CN104726524A - 一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法 - Google Patents
一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104726524A CN104726524A CN201310722672.9A CN201310722672A CN104726524A CN 104726524 A CN104726524 A CN 104726524A CN 201310722672 A CN201310722672 A CN 201310722672A CN 104726524 A CN104726524 A CN 104726524A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- substratum
- precursor
- lantus
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法。其特征是每升该培养基中含有柠檬酸3～8g，硫酸铁0.01～0.1g，磷酸氢二铵2～8g，磷酸二氢钾2～4g，硫酸镁1～4g，葡萄糖8～15g，甘油1～3g，酵母提取物10～16g，维生素B10.05～0.2g，痕量元素钼酸铵0.5～1mg，硫酸铜0.1～1mg，硼酸1～4mg，碘化钾0.2～0.6mg，氯化锰1～4mg和乙酸锌1～5mg，其余为水。将重组大肠杆菌BL21(DE3)/hpl菌株用固体斜面培养基培养得到单克隆，然后将单克隆菌种接种到液体种子培养基上培养，得到的液体种子接种到上述本发明培养基上，摇瓶振荡发酵或通气搅拌发酵罐发酵培养得到甘精胰岛素前体。本发明操作简单，原材料成本低廉，得到的甘精胰岛素前体蛋白含量至少在7g/l，最高达11g/l以上，为甘精胰岛素大规模生产开辟了一条新途径。
Description
技术领域
本发明设计一种生物培养基，具体来说设计一种新的发酵生产甘精胰岛素前体的培养基，以及用培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法。
背景技术
甘精胰岛素是一个基因重组长效人胰岛素类似物，属于第三代高端胰岛素产品。胰岛素药物一直具有广阔的发展前景。胰岛素技术发展历经了从早期的动物胰脏中提取动物胰岛素，到现在的生物合成人胰岛素以及人胰岛素类似物。第三代基因重组胰岛素类似物，甘精胰岛素，是胰岛素的最高端产品。目前赛诺菲-安万特的首个第三代高端胰岛素“来的时”在世界上销售额2010年近50亿美元，是全球最畅销药物前200名中排位第7的“重磅炮弹”药物。
本发明涉及的第三代高端胰岛素是在胰岛素的A链上21位用甘氨酸取代天冬酰胺，并在B链3增加精氨酸。与第一代动物胰岛素、第二代重组人胰岛素最大的区别在于：它能模拟人体生理胰岛素分泌模式，使血糖安全达标而不会出现低血糖，可大大降低糖尿病引起的并发症。
近年来以甘精胰岛素为代表的第三代最先进的基因重组人胰岛素类似物在国际市场已经逐步取代第二代人胰岛素占据了市场的龙头地位。甘精胰岛素起效更快，作用更持久，是唯一可在人体中达到24小时平稳分泌的长效胰岛素。产品符合人类生活作息周期，每天只需注射一次。甘精胰岛素称之为穷人的胰岛素泵是因为他价格比胰岛素泵便宜，而且每天只打一针，比预混胰岛素方便的多。甘精胰岛素是未来市场增长的主要推动力。
重组胰岛素表达系统常用的有两种，一为大肠杆菌包涵体表达系统，这种技术较为成熟，开发较早。具有工艺简单、产量高、周期短、生产成本低的优点。许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，对包涵体变复性等。另一种为酵母表达系统，使用具有翻译后修饰的酿酒酵母作为表达系统，省去了包涵体变复性的繁琐及高消耗操作步骤。但酵母作为表达系统不适用于“甘精胰岛素”的表达和制备。
大肠杆菌表达系统是目前最常用外源蛋白表达系统，其生长周期短，培养成本低廉，代谢调控较为成熟，在重组蛋白外源基因表系统中占主导地位。在大肠杆菌的发酵中，外源基因高效表达条件下的高密度发酵对于减少培养体积，缩短生产周期，提高生产效率，降低生产成本，简化产品纯化工艺都具有非常重要的意义，但是高密度发酵过程中容易出现菌体衰老、自溶和外源基因不能高效表达等现象。因此，优化大肠杆菌的生长条件对提高外源蛋白的产量至关重要。
不同的培养基成分不同，对重组大肠杆菌的生长和产物的表达影响也不同，在发酵过程中添加的盐类和微量元素的含量尤其是铁，锌，锰，铜，钴等矿物元素，他们或是一些酶的激活剂后者是一些酶的组分，因此可以降低有害代谢产物(主要是乙酸)的积累，改善细胞生长，增加菌体得率，提高外源蛋白的表达水平。
