CN106434717A - 一种生物合成制备人glp‑1多肽或其类似物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物合成制备人胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)及其类似物的方法。本发明采用基因工程技术，构建重组大肠杆菌表达GLP‑1融合蛋白(GLP‑1 fusion protein)，并在融合蛋白内设计蛋白酶切位点，具有形如A‑B‑C结构的基因序列，其中A为伴侣蛋白基因，B为编码包含酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为编码GLP‑1或其类似物的基因。重组工程菌经诱导表达后，融合蛋白纯化后经酶切，可以获得GLP‑1及其类似物，经检测具备生物活性。本发明提供的GLP‑1及其类似物制备方法简单快捷，生产条件温和、产物分离提取方便、工艺简单，具有良好的产业化前景。

Description

一种生物合成制备人GLP-1多肽或其类似物的方法
技术领域
本发明涉及DNA重组制备蛋白多肽技术，具体涉及一种GLP-1及其类似物与标签蛋白的融合表达，GLP以及利用上述技术在生物合成分离制备GLP-1及其类似物多肽方面的应用。
背景技术
上世纪60年代，麦金太尔((McIntyre)和埃尔里克(Elrick)等人发现，口服葡萄糖对胰岛素分泌的促进作用明显高于静脉注射，这种额外的效应被称为“肠促胰素效应”。随着细胞和分子生物学的发展，研究证实肠促胰素是人体内一种肠源性激素，在进食后该类激素可促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。
肠促胰素主要由胰高血糖素-1(GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)组成，其中GLP-1在2型糖尿病的发生发展中起着更为重要的作用。研究表明，一方面GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空来降低血糖；另一方面，GLP-1还有减缓β细胞凋亡，促进其再生的独特作用。
1983年Mclntyre等在分析胰高血糖素前体——胰高血糖素原(proglucagon，PG)的基因序列时发现了GLP-1。GLP-1基因在胰腺α细胞、肠道L细胞表达。完整的GLP-1多肽由37个氨基酸构成，其1-37肽序列结构为：
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG；
GLP-1多肽在体内的生物活性形式为GLP-1(7-37)多肽和GLP-1(7-36)酰胺，其中约80％的GLP-1循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺。根据本领域习惯，GLP-1(7-37)OH的氨基末端指定为7号，而羧基末端指定为37号。关于GLP-1类似物和衍生物的更详细描述见Hoffmann，J.A.[WO99/29336，1999年6月17日公布]和Knudsen，L.B.等[J.Med.Chem.43：1664-1669(2000)]。GLP-1(1-37)在体内生成后，通过两步酶切，分别去除N端6个氨基酸及形成C端酰胺化，最终生成具有高度活性的GLP-1(7-36)酰胺(也称GLP-1片段)。
GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素，它通过与GLP-1受体(GLP-1R，属于β受体家族的G偶联蛋白)结合发挥作用。GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路。胰岛成熟β细胞的GLP-1受体偶联Gs，活化腺苷酰环化酶，产生cAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成，降低胰高血糖素浓度并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。通过激活蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、MAPK通道，调节凋亡前蛋白及诱导抗凋亡蛋白Bcl-2与Bcl-xL的表达以减缓β细胞凋亡，增进其再生，促使胰岛β细胞分化并增殖。此外，GLP-1还能减慢胃排空速度；通过作用下丘脑，抑制食欲。
目前GLP-1及其类似物等多肽多采用基因重组方法制备。基因重组制备蛋白、多肽常采用大肠杆菌和酵母作为宿主。
利用酵母作为宿主制备多肽，多采用分泌表达，既在多肽的N端融合酵母信号肽(如α因子信号肽等)，在信号肽的引导下，多肽分泌到培养基中。该方案表达量高，后续分离纯化方便，但存在表达产物易降解的问题。Egel-Mitani等人(Egel-Mitani,2000)在利用酿酒酵母表达GLP-1时发现，GLP-1分泌到培养基中后，极易被降解成多个片段，导致后续纯化过程收率降低。
除了酵母外，大肠杆菌也是一类常用的蛋白表达宿主。然而GLP-1及其类似物等多肽，由于长度较短，在大肠杆菌细胞内极易降解，在表达时一般采用融合表达。采用融合表达方案，为得到具有生物活性的多肽，需要在纯化出融合蛋白后，去除多肽之外的其余肽段，此时可通过化学切割或者酶切割等方法实现。亦可通过内含肽的方法，通过蛋白自切割释放多肽，如Esipov等(Esipov 2006)采用Intein融合方案表达GLP-1，然而次方案表达出的融合蛋白为包涵体，表达量较低，后续处理成本高。采用化学切割，纯在切割反应不完全，导致收率较低。采用酶切割，则酶制剂成本较高。
发明内容
针对现有技术不足,本发明的目的是提供一种可用于大规模、低成本制备GLP-1或其类似物的生物制备方法。
为此发明目的，发明首先提供了一种可用于制备GLP-1或其类似物多肽的先导融合蛋白及编码该先导融合蛋白的融合基因。所述的融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为伴侣蛋白基因，B为编码包含酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为编码GLP-1或其类似物的基因。
所述融合基因中，A部分的伴侣蛋白基因可选自TrxA、DsbA、DsbC、Sumo、GST，Intein等，优选TrxA蛋白。TrxA蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.8所示，编码基因的序列如Seq ID No.7所示。
所述融合基因中，B部分的酶切位点连接肽可选自肠激酶、凝血酶、SUMO Protease等，优选肠激酶酶切位点连接肽。肠激酶酶切位点连接肽的序列如Seq ID No.6所示，编码基因的序列如Seq ID No.5所示。
