CN111378027A - 一种索玛鲁肽前体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种索玛鲁肽前体的制备方法，本发明采用基因重组技术，与化学合成相比，减少了杂质的产生，纯度和收率相对较高；其主要的步骤包括：首先利用基因重组技术将带有GLP‑1(9‑37)基因序列且为串联表达序列的质粒导入到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，构建重组工程菌，经过高密度发酵诱导后获得表达GLP‑1(9‑37)的串联表达蛋白，后进过变性、复性酶切、纯化等步骤后得到索玛鲁肽前体GLP‑1(9‑37)。

Description

一种索玛鲁肽前体的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种索玛鲁肽前体的制备方法。

背景技术

索玛鲁肽(Semaglutide)是一种通过基因重组技术生产的GLP-1类似物，与人GLP-1具有较高的氨基酸序列同源性，与天然的GLP-1不同的在于索玛鲁肽在人体中的药代动力学以及药效动力学两方面更适用于每周一次的给药方案，其有较高的药物稳定性。当索玛鲁肽药物进行皮下注射后，其主要通过如下机理来延长药物的作用时间：一是通过药物蛋白的交联作用使其吸收能够减慢，二是能够与白蛋白结合，同时对DPP-Ⅳ等酶类等具有较为稳定的防止降解的能力，从而能管理具有较长的血浆内半衰期。在2型糖尿病患者中，其临床给药表现为单次给药索玛鲁肽可以检测到胰岛素分泌率以葡萄糖浓度依赖的模式的增加。目前索玛鲁肽作为新型的GLP-1类似物药物，具有较好的半衰期，能够降低糖尿病患者的给药次数，经济负担以及降低患者的给药痛苦。

索玛鲁肽作为胰高血糖素肽GLP-1类似物的较为先进的药物之一，在美国地区作为2型糖尿病患者经二甲双胍单药或其他抗糖尿病口服药物治疗失败后的二三线药物使用。其所展示的多个临床试验研究证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖，并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。

索玛鲁肽由诺和诺德公司开发研制，通过基因从组计技术，利用酿酒酵母发酵生产获得索玛鲁肽的结构如下：

H-7His-8Aib-9Glu-10Gly-11Thr-12Phe-13Thr-14Ser-15Asp-16Val-17Ser-18Ser-19Tyr-20Leu-21Glu-22Gly-23Gln-24Ala-25Ala-26Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid Mono-tert-butylester)-27Glu-28Phe-29Ile-30Ala-31Trp-32Leu-33Val-34Arg-35Gly-36Arg-37Gly-OH。

由以上结构式可知：索玛鲁肽分子式为C₁₈₇H₂₉₁N₄₅O₅₉，分子量为4113.57，是在天然GLP-1分子结构上更换了1个氨基酸(第34位的赖氨酸改为了精氨酸)，第8为的丙氨酸改为了非天然氨基酸Aib，并在26位赖氨酸接上AEEA、谷氨酸和十八烷酸脂肪链，即由多肽GLP-1(9-37)，His-Aib和AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid Mono-tert-butylester三部分组成，现有技术中中间体多肽GLP-1(9-37)的合成方法主要采用化学合成添加，但存在收率低，纯度不高的缺点。

发明内容

本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种索玛鲁肽前体的制备方法；通过基因重组技术，利用大肠杆菌高密度发酵诱导表达获得GLP-1串联表达蛋白包涵体，后经过变复性、酶切、分离等操作获得多肽片段GLP-1(9-37)。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种用于合成索玛鲁肽前体多肽GLP-1的串联形式蛋白，包含SEQ IDNo.1所述的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码所述融合蛋白的基因，包含SEQ No.2所述的DNA序列。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体，所述重组载体，将所述编码基因插入质粒Pet-27b(+)相应酶切位点。

本发明还提供一种包含所述编码基因的工程菌。

本发明还提供了一种利用所述编码基因合成索玛鲁肽前体多肽的方法，包括以下步骤：

步骤1，合成编码基因，所述编码基因包含SEQ ID No.2所述的DNA序列，并将该基因序列连接到表达载体pET-27b(+)中，并将含有此编码基因表达载体转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，构建重组工程菌；

步骤2，所筛选的重组工程菌经过发酵诱导表达包涵体形式的串联表达索玛鲁肽前体；

步骤3，菌体破碎收集包涵体、包涵体洗涤、变复性经过酶切纯化后获得多肽索玛鲁肽前体GLP-1(9-37)。

优选地，将所述步骤1中表达载体的连接方式为：通过NdeI/XhoI酶切位点插入到质粒pET-27b(+)相应酶切位点中。

优选地，所述步骤2中重组基因工程菌的发酵采取高密度发酵；具体培养方式为：接种所得基因工程菌于10mL LB培养基中，30℃200rpm振荡过夜培养至OD₆₀₀＝12～15后，按照0.8％(v/v)比例转接培养后的菌液至100mL LB培养基中，振荡培养至OD₆₀₀＝4时将摇瓶培养菌种接入到2.5L的发酵培养基中进行高密度发酵罐培养；初始发酵温度为30℃，搅拌速度200rpm，通气量为2L/min，pH为6.7，之后随着培养提高搅拌转速与通气量最大分别至800rpm和8L/min以维持培养过程中的溶解氧始终保持在30％以上，搅拌转速和空气流量达到上线后，溶解氧快速上升后，开始流加补料，此时培养pH为6.9，当补料6h后，控制温度30℃，加入异丙基硫代半乳糖苷进行8h的补料诱导后离心获取菌体。

优选地，所述步骤3的具体步骤为：将串联表达的索玛鲁肽前包涵体用0.5M Tris-HCl pH 8.5的缓冲液搅拌均匀后加入0.5％的SDS以及1％的Triton X-100，室温下用磁力搅拌器搅拌3-4小时，使沉淀缓慢溶解；4℃，10000rpm离心10min，弃沉淀；将所得上清使用使用去离子水稀释10倍，然后使用0.22μm微孔滤膜过滤后得到可溶性蛋白；复性后的可溶蛋白经过KEX2酶以及羧肽酶B(1:100)在室温下酶解16h后即可得到索玛鲁肽前体的混合液。混合液使用阴离子交换以及反向填料分离即可获得纯化符合要求的索玛鲁肽前体。阴离子纯化条件：缓冲液A-25mM Tris-HCl pH 8.5，缓冲液B-A+1M NaCl,线性梯度洗脱20CV。反相纯化的纯化条件：缓冲液A-50mM磷酸三乙胺缓冲液pH 2.17，缓冲液B-ACN，线性梯度洗脱8CV。

相对于现有技术，本发明的优点如下，

本发明是索玛鲁肽前体体外原核表达实践中的一种技术革新，具体涉及一种索玛鲁肽前体蛋白原核串联表达包涵体的变复性方法，其能够有效提升包涵体的变复性效率达95％以上并获得可溶性蛋白；本发明利用棉麻基因合成索玛鲁肽前体的串联表达方法，收率高、纯度高。

附图说明

图1是诱导前后电泳图；图中，泳道1：重组蛋白高密度发酵诱导前；2：重组蛋白高密度发酵诱导2h；3：重组蛋白高密度发酵诱导4h；4：重组蛋白高密度发酵诱导6h；5：重组蛋白高密度发酵诱导8h；6：重组蛋白高密度发酵诱导10h；

图2是酶切前后电泳图；图中，泳道1：串联表达蛋白复性产物；2：复性蛋白KEX2/CPB酶切产物；

图3是酶切前HPLC检测图；

图4是酶切后HPLC检测图；

图5是酶切后混合液阴离子纯化图谱；

图6是阴离子纯化HPLC检测图；

图7是酶切后反相纯化图谱；

图8是反相纯化HPLC检测图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂供应商处购买得到的。

实施例1：

重组工程菌的构建

利用全基因组合成技术将串联表达的索玛鲁肽前体基因与质粒pET-27b(+)整合获得序列cDNA，其限制性酶切位点为NdeI/XhoI，诱导表达电泳图如图1所示，重组质粒通过化学转化发转化到宿主大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，构建重组工程菌。经测序，工程菌序列与设计序列一致。

酶和试剂：

实施例中设计分子生物学操作所用的限制性内切酶够自于TAKARA公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

实施例中所涉及的编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列的合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。表达菌株BL21(DE3)购自MERCK。

培养基：

LB抗性培养基为相应培养基加相应抗生素或遗传霉素，如：Ampicillin。

将合成后的基因序列连接产物使用CaCl₂化学转化法转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中，操作步骤如下：

用接种环挑取少量大肠杆菌，用划线法接种到LB培养基上，在37℃恒温培养箱内过夜培养，从平板上挑单菌落接种到新配制的LB液体培养基中，用37℃、200r/min的摇床培养，使用紫外分光光度计检测菌悬液的OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值在0.2-0.5之间时，放置冰中中止生长。用移液枪取上述大肠杆菌悬液1mL置于离心管中，4℃，4000r/min条件下离心5min，弃上清液；向离心管中分别加入100μL预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂，用移液枪吹吸混匀，切勿剧烈振荡，4000r/min，4℃条件下离心5min，弃上清液；

向离心管中分别加入预冷的100μL 0.1mol CaCl₂-MgCl₂，用移液枪吹打混匀沉淀，不可剧烈振荡，将重组后的质粒和大肠杆菌BL21(DE3)感受态冰浴20min后，42℃热击45s，并使用LB培养基后培养1h后，转化涂布于含有氨苄霉素(100mg/L)LB平板中，培养过夜后挑选阳性克隆，提取质粒双酶切并验证构建的重组质粒。

实施例2：

高密度发酵以及诱导表达

将上述实施例1中所挑选的阳性重组工程菌按照1％接种量接种于10mL LB液体培养基中，30℃ 200rpm培养至OD600＝12～15，待菌体生长起来后，将其按照0.8％接种量接种于100mL LB液体培养基中，30℃ 200rpm振荡培养，待OD₆₀₀约为4的过程中，接入到2.5L的发酵培养基中进行高密度培养。初始发酵温度为34℃，搅拌速度为200rpm,通气量为2L/min，pH为6.7，之后不断提高搅拌转速与通气量最大至800rpm和8L/min以维持溶解氧始终在30％以上，因为高密度发酵需要大量的洋气，若洋气供应不足，不仅会一直菌体呼吸作用，限制菌体生产繁殖，然且会积累部分有些代谢产物，引起菌体死亡，抑制蛋白表达，降低目标蛋白的表达量。因此，高密度培养过程中必须保证足够的氧气供应，DO溶解氧比例不能低于30％，但是也不能太高，过高的溶解氧会产生菌体溶解氧中毒，使菌体提前裂解死亡。当搅拌转速和空气流量达到上限后，若溶解氧快速上升时，进行6h流加补料，控制温度在34℃、pH6.9左右，溶解氧30％以上，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行6h的诱导后，出罐，出罐后离心得到菌体湿重145g/L。

本实施例的培养基配方及pH调节剂如下：

LB培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉：15g/L，氯化钠10g/L；

发酵培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉：30g/L，磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二钠4g/L，硫酸铵6g/L，二水氯化钙0.02g/L，七水硫酸镁10g/L。

补料培养基：酵母粉：20g/L，葡萄糖：30g/L；

pH调节剂：30％磷酸，30％氨水。

实施例3：

重组串联表达索玛鲁肽前体的变复性

将实施例2中诱导表达后的工程菌培养基离心，取菌体，按照1:10(w:v)比例加入破碎缓冲液，采用ATS均质机850bar，40Hz的频率破菌两次，8500rpm离心30min，收集包涵体。所得串联表达的索玛鲁肽前包涵体用0.5M Tris-HCl pH 8.5的缓冲液搅拌均匀后加入0.5％的SDS以及1％的Triton X-100配得溶液比例为4％(w:v)的蛋白混合液,室温下用磁力搅拌器搅拌蛋白混合溶液3-4小时，使沉淀缓慢溶解；4℃，10000rpm离心10min，弃沉淀。将所得上清使用使用去离子水稀释10倍，然后使用0.22μm微孔滤膜过滤后得到可溶性蛋白。

本实施例中所使用的各种缓冲液配方如下：

破碎缓冲液：25mM Tris-HCl+5mM EDTApH 8.5

包涵体溶解缓冲液：0.5M Tris-HCl+0.5％SDS+1％Triton X-100pH 8,5

实施例4：

索玛鲁肽前体的纯化

实施例3中所得到的可溶性蛋白混合液稀释到蛋白溶液0.1mg/mL，在复性缓冲液中加入KEX2以及羧肽酶B按照1:100(w:w)在30℃下酶切16h后即可得到索玛鲁肽前体以及连接肽等混合液，酶切SDS-PAGE图谱如图2所示，酶切前后HPLC电泳图谱如图3、4所示。混合液使用阴离子交换以及反向填料分离后即可获得纯度符合要求的索玛鲁肽前体样品，所获得样品经质谱结果确定。阴离子纯化条件：缓冲液A-25mM Tris-HCl pH 8.5，缓冲液B-A+1MNaCl,线性梯度洗脱20CV，阴离子纯化图谱如图5所示，HPLC检测图谱如图6所示。反相纯化的纯化条件：缓冲液A-50mM磷酸三乙胺缓冲液pH 2.17，缓冲液B-ACN，线性梯度洗脱8CV，反相纯化图谱如图7所示，HPLC检测图谱如图8所示。

SEQ ID No.1

优化后的串联表达索玛鲁肽前体氨基酸PRT人工序列(99aa)：

MRLNSAKREGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRGKREGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA

WLVRGRGKREGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG

SEQ ID No.2

优化后的串联表达索玛鲁肽前体核酸DNA人工序列(297bp)：

(NdeI)ATGCGTCTGAACAGCGCGAAGCGTGAGGGTACCTTCACCAGCGATGTGAGCAGCTACCTGGAGGGTCAGGCGGCGAAGGAATTCATCGCGTGGCTGGTGCGTGGTCGTGGCAAACGTGAAGGTACCTTTACCAGCGATGTTAGCAGCTATCTGGAGGGCCAAGCGGCGAAGGAATTCATTGCGTGGCTGGTTCGCGGTCGTGGCAAACGTGAGGGTACCTTTACCAGCGACGTTAGCAGCTACCTGGAGGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTTATTGCGTGGCTGGTTCGTGGCCGCGGT(XhoI)

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 万新医药科技(苏州)有限公司

江苏万邦医药科技有限公司

江苏万邦生化医药集团有限责任公司

<120> 一种索玛鲁肽前体的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 99

<212> PRT

<213> 1(人工序列)

<400> 1

Met Arg Leu Asn Ser Ala Lys Arg Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val

1 5 10 15

Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu

20 25 30

Val Arg Gly Arg Gly Lys Arg Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser

35 40 45

Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val

50 55 60

Arg Gly Arg Gly Lys Arg Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg

85 90 95

Gly Arg Gly

<210> 2

<211> 297

<212> DNA

<213> 2(人工序列)

<400> 2

atgcgtctga acagcgcgaa gcgtgagggt accttcacca gcgatgtgag cagctacctg 60

gagggtcagg cggcgaagga attcatcgcg tggctggtgc gtggtcgtgg caaacgtgaa 120

ggtaccttta ccagcgatgt tagcagctat ctggagggcc aagcggcgaa ggaattcatt 180

gcgtggctgg ttcgcggtcg tggcaaacgt gagggtacct ttaccagcga cgttagcagc 240

tacctggagg gccaggcggc gaaagagttt attgcgtggc tggttcgtgg ccgcggt 297

Claims (10)

1.一种蛋白质，其特征在于，包含如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。

2.一种编码如权利要求1所述蛋白质的编码基因，其特征在于，包含如SEQ ID No.2所述的DNA序列。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，将所述编码基因插入质粒pET-27b(+)相应的酶切位点中。

5.一种包含如权利要求2所述编码基因的重组工程菌。

6.权利要求2所述编码基因在合成索玛鲁肽中间体多肽中的应用。

7.权利要求6中所述的应用，其特征在于，包含如下步骤：

(1)合成编码基因，所述编码基因包含SEQ ID No.2所述的DNA序列；

(2)将编码基因连接到表达载体中；

(3)将带有编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组工程菌；

(4)重组工程菌发酵诱导表达以包涵体形式存在的串联表达蛋白，所述串联表达蛋白包含SEQ ID No.1所述的氨基酸序列；

(5)菌体破碎收集包涵体、包涵体洗涤、变性和复性；

(6)酶切、分离纯化获得索玛鲁肽前体GLP-1(9-37)。

8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于，所述的步骤(2)中表达载体的连接方式为通过限制性内切酶NdeI/XholI酶切位点插入到质粒pET-27b(+)相应酶切位点中。

9.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中工程菌的发酵采取高密度发酵，诱导表达所用的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷；所得索玛鲁肽前体包涵体的变复性方法，包括以下步骤。

(4.1)将索玛鲁肽前体串联表达的包涵体用0.5M Tris-HCl pH 8.5的缓冲液搅拌均匀后加入0.5％的SDS以及1％的Triton X-100,室温下用磁力搅拌器搅拌3-4小时，使沉淀缓慢溶解；

(4.2)4℃，10000rpm离心10min，弃沉淀；

(4.3)将所得上清使用使用去离子水稀释10倍，然后使用0.22μm微孔滤膜过滤后得到可溶性蛋白。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中的串联表达蛋白，使用相应溶液进行溶解后，使串联表达可溶性蛋白进行变性；使用去离子水稀释复性并经KEX2酶以及羧肽酶B酶切后获得可溶性的串联表达的索玛鲁肽前体，使用阴离子交换以及反向填料分离纯化获得索玛鲁肽前体。

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