CN115029404B - 用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用 - Google Patents
用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用。该发酵培养基包括:柠檬酸2.55‑3.4g/L、七水硫酸镁3.5‑4.5g/L、有机氮源15‑36g/L、甘油4.5‑5.5g/L、无水磷酸二氢钾13‑14g/L、无水磷酸氢二铵8‑9g/L、维生素B14‑5 mg/L,微量元素0.8‑1.2mL/L。该发酵培养基克服了突变菌株的生长缺陷,使得菌株能够更好的生长,生长速率达到野生菌水平,实现高密度培养;能显著促进短肽类蛋白的分泌表达,诱导后菌株密度稳定持续增长,发酵周期达40小时,发酵培养基中的目的蛋白得到持续累积。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,具体而言,本发明涉及到一种用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用。
背景技术
大肠杆菌作为成熟的蛋白质表达平台,已大量应用到不同领域中;表达的外源蛋白主要分布在细胞内、周质空间以及胞外。相对于胞内表达,如果能将重组蛋白分泌到周质空间或培养基中将有更大的优势:首先它可以避免重组蛋白在细胞内大量积累而形成包涵体,更进一步的可促进蛋白折叠和加工,获得更高产量和纯度的重组蛋白,并大大简化了下游分离纯化的步骤,降低生产成本。
分泌表达重组蛋白一般会通过表达信号肽或融合定位在周质空间的蛋白,使外源蛋白成功分泌到大肠杆菌周质空间,但重组蛋白依然只有小部分能穿透细胞外膜,分泌到细胞外。原因是大肠杆菌缺乏有效的胞外分泌机制,大多数外源蛋白无法分泌到培养基中。重组蛋白的分泌目前使用的多种遗传学方法包括:改造转运路径,融合表达能直接分泌到胞外的蛋白片段,融合表达外膜蛋白或渗透压诱导的蛋白。此外,共表达促裂解蛋白比如细菌素释放蛋白或大肠杆菌素蛋白也能改变大肠杆菌细胞外膜的通透性,从而使周质空间蛋白释放到培养基中。
同时,许多发酵技术也被用于目标蛋白的胞外表达,如改变培养基组成、温度(Mohedano A F,Fernandez J,Gaya P,et al.Effect of pH,temperature and cμLturemedium composition on the production of an extracellμLar cysteine proteinaseby Micrococcus sp.INIA 528[J].Journal of applied microbiology,1997,82(1):81-86.),钙离子和添加诸如甘氨酸和其他补充试剂(Yang J,Moyana T,MacKenzie S,etal.One Hundred Seventy-Fold Increase in Excretion of an FV Fragment-TumorNecrosis Factor Alpha Fusion Protein(sFV/TNF-α)fromEscherichia coli Caused bythe Synergistic Effects of Glycine and Triton X-100[J].Applied andenvironmental microbiology,1998,64(8):2869-2874.)等。据报道,通过发酵控制的方法能使部分重组蛋白分泌到胞外,但是该方法通用性太差,需要对每种重组蛋白的发酵的条件进行针对优化研究(Fu X Y,Tong W Y,Wei D Z.ExtracellμLar production of humanparathyroid hormone as a thioredoxin fusion formin Escherichia coli bychemical permeabilization combined with heat treatment[J].Biotechnologyprogress,2005,21(5):1429-1435.)。所以,在重组蛋白的生产过程中,构建大肠杆菌的渗漏菌株成为了一种可用的重组蛋白胞外分泌方法。所谓的渗漏菌株,它们在外膜上有缺陷,即使用遗传手段改变细胞壁或膜的通透性,从而部分地将周质蛋白释放到发酵培养基中,这是一种非特异性的机制。理论上,遗传工程改造大肠杆菌可导致其细胞外膜或细胞壁缺陷,使其周质空间蛋白部分释放到培养基中。根据报道,大肠杆菌外膜分布着多种膜蛋白,其中分布最为广泛之一的膜蛋白被称为LPP(脂蛋白)。早期研究发现,LPP膜脂蛋白的缺失将会使得大肠杆菌细胞外膜的透性大为增加,从而有利于重组蛋白的跨膜转运至胞外成为可溶性蛋白。
WACKER CHEMIE AG公司通过对大肠杆菌的LPP蛋白进行敲除或LPP蛋白进行突变,并把外源蛋白与信号肽序列相连,构建的重组菌株使用FM4培养基进行发酵,培养基中包括浓度在4mg/L以上的Ca2+或浓度在48mg/L以上的Mg2+,最终实现了大肠杆菌菌株将异源蛋白分泌到发酵培养基中(US 20080254511A1)。然而本实验室研究发现外膜脂蛋白基因的敲除或突变对于菌株的生长有较为明显的影响;使用FM4培养基进行发酵,生长期菌株生长较慢,细胞得率也较低,发酵进行至中后期时,改造的菌株的密度明显下降;可能原因是细胞膜的通透性提高后导致胞内物质的非特异性的外渗,会使得营养利用率下降,菌株生长速率受限;发酵的表达期过程,细胞外膜分泌压力不断提高,进一步降低了细胞外膜的稳定性,导致细胞的裂解死亡;这些问题都大大的降低了外源蛋白的表达积累速率,同时因菌株裂解释放的物质将影响后续的目的蛋白的回收利用。因此,大肠杆菌渗漏菌株,包括LPP外膜蛋白突变或缺失的大肠杆菌菌株,不够健壮,不适合工业化放大生产。在渗漏菌株技术基础上,如果能通过调整培养基成分或调整发酵工艺的常见发酵技术手段,使改造菌株达到野生菌株的生长状态,并获得外源蛋白的高效分泌表达,这将会极大的促进大肠杆菌分泌表达技术的发展,为工业应用打下坚实的基础。