国内唯一第二代胰岛素表达水平在300mg-500mg/L。本发明涉及的专有技术开发生产的第三代长效人胰岛素表达产量可达7g/L，是目前国内表达工业水平的10多倍。
发明内容
本发明的目的在于开发出一种新的发酵生产甘精胰岛素前体的培养基；另一目的是开发出一种用这种培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法。
我们通过将柠檬酸，硫酸铁，磷酸氢二铵，磷酸二氢钾，硫酸镁，葡萄糖，甘油，酵母提取物，维生素B1，钼酸铵，硫酸铜，硼酸，碘化钾，氯化锰和乙酸锌混合，得到发酵生产甘精胰岛素前体的培养基，然后将重组大肠杆菌BL21(DE3)/hpl菌株接种于上述发酵培养基，发酵得到的甘精胰岛素前体含量在7g/l以上，且生产成本低廉，从而实现了本发明的目的。
本发明发酵生产甘精胰岛素前体的培养基，其特征是每升培养基中含有柠檬酸3～8g，硫酸铁0.01～0.1g，磷酸氢二铵2～8g，磷酸二氢钾2～4g，硫酸镁1～4g，葡萄糖8～15g，甘油1～3g，酵母提取物10～16g，维生素B10.05～0.2g，痕量元素钼酸铵0.5～1mg，硫酸铜0.1～1mg，硼酸1～4mg，碘化钾0.2～0.6mg，氯化锰1～4mg和乙酸锌，其余为水，pH为6.8～7.2。
本发明发酵生产甘精胰岛素前体的培养基用通常的方法制备，是将各组分用水溶解后混合，并用水定容至规定体积(比如制备1L培养基，则各组分按以上比例用水溶解后混合，用水定容至1L)，并用质量分数5％NaOH调节pH至6.8～7.2而得到。
用本发明所述培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法，其特征包括以下的步骤：
(1)将重组大肠杆菌BL21(DE3)/hpl菌株在固体斜面培养基上培养，35℃～37℃培养18～24小时，得到斜面菌种；
(2)将斜面菌种接种到液体种子培养基，于35℃～37℃的温度下摇床培养，得到液体种子；
(3)将液体种子接种到上述本发明生产甘精胰岛素前体的培养基中，于32℃～38℃通气搅拌发酵罐发酵培养12～18小时，当菌体密度的OD600值达到50～70时，停止发酵，得到甘精胰岛素前体。
步骤(1)所述的大肠杆菌BL21(DE3)菌株是常用的大肠杆菌表达菌株，该菌株可以从市场上够得，重组大肠杆菌BL21(DE3)/hpl菌株是本公司开发的甘精胰岛素生产菌株；所述的固体斜面培养基pH值6.7～7.2，每升培养基中含有蛋白胨5～10g，酵母粉3～6g，氯化钠3～6g，琼脂12～15g，其余为水。
步骤(2)所述的液体种子培养基pH值6.8～7.2，每升培养基中含有葡萄糖1～5g，磷酸二氢钾1～4g，磷酸氢二钾3～6g，氯化钠2～8g，酵母粉6～12g，；采用的摇床培养是采用摇床振幅65～75cm，转速180～250r/min，培养时间18～24小时。
步骤(3)所述的液体种子在发酵生产甘精胰岛素前体的培养基中的接种量最好是体积分数5％～10％，所述的通气搅拌发酵罐培养中每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比是1∶0.1～1.0，在发酵10～18小时后用10％～16％氨水调节培养基的pH在6.6～7.2。
本发明操作简单，原材料成本低廉，得到的甘精胰岛素前体蛋白至少在7g/l，最高可以达到12g/l以上，因此本发明为甘精胰岛素的大规模生产开辟了一条新的途径。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制
实施例1：
将柠檬酸3g，硫酸铁0.01g，磷酸氢二铵2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，葡萄糖8g，甘油1g，酵母提取物10g，维生素B10.05g，痕量元素钼酸铵0.5mg，硫酸铜0.1mg，硼酸1mg，碘化钾0.2mg，氯化锰1mg和乙酸锌1mg，加自来水溶解混合至1L，用5％NaOH调节上述溶液的pH为6.8，得到发酵培养基。
实施例2：
将柠檬酸5g，硫酸铁0.05g，磷酸氢二铵5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁2g，葡萄糖12g，甘油2g，酵母提取物13g，维生素B10.1g，痕量元素钼酸铵0.8mg，硫酸铜0.5mg，硼酸2mg，碘化钾0.4mg，氯化锰3mg和乙酸锌3mg，加自来水溶解混合至1L，用5％NaOH调节上述溶液的pH为7.0，得到发酵培养基。
实施例3：
