液中,使复性液蛋白终浓度为0.20mg/ml,4℃静置复性24hr 后于20mM Tris,1mM EDTA,pH8.0的透析外透液中透析除去L-Arg,每12hr更换外透液一次,共更换3次,总计时间为36hr。透析结束后离心或者过滤,除去悬浮物,上清进行进一步的分离纯化。经过离子交换层析纯化,1000ml复性液含蛋白200mg,纯化获得的目标蛋白1.7mg,表明复性收率非常低。
Claims (6)
1.一种人神经调节蛋白4的制备方法,包括优化人神经调节蛋白4的编码基因,合成基因,构建表达载体及转化大肠杆菌工程菌,筛选出阳性克隆,工程菌培养和表达,收集大肠杆菌菌体,破菌,纯化融合蛋白,其特征在于:(1)人神经调节蛋白4与SUMO标签蛋白相连,所述人神经调节蛋白4的基因编码序列如SEQ ID NO.3所示;(2)纯化的融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切得到人神经调节蛋白4蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种人神经调节蛋白4的制备方法,其特征在于:表达载体是pET系列载体质粒。
3.根据权利要求1所述的一种人神经调节蛋白4的制备方法,其特征在于:工程菌的培养和诱导表达温度为10℃~40℃。
4.根据权利要求1所述的一种人神经调节蛋白4的制备方法,其特征在于:工程菌的培养和诱导表达温度优选为10℃~20℃。
5.根据权利要求1所述的一种人神经调节蛋白4的制备方法,其特征在于:SUMO蛋白酶酶切温度为2~37℃,时间为1~16小时,pH为5.0~9.0,DTT浓度为0.1~2mM,融合蛋白与SUMO蛋白酶的比例为1mg/10U~500U。
6.根据权利要求1所述的一种人神经调节蛋白4的制备方法,其特征在于:采用亲和层析技术、离子交换层析、分子筛层析、疏水层析一种或多种方法进行纯化。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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