针对现有技术存在的问题,迫切需要开发一种新的培养基配方,使得大肠杆菌渗漏菌株的生长密度达到野生菌水平,诱导过程不会发生菌体裂解,外源蛋白能实现高效分泌表达,最终获得能满足研发和生产所需的培养基配方。
发明内容
本发明为了解决LPP基因敲除或突变的大肠杆菌,在常见的大肠杆菌高密度培养基中,生长期菌株代谢缓慢,细胞密度低,诱导后菌株大量裂解,无法分泌表达短肽类蛋白的问题。为此,本发明提供一种适合该类改造菌株分泌短肽类蛋白的发酵培养基,使该类型的改造菌株生长活力达到野生型菌株的水平,诱导后无明显裂解,并能持续分泌短肽类蛋白。
本发明的另一目的在于提供上述发酵培养基的应用。
本发明通过以下方案实现:
一种用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌表达短肽类蛋白的发酵培养基,包括如下组分:柠檬酸2.55g/L-3.4g/L、七水硫酸镁3.5g/L-4.5g/L、有机氮源15g/L-36g/L、甘油4.5g/L-5.5g/L、无水磷酸二氢钾13g/L-14g/L、无水磷酸氢二铵8g/L-9g/L、维生素B14mg/L-5mg/L,微量元素0.8mL/L-1.2mL/L;优选包括如下组分:柠檬酸2.55g/L-3.4g/L、七水硫酸镁4g/L、有机氮源15g/L-36g/L、甘油5g/L、无水磷酸二氢钾13.3g/L、无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B1 4.5mg/L,微量元素1mL/L;更优选包括如下组分:柠檬酸2.55g/L、七水硫酸镁4g/L、有机氮源18g/L、甘油5g/L、无水磷酸二氢钾13.3g/L、无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B1 4.5mg/L,微量元素1mL/L。
所述的微量元素由以下组分组成:EDTA 16.8g/L-33.6g/L、氯化钴2.3g/L-2.7g/L、一水合硫酸锰12.5g/L-13.5g/L、二水氯化铜1g/L-2g/L、硼酸2.5g/L-3.5g/L、钼酸钠2g/L-3g/L、七水硫酸锌9g/L-10g/L、六水合氯化铁100g/L-120g/L;优选由以下组分组成:EDTA16.8g/L-33.6g/L、氯化钴2.5g/L、一水合硫酸锰12.8g/L、二水氯化铜1.5g/L、硼酸3g/L、钼酸钠2.5g/L、七水硫酸锌9.6g/L、六水合氯化铁110g/L;更优选由以下组分组成:EDTA16.8g/L、氯化钴2.5g/L、一水合硫酸锰12.8g/L、二水氯化铜1.5g/L、硼酸3g/L、钼酸钠2.5g/L、七水硫酸锌9.6g/L、六水合氯化铁110g/L。
所述的有机氮源优选为酵母浸粉和酵母蛋白胨中的至少一种;更优选为酵母浸粉和酵母蛋白胨按质量比2:1配比混合得到的有机氮源。
所述的短肽类蛋白指GLP-1及其类似物、GLP-2及其类似物、胰高血糖素及其类似物、GIP及其类似物等胰腺分泌多肽,这类多肽有类似结构,水解位点相近,因此这类多肽在发酵表达过程中的表达水平应接近。
上述用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌表达短肽类蛋白的发酵培养基在发酵分泌表达短肽类蛋白中的应用,是能表达短肽类蛋白的LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌使用所述的发酵培养基进行发酵。
所述的能表达短肽类蛋白的LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌优选通过如下步骤制备得到:将编码短肽类蛋白的基因转入LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌中得到;更优选通过如下步骤制备得到:将编码短肽类蛋白的基因克隆入原核表达载体中,将得到的重组载体转入LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌中得到。
所述的编码短肽类蛋白的基因具有形如A-B-C-D结构的基因序列,其中A为信号肽基因,B为伴侣蛋白编码基因,C为连接肽编码基因,D为短肽类蛋白编码基因。
所述的信号肽优选为ctg信号肽。
所述的伴侣蛋白优选为HV蛋白。
所述的连接肽优选为DDDDK。
所述的短肽类蛋白优选为胰腺分泌多肽或其类似物;更优选为GLP-1或其类似物、GLP-2或其类似物、胰高血糖素或其类似物、GIP或其类似物;最优选为GLP-1(9-37)。
所述的原核表达载体可选自大肠杆菌常用载体或将tac启动子替换pET载体中的T7启动子得到的载体。
所述的pET载体是pET系列表达载体,优选为pET-28a(+)载体。
所述的LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌优选为将野生型大肠杆菌W3110的膜脂蛋白(LPP)基因序列做敲除或点突变的大肠杆菌。
所述的敲除或点突变是通过同源重组方式进行;更优选为使用氯霉素抗性基因替换LPP基因实现敲除,或是使用氯霉素抗性基因插入LPP基因实现点突变。
所述的发酵优选包括如下步骤:
(1)将种子液接种于所述的发酵培养基中进行发酵;
(2)加入补料,进行补料发酵;
(3)补料发酵至对数生长期末期或稳定期,加入诱导剂诱导培养,进行外源蛋白表达。
步骤(1)中所述的种子液优选通过如下步骤制备得到:将能表达短肽类蛋白的LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌接种于LB培养基中,进行摇瓶培养。
所述的接种量优选为体积百分比5-10%。
所述的摇瓶培养的条件优选为35-38℃、150-250rpm培养3-6小时;更优选为37℃、220rpm培养3-5小时。
步骤(1)中所述的接种量优选为体积百分比5-10%。
步骤(1)中所述的发酵的条件优选如下:起始培养条件33~37℃、120~180rpm,pH7.0,空气1.8~2.2L/min,随着培养进行,自动增加转速,控制溶氧在20-40%,培养4~6小时;更优选如下:起始培养条件30℃、150rpm、pH7.0、空气2L/min,随着培养进行,自动增加转速,控制溶氧在20-40%,培养5小时。