所述融合基因中，C部分为编码GLP-1或其类似物的基因序列，所述的GLP-1或其类似物可选自GLP-1(7-37),GLP-1(8-37),GLP-1(9-37),GLP-1(10-37),GLP-1(11-37),GLP-1(12-37),GLP-1(13-37),GLP-1(14-37),GLP-1(15-37)或GLP-1多肽类似物,包括:
Arg34-GLP-1(7-37),Arg26-GLP-1(7-37),Lys36-GLP-1(7-37),Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40),Arg26Lys36-GLP-1(7-37),Arg34Lys36-GLP-1(7-37),Arg26Lys39-GLP-1(7-39),Arg34Lys40-GLP-1(7-40),Arg26,34Lys36 ,39-GLP-1(7-39),Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40),Gly8Arg26-GLP-1(7-37),Gly8Arg34-GLP-1(7-37),Gly8Lys36-GLP-1(7-37),Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37),Gly8Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39),Gly8Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40),Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37),Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37),Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39),Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40),Gly8Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39),Gly8Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40),Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(7-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(7-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(7-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(7-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(7-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(1-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(1-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(1-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(1-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(1-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(1-43),Arg26, 34Lys44-GLP-1(1-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(1-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(2-38),Arg26, 34Lys39-GLP-1(2-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(2-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(2-41),Arg26, 34Lys42-GLP-1(2-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(2-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(2-44),Arg26, 34Lys45-GLP-1(2-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(3-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(3-39),Arg26, 34Lys40-GLP-1(3-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(3-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(3-42),Arg26, 34Lys43-GLP-1(3-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(3-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(3-45),Arg26, 34Lys38-GLP-1(4-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(4-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(4-40),Arg26, 34Lys41-GLP-1(4-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(4-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(4-43),Arg26, 34Lys44-GLP-1(4-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(4-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(5-38),Arg26, 