CN113502310A - 一种高密度发酵制备司美鲁肽前体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于重组大肠杆菌高密度发酵生产司美鲁肽前体的方法。针对目前发酵生产司美鲁肽表达量低的问题，本发明通过在制备的用于表达司美鲁肽前体的重组大肠杆菌的高密度发酵培养基中显著提高Mg离子浓度，提升发酵培养的诱导OD值至150以上，显著提高了重组大肠杆菌发酵OD值和包涵体菌体生物量，实现了重组工程菌的高密度发酵效果，显著增加了司美鲁肽前体表达量。

Description

一种高密度发酵制备司美鲁肽前体的方法
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一种表达司美鲁肽前体的重组工程菌的高密度发酵方法。
背景技术
随着社会经济的发展，人民生活水平逐步提高，人们的饮食结构发生了巨大变化，也导致肥胖发生率增加，并进一步导致糖尿病患者人数的急剧增加。据统计数据显示，我国糖尿病患者人数超过1亿，同时还有超过1.5亿的隐形糖尿病前期患者。糖尿病已经成为第三大慢性疾病。
糖尿病是由遗传和环境因素长期相互作用导致的复杂的慢性代谢性疾病，是由于胰岛素分泌缺乏导致，以高血糖为特征的疾病，分为I型糖尿病和II型糖尿病。其中，II型糖尿病（T2DM）在我国糖尿病患者中占到了95%以上的比例。
近年来，胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)受体激动剂(GLP-1RAs)逐渐成为治疗T2DM的研究热点。GLP-1通过葡萄糖依赖的方式促进胰岛素的合成和分泌，发挥降糖作用。其不仅具有优异的降糖效果，还有控制体重、调节血脂、改善胰岛β细胞功能等特点，其低血糖等的不良反应率也明显小于其他治疗糖尿病的药物。目前，市场上用于治疗糖尿病的GLP-1药物主要有艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利拉鲁肽和司美鲁肽（又名索玛鲁肽，Semaglutide）。
司美鲁肽(Semaglutide)是由丹麦诺和诺德公司研制的一种新一代GLP-1类似物，是一种长效GLP-1制剂（周制剂）。司美鲁肽与人GLP-1同源性较高，其以天然人GLP-1（7-37）分子为基础，通过替换第8位氨基酸（丙氨酸替换为α-氨基丁酸）和第34位氨基酸（赖氨酸替换为精氨酸），同时在第26位赖氨酸通过间隔基连接C18脂肪二酸侧链得到。司美鲁肽通过上述结构调整，实现了可抵抗二肽基肽酶4降解，并与白蛋白结合而延长体内半衰期，实现一周给药一次的长效效果。目前，诺和诺德也已经推出了司美鲁肽的口服制剂，并且，除了治疗糖尿病外，FDA已批准司美鲁肽用于减肥适应症。
目前，对于司美鲁肽的研究主要集中在其重组工程菌构建、蛋白纯化及制剂方面，对于如何提高司美鲁肽重组工程菌发酵密度、显著提高其表达量的研究鲜有涉及。
高密度发酵是指微生物在液体培养基中密度超过常规10倍以上进行生长发酵的技术，现代高密度发酵主要是在基因工程菌（主要是大肠杆菌）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。提高菌体发酵培养密度，不仅可以减少培养容器体系、培养基的消耗和下游工艺（如分离、纯化等）的效率，还可以缩短生产周期、减少设备投入和增大产能、降低成本，具有重要的工业应用价值。
专利CN111763704A提供了一种提高司美鲁肽及其前体生产菌株发酵密度以提高产量的方法，该专利通过设计新的基础培养基和补料培养基，并通过在发酵过程中添加特定全氟化碳乳液实现高密度发酵方法，并最终将产量提高到12.5μg/ml。但该方法需要用到多种特定成分，且发酵表达量仍有待提高。
为此，本发明针前期构建的表达司美鲁肽前体的重组大肠杆菌工程菌，提供一种高密度发酵方法，极大的提高了菌体发酵密度，提高了目的蛋白表达量，具有良好的产业应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的稳定高表达司美鲁肽前体的重组工程菌及其高密度发酵方法，本发明的构建方法能够显著提高重组工程菌的发酵密度和目的蛋白包涵体及目的蛋白的表达量。
司美鲁肽结构如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由于上述司美鲁肽结构中，其末端序列的二肽为His-Aib（Aib为非天然氨基酸），其无法通过直接发酵表达得到，因此，通常采用构建表达司美鲁肽的除上述二肽外的多肽片段（司美鲁肽前体）的重组工程菌，在通过发酵获得所述司美鲁肽前体后与上述二肽合成得到完整司美鲁肽的肽序列，并通过在上述肽序列的第26位赖氨酸通过间隔基连接C18脂肪二酸侧链得到司美鲁肽原料。