步骤(2)中所述的补料发酵的条件优选如下:以0.2~0.4mL/min速率流加补料,流加培养16~22小时,自动控制转速,使溶氧维持在20-40%;更优选如下:以0.3mL/min速率流加补料,流加培养19小时,自动控制转速,使溶氧维持在20-40%。
步骤(2)中所述的补料优选为含有机氮源的甘油溶液,其中,有机氮源的浓度为质量体积比9%~10%,甘油溶液的浓度为体积百分比35%~45%。
所述的有机氮源的浓度优选为质量体积比9.5%。
所述的甘油溶液的浓度优选为40%。
所述的有机氮源优选为酵母浸粉和酵母蛋白胨中的至少一种。
步骤(3)中所述的诱导剂优选为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
步骤(3)中所述的诱导剂的用量优选为按其在发酵体系中的终浓度为0.05mmol/L~0.25mmol/L计;更优选为按其在发酵体系中的终浓度为 0.1mmol/L计。
步骤(3)中所述的诱导培养的条件优选如下:于25~30℃进行诱导外源蛋白表达,期间选择性加入补料;更优选如下:于28℃进行诱导外源蛋白表达,期间选择性加入补料。
所述的补料优选为含有机氮源的甘油溶液,其中,有机氮源的浓度为质量体积比9%~10%,甘油溶液的浓度为体积百分比35%~45%。
所述的有机氮源的浓度优选为质量体积比9.5%。
所述的甘油溶液的浓度优选为40%。
所述的有机氮源优选为酵母浸粉和酵母蛋白胨中的至少一种。
所述的补料的添加量如下:以0.2~0.4mL/min速率流加补料,流加诱导培养,自动控制转速,使溶氧维持在20-40%;更优选如下:以0.3mL/min速率流加补料,流加诱导培养,自动控制转速,使溶氧维持在20-40%。
所述的流加诱导培养的时间优选为35~50h;更优选为40~45h。
本发明相对于现有技术具有以下优势和效果:
本发明提供的发酵培养基,相对于常用的发酵培养基和US20080254511Al中的FM4培养基,提高有机氮源至1.5%-3.6%,柠檬酸浓度提高至2.55g/L-3.4g/L,克服了突变菌株的生长缺陷,使得菌株能够更好的生长,生长速率达到野生菌水平,实现高密度培养;含有16.8-33.6mg/L的EDTA,可显著促进短肽类蛋白的分泌表达,诱导后菌株密度稳定持续增长,发酵周期达40小时,发酵培养基中的目的蛋白得到持续累积。
附图说明
图1是菌株AHW4和AHW5的LPP基因电泳结果图;其中,泳道M为DNA标准品,从上到下分子量依次为:2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24为AHW4突变后的LPP基因结果;泳道28、29、31、34、37、38、42、44、46为AHW5敲除LPP基因的结果;泳道25、27、30、32、33、35、36、39、40、41、43、45、47、48为阴性对照结果。
图2是实例1重组质粒pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)的图谱图。
图3是实例3和实例4细胞密度随发酵时间的变化曲线图。
图4是实例3 5L发酵罐发酵过程搅拌转速监测曲线图。
图5是实例3 5L发酵罐发酵液上清电泳检测结果图;其中,泳道M为蛋白质标准品,从上到下分子量依次为:42.0KD、26.0KD、17.0KD、10.0KD、4.2KD;泳道1为诱导0h的样品;泳道2为诱导16.5h的样品;泳道3为诱导24h的样品;泳道4为诱导40h的样品;泳道5为诱导45h的样品;目的蛋白在10.78KDa附近。
图6是实例4 5L发酵罐发酵过程搅拌转速监测曲线图。
图7是实例4 5L发酵罐发酵液上清电泳检测结果图;其中,泳道M为蛋白质标准品,从上到下分子量依次为:42.0KD、26.0KD、17.0KD、10.0KD、4.2KD;泳道1为诱导0h的样品;泳道2为诱导16.5h的样品;泳道3为诱导24h的样品;泳道4为诱导40h的样品。
具体实施方式
以下通过实施例和说明书附图进一步说明本发明,实施例仅用于说明本发明而并不限制发明所要求的保护范围。
1、SDS-PAGE检测方法
(1)样品处理:取本品20μL,加入10μL 4倍浓度的LDS蛋白上样缓冲液(LDS SampleBuffer(4×)),混合均匀,100℃煮沸7min。放冷至室温后,取10μL混合液上样。同时取10μLMarker上样。
(2)电泳:初始以120V开始电泳,30min左右,调整电压至200v。直至指示剂距前沿0.5-1cm处结束电泳。
(3)固定:取出的凝胶置于染色盒中,加入三氯乙酸固定液固定30min后,用水漂洗2-3次。
(4)染色:加入考马斯亮蓝染色液浸没凝胶,在脱色摇床上染色过夜。
(5)脱色:染色后凝胶用水冲洗2次,加入考马斯亮蓝脱色液浸没凝胶,在脱色摇床上脱色至背景干净为止。
(6)脱色后凝胶用水冲洗2次,加入水浸没凝胶,可保存用于扫描处理结果。
2、裂解率计算
OD是optical density(光密度)的缩写,表示被检测物吸收掉的光密度,OD600就是利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度,从而估计细菌的生长情况;本文将以裂解率定义菌种的密度变化情况,对菌种诱导前后生长情况进行评价。
裂解率=(发酵诱导开始时的OD-发酵诱导结束的OD600)/发酵诱导开始时的OD*100%
实施例1含pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)基因工程菌的构建
构建具有融合基因的大肠杆菌工程菌株,其融合基因具有形如A-B-C-D结构的基因序列,其中A为信号肽编码基因,B为伴侣蛋白编码基因,C为连接肽编码基因,D为GLP-1(9-37)片段编码基因。
重组大肠杆菌菌株通过如下步骤得到:将形如A-B-C-D结构的融合基因克隆入原核表达载体中,得到的重组表达载体再转入大肠杆菌工程菌中,得到重组大肠杆菌菌株。
所述的原核表达载体通过pET-28a(+)载体改造获得,改造过程如下:PCR扩增pFLAG–CTC载体(Sigma)的tac启动子区域,引物两端加上BlpI和SphI酶切位点,BlpI和SphI双酶切PCR产物和pET-28a(+)载体,T4 DNA连接酶连接后化转大肠杆菌top10感受态细胞,PCR鉴定阳性克隆。提取质粒后获得启动子更换的pET-28a(+)载体,该载体命名为pETflag-CTC。