34Lys39-GLP-1(5-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(5-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(5-41),Arg26, 34Lys42-GLP-1(5-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(5-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(5-44),Arg26, 34Lys45-GLP-1(5-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(6-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(6-39),Arg26, 34Lys40-GLP-1(6-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(6-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(6-42),Arg26, 34Lys43-GLP-1(6-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(6-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(6-45),Arg26Lys38-GLP-1(1-38),Arg34Lys38-GLP-1(1-38),Arg26,34Lys36,38-GLP-1(1-38),Arg26Lys38-GLP-1(7-38),Arg34Lys38-GLP-1(7-38),Arg26,34Lys36,38-GLP-1(7-38),Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38),Arg26Lys39-GLP-1(1-39),Arg34Lys39-GLP-1(1-39),Arg26,34Lys36,39-GLP-1(1-39),Arg26Lys39-GLP-1(7-39),Arg34Lys39-GLP-1(7-39)和Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39)。
适合本发明的GLP-1类似物在现有技术中有多处记载，具体可参考描述于WO93/19175中(Novo Nordisk)，WO99/43705(Novo Nordisk)，WO99/43706(Novo Nordisk)，WO99/43707(Novo Nordisk)，WO98/08871(具有亲脂性取代基的类似物)和WO02/46227(与血清白蛋白或与Ig的Fc部分融合的类似物)(Novo Nordisk A/S)，WO99/43708(Novo Nordisk A/S)，WO99/43341(Novo Nordisk A/S)，WO87/06941(The General Hospital Corporation)，WO90/11296(The General Hospital Corporation)，WO91/11457(Buckley等)，WO98/43658(Eli Lilly&Co.)，EP0708179-A2(Eli Lilly&Co.)，EP0699686-A2(Eli Lilly&Co.)，WO01/98331(Eli Lilly&Co.)和CN200480034152.8中所提及的那些，在此全部引入作为参考。
可用一简单体系来描述GLP-1多肽的片段及类似物。例如Arg34-GLP-1(7-37)表示从GLP-1缺失掉氨基酸残基No.1-6，并在位置34(Lys)用Arg取代天然存在的氨基酸残基后形成的GLP-1片段,其他类似物以此类推。本文中提到C-末端延伸的GLP-1类似物时，则除非另外说明，在38位的氨基酸残基均是Arg，在39位的可选氨基酸残基也是Arg(除非另有说明)，在40位的可选氨基酸残基是Asp(除非另有说明)。同样，如果C-末端延伸的类似物延伸到位置41、42、43、44或45，则除非另外说明，此延伸物的氨基酸序列均与人前胰高血糖素原中的对应序列一样。
所述融合基因中，C部分的GLP-1或其类似物优选自Arg34-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(8-37),Arg34-GLP-1(9-37),Arg34-GLP-1(10-37),Arg34-GLP-1(11-37),Arg34-GLP-1(12-37),Arg34-GLP-1(13-37),Arg34-GLP-1(14-37)和Arg34-GLP-1(15-37)。
其中，Arg34-GLP-1(7-37)的序列为：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG；
其基因序列和氨基酸序列分别如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。
Arg34-GLP-1(9-37)的序列为：
EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG；
其基因序列和氨基酸序列分别如Seq ID No.3和Seq ID No.4所示。
本发明构建的融合基因，优选为编码TrxA-肠激酶酶切位点-Arg34-GLP-1(7-37)融合蛋白的基因序列，其DNA序列如SEQ ID No.9所示，编码的融合蛋白的氨基酸序列如如SEQ ID No.10所示。
本发明构建的融合基因，另一优选为编码TrxA-肠激酶酶切位点-Arg34-GLP-1(9-37)融合蛋白的基因序列，其DNA序列如SEQ ID No.11所示，编码的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
构建好融合基因后，可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。不同的融合基因可分别在宿主中表达得到各种融合蛋白。
本发明的另一目的提供一种可以大规模,低成本生产重组GLP-1多肽或其类似物的方法，所述方法包括如下的步骤：
(1)、在保持各自基因密码子阅读框架不变的前提下，构建具有如下结构的融合基因：A-B-C，其中A部分为编码伴侣蛋白的核苷酸序列，B为编码蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为GLP-1多肽或其类似物基因；