为实现本发明的目的，本发明首先提供一种能够用于高密度发酵的表达司美鲁肽前体的重组工程菌，所述工程菌按照如下方法构建：
（1）合成如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的融合多肽编码基因；
（2）将上述编码基因连接至表达载体中，构建得到含编码基因的重组表达载体；
（3）将构建的重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到所述重组工程菌。
优选地，步骤（2）具体方法为：将上述编码基因序列的5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加终止密码子以及XhoI酶切位点，然后通过酶切克隆到表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间，从而构建得到重组表达载体pET-30a(+)-A1- GLP-1或pET-30a(+)-A2-GLP-1。
进一步优选地，步骤（3）的具体方法为：将重组表达载体pET-30a(+)-A1- GLP-1或pET-30a(+)-A2- GLP-1通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，筛选得到所述重组工程菌。
针对上述方法构建的重组工程菌，本发明进一步提供一种所述重组工程菌的高密度发酵方法。本发明的方法通过在发酵培养基中提高Mg2+量，显著提高重组工程菌诱导OD600值，并通过诱导后的低温发酵表达，从而实现整个发酵菌体密度和产量的显著提升。
因此，本发明提供的高密度发酵方法具体包括如下步骤：
（1）溶液配制
A．氨水配制
纯化水中经灭菌后，无菌条件下加入等体积氨水混匀待用；所述灭菌优选过滤灭菌、高温灭菌，更优选121 ℃灭菌30 min处理。
B．活化培养基
活化培养基组成为胰蛋白胨18-23g/L，酵母浸粉8-12 g/L，氯化钠8-12 g/L，灭菌处理。
优选地，所述活化培养基组成为胰蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠10g/L优选121 ℃灭菌30 min处理。
C．溶液D配制
溶液D组成为七水合硫酸亚铁1-5 g/L，七水合硫酸锌0.2-2 g/L，一水合硫酸锰0.1-1 g/L，四水合钼酸铵0.01-0.6 g/L，五水合硫酸铜(II) 0.02-0.5g/L，磷酸45-50ml/L，灭菌处理。
优选地，所述溶液D组成为七水合硫酸亚铁2-4 g/L，七水合硫酸锌0.5-1g/L，一水合硫酸锰0.3-0.6g/L，四水合钼酸铵0.1-0.2g/L，五水合硫酸铜(II) 0.05-0.15g/L，磷酸45-50ml/L；
更优选地，所述溶液D组成为七水合硫酸亚铁3.36g/L，七水合硫酸锌0.84g/L，一水合硫酸锰0.51g/L，四水合钼酸铵0. 18g/L，五水合硫酸铜(II) 0.12g/L，磷酸48ml/L。所述灭菌可以为过滤除菌等灭菌方式，优选0.22μm滤器过滤除菌。
D．补料培养基
30-50%的葡萄糖和5-25%的酵母浸粉，所述葡萄糖和酵母浸粉具体的浓度、补加速度和补加量根据菌株生长情况确定。
E．发酵培养基
发酵培养基组成为酵母浸粉3-18g/L，一水合柠檬酸0.5-3g/L，硫酸铵3-15g/L，磷酸二氢钾5-12 g/L，无水氯化钙0.001-0.01 g/L，七水合硫酸亚铁0.02-0.1g/L，葡萄糖8-12 g/L，硫酸镁5-15g/L，溶液D 800-1200μl/L，灭菌处理。
优选地，所述培养基组成为酵母浸粉10g/L，一水合柠檬酸1g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，无水氯化钙0.002g/L，七水合硫酸亚铁0.05g/L，葡萄糖10.67g/L，硫酸镁12g/L，溶液D 1000μl/L；所述灭菌优选高温灭菌，更优选为121 ℃灭菌30 min。
（2）菌种活化
一级菌种活化：取冻存重组工程菌，以1:800-1200的比例接种至活化培养基，恒温振荡培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为180-240rpm，培养时间12 ~ 16 h，得到一级活化种子培养液；
二级菌种活化：将培养好的一级活化种子培养液以1:3-6的比例接种至活化培养基中，恒温振荡培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为180-240rpm，培养时间2-4h；得到二级活化种子培养液；