所述的大肠杆菌工程菌为大肠杆菌渗漏菌株,优选为LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌,包括但不限于大肠杆菌AHW5或AHW4。
大肠杆菌AHW5的制备过程如下:以野生型大肠杆菌W3110作为出发菌株,利用分子生物学技术,通过同源重组的方式(参考美国专利申请US20080254511A1进行操作),在宿主菌的LPP膜蛋白基因区域进行敲除,使用一个氯霉素抗性基因(来自pACYCDuet-1载体)替换LPP膜蛋白基因,造成膜蛋白无法表达,获得LPP膜蛋白缺失菌株,命名为AHW5;同样的方法对LPP膜蛋白基因序列进行点突变(参考美国专利申请US20080254511A1进行操作),即通过在LPP膜蛋白基因区域插入一个氯霉素抗性基因(来自pACYCDuet-1载体),造成膜蛋白氨基酸序列异常,无法形成正确的膜蛋白,获得膜蛋白突变菌株,命名为AHW4。通过菌落PCR(使用引物为LPP-mut-F和LPP-mut-R)的方法对两菌株进行了验证,确认该两个重组菌株的LPP蛋白基因已被敲除或突变,菌落PCR电泳检测结果如图1所示,阳性克隆的基因中插入了抗性基因片段,基因大小明显比阴性对照要大,与理论大小一致。
LPP-mut-F:5’-AATACTTGTAACGCTACATGGAGATTAACTCAATCTAGAGGGTATTAATA-3’;
LPP-mut-R:5’-CGTTCAGACAATGCCATACACACTGCCAGCAGGCTTTACGCAATTTAAAG-3’。
所述的融合蛋白具有下述结构,即从N端到C端,信号肽、伴侣蛋白、连接肽及GLP-1(9-37)片段等四个片段连接而成。
所述的信号肽为如SEQ ID NO.1所示的ctg信号肽:
MKRNRFFNTSAAIAISIALNTFFCSMQTIA;
所述的伴侣蛋白为如SEQ ID NO.2所示的HV蛋白:
ATYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ;
所述的连接肽为DDDDK。
所述的GLP-1(9-37)片段如SEQ ID NO.3所示:
EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG。
所述的具有形如A-B-C-D结构的融合基因及工程菌的构建方法可参考自本领域实验指南(J.萨姆布鲁克等,《分子克隆实验指南》第二版,科学出版社,1995年)。设计ctg-HV-DDDDK-GLP-1(9-37)片段融合基因片段,依据密码子表将这些氨基酸序列转换为核苷酸序列,在转换过程中根据大肠杆菌的密码子使用偏好性,选用使用频率较高的密码子,调整其GC含量,去掉影响基因转录的顺式作用元件和重复序列而优化得到,同时在基因序列的3’端引入双终止密码子TAATGA,为了便于基因操作,在ctg-HV-DDDDK-GLP-1(9-37)片段融合基因序列的5’端引入NdeI酶切位点序列CATATG,因此在N端延伸肽前引入ML两个氨基酸,在ctg-HV-DDDDK-GLP-1(9-37)融合基因3’端引入XhoI酶切位点CTCGAG,优化后的ctg-HV-DDDDK-GLP-1(9-37)融合基因序列如SEQ ID NO.4所示。基因序列委托基因合成服务公司合成,TA克隆至pUC57载体上,名称为pUC57-ctg-HV-DDDDK-GLP-1(9-37)。
优化后的ctg-HV-DDDDK-GLP-1(9-37)融合基因序列(SEQ ID NO.4):
CATATGAAGCGTAACCGTTTCTTTAACACCAGCGCGGCGATCGCGATTAGCATCGCGCTGAACACCTTCTTTTGCAGCATGCAGACCATTGCGGCGACCTACACCGACTGCACCGAGAGCGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGCAGCAACGTGTGCGGTCAAGGCAACAAGTGCATCCTGGGTAGCGATGGCGAGAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGCACCCCGAAACCGCAAAGCCACAACGACGGTGATTTCGAGGAAATTCCGGAGGAATACCTGCAAGACGATGACGATGAACCAACCTTCACCAGCGACGTGAGCAGCTACCTGGAGGGTCAGGCGGCGAAAGAATTTATCGCGTGGCTGGTTCGTGGTCGTGGCTAATAACTCGAG。
使用TaKaRa公司的限制性内切酶NdeI和XhoI对质粒pETflag-CTC进行双酶切,同样用NdeI和XhoI对重组载体pUC57-ctg-HV-DDDDK-GLP-1(9-37)进行双酶切。将酶切后的目的DNA片段连接至经同样酶双酶切的pETflag-CTC,经测序验证正确后,命名为pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37),如图2所示。
转化重组菌株:
按照美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》第三版提供的氯化钙法,制备大肠杆菌AHW5感受态细胞和AHW4感受态细胞。取1μL重组表达载体pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)转化至大肠杆菌AHW5感受态细胞,转化方法同样按照《分子克隆实验指南》第三版的氯化钙法进行。将转化液分别涂布至添加了卡那霉素(终浓度为100μg/mL)的LB固体培养基,37℃倒置培养直到出现单菌落,即获得了ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)表达菌种库,命名为
AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)。同样的方法把质粒转化到AHW4感受态细胞,获得重组菌株AHW4/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)。
实施例2
本实例使用重组大肠杆菌AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)分泌表达GLP-1(9-37)多肽蛋白,使用常见的大肠杆菌培养基进行摇瓶发酵实验。
种子液制备:将-80℃保藏的重组大肠杆菌接种于含50mL LB培养基的250mL摇瓶中,培养3小时后(37℃、220rpm)作为发酵种子液;
摇瓶发酵:按5%的体积接种到不同发酵培养基中,培养温度37℃,转速220rpm,培养12小时后加入IPTG进行诱导,IPTG的终浓度为0.1mmol/L;
诱导表达:诱导温度28℃,转速220rpm,每24小时检测密度变化情况,诱导培养时间96小时。
所述摇瓶发酵培养基包括5种大肠杆菌培养基:
培养基1(即LB培养基):胰蛋白胨10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,氯化钠10.0g/L;
培养基2(即TB培养基):胰蛋白胨12.0g/L,酵母提取物24.0g/L,甘油4mL/L,无水磷酸二氢钾2.31g/L,无水磷酸氢二钾12.54g/L;
培养基3(即MR培养基,见“陈昭元.大肠杆菌中重组蛋白的渗漏表达[D].安徽大学,2013.”):柠檬酸1.7g/L,七水硫酸镁1.2g/L,甘油5.0g/L,无水磷酸二氢钾13.3g/L,无水膦酸氢二铵4.0g/L,维生素B14.5mg/L,微量元素1mL/L;微量元素:EDTA 8.4g/L,柠檬酸铁100g/L,钼酸钠2.5g/L,硼酸3.0g/L,氯化钴2.5g/L,二水氯化铜1.5g/L,四水氯化锰15.0g/L,醋酸锌13g/L;
培养基4(即FM4培养基,见“US20080254511Al”):磷酸二氢钾1.5g/L,硫酸铵5.0g/L,七水硫酸镁0.5g/L,二水氯化钙0.15g/L,氯化钠0.5g/L,微量元素1mL/L,胰蛋白胨3.0g/L,酵母提取物1.5g/L,葡萄糖10.0g/L,维生素B1 5.0mg/L,二水柠檬酸钠1.0g/L,七水硫酸亚铁0.075g/L;微量元素:钼酸钠0.15g/L,硼酸2.5g/L,氯化钴0.7g/L,五水硫酸铜0.25g/L,四水氯化锰1.6g/L,七水硫酸锌0.3g/L;
培养基5(即M9培养基):七水磷酸氢二钠12.8g/L,磷酸二氢钾3.0g/L,氯化钠0.5g/L,氯化铵g/L,无水硫酸镁0.24g/L,葡萄糖4g/L,二水氯化钙14.7mg/L。
实验过程对诱导前和诱导后取发酵液检测密度(如表1所示),该菌株在摇瓶发酵过程中生长期密度差异较大,但普遍偏低,诱导后细胞密度出现持续下降,有明显的裂解现象,裂解率最高达55.32%,说明分泌表达GLP-1(9-37)蛋白可能会导致该重组菌株的大量裂解。培养基3发酵过程没有裂解,但是生长密度非常低,生长非常缓慢。本实例证明该菌株在常见的大肠杆菌培养基发酵过程中的生长活力比较低,表达外源蛋白会出现不同程度的裂解。
表1
实施例3(对照实验):
使用重组大肠杆菌AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)分泌表达GLP-1(9-37)蛋白,培养基使用的是US20080254511A1中应用的FM4培养基,发酵工艺参考US20080254511A1所述工艺,具体为:
(1)种子液的制备:将-80℃保藏的大肠杆菌接种于含100mL LB培养基的500mL摇瓶中,37℃、220rpm培养5小时作为种子液。
(2)分批培养发酵:100mL种子液接种到含2L培养基的5L发酵罐中,起始培养条件30℃、pH7.0、转速150rpm、空气2L/min,随着培养进行,自动增加转速,控制溶氧在20-40%,培养5小时。
(3)分批补料发酵:分批培养结束后(培养6h),以0.3mL/min的速率流加浓度为50%w/v的葡萄糖(葡萄糖总用量0.3ml/min×19h×60×50%=171g),继续培养19小时;补料发酵培养条件同步骤(2)。
(4)诱导培养阶段:补料培养结束后,一次性加入终浓度为0.1mmol/L的诱导剂IPTG进行诱导外源蛋白表达,以0.3mL/min的速率流加浓度为50%w/v的葡萄糖,继续培养45小时,诱导培养温度28℃,pH7.0,自动增加转速,控制溶氧在20-40%。
(5)取样及发酵结束:每天两次取样检测密度和pH,发酵液在12000rpm离心5min,发酵结束:诱导45小时结束。
结果发现:生长期17h开始每2h检测菌种生长密度(如图3所示),培养19小时后密度基本稳定无法提高,培养25小时密度比较低,开始诱导后菌体出现明显裂解;生长期菌体代谢缓慢,耗氧量较少,同时释放出大量内容物导致溶氧传质率大幅下降,溶氧曲线表现为快速下降,然后看到菌种代谢率下降,耗氧减少,维持固定溶氧水平,其搅拌转速不断下降,变化情况如图4所示,转速在诱导阶段开始持续下降,说明菌体生长代谢速率下降;SDS-PAGE电泳检测发酵上清液(如图5所示),结果发酵上清中在10.89KDa附近只有小量GLP-1(9-37)目的蛋白,且含量并无增长的趋势,发酵上清中目的蛋白含量只有0.363g/L,占比为2.959%。
所述目的蛋白为GLP-1(9-37)串连HV蛋白,融合蛋白理论大小为10.89KDa;
所述FM4培养基:无水磷酸二氢钾1.5g/L,硫酸铵5.0g/L,七水硫酸镁0.5g/L,二水氯化钙0.15g/L,氯化钠0.5g/L,微量元素1mL/L,胰蛋白胨3.0g/L,酵母提取物1.5g/L,葡萄糖10g/L,维生素B1 5.0mg/L,二水柠檬酸钠1.0g/L,七水硫酸亚铁0.075g/L;微量元素:钼酸钠0.15g/L,硼酸2.5g/L,氯化钴0.7g/L,五水硫酸铜0.25g/L,四水氯化锰1.6g/L,七水硫酸锌0.3g/L。
实施例4:
本实施例使用重组大肠杆菌AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)分泌表达GLP-1(9-37)融合蛋白,使用本发明培养基进行发酵:柠檬酸2.55g/L,七水硫酸镁4.0g/L,酵母蛋白胨6.0g/L,酵母浸粉12.0g/L,甘油5.0g/L,无水磷酸二氢钾13.3g/L,无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B1 4.5mg/L,微量元素1mL/L;微量元素:EDTA 16.8g/L,氯化钴2.5g/L,一水合硫酸锰12.8g/L,二水氯化铜1.5g/L,硼酸3.0g/L,钼酸钠2.5g/L,七水硫酸锌9.6g/L,六水合氯化铁110.0g/L。
发酵步骤如下:
(1)种子液的制备:将-80℃保藏的大肠杆菌接种于含100mL LB培养基的500mL摇瓶中,37℃、220rpm培养5小时作为种子液。
(2)分批培养发酵:100mL种子液接种到含2L培养基的5L发酵罐中,起始培养条件30℃、pH7.0、转速150rpm、空气2L/min,随着培养进行,自动增加转速,控制溶氧在20-40%,培养5小时。
(3)分批补料发酵:分批培养结束后(培养6h),以0.3mL/min的速率流加浓度为40%(v/v)甘油(含9.5%w/v氮源),继续培养19小时;补料发酵培养条件同步骤(2)。
(4)诱导培养阶段:补料培养结束后,一次性加入终浓度为0.1mmol/L的诱导剂IPTG进行诱导外源蛋白表达,以0.3mL/min的速率流加浓度为40%(v/v)甘油(含9.5%w/v氮源),继续培养45小时,诱导培养温度28℃,pH7.0,自动增加转速,控制溶氧在20-40%。
(5)取样及发酵结束:每天两次取样检测密度和pH,发酵液在12000rpm离心5min,发酵结束:诱导45小时结束。
实验结果:生长期17h开始每2h检测菌种生长密度(如图3所示),生长期菌株密度更高,比对照组(即实施例3)提高了36.72%,接近野生菌水平;前期密度稳定增加,诱导后期则快速增长,并未出现裂解;发酵诱导期维持固定溶氧水平,其搅拌转速变化情况如图6所示,转速持续维持在高位,且持续上升,说明菌体代谢旺盛,生长状态良好,耗氧持续增加;SDS-PAGE电泳检测发酵上清液(如图7所示),在10.89KDa附近有明显目的蛋白条带,且目的蛋白含量随时间持续累积,目的蛋白产量达2.916g/L,发酵上清中目的蛋白占比达14.516%,是对照组的5.62倍;使用本发明培养基,能使GLP-1(9-37)短肽蛋白分泌表达量大幅增加,且表达周期达到40h以上。
表2
表3
上述融合蛋白为GLP-1(9-37)串连HV蛋白,融合蛋白理论大小为10.89KDa。
所述9.5%氮源为酵母蛋白胨,或酵母浸粉,或酵母蛋白胨和酵母浸粉混合。
实施例5:
本实施例使用重组大肠杆菌AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)分泌表达GLP-1(9-37)融合蛋白,使用本发明培养基(柠檬酸2.98g/L,七水硫酸镁4.0g/L,酵母蛋白胨5.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,甘油5.0g/L,无水磷酸二氢钾13.3g/L,无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B1 4.5mg/L,微量元素1mL/L;微量元素:EDTA 25.2g/L,氯化钴2.5g/L,一水合硫酸锰12.8g/L,二水氯化铜1.5g/L,硼酸3.0g/L,钼酸钠2.5g/L,七水硫酸锌9.6g/L,六水合氯化铁110.0g/L)进行发酵,发酵步骤同实施例4。
诱导表达40h,发酵上清中目的蛋白表达量为2.788g/L,蛋白占比为10.689%。
实施例6:
本实施例使用重组大肠杆菌AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)分泌表达GLP-1(9-37)融合蛋白,使用本发明培养基(柠檬酸2.55g/L,七水硫酸镁4.0g/L,酵母蛋白胨6.0g/L,酵母浸粉12.0g/L,甘油5.0g/L,无水磷酸二氢钾13.3g/L,无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B14.5mg/L,微量元素1mL/L;微量元素:EDTA 33.6g/L,氯化钴2.5g/L,一水合硫酸锰12.8g/L,二水氯化铜1.5g/L,硼酸3.0g/L,钼酸钠2.5g/L,七水硫酸锌9.6g/L,六水合氯化铁110.0g/L)进行发酵,发酵步骤同实施例4。
诱导表达40h,发酵上清中目的蛋白表达量为2.376g/L,占比为10.806%。
实施例7
本实施例使用重组大肠杆菌AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)分泌表达GLP-1(9-37)融合蛋白,使用本发明培养基(柠檬酸3.4g/L,七水硫酸镁4.0g/L,酵母蛋白胨12.0g/L,酵母浸粉24.0g/L,甘油5.0g/L,无水磷酸二氢钾13.3g/L,无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B1 4.5mg/L,微量元素1mL/L;微量元素:EDTA 25.2g/L,氯化钴2.5g/L,一水合硫酸锰12.8g/L,二水氯化铜1.5g/L,硼酸3.0g/L,钼酸钠2.5g/L,七水硫酸锌9.6g/L,六水合氯化铁110.0g/L)进行发酵,发酵步骤同实施例4。
诱导表达40h,发酵上清中目的蛋白表达量为2.762g/L,蛋白占比为9.70%。
对比例1(有机氮源8.0g/L)
本实施例使用重组大肠杆菌AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)分泌表达GLP-1(9-37)融合蛋白,使用本发明培养基(柠檬酸3.4g/L,七水硫酸镁4.0g/L,酵母蛋白胨5.0g/L,酵母浸粉3.0g/L,甘油5.0g/L,无水磷酸二氢钾13.3g/L,无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B14.5mg/L,微量元素1mL/L;微量元素:EDTA 16.8g/L,氯化钴2.5g/L,一水合硫酸锰12.8g/L,二水氯化铜1.5g/L,硼酸3.0g/L,钼酸钠2.5g/L,七水硫酸锌9.6g/L,六水合氯化铁110.0g/L)进行发酵,发酵步骤同实施例4。
诱导表达40h,诱导时起始密度比较低(相当于实例4的15.49%),诱导过程密度增长缓慢,检测结果发酵上清中并没有目的蛋白。
对比例2(不含柠檬酸)
本实施例使用重组大肠杆菌AHW5/pETflag-CTC-ctg+HV+DDDDK+GLP-1(9-37)分泌表达GLP-1(9-37)融合蛋白,使用本发明培养基(七水硫酸镁4.0g/L,酵母蛋白胨6.0g/L,酵母浸粉12.0g/L,甘油5.0g/L,无水磷酸二氢钾13.3g/L,无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B14.5mg/L,微量元素1mL/L;微量元素:EDTA 16.8g/L,氯化钴2.5g/L,一水合硫酸锰12.8g/L,二水氯化铜1.5g/L,硼酸3.0g/L,钼酸钠2.5g/L,七水硫酸锌9.6g/L,六水合氯化铁110.0g/L)进行发酵,发酵步骤同实施例4。
诱导表达40h,诱导开始就出现明显的裂解,诱导24h时细胞裂解率达到42.40%,目的蛋白占比只有4.89%,后续产量基本不增加。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明,但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言,在不脱离本发明原理和精神的情况下,对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型,仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 珠海联邦制药股份有限公司
<120> 用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌高效分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ctg信号肽
<400> 1
Met Lys Arg Asn Arg Phe Phe Asn Thr Ser Ala Ala Ile Ala Ile Ser
1 5 10 15
Ile Ala Leu Asn Thr Phe Phe Cys Ser Met Gln Thr Ile Ala
20 25 30
<210> 2
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HV蛋白
<400> 2
Ala Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys
1 5 10 15
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser
20 25 30
Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro
35 40 45
Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu
50 55 60
Gln
65
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GLP-1(9-37)片段
<400> 3
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
1 5 10 15
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25
<210> 4
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 优化后的ctg-HV-DDDDK-GLP-1(9-37)融合基因序列
<400> 4
catatgaagc gtaaccgttt ctttaacacc agcgcggcga tcgcgattag catcgcgctg 60
aacaccttct tttgcagcat gcagaccatt gcggcgacct acaccgactg caccgagagc 120
ggtcagaacc tgtgcctgtg cgaaggcagc aacgtgtgcg gtcaaggcaa caagtgcatc 180
ctgggtagcg atggcgagaa aaaccagtgc gttaccggtg aaggcacccc gaaaccgcaa 240
agccacaacg acggtgattt cgaggaaatt ccggaggaat acctgcaaga cgatgacgat 300
gaaccaacct tcaccagcga cgtgagcagc tacctggagg gtcaggcggc gaaagaattt 360
atcgcgtggc tggttcgtgg tcgtggctaa taactcgag 399
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物LPP-mut-F
<400> 5
aatacttgta acgctacatg gagattaact caatctagag ggtattaata 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物LPP-mut-R
<400> 6
cgttcagaca atgccataca cactgccagc aggctttacg caatttaaag 50
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 连接肽
<400> 7
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
Claims (13)
1.用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌表达短肽类蛋白的发酵培养基在发酵分泌表达短肽类蛋白中的应用,其特征在于:是能表达短肽类蛋白的LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌使用用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌表达短肽类蛋白的发酵培养基进行发酵;