将柠檬酸8g，硫酸铁0.1g，磷酸氢二铵8g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁4g，葡萄糖15g，甘油3g，酵母提取物16g，维生素B10.2g，痕量元素钼酸铵1mg，硫酸铜1mg，硼酸4mg，碘化钾0.6mg，氯化锰4mg和乙酸锌5mg，加自来水溶解混合至1L，用5％NaOH调节上述溶液的pH为7.2，得到发酵培养基。
实施例4：
将重组大肠杆菌菌株在固体斜面培养基(pH6.7，蛋白胨5g，酵母粉9g，氯化钠6g，琼脂15g，加自来水溶解混合至1L)上培养，35℃培养24小时，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2的菌种刮下，转接到装有20ml液体种子培养基(pH值6.8，葡萄糖5g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钾5g，氯化钠6g，酵母粉12g，加自来水溶解混合至1L)的500ml三角瓶(0.07MPa10min)中，于37℃往复式摇床(振幅65cm，摇床转速180r/m)振动培养18小时。得到液体种子。
将1.25L液体种子接种入装有25L实施例1的本发明培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌8分钟)通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶0.1，37℃发酵培养，当发酵进行至13小时，停止发酵，得到甘精胰岛素前体。
采用金属亲和层析和考马斯亮蓝G-250法测定甘精胰岛素前体蛋白的含量：发酵液4500r/min离心15min后，剔除上清，收获固态菌体，超声破碎菌体。以8000rpm，4℃，10min，收集甘精胰岛素前体蛋白的包涵体沉淀。用8M的尿素缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，0.2mmol/L DTT或100mmol/Lβ-巯基乙醇，2％Triton)重新溶解包涵体。包涵体溶解后的上清液，转移到镍亲和层析柱，以5×柱体积的结合缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，5mM Imidazole，0.5M NaCl)平衡柱子；20×柱体积的洗涤缓冲液(Tris-HCl pH7.9，300mM Imidazole，0.5M NaCl)洗脱蛋白，收集蛋白流出液。根据考马斯亮蓝G-250法制作蛋白定量标准曲线，吸取蛋白样品0.1mL，放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得蛋白样品提取液中蛋白质的含量。测出本实施例中甘精胰岛素前体蛋白8.25g/l。
实施例5：
将重组大肠杆菌菌株在固体斜面培养基(pH值7.0，蛋白胨7g，酵母粉6g，氯化钠7g，琼脂15g，加自来水溶解混合至1L)上培养，35℃培养24小时，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2的菌种刮下，转接到装有20ml液体种子培养基(pH值7.0，每升培养基中含有葡萄糖3g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾6g，氯化钠2g，酵母粉10g，，加自来水溶解混合至1L)的500ml三角瓶(0.07MPa10min)中，于34℃往复式摇床(振幅65cm，摇床转速180r/m)振动培养18小时。得到液体种子。
将1.25L液体种子接种入装有25L实施例2的本发明培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌8分钟)通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶0.4，37℃发酵培养，当发酵进行至13小时，停止发酵，得到甘精胰岛素前体。按照实施例4的方法测得甘精胰岛素前体的含量为7.23g/l。
实施例6：
将重组大肠杆菌菌株在固体斜面培养基(pH值7.2，蛋白胨9g，酵母粉7g，氯化钠8g，琼脂15g，加自来水溶解混合至1L)上培养，37℃培养24小时，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2的菌种刮下，转接到装有20ml液体种子培养基(pH值7.0，每升培养基中含有葡萄糖5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾6g，氯化钠8g，酵母粉12g，，加自来水溶解混合至1L)的500ml三角瓶(0.07MPa10min)中，于34℃往复式摇床(振幅65cm，摇床转速180r/m)振动培养18小时。得到液体种子。