(2)、将上述的A-B-C融合基因序列连接到表达载体，将表达载体转化导入大肠杆菌中，经筛选得到重组基因工程菌；
(3)、高密度发酵重组大肠杆菌，经诱导表达获得融合蛋白，加入蛋白酶切，经分离纯化获得重组GLP-1多肽或其类似物。
步骤(1)中，A、B、C各部分的基因定义如前所述。人工合成C部分(GLP-1或其类似物)基因，并在5’和3’端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，合成好的基因克隆在pUC32质粒中，此部分工作由技术服务公司完成。抽提质粒双酶切，得到GLP-1基因片段，将此片段通过连接酶克隆岛双酶切后的pET32a质粒载体，利用载体上已有的A和B部分基因，构成完整的表达序列A-B-C。
构建好融合基因后，可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如表达载体pET系列载体、pDEST系列载体等。优选的方法是将编码本发明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至表达载体pDEST-15，含有T7启动子。
载体可经转化大肠杆菌宿主，宿主可选自BL21(DE3)、T7Express、BL21(DE3pLyss)等，优选BL21(DE3pLyss)。转化所需载体至宿主细胞中去可用通常的方法，如：热激法、电转法等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细菌，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。
可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法，可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)的生长，第二阶段主要用于合成产物。可以用各种蛋白分离的方法分离纯化蛋白，如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。
本发明一个优选的实施例是在大肠杆菌中表达GLP-1及其类似物，为此构建一个重组质粒，该质粒含有T7启动子、融合蛋白、蛋白酶切位点、GLP-1或其类似物。将构建好的质粒，转化大肠杆菌BL21，得到重组工程菌，表达重组融合蛋白。构建好重组工程菌经发酵，重组蛋白获得表达。离心收集菌体，通过高压匀浆破碎大肠杆菌，释放重组蛋白。利用重组蛋白中的His-Tag，通过金属螯合柱层析，纯化出融合蛋白。再利用E切割，将GLP-1或其类似物与融合蛋白断开，释放出多肽。最后利用等电沉淀，获得GLP-1或其类似物。
本发明的技术现对于现有技术具有以下的优点：
1、由于融合蛋白的存在，目的蛋白以可溶性蛋白形式表达，表达量高(占菌体总蛋白15％以上，最高可达50％)。2、融合蛋白的存在可以大大简化下游简化工艺。如TrxA融合蛋白很容易通过硫胺分级沉淀与其它蛋白分离。
3、利用EK酶酶切，酶识别位点特异性高，酶活性高、反应时间短、反应条件温和，处理工艺简易。
4、融合蛋白的纯在，使得酶切后多肽与余下部分容易分离，简化了多肽的纯化工艺。
5、通过等点沉淀的方法，一步从酶切液里面回收多肽，工艺简单、成本低。
附图说明
附图1：pET32a-GLP-1质粒图谱
附图2：pDEST-15-GLP-1质粒图谱
附图3：融合蛋白HPLC检测图谱
附图4：EK酶切后HPLC检测图谱
附图5：EK酶切后SDS-PAGE检测图谱，(泳道4为未酶切样品泳道1-3；5-7为酶切不同时间终止反应后的样品)
附图6：粗肽Arg34-GLP-1(7-37)体外活性检测结果图
具体实施方式
实施例1
构建一种表达人胰高血糖素-1类似物的基因工程菌：含有TrxA-EK-Arg34-GLP-1(7-37)的基因工程菌，此处TrxA为硫氧还蛋白。
首先根据Arg34-GLP-1(7-37)多肽序列，翻译成基因序列，在其5’端添加EK酶切位点对应的核酸序列以及KpnI酶切位点，在其3’端添加终止子以及BamHI酶切位点，具体如下：
GGTACCGACGACGACGACAAGGAGGGTACTTTCACTTCTGACGTTTCTTCTTACTTGGAGGGTCAAGCTGCTAAGGAGTTCATTGCTTGGTTGGTTAGGGGTAGAGGATGAAAGCTT
由基因合成服务公司合成上述序列，并克隆在克隆载体pUC32上。抽提该质粒，通过KpnI和BamHI双酶切，将合成的基因片段从质粒上酶切下来。TrxA蛋白的基因来自于pET32a质粒。具体得，设计引物通过PCR得到TrxA基因片段,并在片段两端添加NdeI和KpnI酶切位点；将扩增片段通过拓扑异构酶连接到T载体上，将该载体转化大肠杆菌Top1，摇菌抽提质粒通过NdeI和KpnI双酶切得到TrxA基因片段。将上述酶切得到的多肽基因片段和TrxA基因片段通过酶切链接克隆到pET32a质粒的NdeI和BamHI酶切位点之间，构建好的质粒如图1所示。将上述质粒通过NdeI和BamHI酶切得到表达序列，通过连接酶连接到表达载体pDEST-15相应的酶切位点中间，得到表达GLP-1类似物的表达载体，构建好的质粒如图2所示。
将表达载体通过热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，由于构建好的质粒带有氨苄青霉素抗性，通过抗性平板筛选，得到表达GLP-1类似物的基因工程菌。
实施例2
构建一种表达人胰高血糖素-1类似物的基因工程菌：含有TrxA-EK-Arg34-GLP-1(9-37)的基因工程菌，此处TrxA为硫氧还蛋白。
首先合成Arg34-GLP-1(9-37)多肽的基因序列，在其5’端添加EK酶切位点对应的核酸序列以及KpnI酶切位点，在其3’端添加终止子以及BamHI酶切位点，具体如下：
GGTACCGACGACGACGACAAGACTTTCACTTCTGACGTTTCTTCTTACTTGGAGGGTCAAGCTGCTAAGGAGTTCATTGCTTGGTTGGTTAGGGGTAGAGGATGAAAGCTT
由基因合成服务公司合成上述序列，并克隆在克隆载体pUC32上。抽提该质粒，通过KpnI和BamHI双酶切，将合成的基因片段从质粒上酶切下来。TrxA蛋白的基因来自于pET32a质粒。具体得，设计引物通过PCR得到TrxA基因片段,并在片段两端添加NdeI和KpnI酶切位点；将扩增片段通过拓扑异构酶连接到T载体上，将该载体转化大肠杆菌Top1，摇菌抽提质粒通过NdeI和KpnI双酶切得到TrxA基因片段。将上述酶切得到的多肽基因片段和TrxA基因片段通过酶切链接克隆到pET32a质粒的NdeI和BamHI酶切位点之间。
将上述质粒通过NdeI和BamHI酶切，将酶切片段连接到表达载体pDEST-15相应的酶切位点中间，得到表达Arg34-GLP-1(9-37)多肽的表达载体。
将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，通过抗性平板筛选，得到表达Arg34-GLP-1(9-37)多肽的基因工程菌。
实施例3
构建一种表达人胰高血糖素-1的基因工程菌：含有TrxA-EK-Arg34-GLP-1(11-37)的基因工程菌，此处TrxA为硫氧还蛋白。其构建方法同实施例1和2。
实施例4
构建一种表达人胰高血糖素-1的基因工程菌：含有DsbA-EK-GLP-1的基因工程菌，此处DsbA为二硫键形成蛋白A。
首先合成Arg34-GLP-1(11-37)多肽的基因序列，在其5’端添加EK酶切位点对应的核酸序列以及KpnI酶切位点，在其3’端添加终止子以及BamHI酶切位点，具体如下：
GGTACCGACGACGACGACAAGACTTTCACTTCTGACGTTTCTTCTTACTTGGAGGGTCAAGCTGCTAAGGAGTTCATTGCTTGGTTGGTTAGGGGTAGAGGATGAAAGCTT
将该序列克隆到pET39a载体的KpnI和BamHI酶切位点之间。如此利用pET39a载体原有序列，可以在Arg34-GLP-1(11-37)上游融合DsbA蛋白。
将上述质粒通过NdeI和BamHI酶切，克隆到表达载体pDEST-15相应的酶切位点中间，得到表达Arg34-GLP-1(11-37)的表达载体。
将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，通过抗性平板筛选，得到表达Arg34-GLP-1(11-37)的基因工程菌。
实施例5
取实施例1(其它构建的菌种可同样处理)中构建好的基因工程菌，进行高密度发酵，离心后获得菌体，10L发酵液可得1kg湿菌。菌体按照1:10重悬于100mM Tris-HCl pH8.5的缓冲液中，匀浆破菌后收集上清液。上清液加入硫酸铵沉淀蛋白，收集蛋白沉淀，用20mMTris-HCl pH8.5溶解，然后用Q-FF离子交换层析纯化出融合蛋白，纯化出的融合蛋白约为10g/L发酵液，纯度大于90％，见附图3。
实施例6
实施例5经Q-FF纯化后得到的融合蛋白，加入10X切割缓冲液，然后加入肠激酶进行酶切。酶切温度2-8°，酶切时间4-12h，酶切效率大于95％，见附图4(RP-HPLC)和5(SDS-PAGE)。酶切结束后加入20％无水乙醇，调节pH至4.5，静置过夜后，收集沉淀即为Arg34-GLP-1(7-37)，其中Arg34-GLP-1(7-37)的收率大于90％。
实施例7
Arg34-GLP-1(7-37)体外活性测定
根据本公司专利CN201410079787.5，采用RIN-m5f细胞测定Arg34-GLP-1(7-37)的体外活性。将RIN-m5f培养于96孔板中，培养一定时间后，加入对照品以及Arg34-GLP-1(7-37)粗品，继续培养一段时间后，采用Promega试剂盒，测定细胞内cAMP水平。结果显示(附图6)，Arg34-GLP-1(7-37)粗品具有70％左右的体外活性。

Claims (10)

1.一种融合基因，所述的融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为伴侣蛋白基因，B为编码包含酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为编码GLP-1或其类似物的基因；
所述融合基因中，A部分的伴侣蛋白基因可选自TrxA、DsbA、DsbC、Sumo、GST，Intein等；
B部分的酶切位点连接肽可选自肠激酶、凝血酶、SUMO Protease等；
C部分为编码GLP-1或其类似物的基因序列，所述的GLP-1或其类似物可选自GLP-1(7-37),GLP-1(8-37),GLP-1(9-37),GLP-1(10-37),GLP-1(11-37),GLP-1(12-37),GLP-1(13-37),GLP-1(14-37),GLP-1(15-37)或GLP-1多肽类似物,包括:
Arg34-GLP-1(7-37),Arg26-GLP-1(7-37),Lys36-GLP-1(7-37),Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40),Arg26Lys36-GLP-1(7-37),Arg34Lys36-GLP-1(7-37),Arg26Lys39-GLP-1(7-39),Arg34Lys40-GLP-1(7-40),Arg26,34Lys36 ,39-GLP-1(7-39),Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40),Gly8Arg26-GLP-1(7-37),Gly8Arg34-GLP-1(7-37),Gly8Lys36-GLP-1(7-37),Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37),Gly8Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39),Gly8Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40),Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37),Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37),Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39),Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40),Gly8Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39),Gly8Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40),Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(7-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(7-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(7-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(7-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(7-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(1-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(1-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(1-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(1-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(1-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(1-43),Arg26, 34Lys44-GLP-1(1-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(1-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(2-38),Arg26, 34Lys39-GLP-1(2-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(2-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(2-41),Arg26, 34Lys42-GLP-1(2-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(2-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(2-44),Arg26, 34Lys45-GLP-1(2-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(3-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(3-39),Arg26, 34Lys40-GLP-1(3-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(3-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(3-42),Arg26, 34Lys43-GLP-1(3-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(3-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(3-45),Arg26, 34Lys38-GLP-1(4-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(4-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(4-40),Arg26, 34Lys41-GLP-1(4-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(4-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(4-43),Arg26, 34Lys44-GLP-1(4-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(4-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(5-38),Arg26, 34Lys39-GLP-1(5-39),Arg26,34Lys40-GLP-1(5-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(5-41),Arg26, 34Lys42-GLP-1(5-42),Arg26,34Lys43-GLP-1(5-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(5-44),Arg26, 34Lys45-GLP-1(5-45),Arg26,34Lys38-GLP-1(6-38),Arg26,34Lys39-GLP-1(6-39),Arg26, 34Lys40-GLP-1(6-40),Arg26,34Lys41-GLP-1(6-41),Arg26,34Lys42-GLP-1(6-42),Arg26, 34Lys43-GLP-1(6-43),Arg26,34Lys44-GLP-1(6-44),Arg26,34Lys45-GLP-1(6-45),Arg26Lys38-GLP-1(1-38),Arg34Lys38-GLP-1(1-38),Arg26,34Lys36,38-GLP-1(1-38),Arg26Lys38-GLP-1(7-38),Arg34Lys38-GLP-1(7-38),Arg26,34Lys36,38-GLP-1(7-38),Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38),Arg26Lys39-GLP-1(1-39),Arg34Lys39-GLP-1(1-39),Arg26,34Lys36,39-GLP-1(1-39),Arg26Lys39-GLP-1(7-39),Arg34Lys39-GLP-1(7-39)或Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39)。
2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因中，A部分的伴侣蛋白为TrxA蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.8所示，编码基因的序列如Seq ID No.7所示。
3.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因中，B部分酶切位点连接肽为肠激酶酶切位点连接肽，其氨基酸序列如Seq ID No.6所示，编码基因的序列如Seq IDNo.5所示。
4.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因中，C部分的GLP-1或其类似物为Arg34-GLP-1(7-37)；其中，Arg34-GLP-1(7-37)的基因序列和氨基酸序列分别如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。
5.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因的DNA序列如SEQ IDNo.9所示。
6.权利要求1-5任一项所述的融合基因编码的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
8.一种生产重组GLP-1多肽或其类似物的方法，所述方法包括如下的步骤：
(1)、在保持各自基因密码子阅读框架不变的前提下，构建具有权利要求1所述结构的融合基因：A-B-C，其中A部分为编码伴侣蛋白的核苷酸序列，B为编码蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为GLP-1多肽或其类似物基因；
(2)、将上述的A-B-C融合基因序列连接到表达载体，将表达载体转化导入大肠杆菌中，经筛选得到重组基因工程菌；
(3)、高密度发酵重组大肠杆菌，经诱导表达获得融合蛋白，加入蛋白酶切，经分离纯化获得重组GLP-1多肽或其类似物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(2)的表达载体为pET系列载体或pDEST系列载体。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)的宿主为大肠杆菌宿主，宿主可选自BL21、T7Express、BL21等。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109589406A (zh) * 2018-12-28 2019-04-09 中国医学科学院医学生物学研究所 一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗及其制备方法
CN109628479A (zh) * 2018-12-25 2019-04-16 天津农学院 一种胰高血糖素样肽-1的重组表达方法
CN110092825A (zh) * 2019-05-06 2019-08-06 山东汉泰生物科技有限公司 一种利用基因重组制备利拉鲁肽中间体多肽的方法
WO2019153827A1 (zh) * 2018-02-06 2019-08-15 美药星（南京）制药有限公司 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法
CN110498849A (zh) * 2019-09-16 2019-11-26 南京迪维奥医药科技有限公司 一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法
CN111378027A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 万新医药科技(苏州)有限公司 一种索玛鲁肽前体的制备方法
CN111763679A (zh) * 2019-05-22 2020-10-13 杭州杰迪生物科技有限公司 一种胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞
CN113278061A (zh) * 2021-06-22 2021-08-20 南京林业大学 一种生物化学法制备索马鲁肽的方法
CN113416683A (zh) * 2021-06-01 2021-09-21 南昌大学 一种大肠杆菌Nissle 1917基因工程菌及其制备方法和应用
WO2021249564A1 (zh) * 2020-06-11 2021-12-16 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种索玛鲁肽衍生物及其制备方法和应用
WO2022012020A1 (zh) * 2020-07-17 2022-01-20 安徽新熙盟生物科技有限公司 Glp-1类似物多肽的制备方法及在ⅱ型糖尿病中应用
CN114075272A (zh) * 2020-08-10 2022-02-22 杭州俊丰生物工程有限公司 一种人神经调节蛋白4的制备方法
WO2022064517A1 (en) * 2020-09-23 2022-03-31 Dr. Reddy's Laboratories Limited A process for the preparation of semaglutide and semapeptide
CN115850385A (zh) * 2022-07-04 2023-03-28 北京惠之衡生物科技有限公司 一种促表达肽及其应用
WO2023124847A1 (zh) * 2021-12-28 2023-07-06 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效glp-1衍生物

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004029076A2 (en) * 2002-09-25 2004-04-08 Novo Nordisk A/S Purification process comprising microfiltration at elevated temperatures
CN1587385A (zh) * 2004-09-08 2005-03-02 华东师范大学 高效表达人胰高血糖素样肽－1的基因工程菌及其构建方法和应用
WO2005028516A2 (en) * 2003-09-19 2005-03-31 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
CN101328221A (zh) * 2008-04-14 2008-12-24 中国药科大学 一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途
CN102108097A (zh) * 2009-12-29 2011-06-29 华东师范大学 一种新型glp-1衍生物
CN102134274A (zh) * 2010-01-25 2011-07-27 华东师范大学 tGLP-1衍生物及其制备和应用
CN102212127A (zh) * 2011-05-17 2011-10-12 成都因尔美科技有限公司 胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物及其制备方法和用途
CN102660491A (zh) * 2012-05-18 2012-09-12 华东师范大学 高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌及其构建方法和应用
CN103709253A (zh) * 2013-12-20 2014-04-09 南开大学 一种生物合成制备glp-1及其类似物的方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004029076A2 (en) * 2002-09-25 2004-04-08 Novo Nordisk A/S Purification process comprising microfiltration at elevated temperatures
WO2005028516A2 (en) * 2003-09-19 2005-03-31 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
CN1587385A (zh) * 2004-09-08 2005-03-02 华东师范大学 高效表达人胰高血糖素样肽－1的基因工程菌及其构建方法和应用
CN101328221A (zh) * 2008-04-14 2008-12-24 中国药科大学 一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途
CN102108097A (zh) * 2009-12-29 2011-06-29 华东师范大学 一种新型glp-1衍生物
CN102134274A (zh) * 2010-01-25 2011-07-27 华东师范大学 tGLP-1衍生物及其制备和应用
CN102212127A (zh) * 2011-05-17 2011-10-12 成都因尔美科技有限公司 胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物及其制备方法和用途
CN102660491A (zh) * 2012-05-18 2012-09-12 华东师范大学 高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌及其构建方法和应用
CN103709253A (zh) * 2013-12-20 2014-04-09 南开大学 一种生物合成制备glp-1及其类似物的方法

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019153827A1 (zh) * 2018-02-06 2019-08-15 美药星（南京）制药有限公司 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法
US10851146B2 (en) 2018-02-06 2020-12-01 Amphastar Nanjing Pharmaceuticals Inc. Method for preparing liraglutide intermediate polypeptide
CN109628479A (zh) * 2018-12-25 2019-04-16 天津农学院 一种胰高血糖素样肽-1的重组表达方法
CN109589406B (zh) * 2018-12-28 2022-06-03 中国医学科学院医学生物学研究所 一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗及其制备方法
CN109589406A (zh) * 2018-12-28 2019-04-09 中国医学科学院医学生物学研究所 一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗及其制备方法
CN111378027A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 万新医药科技(苏州)有限公司 一种索玛鲁肽前体的制备方法
CN110092825A (zh) * 2019-05-06 2019-08-06 山东汉泰生物科技有限公司 一种利用基因重组制备利拉鲁肽中间体多肽的方法
CN111763679A (zh) * 2019-05-22 2020-10-13 杭州杰迪生物科技有限公司 一种胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞
CN110498849A (zh) * 2019-09-16 2019-11-26 南京迪维奥医药科技有限公司 一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法
WO2021249564A1 (zh) * 2020-06-11 2021-12-16 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种索玛鲁肽衍生物及其制备方法和应用
WO2022012020A1 (zh) * 2020-07-17 2022-01-20 安徽新熙盟生物科技有限公司 Glp-1类似物多肽的制备方法及在ⅱ型糖尿病中应用
CN114075272A (zh) * 2020-08-10 2022-02-22 杭州俊丰生物工程有限公司 一种人神经调节蛋白4的制备方法
CN114075272B (zh) * 2020-08-10 2023-09-22 杭州俊丰生物工程有限公司 一种人神经调节蛋白4的制备方法
WO2022064517A1 (en) * 2020-09-23 2022-03-31 Dr. Reddy's Laboratories Limited A process for the preparation of semaglutide and semapeptide
CN113416683A (zh) * 2021-06-01 2021-09-21 南昌大学 一种大肠杆菌Nissle 1917基因工程菌及其制备方法和应用
CN113278061A (zh) * 2021-06-22 2021-08-20 南京林业大学 一种生物化学法制备索马鲁肽的方法
CN113278061B (zh) * 2021-06-22 2024-04-09 南京林业大学 一种生物化学法制备索马鲁肽的方法
WO2023124847A1 (zh) * 2021-12-28 2023-07-06 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效glp-1衍生物
CN115850385A (zh) * 2022-07-04 2023-03-28 北京惠之衡生物科技有限公司 一种促表达肽及其应用

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