所述的突变指的是造成膜蛋白氨基酸序列异常,无法形成正确的膜蛋白;
所述的用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌表达短肽类蛋白的发酵培养基包括如下组分:柠檬酸2.55 g/L -3.4g/L、七水硫酸镁3.5 g/L -4.5g/L、有机氮源 15 g/L -36g/L、甘油4.5 g/L -5.5g/L、无水磷酸二氢钾13 g/L -14g/L、无水磷酸氢二铵8 g/L -9g/L、维生素B1 4 mg/L -5 mg/L,微量元素 0.8 mL/L -1.2mL/L;
所述的微量元素由以下组分组成:EDTA 16.8g/L-33.6g/L、氯化钴 2.3 g/L-2.7g/L、一水合硫酸锰12.5g/L-13.5 g/L、二水氯化铜 1 g/L-2g/L、硼酸2.5 g/L-3.5g/L、钼酸钠2g/L-3g/L、七水硫酸锌9 g/L-10g/L、六水合氯化铁100g/L-120g/L。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:
所述的用于LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌表达短肽类蛋白的发酵培养基包括如下组分:柠檬酸2.55g/L-3.4g/L、七水硫酸镁4g/L、有机氮源18g/L-36g/L、甘油5g/L、无水磷酸二氢钾13.3g/L、无水磷酸氢二铵8.36g/L,维生素B1 4.5 mg/L,微量元素 1mL/L。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述的微量元素由以下组分组成:EDTA16.8g/L-33.6g/L、氯化钴 2.5g/L、一水合硫酸锰12.8g/L、二水氯化铜 1.5g/L、硼酸3g/L、钼酸钠2.5g/L、七水硫酸锌9.6g/L、六水合氯化铁110g/L。
4.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
所述的有机氮源为酵母浸粉和酵母蛋白胨中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:
所述的有机氮源为酵母浸粉和酵母蛋白胨按质量比2:1配比混合得到的有机氮源。
6.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述的短肽类蛋白为胰腺分泌多肽。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述的短肽类蛋白为GLP-1、GLP-2、胰高血糖素或GIP。
8.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的能表达短肽类蛋白的LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌通过如下步骤制备得到:将编码短肽类蛋白的基因转入LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌中得到。
9.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的能表达短肽类蛋白的LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌通过如下步骤制备得到:将编码短肽类蛋白的基因克隆入原核表达载体中,将得到的重组载体转入LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌中得到。
10.根据权利要求8或9所述的应用,其特征在于:
所述的编码短肽类蛋白的基因具有形如A-B-C-D结构的基因序列,其中A为信号肽基因,B为伴侣蛋白编码基因,C为连接肽编码基因,D为短肽类蛋白编码基因;
所述的LPP单基因敲除或突变的大肠杆菌为将野生型大肠杆菌W3110的膜脂蛋白基因序列做敲除或突变的大肠杆菌。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于:
所述的信号肽为ctg信号肽;
所述的伴侣蛋白为HV蛋白;
所述的连接肽为DDDDK;
所述的敲除或突变是通过同源重组方式进行,使用氯霉素抗性基因替换LPP基因实现敲除,或是使用氯霉素抗性基因插入LPP基因实现突变。
12.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:
所述的发酵包括如下步骤:
(1)将种子液接种于所述的发酵培养基中进行发酵;
(2)加入补料,进行补料发酵;
(3)补料发酵至对数生长期末期或稳定期,加入诱导剂诱导培养,进行外源蛋白表达。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于:
步骤(1)中所述的发酵的条件如下:起始培养条件33~37℃、120~180rpm,pH7.0,空气1.8~2.2L/min,随着培养进行,自动增加转速,控制溶氧在20-40%,培养4~6小时;
步骤(2)中所述的补料发酵的条件如下:以0.2~0.4mL/min速率流加补料,流加培养16~22小时,自动控制转速,使溶氧维持在20-40%;
步骤(2)中所述的补料为含有机氮源的甘油溶液,其中,有机氮源的浓度为质量体积比9%~10%,甘油溶液的浓度为体积百分比35%~45%;
步骤(3)中所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷;
步骤(3)中所述的诱导剂的用量按其在发酵体系中的终浓度为0.05 mM ~0.25mM计;
步骤(3)中所述的诱导培养的条件如下:于25~30℃进行诱导外源蛋白表达,期间选择性加入补料。
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