将1.25L液体种子接种入装有25L实施例3的本发明培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌8分钟)通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶0.8，35℃发酵培养，当发酵进行至13小时，停止发酵，得到甘精胰岛素前体。按照实施例4的方法测得甘精胰岛素前体的含量为9.01g/l。
实施例7：
将重组大肠杆菌菌株在固体斜面培养基(pH值6.9，蛋白胨8g，酵母粉9g，氯化钠6g，琼脂15g，加自来水溶解混合至1L)上培养，37℃培养24小时，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2的菌种刮下，转接到装有20ml液体种子培养基(pH值7.0，每升培养基中含有葡萄糖4g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾6g，氯化钠7g，酵母粉11g，，加自来水溶解混合至1L)的500ml三角瓶(0.07MPa10min)中，于34℃往复式摇床(振幅65cm，摇床转速180r/m)振动培养18小时。得到液体种子。
将1.25L液体种子接种入装有25L实施例1的本发明培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌8分钟)通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶0.5，35℃发酵培养，当发酵进行至15小时，停止发酵，得到甘精胰岛素前体。按照实施例4的方法测得甘精胰岛素前体的含量为12.03g/l。
实施例8：
将重组大肠杆菌菌株在固体斜面培养基(pH值7.0，蛋白胨7g，酵母粉5g，氯化钠7g，琼脂13g，加自来水溶解混合至1L)上培养，37℃培养20小时，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2的菌种刮下，转接到装有20ml液体种子培养基(pH值7.2，每升培养基中含有葡萄糖4g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钾5g，氯化钠7g，酵母粉10g，，加自来水溶解混合至1L)的500ml三角瓶(0.07MPa10min)中，于34℃往复式摇床(振幅65cm，摇床转速180r/m)振动培养16小时。得到液体种子。
将1.25L液体种子接种入装有25L实施例2的本发明培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌8分钟)通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶0.7，37℃发酵培养，当发酵进行至16小时，停止发酵，得到甘精胰岛素前体。按照实施例4的方法测得甘精胰岛素前体的含量为12.03g/l。
实施例9：
将重组大肠杆菌菌株在固体斜面培养基(pH值7.1，蛋白胨8g，酵母粉9g，氯化钠6g，琼脂15g，加自来水溶解混合至1L)上培养，37℃培养24小时，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2的菌种刮下，转接到装有20ml液体种子培养基(pH值7.0，每升培养基中含有葡萄糖3g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾6g，氯化钠7g，酵母粉11g，，加自来水溶解混合至1L)的500ml三角瓶(0.07MPa10min)中，于34℃往复式摇床(振幅65cm，摇床转速180r/m)振动培养18小时。得到液体种子。
将1.25L液体种子接种入装有25L实施例3的本发明培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌8分钟)通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶0.9，35℃发酵培养，当发酵进行至19小时，停止发酵，得到甘精胰岛素前体。按照实施例4的方法测得甘精胰岛素前体的含量为11.34g/l。
Claims (3)
1.一种发酵生产甘精胰岛素前体的培养基，其特征是每升培养基中含有柠檬酸3～8g，硫酸铁0.01～0.1g，磷酸氢二铵2～8g，磷酸二氢钾2～4g，硫酸镁1～4g，葡萄糖8～15g，甘油1～3g，酵母提取物10～16g，维生素B10.05～0.2g，痕量元素钼酸铵0.5～1mg，硫酸铜0.1～1mg，硼酸1～4mg，碘化钾0.2～0.6mg，氯化锰1～4mg和乙酸锌1～5mg，其余为水，pH为6.8～7.2.