（3）发酵培养
活化菌种接种：将发酵培养基用氨水调节pH至6.7-7.0后，将二级活化种子培养液以1:8-12的比例加入到发酵培养基中，开始发酵；
发酵条件初始设定：温度37.0±1.0℃，空气流量400-600 ml/min，氧气设置0~300 ml/min，，转速设置400-1400 rpm；
发酵过程控制：发酵过程中控制溶氧范围在15% ~ 30%，当OD600值升至150-170时，加入1.0mM的IPTG诱导，诱导后温度降至30±1.0℃，诱导培养22-26h；发酵过程中，当底糖耗尽时开始流加补料培养基。
优选地，步骤（2）中，一级菌种活化条件为：取冻存重组工程菌，以1:1000的比例接种至活化培养基，恒温振荡培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间12 ~16 h，得一级活化种子培养液；
二级菌种活化条件为：将培养好的一级活化种子培养液以1:5的比例接种至活化培养基中，恒温振荡培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间3h；得二级活化种子培养液。
优选地，步骤（3）中发酵培养过程控制如下：
活化菌种接种：发酵培养基用氨水调节pH至6.8后，将二级活化种子培养液以1:10的比例加入到发酵培养基中，开始发酵；
发酵条件初始设定：温度37.0±1.0℃，空气流量500ml/min，纯氧设置0ml/min，转速设置400rpm；
发酵过程控制：发酵过程中通过控制转速和/或纯氧通入将溶氧范围控制在15% ~30%，当OD600值升至160时，加入1.0mM的IPTG诱导，诱导后温度在15-30min内降至30±1.0℃，诱导培养24h；当底糖耗尽时开始流加补料培养基。
本发明在设计得到能够稳定高表达司美鲁肽前体的重组工程菌的基础上，通过在制备的基础发酵培养基中进一步提高Mg2+浓度至5-15g/L、诱导培养温度调整至30℃左右和将诱导OD600值调整至15—170，显著提高了重组工程菌的菌体发酵密度，将OD600发酵密度甚至提高至320以上，菌体发酵生物量提高至340 g/L以上，目标蛋白表达量更是提高至16g/L以上。因此，本发明的方法能够显著提高菌体发酵表达量，降低生产成本，具有极为广阔的工业应用前景。
附图说明
图1为实施例2中发酵方法测得的重组工程菌A2-GLP-1-5生长曲线；
图2为实施例3中发酵方法测得的重组工程菌A2-GLP-1-5生长曲线。
具体实施方式
实施例1：稳定高表达司美鲁肽前体的重组大肠杆菌工程菌的构建
（1）分别合成如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的融合多肽编码基因，并分别在其序列的5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加终止密码子以及XhoI酶切位点；
（2）将步骤（1）制备得到的基因片段分别通过酶切克隆到表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间，从而构建得到2种重组表达载体pET-30a(+)-A1- GLP-1和pET-30a(+)-A2- GLP-1；
（3）将步骤（2）得到的重组表达载体分别通过热击法转化导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，经过抗性筛选单克隆，两种重组工程菌分别挑选8个克隆，分别命名为A1-GLP-1-1至A1-GLP-1-8和A2-GLP-1-1至A2-GLP-1-8，置于甘油中保存。
经测序，本实施例中得到的基因工程菌中的序列与所设计的序列一致。
实施例2：重组大肠杆菌工程菌的高密度发酵（低Mg2+浓度和低OD600诱导值）
（1）溶液配制
A．氨水配制
取300 ml纯化水于补料瓶中，经121 ℃灭菌30 min后，无菌条件下将等体积氨水加入该补料瓶中混匀待用。
B．活化培养基
活化培养基组成为胰蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠10g/L；121 ℃灭菌30min。
C．溶液D配制
溶液D组成为七水合硫酸亚铁3.36g/L，七水合硫酸锌0.84g/L，一水合硫酸锰0.51g/L，四水合钼酸铵0. 18g/L，五水合硫酸铜(II) 0.12g/L，磷酸48ml/L；0.22μm滤器过滤除菌。
D．补料培养基
30-50%的葡萄糖和5-25%的酵母浸粉，所述葡萄糖和酵母浸粉具体的浓度、补加速度和补加量根据菌株生长情况确定。
E．发酵培养基
发酵培养基组成为酵母浸粉10g/L，一水合柠檬酸1g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，无水氯化钙0.002g/L，七水合硫酸铁0.05/L，葡萄糖10.67g/L，硫酸镁0.24g/L，溶液D1000μl/L； 121 ℃灭菌30 min。
（2）菌种活化
一级菌种活化：取实施例1中构建保存的相应重组工程菌50 μl接入到装有50 ml活化培养基的250ml三角瓶中，于恒温振荡器中培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间12 ~ 16 h，至OD600值至4.0-8.0，得一级活化种子培养液；
二级菌种活化：将培养好的一级活化种子培养液40 ml接入到装有200 ml活化培养基的1000 ml三角瓶中，于恒温振荡器中培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间2-5h，至OD600值至3.0 - 4.0；得二级活化种子培养液；
（3）发酵培养
活化菌种接种：将0.8L发酵培养基加入2L发酵罐中，用氨水调节pH至6.8后，将二级活化种子培养液80ml加入到发酵培养基中，开始发酵；
发酵条件初始设定：温度37.0±1.0℃，空气流量500ml/min，氧气设置0ml/min，转速设置400rpm；
发酵过程控制：发酵过程中通过控制转速和通入纯氧速度控制溶氧范围在15% ~30%，当OD600值升至90时，加入1.0mM的IPTG诱导，诱导后20min左右温度降至30±1.0℃，诱导培养至稳定期；发酵过程中，当底糖耗尽时开始流加补料培养基。
（4）发酵过程中样品检测
吸光度检测：补料开始后每2 h取样使用紫外分光光度计检测发酵液OD600值并记录，在添加诱导剂之前取样作为蛋白检测空白对照，并绘制生长曲线。
实施例3：重组大肠杆菌工程菌的高密度发酵
（1）溶液配制
A．氨水配制
取300 ml纯化水于补料瓶中，经121 ℃灭菌30 min后，无菌条件下将等体积氨水加入该补料瓶中混匀待用。
B．活化培养基
培养基组成为胰蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠10g/L；121 ℃灭菌30 min。
C．溶液D配制
溶液D组成为七水合硫酸亚铁3.36g/L，七水合硫酸锌0.84g/L，一水合硫酸锰0.51g/L，四水合钼酸铵0. 18g/L，五水合硫酸铜(II) 0.12g/L，磷酸48ml/L；0.22μm滤器过滤除菌。
D．补料培养基
30-50%的葡萄糖和5-25%的酵母浸膏，所述葡萄糖和酵母浸膏具体的浓度、补加速度和补加量根据菌株生长情况确定。
E．发酵培养基
发酵培养基组成为酵母浸粉10g/L，一水合柠檬酸1g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，无水氯化钙0.002g/L，七水合硫酸铁0.05/L，葡萄糖10.67g/L，硫酸镁12g/L，溶液D1000μl/L；121 ℃灭菌30 min。
（2）菌种活化
一级菌种活化：取实施例1中构建保存的相应重组工程菌50 μl接入到装有50 ml活化培养基的250ml三角瓶中，于恒温振荡器中培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间12 ~ 16 h，至OD600值至4.0-8.0，得一级活化种子培养液；
二级菌种活化：将培养好的一级活化种子培养液40 ml接入到装有200 ml活化培养基的1000 ml三角瓶中，于恒温振荡器中培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间2-5h，至OD600值至3.0 - 4.0；得二级活化种子培养液；
（3）发酵培养
活化菌种接种：将0.8L发酵培养基加入2L发酵罐中，用氨水调节pH至6.8后，将二级活化种子培养液80ml加入到发酵培养基中，开始发酵；
发酵条件初始设定：温度37.0±1.0℃，空气流量500ml/min，氧气设置0ml/min，转速设置400rpm；
发酵过程控制：发酵过程中通过控制转速和通入纯氧速度等控制溶氧范围在15%~ 30%，当OD600值升至160时，加入1.0mM的IPTG诱导，诱导后20min左右温度降至30±1.0℃，诱导培养至稳定期；发酵过程中，当底糖耗尽时开始流加补料培养基。
（4）发酵过程中样品检测
吸光度检测：补料开始后每2 h取样使用紫外分光光度计检测发酵液OD600值并记录，在添加诱导剂之前取样作为蛋白检测空白对照，并绘制生长曲线。
实施例2与实施例3发酵方法结果比对分析
为方便对比说明，以实施例中构建的重组工程菌A2-GLP-1-5的数据作为依据，进行比对分析，具体发酵结果如下下表1所示：
表1：重组工程菌A2-GLP-1-5发酵结果对比表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本申请发明人意外发现，对于本发明构建的重组工程菌，在发明人制备的发酵培养基基础上，通过极大增加培养基中Mg2+浓度，可以显著提高重组工程菌进入对数生长期时的OD600值，参见图1和图2。根据菌株生长曲线图可知，本发明方法可以将此进入对数生长期的OD600值显著提高，因此，使得对菌株的诱导可以由90提升至160（实验结果证实，实施例1中构建筛选的16株重组工程菌，均可将其诱导OD600值提升至150以上）。
进而，通过改变发酵培养基中Mg2+浓度和IPTG诱导OD600值，本发明的各株重组工程菌的最终发酵OD600值达到了320以上，发酵菌体生物量提高至340g/L以上，尤其是蛋白表达量更是达到惊人的16g/L以上。对于实施例1中构建的重组工程菌，其使用实施例3中所述方法的目的蛋白表达量相对与实施例2，普遍提高了1倍左右。而以上述A2-GLP-1-5菌株结果为例，使用实施例3中的方法，其下罐OD600提高46.3%，目的表达量更是提高了2.37倍。
序列表
<110> 北京惠之衡生物科技有限公司
吉林惠升生物制药有限公司
<120> 一种高密度发酵制备司美鲁肽前体的方法
<141> 2021-08-19
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtggt 126

Claims (7)

1.一种高密度发酵培养基，其组成为酵母浸粉3-18g/L，一水合柠檬酸0.5-3g/L，硫酸铵3-15g/L，磷酸二氢钾5-12 g/L，无水氯化钙0.001-0.01 g/L，七水合硫酸铁0.02-0.1g/L，葡萄糖8-12 g/L，硫酸镁5-15g/L，溶液D 800-1200μl/L；
其中，溶液D组成为：七水合硫酸亚铁1-5 g/L，七水合硫酸锌0.2-2 g/L，一水合硫酸锰0.1-1 g/L，四水合钼酸铵0.01-0.6 g/L，五水合硫酸铜II 0.02-0.5g/L，磷酸45-50ml/L。
2.一种利用重组大肠杆菌高密度发酵生产司美鲁肽前体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）溶液配制
A．氨水溶液：纯化水经灭菌后，无菌条件下加入等体积氨水混匀待用；
B．活化培养基：胰蛋白胨18-23g/L，酵母浸粉8-12 g/L，氯化钠8-12 g/L，灭菌处理；
C．溶液D配制：七水合硫酸亚铁1-5 g/L，七水合硫酸锌0.2-2 g/L，一水合硫酸锰0.1-1g/L，四水合钼酸铵0.01-0.6 g/L，五水合硫酸铜II 0.02-0.5g/L，磷酸45-50ml/L，灭菌处理；
D．补料培养基：30-50%的葡萄糖和5-25%的酵母浸粉；
E．发酵培养基：酵母浸粉3-18g/L，一水合柠檬酸0.5-3g/L，硫酸铵3-15g/L，磷酸二氢钾5-12 g/L，无水氯化钙0.001-0.01 g/L，七水合硫酸铁0.02-0.1g/L，葡萄糖8-12 g/L，硫酸镁5-15g/L，溶液D 800-1200μl/L，灭菌处理；
（2）菌种活化
一级菌种活化：取冻存重组大肠杆菌，以1:800-1200的比例接种至活化培养基，恒温振荡培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为180-240rpm，培养时间12 ~ 16 h，得一级活化种子培养液；
二级菌种活化：将培养好的一级活化种子培养液以1:3-6的比例接种至活化培养基中，恒温振荡培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为180-240rpm，培养时间2-4h；得二级活化种子培养液；
（3）发酵培养
活化菌种接种：将发酵培养基用氨水调节pH至6.7-7.0后，将二级活化种子培养液以1:8-12的比例加入到发酵培养基中，开始发酵；
发酵条件初始设定：温度37.0±1.0℃，空气流量400-600 ml/min，氧气设置0~ 300ml/min，转速设置400-1400 rpm；
发酵过程控制：发酵过程中控制溶氧范围在15% ~ 30%，当OD600值升至150-170时，加入IPTG诱导，诱导后温度降至30±1.0℃，诱导培养22-26h；发酵过程中，当底糖耗尽时开始流加补料培养基，并根据菌种发酵生长情况，调整补料培养基的浓度、补加速度和补加量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中菌种活化方法为：
一级菌种活化：取冻存重组大肠杆菌，以1:1000的比例接种至活化培养基，恒温振荡培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间12 ~ 16 h，至菌种OD600值至4.0-8.0，得一级活化种子培养液；
二级菌种活化：将培养好的一级活化种子培养液以1:5的比例接种至活化培养基中，恒温振荡培养，培养温度37.0±1.0℃，转速为220±10rpm，培养时间2-4h，至菌种OD600值至3.0-4.0；得二级活化种子培养液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵培养的方法为：
活化菌种接种：将发酵培养基用氨水调节pH至6.8后，将二级活化种子培养液以1:10的比例加入到发酵培养基中，开始发酵；
发酵条件初始设定：温度37.0±1.0℃，空气流量500ml/min，氧气设置0ml/min，转速设置400 rpm；
发酵过程控制：发酵过程中通过控制转速和/或氧气通入量控制溶氧范围在15% ~30%，当OD600值升至160时，加入1mM的IPTG诱导，诱导后温度降至30±1.0℃，诱导培养24h；发酵过程中，当底糖耗尽时开始流加补料培养基，并根据菌种发酵生长情况，调整补料培养基的浓度、补加速度和补加量。
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌按照如下方法构建：
（1）合成如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的融合多肽编码基因；
（2）将上述编码基连接至表达载体中，构建得到重组表达载体；
（3）将构建的重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到所述重组大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌构建方法的步骤（2）为：将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的编码基因序列的5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加终止密码子以及XhoI酶切位点，然后通过酶切克隆到表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间，从而构建得到重组表达载体pET-30a(+)-A1- GLP-1或pET-30a(+)-A2- GLP-1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）的具体方法为：将所述重组表达载体pET-30a(+)-A1- GLP-1或pET-30a(+)-A2- GLP-1通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，筛选得到所述重组大肠杆菌。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774496A (zh) * 2022-06-21 2022-07-22 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法
CN114774398A (zh) * 2022-06-20 2022-07-22 北京惠之衡生物科技有限公司 一种重组ek酶工程菌的高密度发酵方法
CN114790474A (zh) * 2022-06-23 2022-07-26 北京惠之衡生物科技有限公司 一种索马鲁肽的制备方法
CN115029404A (zh) * 2021-03-04 2022-09-09 珠海联邦制药股份有限公司 用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌高效分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104592381A (zh) * 2013-10-31 2015-05-06 江苏万邦生化医药股份有限公司 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法
CN108191981A (zh) * 2018-02-06 2018-06-22 美药星（南京）制药有限公司 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法
CN111072783A (zh) * 2019-12-27 2020-04-28 万新医药科技(苏州)有限公司 一种采用大肠杆菌表达串联序列制备glp-1或其类似物多肽的方法
CN111378027A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 万新医药科技(苏州)有限公司 一种索玛鲁肽前体的制备方法
CN111763704A (zh) * 2020-06-18 2020-10-13 济南康和医药科技有限公司 一种提高司美鲁肽前体产量及菌体密度的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104592381A (zh) * 2013-10-31 2015-05-06 江苏万邦生化医药股份有限公司 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法
CN108191981A (zh) * 2018-02-06 2018-06-22 美药星（南京）制药有限公司 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法
US20190359675A1 (en) * 2018-02-06 2019-11-28 Amphastar Nanjing Pharmaceuticals Inc. Method for preparing liraglutide intermediate polypeptide
CN111378027A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 万新医药科技(苏州)有限公司 一种索玛鲁肽前体的制备方法
CN111072783A (zh) * 2019-12-27 2020-04-28 万新医药科技(苏州)有限公司 一种采用大肠杆菌表达串联序列制备glp-1或其类似物多肽的方法
CN111763704A (zh) * 2020-06-18 2020-10-13 济南康和医药科技有限公司 一种提高司美鲁肽前体产量及菌体密度的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
储炬等: "《现代生物工艺学 下册》", 31 March 2008, 上海：华东理工大学出版社 *
唐朝晖主编: "《生命科学综合设计实验指南》", 30 September 2018, 武汉：华中科技大学出版社 *
陈理 等: "重组大肠杆菌高密度发酵工艺进展", 《海峡药学》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029404A (zh) * 2021-03-04 2022-09-09 珠海联邦制药股份有限公司 用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌高效分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用
CN115029404B (zh) * 2021-03-04 2024-05-14 珠海联邦制药股份有限公司 用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用
CN114774398A (zh) * 2022-06-20 2022-07-22 北京惠之衡生物科技有限公司 一种重组ek酶工程菌的高密度发酵方法
CN114774496A (zh) * 2022-06-21 2022-07-22 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法
CN114774496B (zh) * 2022-06-21 2022-10-04 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法
CN114790474A (zh) * 2022-06-23 2022-07-26 北京惠之衡生物科技有限公司 一种索马鲁肽的制备方法

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