2.一种用权利要求1所述的培养基发酵生产甘精胰岛素前体蛋白的方法，其特征包括以下的步骤：
(1)将重组大肠杆菌BL21(DE3)/hpl菌株在固体斜面培养基上培养，35℃～37℃培养18～24小时，得到斜面菌种；
(2)将斜面菌种接种到液体种子培养基，于35℃～37℃的温度下摇床培养，得到液体种子；
(3)将液体种子接种到权利要求1所述的培养基中，于32℃～38℃通气搅拌发酵罐发酵培养12～18小时，当菌体密度的OD600值达到恒定时停止发酵，得到甘精胰岛素前体。
3.根据权利要求2所述的发酵生产甘精胰岛素前体的方法，其特征是步骤(1)所述的固体斜面培养基pH值6.7～7.2，每升培养基中含有蛋白胨5～10g，酵母粉3～6g，氯化钠3～6g，琼脂12～15g，其余为水；步骤(2)所述的液体种子培养基pH值6.8～7.2，每升培养基中含有葡萄糖1～5g，磷酸二氢钾1～4g，磷酸氢二钾3～6g，氯化钠2～8g，酵母粉6～12g，其余为水；采用的摇床培养室采用摇床振幅65～75cm，转速180～250r/min，培养时间18～24小时，步骤(3)所述的液体种子在发酵生产甘精胰岛素前体的培养基中的接种量是体积分数5％～10％，所述的通气搅拌发酵罐培养中每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比是1∶0.1～1.0，在发酵10～18小时后用10％～16％氨水调节培养基的pH在6.8～7.2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310722672.9A CN104726524A (zh) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | 一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310722672.9A CN104726524A (zh) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | 一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104726524A true CN104726524A (zh) | 2015-06-24 |
Family
ID=53450936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310722672.9A Pending CN104726524A (zh) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | 一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104726524A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111662836A (zh) * | 2019-03-05 | 2020-09-15 | 上海医药工业研究院 | 表达胰岛素前体的基因工程菌及其制备方法和应用 |
| CN112029810A (zh) * | 2019-06-03 | 2020-12-04 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法 |
| CN115029404A (zh) * | 2021-03-04 | 2022-09-09 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌高效分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用 |
-
2013
- 2013-12-20 CN CN201310722672.9A patent/CN104726524A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111662836A (zh) * | 2019-03-05 | 2020-09-15 | 上海医药工业研究院 | 表达胰岛素前体的基因工程菌及其制备方法和应用 |
| CN112029810A (zh) * | 2019-06-03 | 2020-12-04 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法 |
| CN112029810B (zh) * | 2019-06-03 | 2023-08-22 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法 |
| CN115029404A (zh) * | 2021-03-04 | 2022-09-09 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌高效分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用 |
| CN115029404B (zh) * | 2021-03-04 | 2024-05-14 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102154189B (zh) | 一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法 | |
| JP2020534787A (ja) | 黒麹種菌の連続培養及びそれを用いたクエン酸製造方法 | |
| CN110713996B (zh) | 一种海藻糖酶及其载体与应用 | |
| CN104726524A (zh) | 一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法 | |
| CN113186147A (zh) | 一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法 | |
| CN107557407A (zh) | 一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法 | |
| CN102191301B (zh) | 高密度发酵高核热带假丝酵母生产核糖核酸的方法 | |
| CN116751731B (zh) | 一种大规模质粒生产的发酵工艺 | |
| CN115595349A (zh) | 一种利用毕赤酵母大规模生产重组蛋白的工艺 | |
| CN110904156B (zh) | 一种提高桑黄液态发酵三萜产量的方法 | |
| CN116790703A (zh) | 一种生产虾青素的酵母工程菌株及其构建方法、应用 | |
| CN105907812B (zh) | 一种灵芝的多阶段液态深层发酵方法 | |
| CN110583867B (zh) | 薯类淀粉加工中的废弃薯渣生产蛋白饲料的方法 | |
| CN102041285B (zh) | 一种恒pH补料策略发酵生产银耳多糖的方法 | |
| CN108865610A (zh) | 一种对蒸馏型米酒增色增香的方法 | |
| CN114574420B (zh) | 一种促进樟芝深层发酵无性产孢的方法及其培养基和应用 | |
| CN101412991B (zh) | 以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法 | |
| CN105624212A (zh) | 一种以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法 | |
| CN114592020B (zh) | 一种发酵生产n-乙酰氨基葡萄糖的方法 | |
| JP2002017389A (ja) | 茸細胞外多糖体の製造方法 | |
| CN105624213A (zh) | 一种利用微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法 | |
| CN108740292A (zh) | 一种真菌降解辣木叶粉中单宁的发酵工艺及其制备的辣木叶饲料 | |
| CN103601635B (zh) | 一种降解衣康酸发酵液残糖的方法 | |
| CN108660168A (zh) | 一种提高l-色氨酸产量的发酵工艺 | |
| CN107699552A (zh) | 一种提高绿色木霉产纤维素酶酶活的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150624 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |